Systemisch applizierte Therapeutika können erhebliche Nebenwirkungen auslösen, welche auf Grund eines unspezifischen Transports oder einer hohen Dosis von appliziertem Wirkstoff auftreten. Daher bedarf es der Entwicklung neuartiger Wirkstoff-Transportsysteme (Drug Delivery Systems) welche in der Lage sind, Wirkstoffe in genau definierbaren Dosen gezielt in die adressierte Zelle zu transportieren. Ein vielversprechender Ansatz, welcher diesen Anforderungen nachkommt, findet sich in der Layer-by-Layer-Technik (LbL), d.h. der wechselseitigen Assemblierung von Polymeren/Wirkstoffen auf soliden sphärischen Templaten, eines funktionellen Supported Lipid Bilayers sowie der Oberflächenfunktionalisierung mit spezifischen Antikörpern. Dabei ist die Homogenität und Regularität des Supported Lipid Bilayers von großer Bedeutung, um in biomedizinischen Anwendungen eine ungewollte Interaktion mit Serumkomponenten sowie eine Opsonierung zu verhindern. Insbesondere die funktionelle Lipidkomponente besitzt allerdings maßgebliche Auswirkungen auf diese Parameter. In dieser Arbeit wurde die Idee der Oberflächenfunktionalisierung von LbL-beschichteten Silica-Mikropartikeln (SiO2) mit einem funktionellen Supported Lipid Bilayer aufgegriffen und weiterentwickelt, wobei insbesondere die Homogenität des Supported Lipid Bilayers auch auf sehr kleinen Längenskalen (wenige Nanometer) bestimmt wurde. In einem letzten Schritt konnte anhand zweier verschiedener Zelllinien (3T3 und Vero) die Adaptivität und Effektivität des entwickelten Drug Delivery Systems nachgewiesen werden.

Ligandgesteuerte Ionenkanäle sind Membranproteine, die an der Weiterleitung von Reizen und an der Kommunikation zwischen Zellen beteiligt sind. Große Bedeutung besitzt die Messung der Aktivierung der Ionenkanäle beispielsweise in der Medizin (z.B. Ionenkanalerkrankungen), der Pharmazie (z.B. Medikamenten-Screening) und in der Bionanotechnologie (z.B. molekulare Schalter). In all diesen Gebieten besteht die Forderung nach hohen Probendurchsätzen bei sehr hohem Informationsgehalt. Etablierte elektrochemische Detektionsmethoden erfüllen diese Forderung nicht. Um dieses Defizit zu überwinden, wurde ein Ionenkanalsensor-Array mit optischer, paralleler Detektion entwickelt. Eine mikrostrukturierte Polymethyl(meth)acrylat (PMMA)-Schicht dient als Grundgerüst des Arrays. Über die Mikroporen, die nur wenige Mikrometer Durchmesser aufweisen, wird eine Lipidmembran gespannt, in die Ionenkanäle eingebaut werden. Wird der Ionenkanal aktiviert, strömen Ionen in die Mikroporen und führen zu einer messbaren Veränderung des Brechungsindexes. Mittels Oberflächenplasmonen-Resonanz Imaging lässt sich die Aktivierung der Ionenkanäle markierungsfrei und direkt bestimmen. Stabile, die Mikrostruktur überspannende Lipidmembranen wurden durch eine neu entwickelte Stempeltechnik und durch eine Oberflächenmodifikation der PMMA-Mikrostruktur erzielt. Für die Charakterisierung und den Funktionsnachweis des Sensoraufbaus wurden das infrarot-spektroskopische Imaging und die Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt. Schließlich konnte gezeigt werden, dass eine Verbesserung der Empfindlichkeit durch das lokale Aufkonzentrieren der durch den Ionenkanal geströmten Metallionen am Porengrund mit oberflächengebundener 2-(Benzylsulfid)-18-Krone-6 möglich ist.

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Die dynamische Verknüpfung zwischen Plasmamembran und dem unterliegenden Zytoskelett der Zelle ist fundamental für zelluläre Prozesse wie Zellmorphogenese, Zellmotilität und Zelladhäsion. Ezrin als Bestandteil der ERM (Ezrin, Radixin, Moesin) Proteinfamilie verbindet L-α-Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) der Plasmamembran mit filamentösem Aktin (F-Aktin) des Zytoskeletts. Die Ezrinbindung an F-Aktin wird reguliert über den Aktivierungsgrad des Proteins, welcher von der N-terminalen PIP2 Bindung und der Phosphorylierung des Threoninrests 567 abhängt. Aufgrund der Bindung an PIP2 und der Phosphorylierung wechselt Ezrin von einer inaktiven, N- und C-terminal assoziierten Konformation in einen aktivierten, geöffneten Zustand, welcher die C-terminale F-Aktinbindung ermöglicht. Ziel dieser Arbeit war es Aspekte der Verknüpfung zwischen Plasmamembran und Zytoskelett zu untersuchen. Basierend auf Bindung von Ezrin an PIP2-haltige artifizielle Lipidmembranen und der anschließenden F-Aktinbindung, wurden Bindungseigenschaften, die Organisation des F-Aktinnetzwerkes und die durch das Aktinnetzwerk beeinflusste Lipidmembranmechanik untersucht. Im ersten Abschnitt dieser Arbeit wurde der molekulare Aktivierungsprozess von Ezrin anhand der Charakterisierung von Bindungsaffinitäten und der Organisation von Ezrin an Lipidmembranen untersucht. Aufgrund einer reduzierten Proteinhöhe und FRET (FÖRSTER-Resonanzenergietransfer)-Effizienz im Fall der vollständigen Aktivierung (PIP2-Bindung und Phosphorylierung) wurde postuliert, dass Ezrin eine weniger dicht gepackte, geöffnete Konformation gebunden an Lipidmembranen ausbildet. Dies ermöglicht dem Protein C-terminal F-Aktin zu binden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Aktinnetzwerke an festkörperunterstützten Lipidmembranen (SLBs) immobilisiert und über Ezrin an PIP2- oder elektrostatisch an 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin (DOEPC)-haltige SLBs gebunden. Die Netzwerkorganisation wurde mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie untersucht und unter Berücksichtigung der Immobilisierungsstrategie in Hinblick auf den Einfluss der Anzahl an Verknüpfungspunkten und aktinbindender Proteine (Fascin und α-Actinin) analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass beide Immobilisierungsstrategien zu Aktinnetzwerken mit ähnlichen Eigenschaften führten, bezugnehmend auf Maschengröße und Filamentsegmentlänge. Die Aktinnetzwerkdichte konnte direkt über die Anzahl an Verknüpfungspunkten und aktinbindende Proteine (ABPs) reguliert werden, dies demonstriert die physiologische Relevanz der Ergebnisse. Es ist bekannt, dass die Aktindichte in Zellen über PIP2- und ABP-Konzentration gesteuert wird. Im dritten Teil der Arbeit wurde das etablierte Modelsystem auf poröse Substrate übertragen. Unter Kenntnis der vorangegangenen Teile der Arbeit wurde der Einfluss des F-Aktinnetzwerkes auf die Lipidmembranmechanik untersucht. Mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie wurden Indentationsexperimente an porenüberspannenden Lipidmembranen (PSLBs) durchführt, welche zeigten, dass ein aufliegendes F-Aktinnetzwerk die PSLBs versteift. Dies ließ sich auf die reduzierte laterale Mobilität der Lipide innerhalb der PSLBs aufgrund des Aktinnetzwerkes zurückführen, vergleichbar mit dem Picket-Fence-Modell der Plasmamembran bei welchem die Mobilität der Lipide und (Membran-)Proteine, aufgrund der Kompartimentierung der Membran durch das Aktin-Zytoskelett, eingeschränkt ist.

The interactions between cholesterol and other membrane molecules determine important membrane properties. It was shown that even small changes in the molecular structure of cholesterol have a crucial influence on these interactions. We recently reported that in addition to alterations in the tetracyclic ring structure, the iso-branched side chain of cholesterol also has a significant impact on membrane properties (Scheidt H. et al. 2013 Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 12848-12851). Here we used synthetic cholesterol analogs to investigate the influence of an unbranched aliphatic side chain of different length. The 2H NMR order parameter of the phospholipid chains and therefore the molecular packing of the phospholipid molecules shows a significant dependence on the sterol’s alkyl side chain length, while , membrane permeation studied by a dithionite ion permeation assay and lateral diffusion measured by 1H MAS pulsed field gradient NMR are less influenced. To achieve the same molecular packing effect similar to that of an iso-branched aliphatic side chain, a longer unbranched side chain (n-dodecyl instead of n-octyl) at C17 of cholesterol is required. Obviously, sterols having a branched iso- alkyl chain with two terminal methyl groups exhibit altered cholesterol-phospholipid-interactions compared to analogous molecules with a straight unbranched chain.

Systemisch applizierte Therapeutika können erhebliche Nebenwirkungen auslösen, welche auf Grund eines unspezifischen Transports oder einer hohen Dosis von appliziertem Wirkstoff auftreten. Daher bedarf es der Entwicklung neuartiger Wirkstoff-Transportsysteme (Drug Delivery Systems) welche in der Lage sind, Wirkstoffe in genau definierbaren Dosen gezielt in die adressierte Zelle zu transportieren. Ein vielversprechender Ansatz, welcher diesen Anforderungen nachkommt, findet sich in der Layer-by-Layer-Technik (LbL), d.h. der wechselseitigen Assemblierung von Polymeren/Wirkstoffen auf soliden sphärischen Templaten, eines funktionellen Supported Lipid Bilayers sowie der Oberflächenfunktionalisierung mit spezifischen Antikörpern. Dabei ist die Homogenität und Regularität des Supported Lipid Bilayers von großer Bedeutung, um in biomedizinischen Anwendungen eine ungewollte Interaktion mit Serumkomponenten sowie eine Opsonierung zu verhindern. Insbesondere die funktionelle Lipidkomponente besitzt allerdings maßgebliche Auswirkungen auf diese Parameter. In dieser Arbeit wurde die Idee der Oberflächenfunktionalisierung von LbL-beschichteten Silica-Mikropartikeln (SiO2) mit einem funktionellen Supported Lipid Bilayer aufgegriffen und weiterentwickelt, wobei insbesondere die Homogenität des Supported Lipid Bilayers auch auf sehr kleinen Längenskalen (wenige Nanometer) bestimmt wurde. In einem letzten Schritt konnte anhand zweier verschiedener Zelllinien (3T3 und Vero) die Adaptivität und Effektivität des entwickelten Drug Delivery Systems nachgewiesen werden.

A theoretical explanation of the existence of lipid rafts in cell membranes remains a topic of lively debate. Large, micrometer sized rafts are readily observed in artificial membranes and can be explained using thermodynamic models for phase separation and coarsening. In live cells such domains are not observed and various models are proposed to describe why the systems do not coarsen. We review these attempts critically and show within a phase field approach that membrane bound proteins have the potential to explain the different behaviour observed in vitro and in vivo. Large scale simulations are performed to compute scaling laws and size distribution functions under the influence of membrane bound proteins and to observe a significant slow down of the domain coarsening at longer times and a breakdown of the self-similarity of the size-distribution function. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Ligandgesteuerte Ionenkanäle sind Membranproteine, die an der Weiterleitung von Reizen und an der Kommunikation zwischen Zellen beteiligt sind. Große Bedeutung besitzt die Messung der Aktivierung der Ionenkanäle beispielsweise in der Medizin (z.B. Ionenkanalerkrankungen), der Pharmazie (z.B. Medikamenten-Screening) und in der Bionanotechnologie (z.B. molekulare Schalter). In all diesen Gebieten besteht die Forderung nach hohen Probendurchsätzen bei sehr hohem Informationsgehalt. Etablierte elektrochemische Detektionsmethoden erfüllen diese Forderung nicht. Um dieses Defizit zu überwinden, wurde ein Ionenkanalsensor-Array mit optischer, paralleler Detektion entwickelt. Eine mikrostrukturierte Polymethyl(meth)acrylat (PMMA)-Schicht dient als Grundgerüst des Arrays. Über die Mikroporen, die nur wenige Mikrometer Durchmesser aufweisen, wird eine Lipidmembran gespannt, in die Ionenkanäle eingebaut werden. Wird der Ionenkanal aktiviert, strömen Ionen in die Mikroporen und führen zu einer messbaren Veränderung des Brechungsindexes. Mittels Oberflächenplasmonen-Resonanz Imaging lässt sich die Aktivierung der Ionenkanäle markierungsfrei und direkt bestimmen. Stabile, die Mikrostruktur überspannende Lipidmembranen wurden durch eine neu entwickelte Stempeltechnik und durch eine Oberflächenmodifikation der PMMA-Mikrostruktur erzielt. Für die Charakterisierung und den Funktionsnachweis des Sensoraufbaus wurden das infrarot-spektroskopische Imaging und die Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt. Schließlich konnte gezeigt werden, dass eine Verbesserung der Empfindlichkeit durch das lokale Aufkonzentrieren der durch den Ionenkanal geströmten Metallionen am Porengrund mit oberflächengebundener 2-(Benzylsulfid)-18-Krone-6 möglich ist.

The physical properties of glycerophospholipids (GPLs) are not only determined by the head group (HG), but also by their fatty acid (FA) chains, which affect their distribution and function within membranes in the cell. Understanding the microheterogenity of lipid membranes on a molecular level requires qualitative and quantitative characterization of individual lipids and identification of their FA moieties. The aim of my study was to introduce the new technology of multiple precursor ion scanning (MPIS) on a QSTAR Pulsar time-of-flight mass spectrometer (QqTOF) to analyze lipids. Detailed information on fatty acid composition of individual GPL molecules could be obtained in parallel with conventional profiling of lipid classes, and this could be done by direct analysis of total lipid extracts. This method was termed Fatty Acid Scanning (FAS) and Head Group Scanning HGS, respectively. In this way the molecular GPL composition of total lipid extracts could be charted in a single analysis accurately and rapidly at a low picomole concentration level. Furthermore, combining FAS and HGS together with ion trap MS3 analysis allowed complete charting of the molecular composition of PCs, including quantification of their positional isomers, thus providing a detailed and comprehensive characterization of molecular composition of the pool of PCs. Development of the Lipid Profiler software allowed full automation and rapid processing of complex data, including identification and quantification of molecular GPLs. This approach was evaluated by preliminary applications. First, the molecular composition of PCs of total lipid extracts of MDCK cells and of human red blood cells (RBC) could accurately be charted. Significant presence of positional isomers was observed increasing the total number of individual PC species close to one hundred. Secondly, the molecular PC and SM species distribution in detergent resistant membranes (DRMs) prepared by Triton X-100 DRMs were analyzed and were found to be enriched in distinct GPLs. The distribution in PCs and SMs of Triton X-100 DRMs of RBC were compared with those of the DRMs of MDCK cells. Finally, combining the use of a 96 well plate and a robotic system demonstrated that these analyses can be automated and analyzed with high throughput. This system we termed Shotgun Lipidomics. Taken together, this mass spectrometric methodology provides rapid and detailed insight into the distribution of the molecular GPLs of membranes and membrane sub-fractions.

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