Einleitung: Vitamin B12 hat wichtige Funktionen im Energiestoffwechsel sowie bei der Erythropoese. Beide Funktionskreise werden bei Hochleistungskühen besonders beansprucht und können bei Belastungen und ungenügender Vitamin-B12-Versorgung Ausgangspunkt für klinische Störungen werden. Ziele der Untersuchungen: In den vorliegenden Studien wurde der Fragestellung nachgegangen, wie sich die Vitamin-B12-Konzentration im Blutserum von Milchkühen in der Frühlaktation verhält und welche Zusammenhänge zu Stoffwechselparametern, dem Erythrogramm sowie dem Gesundheitsstatus der Kühe bestehen. Des Weiteren wurde geprüft, inwieweit der postpartale Stoffwechsel und der Gesundheitsstatus durch orale Vitamin-B12-Substitutionen stabilisiert werden können. Material und Methoden: Die Untersuchungen zur Vitamin-B12-Statuserhebung erfolgten an 157 Kühen der Rasse Holstein Friesian. Blutproben zur Stoffwechselanalytik wurden 2-6 Tage p.p. sowie 4-5 Wochen p.p. entnommen. Parallel dazu wurden klinische Daten zu Leistung und Gesundheitsstatus bis 3 Monate p.p. erhoben. In einem zweiten Versuch wurden die Kühe in 2 Gruppen eingeteilt, wobei die Versuchsgruppe (65 Kühe) eine orale Vitamin-B12-Substitution in Höhe von 0,5 g Cyanocobalamin/Kuh/Tag 4-6 Wochen a.p. beginnend bis zur Kalbung erhielt. 71 Kühe, die das stallübliche Mineralfutter erhielten, dienten als Kontrollgruppe. Auch hier erfolgten die Blutkontrollen 2-6 Tage p.p. sowie 4-5 Wochen p.p. Es wurden die Milchleistung sowie auftretende Erkrankungen dokumentiert. Die Blutentnahme erfolgte aus der Vena caudalis mediana. Neben den hämatologischen Untersuchungen wurden folgende Parameter aus dem Serum bestimmt: Freie Fettsäuren (FFS), Betahydroxybutyrat (BHB), Glukose, Bilirubin, Cholesterol, Gamma-Glutamyltransferase (GGT), Creatinkinase (CK), Harnstoff, Calcium, Eisen, anorganisches Phosphat (Pi), Cyanocobalamin und Cobalt. Ergebnisse: Die Vitamin-B12-Konzentration zeigt eine signifikante Laktationsdynamik. Alle untersuchten Kühe hatten 4 Wochen p. p. gegenüber 2–6 Tage p. p. erniedrigte Vitamin-B12-Konzentrationen (p ≤ 0,05). Bei den p.p. kranken Kühen sank gegenüber den gesunden Kühen die Vitamin-B12-Konzentration weniger stark ab (p ≤ 0,05), d.h., höhere Vitamin-B12-Konzentrationen können auf klinische Probleme hinweisen. Gesunde sowie auch p.p. kranke Kühe wiesen 2–6 Tage p. p. höhere Werte für die Parameter Erythrozytenzahl, Hämatokrit und Hämoglobinkonzentration auf als 4 Wochen p. p. Die BHB-, FFS- und Bilirubin-Konzentrationen waren bei allen Kühen 2–6 Tage p. p. infolge der partusbedingten Lipolysesteigerung erhöht (p ≤ 0,05). Bei allen Kühen korrelierte die Aktivität der cholestaseanzeigenden GGT eng mit der Vitamin-B12-Konzentration (p ≤ 0,01). Aufgrund dieser engen Korrelation mit der GGT-Aktivität sowie der Bilirubinkonzentration kann Vitamin B12 bei einer Serumkonzentration ≥ 227 ng/l bei Kühen cholestatische Stoffwechselbelastungen anzeigen. Nach Vitamin-B12-Substitution blieben in der Versuchsgruppe 60 % und in der Kontrollgruppe 47,9 % der Kühe in der Frühlaktation gesund. In der Kontrollgruppe hatten 12,7 % eine Nachgeburtsverhaltung und 40,8 % eine Mastitis, in der Versuchsgruppe betrugen die Anteile 21,5 % sowie 26,2 %. Mit x̃ = 320 pg/ml war die Vitamin-B12-Konzentration 2-6 Tage p.p. in der Vitamin-B12-substituierten Gruppe gegenüber x̃ = 224 pg/ml in der Kontrollgruppe gesichert höher. Auch vier Wochen p.p. war die Differenz noch signifikant. Cobalt, die Parameter des Leber- und Energiestoffwechsels sowie Harnstoff und CK unterschieden sich zwischen der Vitamin-B12-substituierten Gruppe und der Kontrollgruppe nicht gesichert. Die Erythrozytenzahlen sowie die Hämoglobin-Konzentrationen waren in der Vitamin-B12-substituierten Gruppe gesichert höher. Der Milchfettgehalt (%) war bei den Vitamin-B12-substituierten Kühen gegenüber den Kontrollkühen signifikant erhöht (p = 0,022), die Milchleistung unterschied sich unwesentlich. Schlussfolgerungen: Signifikant höhere Vitamin-B12- und Hämoglobin-Konzentrationen, höhere Erythrozytenzahlen sowie geringere Morbidität sprechen für positive Effekte der Vitamin-B12-Substitution. Anhand der Parameter des Leber-Energiestoffwechsels sowie der Milchleistung ließ sich dies nicht bestätigen. Cholestase stört die Vitamin-B12-Bewertung im Blut bzw. ist bei der Interpretation zu beachten. / Introduction: Vitamin B12 has important functions in energy metabolism and erythropoiesis. Both functional groups are particularly stressed in high-yielding dairy cows and can be a starting point for clinical disorders under stress and insufficient vitamin B12 supply. Objective: The studies presented were designed to ascertain the characteristics of the serum vitamin B12 concentration of dairy cows in early lactation and to check the relations with metabolic parameters, the erythrogram as well as the health status of the cows. Furthermore, it was examined to what extent the postpartum metabolism can be stabilized by oral vitamin B12 substitutions. Material and methods: The investigations on vitamin B12 status survey were carried out on 157 cows of the Holstein Friesian breed. Blood samples were taken for metabolic analysis at 2-6 days p.p. and at 4-5 weeks p.p. In parallel, clinical findings on the milk yield and the health status were compiled up to 3 months p.p. In a second trial the cows were divided into 2 groups in which the experimental group (65 cows) received an oral vitamin B12 substitution in the amount of 0.5 g cyanocobalamin/cow/day starting 4-6 weeks a.p. up to calving. 71 cows, which recieved the common mineral feed, served as control group. Again the blood tests were performed at 2-6 days p.p. and at 4-5 weeks p.p. The milk yield and emerging diseases were documented. The blood samples werde taken from the Vena caudalis mediana. In addition to haematological investigations the following parameteres were measured: Non-esterified fatty acids (NEFA), beta-hydroxybutyrate (BHB), glucose, bilirubin, cholesterol, gamma-glutamyl transferase (GGT), creatinkinase (CK), urea, calcium, ferric, anorganic phosphor, cyanocobalamin and cobalt. Results: The vitamin B12 concentration shows a significant dynamic in lactation. All examined cows had decreased vitamin B12 concentrations at 4 weeks p. p. compared to 2-6 days p. p. (p ≤ 0.05). In the p.p. morbid cows the vitamin B12 concentration fell less than in the healthy cows (p ≤ 0.05), which means higher vitamin B12 concentrations may indicate clinical problems. Healthy as well as p.p. morbid cows showed higher values for the parameters erythrocyte count, hematocrit and hemoglobin concentration at 2-6 days p.p. than 4 weeks p.p. BHB, FFS, and bilirubin levels were increased in all cows at 2-6 days p.p. as a result of partus related rise in lipolysis (p ≤ 0.05). In all cows, the activity of the GGT, which indicates cholestasis, was closely correlated with the vitamin B12 concentration p ≤ 0.01). Because of this close correlation with GGT activity and bilirubin concentration, vitamin B12 may show cholestatic metabolic stress in cows at a serum concentration ≥ 227 ng/l. After vitamin B12 substitution 60 % of the cows in the experimental group and 47.9 % of the cows in the control group remained healthy during early lactation. In the control group 12.7 % had a Retentio secundinarum and 40.8 % had a mastitis, in the experimental group the proportions were 21.5 % and 26.2 %. At two to six days p.p. the vitamin B12 concentration in the vitamin B12 substituted group was significant higher (x̃ = 320 pg/ml) than in the control group (x̃ = 224 pg/ml). This difference was still significant at four weeks p.p. Cobalt, parameters of liver and energy metabolism as well as urea and CK did not differ significantly between the vitamin B12 substituted group and the control group. Erythrocyte counts and hemoglobin concentrations were significant higher in the vitamin B12 substituted group. Milk fat content (%) was significant higher in the vitamin B12 substituted group compared to the control group (p = 0.022), the milk yield did not differ significantly. Conclusions: Significant higher vitamin B12 and hemoglobin concentrations, higher erythrocyte counts as well as lower morbidity speak for positive effects of vitamin B12 substitution. Based on the parameters of hepatic and energy metabolism as well as milk yield this could not be confirmed. Cholestasis interferes with the evaluation of vitamin B12 in the blood respectively should be considered in the interpretation.

L'obésité est une maladie définie par une accumulation de masse grasse dans le tissu adipeux ayant des conséquences néfastes pour la santé. Les causes de l’obésité sont multiples. Dans un travail récent, il y a été démontré le rôle de la pollution environnementale dans la prise de poids. Dans ce travail, les hypothèses selon lesquelles les récepteurs adrénergiques situés à la surface des cellules adipeuses seraient le siège de l’action des polluants aromatiques polycycliques ont été vérifiées par le dosage de plusieurs agonistes et antagonistes spécifiques et non spécifiques en présence ou non du benzo[a]pyrène sur des récepteurs humains et de cellules d’hamster chinois (CHO). Les quantités d’AMPc obtenues montrent que les HAP ne se déposent pas sur les récepteurs β1, β2, β3 adrénergiques.Cette accumulation se fait au niveau des phospholipides de la membrane cytoplasmique des cellules. Ce qui cause une rigidité des membranes.Cette observation tend à renforcer l'hypothèse selon laquelle le benzo[a]pyrène induirait une inhibition de la lipolyse par l'accumulation au niveau de la bicouche de phospholipides et des changements de conformation de la bicouche de phospholipides dans les environs des récepteurs à sept domaines transmembranaires qui sont β-adrénergiques.La liaison de la bicouche phospholipidique avec les HAP utilisés est une réaction exothermi-que avec un faible dégagement de chaleur / Obesity is a disease defined by an accumulation of fat in adipose tissue with adverse consequences for health. The causes of obesity are many.In recent work, there was demonstrated the role of environmental pollution in weight gain.In this work, the assumptions that the adrenergic receptors on the surface of fat cells would home to the accumulation of polycyclic aromatic pollutants have been verified by measurement of several agonists and antagonists specific and non-specific in the presence or absence of benzo[a]pyrene receptors on human cells and Chinese hamster (CHO). The amounts of cAMP obtained showed that PAHs are not deposited on β-receptors, β1, β2, β3 adrenergic receptors.This accumulation occurs at the cytoplasmic membrane phospholipids of the cells. What cau-ses stiffness of the membranes. This observation tends to reinforce the hypothesis that benzo [a]pyrene induce an inhibition of lipolysis by the accumulation in the phospholipid bilayer and conformational changes of the bilayer phospholipids in the vicinity of receptors seven transmembrane domains which are β-adrenergic receptors

La sécrétion de lipase, la lipolyse extracellulaire et l’absorption des acides gras (AGL) ont été étudiés chez Yarrowia lipolytica (YL) en présence d’huile d’olive et/ou de sucrose. Des mesures d’activité lipase et d’immuno-révélation ont montré que l’activité lipase présente dans le milieu de culture provenait principalement de la lipase YLLIP2. L’huile d’olive induit la production de lipase qui est principalement associée aux cellules pendant les premières heures de cultures. YLLIP2 est ensuite libérée dans le milieu de culture avant d’être totalement dégradée par les protéases. Les triglycérides (TG) sont dégradés alors que la lipase est encore attachée aux cellules. Les produits de lipolyse présents dans le milieu de culture et à l’intérieur des cellules ont été quantifiés par chromatographie TLC-FID et GC. Les niveaux intracellulaires d’AGL et de TG augmentent transitoirement et dépendent de la source de carbone utilisée. Une accumulation maximum de 37,8 % w/w de lipides est observée avec l’huile d’olive seule. Cette étude montre que la levure YL est un modèle intéressant pour étudier la lipolyse extracellulaire et l’absorption des acides gras par les cellules / Lipase secretion, extracellular lipolysis and fatty acid (FFA) uptake were quantified in Yarrowia lipolytica (YL) grown in the presence of olive oil and/or sucrose. Lipase assays and western blot analysis indicated that the lipase activity measured in YL cultures mainly resulted from YLLIP2 lipase. Lipase production was triggered by olive oil and YLLIP2 remained associated with the yeast cells during the first hours of culture. It was then released in the culture medium before it was totally degraded by the alkaline protease. Olive oil triglycerides (TG) were degraded when the lipase was still attached to the cell wall. The fate of lipolysis products in the culture medium and inside the yeast cell were investigated by quantitative TLC-FID and GC analysis. Intracellular levels of FFA and TG increased transiently and were dependent on the carbon sources. A maximum fat storage of 37.8% w/w was observed with olive oil alone. The present study shows that yeasts are interesting models for studying extracellular lipolysis and fat uptake by the cell

Plusieurs cibles thérapeutiques dans le développement de médicaments contre l’obésité visent une diminution de l’appétit et de la masse adipeuse et à augmenter la dépense énergétique. L’appétit et le métabolisme énergétique sont régulés par certains neuropeptides qui agissent au niveau du système nerveux central, notamment dans l’hypothalamus. Parmi ces neuropeptides, les peptides RF-amide ou QRFP (pyroglutamylated RF-amide peptides), ainsi nommés par la présence du motif conservé Arg-Phe-NH2 dans le domaine C-terminal, induisent une hyperphagie et une augmentation de la masse adipeuse lorsqu’administrés par voie centrale. Les formes bioactives de ces peptides comprennent principalement 43 (QRFP-43) et 26 (QRFP-26) acides aminés. Outre les peptides QRFP, leurs récepteurs, les GPR103 de la famille des récepteurs à 7 passages transmembranaires couplés aux protéines G, sont exprimés dans l’hypothalamus. Plus récemment, des études ont montré la sécrétion de ces neuropeptides, et la présence du GPR103, dans le tissu adipeux. Cependant, le rôle de la voie signalétique (QRFP/GPR103) dans la régulation du métabolisme lipidique au niveau périphérique est peu connu. Les travaux de cette thèse ont porté sur la caractérisation des effets adipogéniques périphériques des neuropeptides QRFP. En premier lieu, nos travaux ont montré que les adipocytes 3T3-L1 et les adipocytes murins isolés des dépôts adipeux blancs expriment le prépro-QRFP et uniquement le récepteur GPR103B, un des deux sous-types de récepteurs présents chez la souris. De plus, nous avons montré que l’expression du récepteur est régulée par une diète riche en lipides réduisant l’expression du prépro-QRFP, mais augmentant celle du GPR103B dans les dépôts lipidiques. Chez l’humain, les adipocytes de l’omentum expriment autant le GPR103 que le prépro-QRFP. Nous avons de plus étudié la fonctionnalité du GPR103B dans les adipocytes 3T3-L1 par l’utilisation d’ARN interférents. Nous avons observé que ce récepteur médie les effets adipogéniques des QRFPs en augmentant l’expression du récepteur nucléaire PPAR-gamma (peroxisome proliferator-activated receptor gamma) et le facteur de transcription C/EBP-alpha (CCAAT-enhancer binding protein alpha) résultant en une accumulation des triglycérides. Nous avons aussi mis en évidence les effets anti-lipolytiques des QRFPs. En effet, les QRFP inhibent fortement la lipolyse induite avec l’isoprotérénol. L’étude des mécanismes moléculaires à l’origine des effets anti-lipolytiques du QRFP-43 a montré l’activation de la voie de signalisation PI3-K/PKB (phosphatidylinositol 3-kinase/protéine kinase B) en réponse à la stimulation du GPR103B. La réponse anti-lipolytique induite par le QRFP-43 est associée à une diminution de la phosphorylation de la périlipine A (PLIN1a) et de la lipase hormono-sensible (HSL). Nos études ont élucidé les mécanismes conduisant à l’inhibition de la phosphorylation de la PLIN1a en réponse à l’activation du GPR103B, impliquant l’inhibition de la migration de la cavéoline 1 et de la sous unité catalytique de la protéine kinase A (PKA) au niveau des gouttelettes lipidiques, ainsi que l’inhibition de l’activité des Src kinases et de la protéine kinase C (PKC). En conclusion, nos travaux ont montré que les QRFP-43 et -26 exercent un effet adipogénique et anti-lipolytique dans les adipocytes, mettant ainsi en évidence le rôle des neuropeptides QRFPs dans la régulation du métabolisme lipidique au niveau adipocytaire. / Anti-obesity therapies mostly focused on development of centrally-acting drugs, which also promote weight loss properties. Many studies have documented the relevance of neuroendocrine peptides in the hypothalamus and their influence on the regulation of energy balance. Some neuropeptides have been reported to be expressed and secreted by the adipose tissue where they modulate lipid metabolism, reflecting the importance between hypothalamus and adipose tissue. Among neuropeptides that regulate appetite, QRFP (pyroglutamylated RF-amide peptides) was reported to have hyperphagic properties associated with an increase of adipose mass over lean mass in mice. Both QRFP and its receptor GPR103 are expressed in the hypothalamus of many spices. However, whether QRFP peptides and its receptor are involved in peripheral lipid metabolism is still unknown. This thesis focused on the peripheral effects of QRFP and the role of its receptor on adipose tissue. The results presented here show that QRFP-43 and -26 have direct adipogenic effects on both 3T3-L1 adipocytes and isolated adipocytes from white adipose tissue (WAT). Indeed, we found that prepro-QRFP and the GPR103B receptor, which is one of the two GPR103 sub-types found in mice, are expressed in 3T3-L1 adipocytes and in WAT isolated adipocytes. When mice are fed with high-fat diet, prepro-QRFP expression was reduced whilst GPR103B was increased in different WAT. In human omental adipocytes, both prepro-QRFP and GPR103 are expressed. QRFP treatment on 3T3-L1 adipocytes inhibits isoproterenol (ISO) induced-lipolysis and promotes adipognesis trought fatty acid uptake and expression of key adipogenic transcription factors, PPAR-gamma (peroxisome proliferator-activated receptor gamma) and C/EBP-alpha (CCAAT-enhancer binding protein alpha). The functionality of the GPR103B receptor was studied using short hairpin RNA to knock down its expression in 3T3-L1 adipocytes. Knockdown of GPR103B resulted in complete loss of QRFP peptides antilipolytic effects and fatty acid uptake. GPR103B signaling pathways in antilipolytic effects of QRFP-43 were investigated using 3T3-L1 adipocytes model. Stimulation of GRP103B induced PI3-K/PKB (phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B) pathway. QRFP-43 attenuates lipolysis by inhibiting ISO induced-phosphorylation of perilipin A (PLIN1a) and hormone sensitive lipase (HSL). Moreover, we have underscored the mechanisms of GPR103B mediating inhibition of PLIN1a in 3T3-L1 adipocytes. Activation of GPR103B prevents the translocation of caveolin 1 and the catalytic subunit of PKA induced by ISO on lipid droplets. This latter mechanism is the result of the inhibition of Src kinases and PKC induced by ISO following QRFP-43 treatment in 3T3-L1 adipocytes. In conclusion, the work conducted in this thesis demonstrates a new role of QRFP peptides and the receptor GPR103B as modulator of lipid metabolism in adipose tissue. We have also underscored GPR103B signaling pathways leading to inhibition of lipolysis in adipocytes.

Ein wichtiger Regulator der Lipolyse im Fettgewebe ist das sympathische Nervensystem. Über die Bedeutung präsynaptischer Faktoren (z.B. der lokalen Noradrenalinfreisetzung) des Fettgewebes ist jedoch wenig bekannt. Zudem sezerniert das Fettgewebe Signalmoleküle, die die lokale Lipolyse beeinflussen können, z.B. Angiotensin II (Ang II). Die Lipolyse hängt zudem von der Durchblutung und der Zellularität des Gewebes ab. Es wurde geprüft, ob (I) die lokale neuronale Noradrenalinfreisetzung die Durchblutung und den Stoffwechsel im subkutanen abdominalen Fettgewebe (SAF) beeinflußt und geschlechtsspezifische Unterschiede vorliegen, (II) Ang II die Durchblutung und den Stoffwechsel des SAF inhibiert, (III) Durchblutung und Stoffwechsel des SAF bei Schlanken von der Hautfaltendicke abhängen. 42 Normalgewichtige (18 Männer, 24 Frauen) wurden mit der Mikrodialysetechnik untersucht. Das adrenerge System des SAF wurde mit Isoproterenol (Iso) und Tyramin (Tyr) charakterisiert. Mittels Ethanol-Dilutionstechnik, [Glycerol], [Lactat] und [Glucose] im Dialysat wurden Änderungen in Durchblutung, Lipolyse, Glycolyse und Glucoseversorgung abgeschätzt. Die Hautfaltendicke wurde mittels Caliper-Technik bestimmt. Niedrigere Tyr-Dosen erhöhten die Lipolyse im SAF, die Durchblutung blieb konstant. Der Lipolyseanstieg war bei den Frauen größer als bei den Männern, war aber auch unter Iso bei den Frauen höher. Ang II verminderte zumindest im SAF der Frauen leicht die Durchblutung und indirekt die Lipolyse. Die Hautfaltendicke korrelierte geschlechtsunabhängig negativ-linear mit der Durchblutung und der Lipolyse. Die lokale neuronale Noradrenalinfreisetzung spielt eine wichtige Rolle in der Regulation der Lipolyse des SAF. Die geschlechtsspezifischen Unterschiede sind auf postsynaptische Faktoren zurückzuführen. Ang II beeinflußt die Durchblutung und die Lipolyse des SAF nur gering. Durchblutung und Stoffwechsel des SAF sind schon bei Normalgewichtigen mit zunehmender Hautfaltendicke vermindert. / The sympathetic nerve system is one important regulator of lipolysis. The regulatory role of neuronal transmitter release (e.g. of norepinephrine) and re-uptake in adipose tissue is only poorly understood. Furthermore, adipose tissue secretes hormones, e.g. angiotensin II (Ang II), which can affect adipose tissue lipolysis. Finally, lipolysis depends on blood flow and cellularity of adipose tissue. Aims of this thesis were (I) to characterize the impact of local neuronal norepinephrine release on blood flow and metabolism in subcutaneous abdominal adipose tissue (SAT) and to assess possible gender effects, (II) to proof if Ang II inhibits lipolysis and blood flow in SAT, and (III) to test if SAT thickness is negatively correlated with blood flow and metabolism even in non-obese subjects. 42 lean subjects (18 men, 24 women) were studied using microdialysis technique. Tyramine (Tyr) and isoproterenol (Iso) were used to characterize adrenergic response of SAT. Dialysate [ethanol], [glycerol], [lactate], and [glucose] were measured to assess tissue blood flow (ethanol dilution technique), lipolysis, glycolysis, and nutritive supply. Skin fold thickness was taken to assess thickness of SAT. During perfusion with lower Tyr doses, ethanol ratio remained unchanged, whereas lipolysis increased. The lipolytic response was higher in women vs. men, a gender difference was also observed for Iso-stimulated lipolysis. During perfusion with Ang II, blood flow and lipolysis decreased slightly at least in women. Skin fold thickness was negatively correlated with tissue perfusion and lipolysis without gender-specific differences. Neuronal norepinephrine release plays an important role in the regulation of lipolysis of SAT. The gender difference is explained by a difference in postsynaptic adrenergic sensitivity. Ang II has a minimal effect on local blood flow and metabolism. Increased SAT thickness is associated with reduced tissue perfusion and lipid metabolism, even in lean subjects.

L’hypertriglycéridémie (HTG) correspond à une accumulation des lipoprotéines riches en triglycérides (LRTG) dans la circulation plasmatique, conséquence d’une augmentation de leur synthèse ou plus classiquement décrit, d’une diminution de leur catabolisme. Dans près de 50% des cas, aucune cause génétique n’est identifiée chez les patients présentant une présentant une HTG sévère, aussi bien dans le cadre du syndrome de chylomicronémie familiale (FCS) que dans celui du syndrome de chylomicronémie multifactorielle (MCS). Pour améliorer nos connaissances et la caractérisation de ces patients, la conduction de corrélations phénotypes-génotypes précises grâce à une collaboration clinico-biologique étroite, ainsi que le développement d’outils de diagnostic moléculaire performants, demeurent un enjeu majeur. Premièrement, l’évaluation de la concentration pré-héparinique en LPL et l’activité post-héparinique 60 minutes après l’injection d’héparine chez 62 patients MCS caractérises génétiquement a permis la mise en évidence deux sous-groupes chez ces patients. Deuxièmement, le développement d’une stratégie séquençage de nouvelle génération permettant d’explorer simultanément les 9 gènes les plus prévalents dans les hypercholestérolémies, les hypocholestérolémies et les hypertriglycéridémies, a permis de détecter les variants nucléotidiques avec une sensibilité équivalente au séquençage Sanger mais aussi de détecter des grands réarrangements. L’ensemble des résultats souligne la complexité des mécanismes de régulation du métabolisme des LRTG et l’intérêt de l’étude des interactions gène-gène. Ainsi, ces travaux ont permis de mettre en évidence de nouvelles hypothèses à explorer pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques des HTG sévères et d’améliorer les outils disponibles pour les études de corrélation génotype-phénotype / Hypertriglyceridemia (HTG) correspond to an increase of triglyceride-rich lipoproteins (TGRL) circulating concentration, as a consequence of an increase in the synthesis of or a decrease in their catabolism, most classically described. In nearly 50% of patients with severe hypertriglyceridemia (HTG), no genetic cause is identified, either in familial chylomicronemia syndrome (FCS) or in multifactorial chylomicronemia syndrome (MCS). To gain new insights and to improve patient’s characterization, it remains important to conduct accurate phenotype-genotype association studies through close collaboration with referent lipidologists, and to develop high-performance tools for molecular diagnosis. Firstly, the assessment of pre-heparin LPL concentration as well as LPL activity 60 minutes after heparin injection, enabled the identification of two subgroups within 62 genotyped MCS patients Secondly, the development of a new sequencing generation workflow exploring simultaneously the 9 most prevalent genes in dyslipidemia, allowed the detection of single nucleotide variations with sensitivity equivalent to Sanger sequencing, but also allowed the detection of copy number variations. Collective consideration of the results underlines the complexity of the regulation mechanisms of TGRL metabolism and the interest of gene-gene interactions study. Thus, the studies presented herein bring new hypothesis to explore for understanding the pathophysiological mechanisms of severe HTG and to improve molecular diagnosis tools available for phenotype-genotype association studies

Erst kürzlich wurde der Lipolyse-stimulierte Lipoproteinrezeptor (LSR, engl. lipolysis-stimulated lipoprotein receptor) als der zelluläre Oberflächenrezeptor von CDT und Iota-Toxin, zweier Vertreter der Iota-Toxin-Familie der clostridialen Aktin-ADP-ribosylierenden Toxine, identifiziert. In dieser Arbeit sollte geprüft werden, ob CST, ein weiterer Vertreter der Iota-Toxin-Familie, ebenfalls LSR für den Zelleintritt nutzt. Zunächst wurden die Toxinkomponenten CSTa und CSTb erstmals rekombinant hergestellt. Dazu wurden die für CSTa und CSTb codierenden Genabschnitte mittels PCR amplifiziert und anschließend in einen Expressionsvektor kloniert. Als Expressionsvektor wurde in dieser Arbeit der pHis1522-Vektor verwendet. Zur Amplifizierung wurden die Plasmide in E. coli transformiert und anschließend aufgereinigt. Die Proteinexpression erfolgte in B. megaterium, weil dieses Bakterium sich bereits zur Expression anderer clostridialer Toxine bewährt hatte. Zur Aufreinigung der 6xHis-getaggten Proteine wurde die Nickel-Affinitätschromatographie eingesetzt. Als nächstes wurde gezeigt, dass die rekombinant hergestellten Toxinkomponenten CSTa und CSTb biologisch aktiv waren. Dazu wurden CaCo2-Zellen mit CST behandelt und anschließend die Morphologie der Zellen untersucht. CaCo2-Zellen, die mit CSTa und CSTb behandelt wurden, wiesen Vergiftungserscheinungen wie eine typische Zellabrundung auf. Mit dem „Aktin-Nach-ADP-Ribosylierungs-Assay“ und der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung von TRITC-Phalloidin-gefärbtem Aktin wurde gezeigt, dass das rekombinant hergestellte CST Aktin-ADP-ribosylierende Eigenschaften besaß. Nachdem gezeigt war, dass rekombinant hergestelltes CST sich wie ein biologisch aktives, binäres Aktin-ADP-ribosylierendes Toxin verhält, konnte mithilfe der Vergiftung von H1-HeLa(+LSR)-Zellen und nativen H1-HeLa-Zellen, die kein LSR exprimierten, nachgewiesen werden, dass die Wirkung des Toxins LSR-abhängig ist. FACS-Analysen und Kolokalisationsstudien mit Alexa488-gefärbtem CSTb und Antikörper-gefärbtem LSR erbrachten zusätzlich den Beweis, dass CSTb auf der Zelloberfläche an LSR bindet und bei der Aufnahme in die Zellen mit LSR in endozytischen Vesikeln kolokalisiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass das C. spiroforme Toxin (CST) ebenfalls LSR als Rezeptor für den Zelleintritt verwendet.

La lipase pancréatique apparentée de type 2 du cobaye (GPLRP2) hydrolyse une grande variété de substrats lipidiques. Elle montre cependant une sélectivité selon l’organisation supramoléculaire du substrat et la présence de surfactants comme les sels biliaires (NaTDC). Nous avons utilisé la spectroscopie infrarouge (FTIR) pour étudier les interactions entres les phospholipides (DPPC), les surfactants et la GPLRP2 dans des conditions expérimentales proches de celles du tractus digestif. Pour étudier l’étape d’adsorption indépendamment de l’hydrolyse, un variant inactif de GPLRP2 (S152G) a été produit. Diverses dispersions aqueuses de phospholipides ont été préparées : des vésicules multilamellaires (MLV), unilamellaires (LUV) et des micelles mixtes DPPC-surfactant. GPLRP2 hydrolyse le DPPC présent dans des micelles mixtes DPPC-NaTDC mais n’a aucune activité sur le DPPC en phase lamellaire ou présent dans des micelles DPPC-Triton X100. L’analyse par FTIR de l’interaction de GPLRP2 S152G avec le système DPPC-NaTDC montre des changements importants dans le désordre conformationnel et la mobilité des chaînes acyles, la déshydratation de l’interface, l’orientation des têtes polaires et leurs liaisons hydrogène. Aucun effet n’est observé avec les MLV, les LUV ou le système DPPC-Triton X100. Il y a ainsi une reconnaissance spécifique du DPPC dans les micelles mixtes avec les sels biliaires, en accord avec l’activité enzymatique de GPLRP2. Les changements du spectre IR pendant l’hydrolyse du DPPC par la GPLRP2 ont été suivis. Certaines caractéristiques attribuées à la formation de produits de lipolyse peuvent être utilisées pour une étude quantitative de la lipolyse par FTIR. / Guinea pig pancreatic lipase-related protein type 2 (GPLRP2) hydrolyzes a large set of lipid substrates, but displays however some selectivity depending on the supramolecular structure of substrate and the presence of surfactants like bile salts (NaTDC). We used Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy to study the interactions between phospholipids (DPPC), surfactants and GPLRP2 under conditions close to those of the GI tract. To study the adsorption step independently from hydrolysis, a GPLRP2 inactive variant (S152G) was produced. Various phospholipid dispersions were prepared: multilamellar (MLV) and large unilamellar vesicles (LUV) and mixed micelles with surfactants. GPLRP2 was found to hydrolyze DPPC present in mixed DPPC-NaTDC micelles but was inactive on DPPC vesicles and DPPC-Triton X100 micelles. FTIR analysis of GPLRP2 S152G interaction with the DPPC-NaTDC system showed a decrease in the conformational disorder and mobility of the acyl chains, a dehydratation of the interface, and changes in the orientation and H-bonding of DPPC polar head-groups. These effects were not observed with MLV, LUV and DPPC-Triton X100 micelles, thus indicating a specific recognition of DPPC in mixed phospholipid-bile salt micelles, in agreement with phospholipase activity measurements. Changes in the IR spectra during DPPC hydrolysis by GPLRP2 were monitored. Specific spectral features were associated to the production of lipolysis products and could be used for quantifying phospholipid lipolysis by FTIR.

Le récepteur hépatique aux lipoprotéines LSR est impliqué dans la clairance des lipoprotéines riches en triglycérides telles que les résidus de chylomicrons pendant la phase postprandiale. La réduction de l’expression du LSR chez la souris (LSR+/-) est associée à une dyslipidémie et une lipémie postprandiale élevée. Afin de mieux comprendre la régulation de la distribution des lipides alimentaires, nous avons cherché quels étaient les facteurs pouvant affecter le niveau protéique de LSR. La leptine, hormone sécrétée par le tissu adipeux et connue pour son action d’hormone de satiété au niveau du système nerveux central, a été démontrée dans cette thèse comme modulant l’expression de LSR par la régulation de la transcription du gène lsr. La leptine est impliquée dans la régulation de la lipogénèse à travers SREBP-1. Grâce à l’utilisation d’un extrait de Garcinia cambogia contenant un inhibiteur de l’ATP citrate lyase, nous avons démontré une interaction importante entre les enzymes lipogéniques, l’expression de LSR et d’autres récepteurs lipoprotéiques, afin de maintenir un équilibre entre la synthèse de lipides endogènes et l’apport alimentaire de lipides exogènes. Soumises à un régime hyperlipidique, les souris sauvages montrent une diminution de l’expression des enzymes lipogéniques hépatiques, aggravée chez les souris LSR+/-. Ces résultats indiquent qu’il existe un mécanisme de maintien de l’équilibre entre la lipogénèse (synthèse endogène de lipides), la lipolyse (utilisation lipidique comme substrat énergétique) et le stockage de lipides à travers une forte interaction entre les enzymes lipogéniques et LSR. / The hepatic lipoprotein receptor LSR is involved in the clearance of triglyceride-rich lipoproteins including chylomicrons remnants during the post-prandial phase. Reduced LSR protein expression in mice (LSR+/-) is associated with dyslipidemia and increased postprandial lipemia; these mice exhibit increased weight gain with aging or when placed under a high-fat diet. In order to better understand the regulation of the distribution of dietary lipids, we looked for factors that could regulate LSR protein levels. Leptin is a hormone secreted by the adipose tissue that is a centrally-acting satiety factor, and was demonstrated to modulate LSR mRNA and protein expression through the modulation of transcription of the gene lsr. Leptin has been reported be involved in the control of lipogenesis through SREBP-1c. Using Garcinia cambogia extract containing an inhibitor of ATP citrate lyase, we demonstrated that there is an important link between lipogenic enzymes and LSR protein levels and with other lipoprotein receptors that provides the means to maintain a balance between endogenous lipid synthesis and dietary intake of exogenous lipids. When exogenous lipid intake is increased in the form of a high-fat diet, mice exhibited a decrease in hepatic lipogenic enzymes expression, but a deficiency of LSR led to increased lipid content in the peripheral tissues. These results suggest the presence of mechanisms for the maintenance for the balance between lipogenesis (de novo endogenous lipid synthesis), lipolysis (lipids used as energy substrate), and lipid storage through an important link between lipogenic enzymes and LSR.

La réduction des excursions glycémiques postprandiales a été proposée comme un moyen pour limiter le risque de développement du diabète de type 2. L’intérêt s’est donc porté sur les outils nutritionnels susceptibles de moduler la biodisponibilité des glucides et ainsi leur impact sur la glycémie postprandiale. Les travaux réalisés au cours de cette thèse avaient pour but d’étudier les effets de différents ingrédients modifiant la biodisponibilité du glucose, non seulement sur la glycémie postprandiale à court terme (2 heures) mais aussi sur les cinétiques du débit d’apparition et de disparition de glucose (total, exogène et endogène - isotopes stables) et les autres paramètres métaboliques de la phase postprandiale au cours de la journée. Dans la première étude (β-glucanes), nous avons montré que l’addition de fibres β-glucanes à un repas glucidique chez des sujets sains en surpoids ralentit l’absorption du glucose dans le plasma. Ceci a prolongé la réponse insulinique et par conséquent l’inhibition de la lipolyse et de la production endogène de glucose. Dans la deuxième étude (Eurostarch), nous avons montré que la diminution de la biodisponibilité du glucose au petit-déjeuner (amidon lentement digestible, index glycémique bas) diminue l’apparition du glucose exogène dans le plasma et pourrait avoir un effet second-repas chez des sujets sains en surpoids. Mais nous n’avons pas mis en évidence d’amélioration de ces effets métaboliques à plus long terme (5 semaines). Dans la troisième étude présentée (Nutriose), nous avons montré que l’addition de dextrine résistante NUTRIOSE®10 (fermentescible) au petit-déjeuner chez des sujets sains, diminue les réponses glycémiques, insuliniques postprandiales et le profil de ghréline au cours de la journée (en comparaison à une maltodextrine). En parallèle, la prolongation observée de la fermentation et l’oxydation du NUTRIOSE®10 pourraient fournir de l’énergie en phase postprandiale tardive. En conclusion, l’analyse des paramètres métaboliques au-delà de 2 heures après le repas, a permis de mettre en évidence les effets métaboliques à plus long terme de la modulation de l’apparition du glucose dans le plasma (ralentissement, prolongation, réduction) sur les cinétiques du glucose, la réponse insulinique, la lipolyse et l’oxydation des substrats / The reduction of the postprandial glycemic excursions has been proposed as to limit risk of type 2 diabetes. There has been growing interest in the development of dietary ingredients that could potentially modulate carbohydrates bioavailability and thus their impact on postprandial glycemia. The aim of this thesis was to investigate the effects of the the modulation of glucose bioavailability by different ingredients on 2-hour glycemic response but also on glucose kinetics (total, exogenous and endogenous – stable isotopes) and on other daylong metabolic parameters. In the first study (β-glucanes), we showed that the addition of β-glucan fiber to a carbohydrate meal in healthy overweight subjects reduced the appearance of glucose in plasma. As a consequence, insulin response was also prolonged and induced a prolonged inhibition on lipolysis and endogenous glucose production. In the second study (eurostarch), the reduction in glucose availability (slowly available glucose, low GI) at breakfast decreased plasma exogenous glucose appearance and tended to improve glucose control at the subsequent lunch. But we did not observe the improvement of such metabolic effects in the long-term (5 weeks). In the last study, we showed that the addition of a resistant dextrin, NUTRIOSE®10, decreased postprandial glycemic and insulinemic response as well as daylong satiety-related ghrelin profile, compared to maltodextrin. In parallel, the prolonged fermentation and oxidation pattern of NUTRIOSE®10 up to 10 hours after ingestion at breakfast could induced an extended energy release with NUTRIOSE®10 in the late postprandial phase. In conclusion, the follow-up of metabolic parameters beyond 2 hours after the meal have highlighted the longer-term metabolic effects of the modulation of glucose appearance in plasma (delay, extension, reduction) on glucose kinetics, insulin response, lipolysis and nutrients oxidation