Orientadores: Pedro de Alcantara Pessoa Filho, Everson Alves Miranda / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-09T14:49:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Watanabe_ErikaOhta_D.pdf: 2586256 bytes, checksum: af351628a929312bf64c37235f0a8f20 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A precipitação induzida pela adição de sais (¿salting-out¿) é uma operação unitária freqüentemente empregada na purificação de proteínas. Com a adição de sal, a solução aquosa de proteína separa-se em uma fase pobre e um precipitado rico em proteína, sendo este último efetivamente uma mistura da fase sólida formada (a que chamaremos precipitado verdadeiro) e da fase líquida pobre em proteína, já que uma separação completa das fases não pode ser alcançada. A obtenção de dados completos de equilíbrio de fases na precipitação de proteínas ainda é rara, embora a determinação dos diagramas de fase possa contribuir para a caracterização deste precipitado verdadeiro e para uma melhor compreensão do fenômeno de precipitação. Neste trabalho, o equilíbrio de fases da precipitação de lisozima e albumina de soro bovino (BSA) foi estudado através de ensaios de precipitação, nos quais as composições das fases coexistentes foram analisadas. Os ensaios de precipitação de lisozima foram conduzidos utilizando-se sulfato de amônio e sulfato de sódio a diferentes valores de pH (2,0, 4,0, 7,0 e 10,0) e cloreto de sódio a pH 7,0 e o sal volátil carbamato de amônio a 5,0, 15,0 e 25,0°C como agentes precipitantes. A BSA foi precipitada em sulfato de amônio a pH 2,0, 7,0 e 9,0. A composição do precipitado verdadeiro pode ser obtida através da intersecção de extrapolações das linhas de amarração determinadas experimentalmente, técnica de análise cuja utilização extensiva e sistemática foi realizada pela primeira vez neste trabalho. Os diagramas de fases, para o sistema contendo lisozima e sulfato de amônio e sulfato de sódio, mostraram dois tipos de precipitado verdadeiro: um composto de proteína-água e um complexo de proteína, água e sal. Diferentes valores de pH não influenciaram na composição do precipitado verdadeiro. Para os sistemas lisozima-sulfato de amônioágua a pH 7,0 e a 5,0 e 15,0°C, uma região de ¿salting-in¿ na curva de solubilidade pode ser observada. Duas fases correspondentes a diferentes precipitados foram obtidas para as regiões ¿salting-in¿ e ¿salting-out¿. Os sistemas lisozima-cloreto de sódio e lisozima-carbamato de amônio apresentaram um precipitado verdadeiro composto de proteína-água e apenas proteína, respectivamente. A atividade enzimática da lisozima mostrou-se dependente da concentração de sal, enquanto nenhuma desnaturação foi verificada para a lisozima precipitada em carbamato de amônio. Para o sistema contendo BSA, em cada valor de pH utilizado foi obtido um único precipitado verdadeiro cuja composição é dependente do pH / Abstract: Salt induced protein precipitation (¿salting-out¿) is a unit operation commonly used to protein purification. By adding a salt, an aqueous protein solution is forced to undergo a phase separation into a protein-lean liquid phase and a protein rich phase. Nevertheless, as a complete phase separation cannot be achieved, the protein rich phase is actually a mixture of the solid phase (herein called true precipitate) and the protein-lean liquid phase. The determination of equilibrium diagrams can contribute to the characterization of this true precipitate and to the understanding of the phenomena underlying this so widely used technique but, in spite of this, the experimental determination of phase equilibrium diagrams of protein precipitation is scarce. In this work, phase equilibrium of salt-induced precipitation of lysozyme and bovine serum albumin (BSA) was studied through precipitation assays, in which the compositions ofthe coexisting phases were analysed. Lysozyme precipitation experiments were carried out using ammonium sulfate and sodium sulfate at different values of pH (2.0, 4.0, 7.0 e 10.0) and sodium chloride at pH 7.0 and the volatile salt ammonium carbamate at 5.0, 15.0 and 25.0°C as precipitant agents. Precipitation of BSA was carried out in ammonium sulfate solution at pH 2.0, 7.0 and 9.0. The composition of the true precipitate phase was inferred by the intersection of the extensions of the experimentally determined tie-lines ¿ an analysis not previously carried out to such extent. Phase diagrams of lysozyme-ammonium sulfate and sodium sulfate-water showed two different types of precipitate: a salt-free protein-water phase and a proteinrich phase formed by lysozyme, water and salt. No significant difference was observed in the composition of the true precipitate when the pH value is changed. For systems formed by ammonium sulfate at pH 7.0 at 5.0 and 15.0°C, a salting-in region in the solubility curve was observed. Two different true precipitates were found, corresponding to the salting-in and salting-out regions. The systems lysozyme-sodium chloride and lysozyme-ammonium carbamate showed only one true precipitate composed by protein-water and protein, respectively. Lysozyme activity depends on the salt concentration used to protein precipitation, while no protein denaturation was verified in the lysozyme precipitated by ammonium carbamate. Phase diagrams of BSA-salt-water showed only one true precipitate, whose composition depends on the pH studied. / Doutorado / Engenharia de Processos / Doutor em Engenharia Química

Neste trabalho, sondas solvatocrômicas foram empregadas no estudo de solventes puros, misturas aquosas de solventes próticos e apróticos, líquidos iônicos e suas misturas aquosas. As sondas estudadas foram agrupadas em duas séries, cujas mudanças relevantes foram: (i) série RPMBr2: R de metila a 1-octila permitiu a variação da hidrofobicidade da sonda enquanto o pKa se manteve constante; (ii) série de merocianinas derivadas de piridina, quinolina e acridina. Isso resultou em sondas de hidrofobicidades diferentes com valores parecidos de pKa. Desta forma foi possível isolar os efeitos sobre solvatação provocados pela hidrofobicidade das sondas. As duas séries de sondas mostraram comportamentos solvatocrômicos diferentes. Uma equação modificada de Taft-Kamlet-Abboud permitiu as quantificações individuais de cada propriedade do solvente, tais como acidez, dipolaridade/polarizabilidade e hidrofobicidade para a resposta de cada sonda. O modelo de solvatação preferencial que considera explicitamente a presença de três espécies na mistura binária de solvente foi aplicado, este considera que a água, o solvente orgânico e a espécie solvente orgânico-água competem pela camada de solvatação da sonda. Os resultados deste tratamento ajudaram no entendimento das forças atuantes na solvatação, especialmente com relação aos efeitos das propriedades de ambos a sonda e o solvente, e do aumento da temperatura. Estudos preliminares de misturas aquosas de líquidos iônicos mostraram as semelhanças e as diferenças entre a solvatação por estas misturas \"verdes\" e a por misturas aquosas de álcoois. Uma aplicação do solvatocromismo para o entendimento de un fenômeno físco-químico foi apresentada: os resultados da aplicação do modelo de solvatação preferencial de sondas em misturas aquosas de tetrametiluréia foram usados para explicar o fenômeno de gelificação de proteína neste mesmo sistema de solventes. / In the present work, solvatochromic probes were employed in the study of pure solvents, binary mixtures of water with protic and aprotic solvents, ionic liquids and their aqueous binary mixtures The probes studied are classified in two series: (i) RPMBr2; where R = methyl to 1-octyl allowed increasing the hydrophobicity while maintaining the pKa constant. (ii) The second series involved derivatives of pyridine, quinoline and acridine, this allowed increasing probe hydrophobicity, while maintaining similar pKa. The two series of probes showed different solvatochromic behaviors both in pure solvents and binary solvent mixtures. A modified equation of Taft-Kamlet-Abboud allowed quantification of each solvent property, including acidity, dipolarity/polarizability and hydrophobicity to the response of each probe. The preferential solvation model which explicitly considers the presence of three species was employed; it considers the competition of water, organic solvent and the complex water-organic solvent in the probe solvation shell. The results shed light on the interactions that affect solvation, including temperature-induced desolvation. Preliminary results on aqueous ionic liquids showed the similarities and difference between solvation by these \"green\" mixtures and those of aqueous alcohols. An application of solvatochromism for understanding a physical-chemical phenomenon was presented: the results of application of preferential solvation model of probes in aqueous tetramethylurea mixtures was used to explain the gelation of the protein lysozyme in this same solvent system.

Métodos computacionais são usados para gerar estruturas de complexo proteína-ligante e estimar suas afinidades. Esse trabalho investigou como as diferentes representações da flexibilidade proteica afetam as poses obtidas por ancoragem molecular e as afinidades atribuídas a essas poses. Os mutantes L99A e L99A/M102Q da lisozima T4 foram escolhidos como sistemas modelo. Um descritor para predição de afinidades baseado na aproximação de energia de interação linear (LIE) foi parametrizado especificamente para ligantes da lisozima e foi usado para estimar as afinidades. A proteína foi representada como um grupo de estruturas cristalográficas ou de estruturas de trajetória de dinâmica molecular. O campo de força OPLS-AA para modelar a proteína e os ligantes e a aproximação de Born generalizada para modelar o solvente foram empregados. O descritor de afinidades parametrizado resultou em desvios médios entre afinidades experimentais e calculadas de 1,8 kcal/mol para um conjunto de testes. O descritor teve desempenho satisfatório na separação entre poses cristalográficas e poses falso-positivo e na identificação de poses falso-positivo. Experimentos de agrupamento de complexos realizados com o objetivo de reduzir o custo computacional para estimar afinidades apresentaram resultados insatisfatórios. As melhores aproximações da teoria do ligante implícito propostas aqui para estimar afinidades consideram conjuntos de estruturas de receptor com o mesmo peso. Configurações de ligante também apresentam o mesmo peso ou são dominadas por uma única configuração. A representação da flexibilidade requer um tratamento estatístico adequado para estimativa de afinidades. Aqui, a associação entre LIE e a teoria do ligante implícito mostrou-se frutífera. / Computational methods are used to generate protein-ligand complex structures and estimate their binding affinities. This work investigated how different representations of protein flexibility affect poses obtained by molecular docking and the affinities attributed to these poses. T4 lysozyme mutants L99A and L99A/M102Q were chosen as model systems. A descriptor for prediction of affinities based on linear interaction energy (LIE) approximation was parametrized specifically to lysozyme ligands and was used to estimate affinities. The protein was represented as a group of crystal structures or as structures from a molecular dynamics trajectory. OPLS-AA force field was used to model protein and ligands and the Generalized Born approximation was used to model solvent. The parametrized affinity descriptor resulted in average deviations between experimental and calculated affinities of 1.8 kcal/mol for a test set. Descriptor performance was satisfactory in the separation between crystal poses and false-positive ones and in the identification of false-positive poses. Clustering of complexes was tried out to reduce computational cost to estimate affinities, but results were poor. The best approximations to the implicit ligand theory proposed here in order to estimate affinities consider groups of receptor structures with the same weight. Ligand configurations also have the same weight or are dominated by only one configuration. The representation of protein flexibility requires an adequate statistical treatment when used to estimate affinities. Here, the linking between LIE and the implicit ligand theory proved itself useful.

O oxigênio molecular singlete (1O2) é formado em sistemas biológicos e reage com diferentes biomoléculas. Proteínas representam um dos principais alvos de oxidação, devido as suas altas concentrações em organismos. Em pH fisiológico 1O2 reage com His, Tyr, Met, Cys e Trp. Neste trabalho investigamos a oxidação causada pelo 1O2 e a formação de dimerização em uma proteína modelo, a lisozima. A identificação dos principais produtos de oxidação e dimerização foi realizada por sequenciamento de peptídeos através de nano cromatografia acoplada a espectrometria de massas (nLC-MS/MS). A geração de 1O2 foi realizada por fotossensibilização utilizando luz e rosa bengala como fotossensibilizador, e pela decomposição térmica de endoperóxidos derivado do naftaleno DHPN16O2 e DHPN18O2, uma fonte limpa de 1O2 no meio reacional. Os resultados demonstraram que a reação do oxigênio singlete com lisozima acarreta oxidação dos resíduos de Met, His e Trp. A caracterização da estrutura primária por nLC-MS/MS dos aminoácidos confirmou a adição de átomos de oxigênio marcado (18O). A lisozima é constituída apenas de um resíduo de histidina (His15) e as oxidações identificadas foram adições de massas de +14 Da (descrita como 2-oxo-histidina), +16 e +32 Da. Os resíduos de metionina (Met12 e Met105) foram identificados como sulfóxidos (MetSO - adição de massas de +16 Da). Para os resíduos de triptofano foram identificados a formação de quinurenina (adição de massas de +4 Da), +16 e +32 Da. As oxidações levaram a formação de dimerização na proteína caracterizada por eletroforese em gel e nLC-MS/MS. O objetivo principal do trabalho foi analisar a ligação cruzada entre o resíduo de histidina 2-oxohistidina na lisozima. Entretanto, foram identificadas ligações cruzadas entre 2- oxo-histidina e resíduos de lisina, além de ligações cruzadas com resíduos de triptofano oxidado. Em consequência dos resultados obtidos com a proteína modelo, avaliamos as oxidações e formação de dímeros em proteínas extraídas do cristalino do olho bovino. Diferentes tipos de modificações foram observados, além da formação de dímeros entre resíduos de histidina (2-oxoHis-His) caracterizados por nLC-MS/MS e bioinformática. Os dados obtidos neste trabalho, fornecem evidências da ocorrência simultânea de formação de ligações cruzadas entre diferentes proteicas após exposição a 1O2. O trabalho resultou na identificação e sequenciamento através de nLC-MS/MS de peptídeos oxidados por 1O2 a partir de uma proteína modelo. Esses resultados reiteram o importante papel do 1O2 em reações com proteínas além do seu envolvimento no desenvolvimento de condições patológicas. A dimerização formada na ligação cruzada em 2-oxo-His-His representa um possível novo biomarcador para o 1O2 em sistemas biológicos / Singlet molecular oxygen (1O2) can be generated in biological systems, reacting with different biomolecules. Proteins are major target for oxidants due to higher concentration in organisms. At physiological pH, 1O2 may react with the following aminoacids: His, Tyr, Met, Cys and Trp. Here, we investigated oxidation and dimerization reactions of proteins exposed to 1O2 using lysozyme as a model. Modifications of lysozyme by 1O2 were investigated using mass spectrometry approaches. Identification of the main oxidation and dimerization products were performed by peptide sequencing by nano-chromatography coupled to mass spectrometry (nLC-MS/MS). Singlet oxygen was generated using visible light and rose Bengal as photosensitizer, and from the decomposition of thermolabile endoperoxides DHPN16O2 e DHPN18O2, clean sources of 1O2. Experimental findings showed oxidation of Met, His, and Trp residuesin lysozyme. Structural characterization by nLC-MS/MS of the oxidative modifications in lysozyme tryptic peptides showed the addition of [18O]-labeled atoms in different amino acid residues. Lysozyme has in its structure a single histidine residue (His15). We identified shifts of +14 Da (described as oxohistidine), +16 and +32 Da in this residue. Methionine residues (Met12 and Met105) were oxidized to sulfoxides (MetSO mass shift of +16 Da). Modifications in tryptophan residues were identified as kynurenine (shift mass of +4 Da), +16 and + 32 Da. Oxidized lysozyme subjected to SDS-Page showed dimmers formation. The main aim was to analyze cross-linking formation between 2-oxo-histidine residues in lysozyme. However, cross-links between 2- oxo-histidine and lysine residues, and cross-links between oxidized tryptophan residues have been identified. Following results obtained with the protein model, we evaluated oxidation and the dimers formation in proteins extracted from the lens of the bovine eye. Analysis performed in nLC-MS/MS and bioinformatics identified different types of modifications, including formation of dimers with histidine residues (2-oxo-His-His). The data provided evidence for simultaneous occurrence of protein cross-linking on exposure 1O2. These results demonstrated the important role of 1O2 in protein reactions beyond its involvement in developing of pathological conditions. In conclusion, dimerization of proteins through 2-oxo-His residues may be a possible new biomarker for 1O2 in biological systems.

O oxigênio molecular singlete (1O2) é formado em sistemas biológicos e reage com diferentes biomoléculas. Proteínas representam um dos principais alvos de oxidação, devido as suas altas concentrações em organismos. Em pH fisiológico 1O2 reage com His, Tyr, Met, Cys e Trp. Neste trabalho investigamos a oxidação causada pelo 1O2 e a formação de dimerização em uma proteína modelo, a lisozima. A identificação dos principais produtos de oxidação e dimerização foi realizada por sequenciamento de peptídeos através de nano cromatografia acoplada a espectrometria de massas (nLC-MS/MS). A geração de 1O2 foi realizada por fotossensibilização utilizando luz e rosa bengala como fotossensibilizador, e pela decomposição térmica de endoperóxidos derivado do naftaleno DHPN16O2 e DHPN18O2, uma fonte limpa de 1O2 no meio reacional. Os resultados demonstraram que a reação do oxigênio singlete com lisozima acarreta oxidação dos resíduos de Met, His e Trp. A caracterização da estrutura primária por nLC-MS/MS dos aminoácidos confirmou a adição de átomos de oxigênio marcado (18O). A lisozima é constituída apenas de um resíduo de histidina (His15) e as oxidações identificadas foram adições de massas de +14 Da (descrita como 2-oxo-histidina), +16 e +32 Da. Os resíduos de metionina (Met12 e Met105) foram identificados como sulfóxidos (MetSO - adição de massas de +16 Da). Para os resíduos de triptofano foram identificados a formação de quinurenina (adição de massas de +4 Da), +16 e +32 Da. As oxidações levaram a formação de dimerização na proteína caracterizada por eletroforese em gel e nLC-MS/MS. O objetivo principal do trabalho foi analisar a ligação cruzada entre o resíduo de histidina 2-oxohistidina na lisozima. Entretanto, foram identificadas ligações cruzadas entre 2- oxo-histidina e resíduos de lisina, além de ligações cruzadas com resíduos de triptofano oxidado. Em consequência dos resultados obtidos com a proteína modelo, avaliamos as oxidações e formação de dímeros em proteínas extraídas do cristalino do olho bovino. Diferentes tipos de modificações foram observados, além da formação de dímeros entre resíduos de histidina (2-oxoHis-His) caracterizados por nLC-MS/MS e bioinformática. Os dados obtidos neste trabalho, fornecem evidências da ocorrência simultânea de formação de ligações cruzadas entre diferentes proteicas após exposição a 1O2. O trabalho resultou na identificação e sequenciamento através de nLC-MS/MS de peptídeos oxidados por 1O2 a partir de uma proteína modelo. Esses resultados reiteram o importante papel do 1O2 em reações com proteínas além do seu envolvimento no desenvolvimento de condições patológicas. A dimerização formada na ligação cruzada em 2-oxo-His-His representa um possível novo biomarcador para o 1O2 em sistemas biológicos / Singlet molecular oxygen (1O2) can be generated in biological systems, reacting with different biomolecules. Proteins are major target for oxidants due to higher concentration in organisms. At physiological pH, 1O2 may react with the following aminoacids: His, Tyr, Met, Cys and Trp. Here, we investigated oxidation and dimerization reactions of proteins exposed to 1O2 using lysozyme as a model. Modifications of lysozyme by 1O2 were investigated using mass spectrometry approaches. Identification of the main oxidation and dimerization products were performed by peptide sequencing by nano-chromatography coupled to mass spectrometry (nLC-MS/MS). Singlet oxygen was generated using visible light and rose Bengal as photosensitizer, and from the decomposition of thermolabile endoperoxides DHPN16O2 e DHPN18O2, clean sources of 1O2. Experimental findings showed oxidation of Met, His, and Trp residuesin lysozyme. Structural characterization by nLC-MS/MS of the oxidative modifications in lysozyme tryptic peptides showed the addition of [18O]-labeled atoms in different amino acid residues. Lysozyme has in its structure a single histidine residue (His15). We identified shifts of +14 Da (described as oxohistidine), +16 and +32 Da in this residue. Methionine residues (Met12 and Met105) were oxidized to sulfoxides (MetSO mass shift of +16 Da). Modifications in tryptophan residues were identified as kynurenine (shift mass of +4 Da), +16 and + 32 Da. Oxidized lysozyme subjected to SDS-Page showed dimmers formation. The main aim was to analyze cross-linking formation between 2-oxo-histidine residues in lysozyme. However, cross-links between 2- oxo-histidine and lysine residues, and cross-links between oxidized tryptophan residues have been identified. Following results obtained with the protein model, we evaluated oxidation and the dimers formation in proteins extracted from the lens of the bovine eye. Analysis performed in nLC-MS/MS and bioinformatics identified different types of modifications, including formation of dimers with histidine residues (2-oxo-His-His). The data provided evidence for simultaneous occurrence of protein cross-linking on exposure 1O2. These results demonstrated the important role of 1O2 in protein reactions beyond its involvement in developing of pathological conditions. In conclusion, dimerization of proteins through 2-oxo-His residues may be a possible new biomarker for 1O2 in biological systems.

O trabalho ora apresentado foi concebido como tendo dois objetivos. O primeiro, mais geral, foi implementar uma nova metodologia para o estudo de mudanças conformacionais em proteínas, ou seja, de sua dinâmica estrutural. A técnica de marcação de spin sítio dirigida aliada à ressonância paramagnética eletrônica (SDSL-RPE) são os pilares desse novo método que faz, agora, parte do conjunto de técnicas disponíveis no Grupo de Biofísica Molecular Sérgio Mascarenhas do Instituto de Física de São Carlos (USP). O segundo objetivo, mais específico, representou o caminho efetivamente tomado para que se alcançasse o objetivo geral. Para isso, foi proposto o estudo da correlação estrutura e função de dois sistemas biológicos muito interessantes. O primeiro deles envolveu o estudo do movimento das hélices que compõem a estrutura da proteína ligante de cálcio S100A12 humana (HS100A12) induzido pelos íons cálcio e zinco. Sabendo que a proteína S100A12 humana além de ligar íons Ca+2, apresenta afinidade por outros metais divalentes, como os íons Zn+2 e Cu+2, e que a formação de diferentes oligômeros da proteína é governada pela concentração dos íons Ca+2 e Zn+2, realizamos estudos espectroscópicos utilizando a técnica de dicroísmo circular a fim de investigarmos a estabilidade térmica da proteína HS100A12 na presença e ausência dos íons cálcio e zinco. Mudanças conformacionais na estrutura da HS100A12 foram monitoradas através da construção de uma série de mutantes (simples e duplos) em que resíduos nas hélices B, C e D foram trocados por cisteínas, subsequentemente marcadas com a sonda magnética MTSSL e submetidas às análises de SDSL-RPE. Estas consistiram na medida do espectro de RPE dos vários mutantes em temperatura ambiente para estudarmos os efeitos da presença dos íons sobre a dinâmica experimentada pela sonda nas diversas posições. Além disso, efetuamos medidas de distância entre duas sondas seletivamente inseridas na estrutura protéica, procurando assim complementar o entendimento acerca do efeito da presença dos íons sobre a proteína. Por fim, devido ao fato da proteína HS100A12 estar envolvida em alguns eventos de sinalização celular e interação com o receptor para produtos de glicosilação (RAGE), decidimos também, estudar a interação da proteína com modelos de biomembranas, utilizando monocamadas de Langmuir. O outro problema de interesse utilizou a lizosima do fago T4, uma proteína padrão, da qual uma variedade de mutantes é produzida rotineiramente a fim de obtermos mais detalhes a respeito da sua correlação estrutura e função e tornar mais sólido o entendimento da técnica SDSL. Inicialmente, realizamos um estudo com a suposta criação de uma cavidade no \"core\" hidrofóbico da porção C-terminal da enzima, quando mutamos a Leu 133 por Ala e/ou Gly, ou seja, quando trocamos um resíduo grande por um de menor volume, pois se acredita que a proteína sofra um reajuste estrutural com o intuito de preencher o espaço vazio criado por essa substituição. Para isso, propusemos estudar por SDSL o movimento da α-hélice H inserindo o marcador de spin na posição vizinha ao resíduo mutado. Adicionalmente, realizamos um experimento de \"transmutação\" com a enzima T4L, a fim de investigar a natureza das contribuições para os diferentes modos dinâmicos experimentados pelo marcador de spin quando introduzido em sítios topologicamente semelhantes. / The work presented here was conceived with two main objectives. The first one, more general, involved the implementation of a new methodology for the study of conformational changes in proteins, i.e., its structural dynamics. The technique of Site-directed Spin Labeling combined with Electronic Paramagnetic Resonance (SDSL-EPR) are the pillars of this new method, which is now part of the set of techniques available at the Grupo de Biofísica Molecular Sérgio Mascarenhas, Instituto de Física de São Carlos (USP). The second objective, more specific, represented the path actually taken to achieve the overall goal. Therefore, it was proposed to study the structure-function correlation in two interesting biological systems. The first involved the study of the movement of the helices that form the structure of the human calcium binding protein S100A12 (HS100A12) induced by calcium and zinc ions. Knowing that, besides Ca+2, human S100A12 has also affinity for other divalent metals, such as Zn+2 and Cu+2 ions, and that the formation of different protein oligomers is governed by the concentration of Ca+2 and Zn+2, we performed spectroscopic studies using circular dichroism (CD) to investigate the thermal stability of protein HS100A12 in the presence and absence of calcium and zinc. Conformational changes in the structure of HS100A12 were monitored by producing a series of mutants (singles and doubles) in which residues in helices B, C and D were replaced by cysteine and subsequently labeled with a magnetic probe MTSSL and then analyzed via SDSL-EPR. The latter consisted of the EPR spectra measurement of many mutants at room temperature to study the effects of the presence of ions on the dynamics experienced by the probe in different positions. In addition, we performed measurements of the distance between two probes inserted in the protein structure, thereby, seeking to improve the understanding of the effect of the ions presence on the protein. Finally, due to the fact that HS100A12 is involved in some events of cell signaling and interaction with the Receptor for Advanced Glycation End Products (RAGE), we also decided to study the interaction of protein with models of biomembranes using Langmuir monolayers. In the other problem of interest, we used a variety of mutants of the enzyme T4 lysozyme, a protein standard, in order to obtain more details about its structure-function correlation and make more solid the understanding of SDSL technique. Initially, we conducted a study about the alleged creation of a cavity in the hydrophobic C-terminal portion of the enzyme, when we replaced the Leu 133 by Ala and/or Gly, or when we changed a large residue for a smaller one, because it is believed that the protein undergoes a structural adjustment in order to fill the gap created by this substitution. For this, we studied by SDSL the α-helix H motion, inserting the spin label in a neighbor position of the mutated residue. Additionally, we performed an experiment of \"transmutation\" with the enzyme T4L in order to investigate the nature of contributions for different dynamic modes experienced by the spin label when it is introduced in topologically similar sites.

Neste trabalho, sondas solvatocrômicas foram empregadas no estudo de solventes puros, misturas aquosas de solventes próticos e apróticos, líquidos iônicos e suas misturas aquosas. As sondas estudadas foram agrupadas em duas séries, cujas mudanças relevantes foram: (i) série RPMBr2: R de metila a 1-octila permitiu a variação da hidrofobicidade da sonda enquanto o pKa se manteve constante; (ii) série de merocianinas derivadas de piridina, quinolina e acridina. Isso resultou em sondas de hidrofobicidades diferentes com valores parecidos de pKa. Desta forma foi possível isolar os efeitos sobre solvatação provocados pela hidrofobicidade das sondas. As duas séries de sondas mostraram comportamentos solvatocrômicos diferentes. Uma equação modificada de Taft-Kamlet-Abboud permitiu as quantificações individuais de cada propriedade do solvente, tais como acidez, dipolaridade/polarizabilidade e hidrofobicidade para a resposta de cada sonda. O modelo de solvatação preferencial que considera explicitamente a presença de três espécies na mistura binária de solvente foi aplicado, este considera que a água, o solvente orgânico e a espécie solvente orgânico-água competem pela camada de solvatação da sonda. Os resultados deste tratamento ajudaram no entendimento das forças atuantes na solvatação, especialmente com relação aos efeitos das propriedades de ambos a sonda e o solvente, e do aumento da temperatura. Estudos preliminares de misturas aquosas de líquidos iônicos mostraram as semelhanças e as diferenças entre a solvatação por estas misturas \"verdes\" e a por misturas aquosas de álcoois. Uma aplicação do solvatocromismo para o entendimento de un fenômeno físco-químico foi apresentada: os resultados da aplicação do modelo de solvatação preferencial de sondas em misturas aquosas de tetrametiluréia foram usados para explicar o fenômeno de gelificação de proteína neste mesmo sistema de solventes. / In the present work, solvatochromic probes were employed in the study of pure solvents, binary mixtures of water with protic and aprotic solvents, ionic liquids and their aqueous binary mixtures The probes studied are classified in two series: (i) RPMBr2; where R = methyl to 1-octyl allowed increasing the hydrophobicity while maintaining the pKa constant. (ii) The second series involved derivatives of pyridine, quinoline and acridine, this allowed increasing probe hydrophobicity, while maintaining similar pKa. The two series of probes showed different solvatochromic behaviors both in pure solvents and binary solvent mixtures. A modified equation of Taft-Kamlet-Abboud allowed quantification of each solvent property, including acidity, dipolarity/polarizability and hydrophobicity to the response of each probe. The preferential solvation model which explicitly considers the presence of three species was employed; it considers the competition of water, organic solvent and the complex water-organic solvent in the probe solvation shell. The results shed light on the interactions that affect solvation, including temperature-induced desolvation. Preliminary results on aqueous ionic liquids showed the similarities and difference between solvation by these \"green\" mixtures and those of aqueous alcohols. An application of solvatochromism for understanding a physical-chemical phenomenon was presented: the results of application of preferential solvation model of probes in aqueous tetramethylurea mixtures was used to explain the gelation of the protein lysozyme in this same solvent system.

Made available in DSpace on 2016-04-28T14:16:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Deisy Sunae Kawakami.pdf: 1635094 bytes, checksum: 5d5d31d4bb4c5d53e805055a8ef4dbc0 (MD5) Previous issue date: 2009-10-13 / Secretaria da Educação do Estado de São Paulo / On the turn of the twentieth century, several scientists were investigating infectious diseases. The aim of this research is to rebuild the path followed by Alexander Fleming (1881-1955) in his studies on microbiology, from 1908 to 1921, when he identified an enzyme related to the natural immunology of living beings. This dissertation contains an introduction and five chapters. Chapter 1 deals with Fleming s first bacteriological investigations, in cooperation with Almroth Wright (1861-1947). Besides that, it deals with Fleming s prescriptions for skin infections. Chapter 2 analyses Fleming´s contributions concerning the SALVARSAN therapy. Chapter 3 presents Fleming´s research on the treatment of infected injures got during the First World War, as well as, the experiments on microorganisms performed by him. Chapter 4 describes Fleming s research on secretions and tissues, concerning the identification of an important enzyme related to the natural immunology. Chapter 5 provides some final remarks on the subject. This study showed that Fleming was very cautious in methodological terms. It led to the conclusion that although Fleming had been trained under Wright and several of his contributions were part of a collective work, this was not the case concerning the identification of lysozyme. This Fleming´s original contribution changes the view that was accepted at that time / Na virada do século XX, diversos cientistas estavam investigando as doenças infecciosas. O objetivo desta pesquisa é reconstruir o percurso seguido por Alexander Fleming (1881-1955) em seus estudos de microbiologia, desde 1908 até 1921, quando ele identificou a lisosima, uma enzima relacionada à imunologia natural dos seres vivos. Essa dissertação contém uma introdução e cinco capítulos. O capítulo 1 trata do período em que Fleming iniciou suas investigações bacteriológicas ao lado de Wright, e o que prescreveu para o tratamento de infecções da pele. O capítulo 2 analisa as contribuições de Fleming relacionadas ao tratamento da sífilis, no que se refere à metodologia empregada na administração do Salvarsan. O capítulo 3 discute as pesquisas para o tratamento de feridas infectadas durante a Primeira Guerra Mundial, bem como, os experimentos realizados por Fleming para detectar os microrganismos presentes. O capítulo 4 descreve as pesquisas de Fleming em secreções e tecidos e a identificação de uma importante enzima relacionada à imunologia natural. O capítulo 5 apresenta algumas considerações finais sobre o assunto. Esse estudo levou à conclusão de que Fleming era meticuloso sob o ponto de vista metodológico. Além disso, embora ele tivesse sido treinado por Almroth Wright, ao contrário de suas outras contribuições no período que resultaram de um trabalho coletivo, a lisosima foi uma contribuição original de Fleming. Esta contribuição foi significativa e modificou a visão que se tinha na época sobre o assunto

O trabalho ora apresentado foi concebido como tendo dois objetivos. O primeiro, mais geral, foi implementar uma nova metodologia para o estudo de mudanças conformacionais em proteínas, ou seja, de sua dinâmica estrutural. A técnica de marcação de spin sítio dirigida aliada à ressonância paramagnética eletrônica (SDSL-RPE) são os pilares desse novo método que faz, agora, parte do conjunto de técnicas disponíveis no Grupo de Biofísica Molecular Sérgio Mascarenhas do Instituto de Física de São Carlos (USP). O segundo objetivo, mais específico, representou o caminho efetivamente tomado para que se alcançasse o objetivo geral. Para isso, foi proposto o estudo da correlação estrutura e função de dois sistemas biológicos muito interessantes. O primeiro deles envolveu o estudo do movimento das hélices que compõem a estrutura da proteína ligante de cálcio S100A12 humana (HS100A12) induzido pelos íons cálcio e zinco. Sabendo que a proteína S100A12 humana além de ligar íons Ca+2, apresenta afinidade por outros metais divalentes, como os íons Zn+2 e Cu+2, e que a formação de diferentes oligômeros da proteína é governada pela concentração dos íons Ca+2 e Zn+2, realizamos estudos espectroscópicos utilizando a técnica de dicroísmo circular a fim de investigarmos a estabilidade térmica da proteína HS100A12 na presença e ausência dos íons cálcio e zinco. Mudanças conformacionais na estrutura da HS100A12 foram monitoradas através da construção de uma série de mutantes (simples e duplos) em que resíduos nas hélices B, C e D foram trocados por cisteínas, subsequentemente marcadas com a sonda magnética MTSSL e submetidas às análises de SDSL-RPE. Estas consistiram na medida do espectro de RPE dos vários mutantes em temperatura ambiente para estudarmos os efeitos da presença dos íons sobre a dinâmica experimentada pela sonda nas diversas posições. Além disso, efetuamos medidas de distância entre duas sondas seletivamente inseridas na estrutura protéica, procurando assim complementar o entendimento acerca do efeito da presença dos íons sobre a proteína. Por fim, devido ao fato da proteína HS100A12 estar envolvida em alguns eventos de sinalização celular e interação com o receptor para produtos de glicosilação (RAGE), decidimos também, estudar a interação da proteína com modelos de biomembranas, utilizando monocamadas de Langmuir. O outro problema de interesse utilizou a lizosima do fago T4, uma proteína padrão, da qual uma variedade de mutantes é produzida rotineiramente a fim de obtermos mais detalhes a respeito da sua correlação estrutura e função e tornar mais sólido o entendimento da técnica SDSL. Inicialmente, realizamos um estudo com a suposta criação de uma cavidade no \"core\" hidrofóbico da porção C-terminal da enzima, quando mutamos a Leu 133 por Ala e/ou Gly, ou seja, quando trocamos um resíduo grande por um de menor volume, pois se acredita que a proteína sofra um reajuste estrutural com o intuito de preencher o espaço vazio criado por essa substituição. Para isso, propusemos estudar por SDSL o movimento da α-hélice H inserindo o marcador de spin na posição vizinha ao resíduo mutado. Adicionalmente, realizamos um experimento de \"transmutação\" com a enzima T4L, a fim de investigar a natureza das contribuições para os diferentes modos dinâmicos experimentados pelo marcador de spin quando introduzido em sítios topologicamente semelhantes. / The work presented here was conceived with two main objectives. The first one, more general, involved the implementation of a new methodology for the study of conformational changes in proteins, i.e., its structural dynamics. The technique of Site-directed Spin Labeling combined with Electronic Paramagnetic Resonance (SDSL-EPR) are the pillars of this new method, which is now part of the set of techniques available at the Grupo de Biofísica Molecular Sérgio Mascarenhas, Instituto de Física de São Carlos (USP). The second objective, more specific, represented the path actually taken to achieve the overall goal. Therefore, it was proposed to study the structure-function correlation in two interesting biological systems. The first involved the study of the movement of the helices that form the structure of the human calcium binding protein S100A12 (HS100A12) induced by calcium and zinc ions. Knowing that, besides Ca+2, human S100A12 has also affinity for other divalent metals, such as Zn+2 and Cu+2 ions, and that the formation of different protein oligomers is governed by the concentration of Ca+2 and Zn+2, we performed spectroscopic studies using circular dichroism (CD) to investigate the thermal stability of protein HS100A12 in the presence and absence of calcium and zinc. Conformational changes in the structure of HS100A12 were monitored by producing a series of mutants (singles and doubles) in which residues in helices B, C and D were replaced by cysteine and subsequently labeled with a magnetic probe MTSSL and then analyzed via SDSL-EPR. The latter consisted of the EPR spectra measurement of many mutants at room temperature to study the effects of the presence of ions on the dynamics experienced by the probe in different positions. In addition, we performed measurements of the distance between two probes inserted in the protein structure, thereby, seeking to improve the understanding of the effect of the ions presence on the protein. Finally, due to the fact that HS100A12 is involved in some events of cell signaling and interaction with the Receptor for Advanced Glycation End Products (RAGE), we also decided to study the interaction of protein with models of biomembranes using Langmuir monolayers. In the other problem of interest, we used a variety of mutants of the enzyme T4 lysozyme, a protein standard, in order to obtain more details about its structure-function correlation and make more solid the understanding of SDSL technique. Initially, we conducted a study about the alleged creation of a cavity in the hydrophobic C-terminal portion of the enzyme, when we replaced the Leu 133 by Ala and/or Gly, or when we changed a large residue for a smaller one, because it is believed that the protein undergoes a structural adjustment in order to fill the gap created by this substitution. For this, we studied by SDSL the α-helix H motion, inserting the spin label in a neighbor position of the mutated residue. Additionally, we performed an experiment of \"transmutation\" with the enzyme T4L in order to investigate the nature of contributions for different dynamic modes experienced by the spin label when it is introduced in topologically similar sites.

Métodos computacionais são usados para gerar estruturas de complexo proteína-ligante e estimar suas afinidades. Esse trabalho investigou como as diferentes representações da flexibilidade proteica afetam as poses obtidas por ancoragem molecular e as afinidades atribuídas a essas poses. Os mutantes L99A e L99A/M102Q da lisozima T4 foram escolhidos como sistemas modelo. Um descritor para predição de afinidades baseado na aproximação de energia de interação linear (LIE) foi parametrizado especificamente para ligantes da lisozima e foi usado para estimar as afinidades. A proteína foi representada como um grupo de estruturas cristalográficas ou de estruturas de trajetória de dinâmica molecular. O campo de força OPLS-AA para modelar a proteína e os ligantes e a aproximação de Born generalizada para modelar o solvente foram empregados. O descritor de afinidades parametrizado resultou em desvios médios entre afinidades experimentais e calculadas de 1,8 kcal/mol para um conjunto de testes. O descritor teve desempenho satisfatório na separação entre poses cristalográficas e poses falso-positivo e na identificação de poses falso-positivo. Experimentos de agrupamento de complexos realizados com o objetivo de reduzir o custo computacional para estimar afinidades apresentaram resultados insatisfatórios. As melhores aproximações da teoria do ligante implícito propostas aqui para estimar afinidades consideram conjuntos de estruturas de receptor com o mesmo peso. Configurações de ligante também apresentam o mesmo peso ou são dominadas por uma única configuração. A representação da flexibilidade requer um tratamento estatístico adequado para estimativa de afinidades. Aqui, a associação entre LIE e a teoria do ligante implícito mostrou-se frutífera. / Computational methods are used to generate protein-ligand complex structures and estimate their binding affinities. This work investigated how different representations of protein flexibility affect poses obtained by molecular docking and the affinities attributed to these poses. T4 lysozyme mutants L99A and L99A/M102Q were chosen as model systems. A descriptor for prediction of affinities based on linear interaction energy (LIE) approximation was parametrized specifically to lysozyme ligands and was used to estimate affinities. The protein was represented as a group of crystal structures or as structures from a molecular dynamics trajectory. OPLS-AA force field was used to model protein and ligands and the Generalized Born approximation was used to model solvent. The parametrized affinity descriptor resulted in average deviations between experimental and calculated affinities of 1.8 kcal/mol for a test set. Descriptor performance was satisfactory in the separation between crystal poses and false-positive ones and in the identification of false-positive poses. Clustering of complexes was tried out to reduce computational cost to estimate affinities, but results were poor. The best approximations to the implicit ligand theory proposed here in order to estimate affinities consider groups of receptor structures with the same weight. Ligand configurations also have the same weight or are dominated by only one configuration. The representation of protein flexibility requires an adequate statistical treatment when used to estimate affinities. Here, the linking between LIE and the implicit ligand theory proved itself useful.