Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-04-06T17:12:29Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 8546769 bytes, checksum: 7fd16dd088a3282426027253e609f398 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-06T17:12:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 8546769 bytes, checksum: 7fd16dd088a3282426027253e609f398 (MD5) Previous issue date: 2017-10-30 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / β-lactoglobulina (BLG) é uma proteína presente no soro de leite, com propriedades emulsificantes, nutricionais e de transporte, amplamente utilizada como ingrediente. Esta proteína tem um ponto isoelétrico (PI) baixo, o que permite a sua interação eletrostática com proteínas de alto PI, como a lisozima (LIS), uma proteína da clara de ovo. Essas proteínas são usadas como emulsificantes, de forma a aumentar a estabilidade cinética de emulsões. A estabilidade das emulsões é afetada pela composição das fases contínua e dispersa. Emulsões óleo em água (O/A) de misturas de LIS e BLG foram avaliadas quanto ao efeito do pH e da adição de sal nas suas propriedades emulsificantes (tamanho, potencial ζ, floculação, concentração e composição interfacial proteica) e estabilidade cinética. Posteriormente, emulsões multicamadas formadas por uma emulsão primária de BLG ou LIS, seguida da adição de uma segunda camada de BLG, LIS ou pectina, com carga inversa, foram obtidas e avaliadas quanto a suas propriedades de emulsificação (floculação, diâmetro hidrodinâmico médio e potencial ζ) e estabilidade cinética. Emulsões formadas pelas proteínas puras apresentaram diâmetros menores. A BLG apresentou uma adsorção preferencial na interface em relação a LIS. O pH influenciou principalmente a carga superficial de emulsões, o que afetou a interação entre proteínas, o tamanho final e a estabilidade de emulsões. O aumento da força iônica influenciou negativamente a estabilidade das emulsões formadas pela mistura das proteínas, levando a um aumento dos tamanhos das gotículas, com posterior separação macroscópica de fases. As emulsões estabilizadas por múltiplas camadas, contendo pectina, apresentaram menores diâmetros e maior potencial ζ, em comparação com emulsões formadas apenas por proteínas. A adição de pectina, um polímero carregado e estabilizante, favoreceu a resistência de emulsões multicamadas ao armazenamento e à adição de NaCl. As emulsões podem ser usadas para dispersar compostos lipofílicos, como o β-caroteno (BC), que pode ainda interagir com as proteínas da interface, aumentando a capacidade de carreamento da emulsão. A interação de BLG e LIS com BC foi determinada por meio de espectroscopia de fluorescência, de forma a explorar a possibilidade de uso dessas proteínas em sistemas para a incorporação desse composto. A fluorescência da LIS e BLG foi suprimida pela presença do BC por um processo de supressão estático. As constantes de velocidade de supressão e as constantes de interação calculadas indicaram o mecanismo de supressão estática e a força de ligação média. A capacidade de ligação do BC a BLG diminui significativamente (p<0,05) com a desnaturação, indicando uma inativação parcial dos sítios de ligação. Esses resultados são importantes para embasar o uso dessas proteínas para incorporação do BC em alimentos, o que pode ser alcançado utilizando emulsões simples ou multicamadas de até duas camadas, utilizando pectina. / β-lactoglobulin (BLG) is a protein present in whey, with emulsifying, nutritional and transport properties, widely used as an ingredient. It has a low isoelectric point (IEP), which allows its electrostatic interaction with high IEP proteins, such as lysozyme (LYS), an egg white protein with high IEP. These proteins can be used as emulsifiers in order to increase the kinetic stability of emulsions. The stability of the emulsions is affected by continuous and dispersed phase composition. Oil-in-water (O/W) emulsions of LYS and BLG mixtures were evaluated for the effect of pH and salt addition on their emulsifying properties (oil droplet size and potencial ζ, flocculation, protein concentration and interfacial composition) and kinetic stability. Subsequently, multilayer emulsions formed by a primary emulsion of BLG or LYS, followed by the addition of a second layer of BLG, LYS or pectin, with reverse charge, were obtained and also evaluated for their emulsification properties and kinetic stability. Emulsions formed by pure proteins showed smaller diameters. BLG showed a preferential adsorption at the interface comparing to LYS. The pH mainly influenced the surface charge of emulsions, which affected the interaction between proteins, final size and stability of emulsions. The increase in ionic strength negatively influenced the stability of the emulsions formed by the mixture of proteins, leading to an increase in droplet size, with subsequent macroscopic phase separation. The multilayer stabilized emulsions containing pectin had smaller diameters and higher potential ζ, compared to multilayer emulsions formed only by proteins. The addition of pectin, a charged polymer and stabilizer, favored the resistance of multilayer emulsions to the storage and addition of NaCl. Emulsions, composed of two slightly soluble phases, can be used to disperse lipophilic compounds, such as β-carotene (BC), which may further interact with interface proteins, increasing the emulsion load capacity. The interaction of BLG and LYS with BC was determined by fluorescence spectroscopy in order to explore the possibility of using emulsified systems containing those proteins in the incorporation of this compound. The quenching rate constants and binding constants calculated indicated the static quenching mechanism and medium binding force. The binding ability of the BC to both proteins decreased significantly (p<0.05) with denaturation, indicating partial inactivation of the binding sites. Those results are important to support the use of proteins for incorporation of BC in foods, which can be used using single or multilayer emulsions up to two layers, using pectin.

Os compostos antimicrobianos naturais são um tema de grande interesse devido ao aumento da demanda por alimentos seguros e de alta qualidade. A utilização de lipossomas é uma alternativa interessante para proteger antimicrobianos nos alimentos, além de fornecer compostos naturais de liberação controlada. Os lipossomas revestidos com polissacarídeos apresentam melhor estabilidade, representando uma alternativa aos lipossomas convencionais. Inicialmente, os nanolipossomas que encapsulam a nisina foram preparados com fosfatidilcolina de soja (PC) e pectina ou ácido poligalacturônico. Os lipossomas desenvolvidos apresentaram alta eficiência de encapsulação, baixo índice de polidispersão e foram estáveis durante 21 dias a 7 °C e 25 °C. A atividade antimicrobiana foi observada contra cinco cepas diferentes de Listeria em placas de ágar de leite, com uma melhor eficiência contra L. innocua 6a. Em um segundo momento, as características estruturais dos lipossomas foram estudadas por dispersão de raios-X de pequeno ângulo (SAXS) e as amostras foram submetidas a ciclos de temperatura (20-60 °C). Para isso, os lipossomas foram desenvolvidos contendo pectina ou ácido poligalacturônico pelos métodos de hidratação de filme e evaporação em fase reversa, para encapsular nisina. A análise de SAXS confirmou a presença de estruturas lamelares em todas as amostras. Além disso, parte da estrutura multilamelar tornou-se cúbica, provavelmente devido à presença de nisina nos lipossomas. A adição de polissacarídeos mostrou diferenças entre as fases cúbicas formadas. Em última análise, a mistura de lisozima e nisina foi encapsulada em lipossomas contendo polissacarídeos. O diâmetro médio dos lipossomas foi de 85,6 e variou para 77,3 e 79,9 nm com a incorporação de pectina ou ácido poligalacturônico, respectivamente. O potencial zeta dos lipossomas com polissacarídeos foi de cerca de -30 mV, mostrando alta eficiência de encapsulação. A atividade antimicrobiana foi avaliada a 37 °C, mostrando que a PC-pectina reduziu a população de L. monocytogenes em 2 log UFC/mL e 5 log UFC/mL em leite integral e desnatado, respectivamente. Em refrigeração, a PC-pectina reduziu a população de L. monocytogenes para quase zero por até 25 dias em leite desnatado. Portanto, pode dizer-se que os lipossomas que contêm polissacarídeos podem ser uma tecnologia promissora para o encapsulamento da lisozima e nisina. Além disso, a existência de estrutura cúbica nos lipossomas pode proporcionar liberação controlada de antimicrobianos. / Natural antimicrobial compounds are a topic of utmost interest due to the increased demand for safe and high-quality foods. The use of liposomes is an interesting alternative to protect antimicrobials in food, also providing controlled release natural compounds. Polysaccharides coated liposomes present better stability, representing an alternative to conventional liposomes. Initially, nanoliposomes encapsulating nisin were prepared with soy phosphatidylcholine (PC) and pectin or polygalacturonic acid. The liposomes developed presented high encapsulation efficiency, low polydispersity index, and were stable for 21 days at 7°C and 25°C. The antimicrobial activity was observed against five different strains of Listeria in milk-agar plates, with a better efficiency against L. innocua 6a. In a second moment, structural characteristics of liposomes were studied by small angle X-ray scattering (SAXS) and the samples were submitted to temperature cycles (20-60°C). For this, liposomes were developed containing pectin or polygalacturonic acid by the thin-film hydration method and reverse phase evaporation method for nisin encapsulation. The analysis of SAXS confirmed the presence of lamellar structures in all the samples. In addition, part of the multilamellar structure became cubic, probably due to the presence of nisin in the liposomes. The addition of polysaccharides showed differences between the cubic phases formed. Ultimately, the mixture of lysozyme and nisin were encapsulated in liposomes containing polysaccharides. The mean diameter of the liposomes was 85.6 and varied to 77.3 and 79.9 nm with the incorporation of pectin or polygalacturonic acid, respectively. The zeta potential of liposomes with polysaccharides were around -30 mV, showing high encapsulation efficiency. The antimicrobial activity was assessed at 37 °C, showing that PC-pectin reduced the population of L. monocytogenes to 2 log CFU/mL and 5 log CFU/mL in whole and skim milk, respectively. At under refrigeration, PC-pectin reduced the population of L. monocytogenes to almost zero for up to 25 days in skim milk. Therefore, it can say that the liposomes containing polysaccharides can be a promising technology for the encapsulation of lysozyme and nisin. In addition, the existence of cubic structure in the liposomes can provide controlled release of antimicrobials.

Os compostos antimicrobianos naturais são um tema de grande interesse devido ao aumento da demanda por alimentos seguros e de alta qualidade. A utilização de lipossomas é uma alternativa interessante para proteger antimicrobianos nos alimentos, além de fornecer compostos naturais de liberação controlada. Os lipossomas revestidos com polissacarídeos apresentam melhor estabilidade, representando uma alternativa aos lipossomas convencionais. Inicialmente, os nanolipossomas que encapsulam a nisina foram preparados com fosfatidilcolina de soja (PC) e pectina ou ácido poligalacturônico. Os lipossomas desenvolvidos apresentaram alta eficiência de encapsulação, baixo índice de polidispersão e foram estáveis durante 21 dias a 7 °C e 25 °C. A atividade antimicrobiana foi observada contra cinco cepas diferentes de Listeria em placas de ágar de leite, com uma melhor eficiência contra L. innocua 6a. Em um segundo momento, as características estruturais dos lipossomas foram estudadas por dispersão de raios-X de pequeno ângulo (SAXS) e as amostras foram submetidas a ciclos de temperatura (20-60 °C). Para isso, os lipossomas foram desenvolvidos contendo pectina ou ácido poligalacturônico pelos métodos de hidratação de filme e evaporação em fase reversa, para encapsular nisina. A análise de SAXS confirmou a presença de estruturas lamelares em todas as amostras. Além disso, parte da estrutura multilamelar tornou-se cúbica, provavelmente devido à presença de nisina nos lipossomas. A adição de polissacarídeos mostrou diferenças entre as fases cúbicas formadas. Em última análise, a mistura de lisozima e nisina foi encapsulada em lipossomas contendo polissacarídeos. O diâmetro médio dos lipossomas foi de 85,6 e variou para 77,3 e 79,9 nm com a incorporação de pectina ou ácido poligalacturônico, respectivamente. O potencial zeta dos lipossomas com polissacarídeos foi de cerca de -30 mV, mostrando alta eficiência de encapsulação. A atividade antimicrobiana foi avaliada a 37 °C, mostrando que a PC-pectina reduziu a população de L. monocytogenes em 2 log UFC/mL e 5 log UFC/mL em leite integral e desnatado, respectivamente. Em refrigeração, a PC-pectina reduziu a população de L. monocytogenes para quase zero por até 25 dias em leite desnatado. Portanto, pode dizer-se que os lipossomas que contêm polissacarídeos podem ser uma tecnologia promissora para o encapsulamento da lisozima e nisina. Além disso, a existência de estrutura cúbica nos lipossomas pode proporcionar liberação controlada de antimicrobianos. / Natural antimicrobial compounds are a topic of utmost interest due to the increased demand for safe and high-quality foods. The use of liposomes is an interesting alternative to protect antimicrobials in food, also providing controlled release natural compounds. Polysaccharides coated liposomes present better stability, representing an alternative to conventional liposomes. Initially, nanoliposomes encapsulating nisin were prepared with soy phosphatidylcholine (PC) and pectin or polygalacturonic acid. The liposomes developed presented high encapsulation efficiency, low polydispersity index, and were stable for 21 days at 7°C and 25°C. The antimicrobial activity was observed against five different strains of Listeria in milk-agar plates, with a better efficiency against L. innocua 6a. In a second moment, structural characteristics of liposomes were studied by small angle X-ray scattering (SAXS) and the samples were submitted to temperature cycles (20-60°C). For this, liposomes were developed containing pectin or polygalacturonic acid by the thin-film hydration method and reverse phase evaporation method for nisin encapsulation. The analysis of SAXS confirmed the presence of lamellar structures in all the samples. In addition, part of the multilamellar structure became cubic, probably due to the presence of nisin in the liposomes. The addition of polysaccharides showed differences between the cubic phases formed. Ultimately, the mixture of lysozyme and nisin were encapsulated in liposomes containing polysaccharides. The mean diameter of the liposomes was 85.6 and varied to 77.3 and 79.9 nm with the incorporation of pectin or polygalacturonic acid, respectively. The zeta potential of liposomes with polysaccharides were around -30 mV, showing high encapsulation efficiency. The antimicrobial activity was assessed at 37 °C, showing that PC-pectin reduced the population of L. monocytogenes to 2 log CFU/mL and 5 log CFU/mL in whole and skim milk, respectively. At under refrigeration, PC-pectin reduced the population of L. monocytogenes to almost zero for up to 25 days in skim milk. Therefore, it can say that the liposomes containing polysaccharides can be a promising technology for the encapsulation of lysozyme and nisin. In addition, the existence of cubic structure in the liposomes can provide controlled release of antimicrobials.

Orientadores: Albina Messias de Almeida Milani Altemani, Fernanda Viviane Mariano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-26T21:33:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ConchaGomez_CamilaAndrea_M.pdf: 7905371 bytes, checksum: d30a270e5a2b856cfa2e57fa9e5a3522 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Introdução: Vários tumores de glândulas salivares imitam o sistema ductal, principalmente o ducto intercalado, tais como o adenoma pleomórfico, adenoma de células basais, carcinoma adenóide-cístico e carcinoma epitelial-mioepitelial. Contudo o adenocarcinoma polimorfo de baixo grau não apresenta ductos com dupla população celular como os outros descritos, mas é acreditado que este tumor é originado do ducto intercalado terminal. Em relação aos marcadores imunoistoquímicos, existem aqueles que detectam a expressão de enzimas e podem ser usados como marcadores funcionais de diferenciação celular, como lisozima e DOG1. Na glândula salivar normal, a lisozima é expressa no citoplasma das células luminais do ducto intercalado e em pequena quantidade nas células acinares, enquanto que o DOG1 é expresso na porção membranosa apical das células acinares e luminais do ducto intercalado. Objetivo: investigar a utilidade de lisozima e DOG1 na avaliação dos tumores salivares que se acredita sejam originados do ducto intercalado. Material e métodos: A expressão imunoistoquímica destes marcadores foi analisada em: 24 casos de Adenomas pleomórfico (AP), 10 Mioepiteliomas (M), 17 Tumores de Warthin (TW), 21 Adenocarcinomas polimorfo de baixo grau (APBG), 14 Carcinomas epitelial-mioepitelial CEME), 17 Carcinomas adenóide cístico (CAC), 14 Carcinomas secretor análogo da mama (MASC), 22 Carcinomas de células acinares (CCA), 11 Carcinomas mucoepidermóide (CM), 4 Carcinomas de ducto salivar (CDS), 7 Carcinomas mioepitelial (CMi). Resultados: a expressão luminal apical de DOG1 foi observada somente em: CCA, AP, APBG, CEME e CAC. Este padrão de DOG1 foi mais extenso e frequente no CCA; nos outros tumores foi mais variável, porém com maior expressão no CEME. Lisozima foi positiva em: MASC, CEME, AP, APBG e CDS. Somente nos 2 primeiros tumores, a expressão de lisozima foi encontrada em mais de 50% dos casos. Conclusões: As expressões apical luminal de DOG1 e de lisozima no AP, APBG, CEME e CAC possivelmente indicam diferenciação do tipo ducto intercalado, que é variável nestas neoplasias. Dentre elas, o CEME é que apresenta tal diferenciação com maior frequência e extensão. As expressões de DOG1 tipo apical luminal e de lisozima podem ser utilizadas no diagnóstico diferencial entre MASC e CCA, nos casos que apresentam dificuldade diagnóstica, uma vez que são fortemente expressas no primeiro e ausente no segundo / Abstract: Introduction: Several salivary tumors present a cellular composition that is similar to that of the intercalated duct, such as: Pleomorphic adenoma (PA), Basal cell adenoma (BCA), Adenoid cystic carcinoma (AdCC) and Epithelial-myoepithelial carcinoma (EMC). Regarding Polymorphic low grade adenocarcinoma (PLGA), although it does not present a dual cell composition as the other tumors, it is believed to be originated from the terminal intercalated duct. In relation to immunohistochemical markers, there are those that detect enzyme expression and can be used as functional marker of cellular differentiation, such as DOG1 and lysozyme. In normal salivary gland, lysozyme is expressed in the cytoplasm of luminal cells of intercalated duct and in small amount of acinar cells whereas DOG1 is expressed in the apical membrane of both acinar and luminal cells of intercalated ducts. Objetive: investigate the utility of DOG1 and lysozyme in the evaluation of salivary tumors. Material and methods: The immunohistochemical expression of these markers was analyzed in 24 cases of PA, 10 Myoepitheliomas (M), 17 Warthin tumors (WT), 21 PLGA, 14 EMC, 17 AdCC, 14 Mammary analogue secretory carcinoma (MASC), 22 Acinic cell carcinoma (ACC), 11 Mucoepidermoid carcinoma (MEC), 4 Salivary duct carcinoma (SDC) and 7 Myoepithelial carcinoma (MC). Results: Luminal apical expression of DOG1 was observed only in ACC, PA, PLGA, EMC and AdCC. This DOG1 pattern of expression was more frequent and extensive in ACC; in the other tumors this expression was variable but more marked in EMC. Lysozyme was detected in MASC, EMC, PA, PLGA and SDC. Only in MASC and EMC, lysozyme expression was found in more than 50% of the cases. Conclusions: Luminal apical expression of DOG1 and of lysozyme in PA, PLGA, EMC and AdCC probably represent intercalated duct differentiation, which is variable in these tumors. Among these tumors, EMC is the lesion where such differentiation occurs more frequently and extensively. Luminal apical expression of DOG1 and of lysozyme can be useful for distinguishing MASC from ACC because both protein are markedly expressed only in the former tumor / Mestrado / Patologia / Mestra em Estomatopatologia

Os compostos antimicrobianos naturais são um tema de grande interesse devido ao aumento da demanda por alimentos seguros e de alta qualidade. A utilização de lipossomas é uma alternativa interessante para proteger antimicrobianos nos alimentos, além de fornecer compostos naturais de liberação controlada. Os lipossomas revestidos com polissacarídeos apresentam melhor estabilidade, representando uma alternativa aos lipossomas convencionais. Inicialmente, os nanolipossomas que encapsulam a nisina foram preparados com fosfatidilcolina de soja (PC) e pectina ou ácido poligalacturônico. Os lipossomas desenvolvidos apresentaram alta eficiência de encapsulação, baixo índice de polidispersão e foram estáveis durante 21 dias a 7 °C e 25 °C. A atividade antimicrobiana foi observada contra cinco cepas diferentes de Listeria em placas de ágar de leite, com uma melhor eficiência contra L. innocua 6a. Em um segundo momento, as características estruturais dos lipossomas foram estudadas por dispersão de raios-X de pequeno ângulo (SAXS) e as amostras foram submetidas a ciclos de temperatura (20-60 °C). Para isso, os lipossomas foram desenvolvidos contendo pectina ou ácido poligalacturônico pelos métodos de hidratação de filme e evaporação em fase reversa, para encapsular nisina. A análise de SAXS confirmou a presença de estruturas lamelares em todas as amostras. Além disso, parte da estrutura multilamelar tornou-se cúbica, provavelmente devido à presença de nisina nos lipossomas. A adição de polissacarídeos mostrou diferenças entre as fases cúbicas formadas. Em última análise, a mistura de lisozima e nisina foi encapsulada em lipossomas contendo polissacarídeos. O diâmetro médio dos lipossomas foi de 85,6 e variou para 77,3 e 79,9 nm com a incorporação de pectina ou ácido poligalacturônico, respectivamente. O potencial zeta dos lipossomas com polissacarídeos foi de cerca de -30 mV, mostrando alta eficiência de encapsulação. A atividade antimicrobiana foi avaliada a 37 °C, mostrando que a PC-pectina reduziu a população de L. monocytogenes em 2 log UFC/mL e 5 log UFC/mL em leite integral e desnatado, respectivamente. Em refrigeração, a PC-pectina reduziu a população de L. monocytogenes para quase zero por até 25 dias em leite desnatado. Portanto, pode dizer-se que os lipossomas que contêm polissacarídeos podem ser uma tecnologia promissora para o encapsulamento da lisozima e nisina. Além disso, a existência de estrutura cúbica nos lipossomas pode proporcionar liberação controlada de antimicrobianos. / Natural antimicrobial compounds are a topic of utmost interest due to the increased demand for safe and high-quality foods. The use of liposomes is an interesting alternative to protect antimicrobials in food, also providing controlled release natural compounds. Polysaccharides coated liposomes present better stability, representing an alternative to conventional liposomes. Initially, nanoliposomes encapsulating nisin were prepared with soy phosphatidylcholine (PC) and pectin or polygalacturonic acid. The liposomes developed presented high encapsulation efficiency, low polydispersity index, and were stable for 21 days at 7°C and 25°C. The antimicrobial activity was observed against five different strains of Listeria in milk-agar plates, with a better efficiency against L. innocua 6a. In a second moment, structural characteristics of liposomes were studied by small angle X-ray scattering (SAXS) and the samples were submitted to temperature cycles (20-60°C). For this, liposomes were developed containing pectin or polygalacturonic acid by the thin-film hydration method and reverse phase evaporation method for nisin encapsulation. The analysis of SAXS confirmed the presence of lamellar structures in all the samples. In addition, part of the multilamellar structure became cubic, probably due to the presence of nisin in the liposomes. The addition of polysaccharides showed differences between the cubic phases formed. Ultimately, the mixture of lysozyme and nisin were encapsulated in liposomes containing polysaccharides. The mean diameter of the liposomes was 85.6 and varied to 77.3 and 79.9 nm with the incorporation of pectin or polygalacturonic acid, respectively. The zeta potential of liposomes with polysaccharides were around -30 mV, showing high encapsulation efficiency. The antimicrobial activity was assessed at 37 °C, showing that PC-pectin reduced the population of L. monocytogenes to 2 log CFU/mL and 5 log CFU/mL in whole and skim milk, respectively. At under refrigeration, PC-pectin reduced the population of L. monocytogenes to almost zero for up to 25 days in skim milk. Therefore, it can say that the liposomes containing polysaccharides can be a promising technology for the encapsulation of lysozyme and nisin. In addition, the existence of cubic structure in the liposomes can provide controlled release of antimicrobials.

O aumento na procura por produtos naturais pelo mercado farmacêutico, cosmético e alimentício demanda pesquisas no desenvolvimento desses produtos. Esses são direcionados à obtenção de substâncias de origem vegetal ou animal, assim como, para produtos biotecnológicos. Investigações quanto à atividade antibacteriana de proteínas e peptídeos são realizadas. Dentre essas substancias, podemos citar as lisozimas, proteínas que hidrolisam as ligações &#946; 1-4 glicosídicas entre o ácido N-acetilmurâmico e N-acetilglicosamina, presentes no peptidoglicano da parede celular bacteriana. Além disso, apresentam atividade de quitinase, ou seja, quebram a ligação glicosídica da quitina presente na parede fúngica. As lisozimas apresentam alta especificidade pela parede microbiana indicando aparente ausência de efeitos tóxicos aos humanos. Assim, tornando-a candidata a agente antimicrobiano em formulações cosméticas e farmacêuticas. A lisozima de ovo de galinha tem atividade antimicrobiana, entretanto não havia estudos relacionados com os micro-organismos contaminantes normalmente encontrados em produtos farmacêuticos e cosméticos. Além disso, a lisozima recombinante de Musca domestica (MdL1) não possui ainda sua atividade antimicrobiana definida. Os objetivos do trabalho foram:1) Obtenção da lisozima recombinante de Musca domestica (MdL1); 2) Avaliação a atividade antimicrobiana da MdL1 e de lisozima de ovo de galinha, Hen Egg White Lysozyme (HEWL), frente à Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Micrococcus luteus (ATCC 4698), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Escherichia coli (ATCC 8739), Candida albicans (ATCC 10231) e Aspergillus niger (ATCC 16404); 3) Avaliação da toxicidade da lisozima em cultura de células de fibroblastos (ATCC CCL-92). A MdL1 foi obtida por meio de expressão gênica em Pichia pastoris GS115 (Invitrogen), concentrada utilizando polietilenoglicol 6000 e dialisada contra água deionizada através da membrana com porosidade seletiva de 12kDa. A homogeneidade foi analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes; e a atividade catalítica foi avaliada utilizando células liofilizadas de Micrococcus luteus como substrato. A atividade antimicrobiana foi determinada por método específico para cada enzima. A toxicidade in vitro das amostras foi avaliada pela viabilidade celular de fibroblastos ATCC CCL-92. A MdL1 obtida apresentou características de homogeneidade adequadas e atividade de 108,35 U/mg. A HEWL mostrou-se ativa contra S. aureus, M. luteus e C. albicans. A MdL1 apresentou-se ativa contra M. luteus, apenas. Devido a ausência de atividade antimicrobiana a MdL1 não foi submetida a avaliação citotóxica. Em relação à HEWL não demonstrou citotoxicidade na avaliação prévia realizada. / The increase in the search for natural products by pharmaceutical, cosmetic and food markets requires researches in these products development. These are directed to obtaining substances of vegetal or animal origin, as well as biotechnological products. The research in relation to antibacterial activity of proteins and peptides is carried out. Among these substances, it is possible to mention the lysozyme, protein that catalyze the break of 1,4-beta-D glucosidic bond between N-acetylmuramic acid and N-acetilglicosamine which are present in peptidoglicane of the bacterial cell wall. Besides, there is kitinase activity, that is, they break the glicosidic bond of chitin which is present in fungal wall. The lysozymes show high specificity by microbial wall indicating apparent absence of toxicological effects to human beings. Therefore, it becomes the candidate to antimicrobial ingredient in cosmetic and pharmaceutical dosage forms. The hen egg white lysozyme has antimicrobial activity, however there were no studies related to spoiled microorganism usually found in pharmaceutical and cosmetic products. In addition, there were not studies about microbial activity of recombinant Musca domestica lysozyme 1 (MdL1). The aim of this research was: 1) To obtain MdL1; 2) Evaluation of MdL1 and hen egg white lysozyme (HEWL) antimicrobial activity against Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Micrococcus luteus (ATCC 4698), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Escherichia coli (ATCC 8739), Candida albicans (ATCC 10231) e Aspergillus niger (ATCC 16404); 3) Evaluation of lysozyme toxicity in fibroblast cells culture (ATCC CCL-92). The MdL1 was expressed as recombinant protein in Pichia pastoris GS115 (Invitrogen), concentrated using polyethylene glycol 6000 and dialyzed against deionized water through the selective porosity of 12kDa membrane. The homogeneity was analyzed by electrophoresis in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and the catalytic activity was evaluated using lyophilized cells of Micrococcus luteus as substract. The antimicrobial activity was evaluated using specific methods for each enzyme. The sample toxicity was evaluated by cell viability using ATCC CCL-92 fibroblasts. The MdL1 obtained presented suitable homogeneity characteristics and activity of 108.35 U/mg. The HEWL has showed activity against S. aureus, M. luteus e C. albicans. MdL1 only showed activity against M. luteus. Due to the absence of antimicrobial activity of MdL1 in the evaluated concentration it was not submitted to the cytotoxicity test. Regarding HEWL, it has not showed citotoxicity in the previous test.

O aumento na procura por produtos naturais pelo mercado farmacêutico, cosmético e alimentício demanda pesquisas no desenvolvimento desses produtos. Esses são direcionados à obtenção de substâncias de origem vegetal ou animal, assim como, para produtos biotecnológicos. Investigações quanto à atividade antibacteriana de proteínas e peptídeos são realizadas. Dentre essas substancias, podemos citar as lisozimas, proteínas que hidrolisam as ligações &#946; 1-4 glicosídicas entre o ácido N-acetilmurâmico e N-acetilglicosamina, presentes no peptidoglicano da parede celular bacteriana. Além disso, apresentam atividade de quitinase, ou seja, quebram a ligação glicosídica da quitina presente na parede fúngica. As lisozimas apresentam alta especificidade pela parede microbiana indicando aparente ausência de efeitos tóxicos aos humanos. Assim, tornando-a candidata a agente antimicrobiano em formulações cosméticas e farmacêuticas. A lisozima de ovo de galinha tem atividade antimicrobiana, entretanto não havia estudos relacionados com os micro-organismos contaminantes normalmente encontrados em produtos farmacêuticos e cosméticos. Além disso, a lisozima recombinante de Musca domestica (MdL1) não possui ainda sua atividade antimicrobiana definida. Os objetivos do trabalho foram:1) Obtenção da lisozima recombinante de Musca domestica (MdL1); 2) Avaliação a atividade antimicrobiana da MdL1 e de lisozima de ovo de galinha, Hen Egg White Lysozyme (HEWL), frente à Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Micrococcus luteus (ATCC 4698), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Escherichia coli (ATCC 8739), Candida albicans (ATCC 10231) e Aspergillus niger (ATCC 16404); 3) Avaliação da toxicidade da lisozima em cultura de células de fibroblastos (ATCC CCL-92). A MdL1 foi obtida por meio de expressão gênica em Pichia pastoris GS115 (Invitrogen), concentrada utilizando polietilenoglicol 6000 e dialisada contra água deionizada através da membrana com porosidade seletiva de 12kDa. A homogeneidade foi analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes; e a atividade catalítica foi avaliada utilizando células liofilizadas de Micrococcus luteus como substrato. A atividade antimicrobiana foi determinada por método específico para cada enzima. A toxicidade in vitro das amostras foi avaliada pela viabilidade celular de fibroblastos ATCC CCL-92. A MdL1 obtida apresentou características de homogeneidade adequadas e atividade de 108,35 U/mg. A HEWL mostrou-se ativa contra S. aureus, M. luteus e C. albicans. A MdL1 apresentou-se ativa contra M. luteus, apenas. Devido a ausência de atividade antimicrobiana a MdL1 não foi submetida a avaliação citotóxica. Em relação à HEWL não demonstrou citotoxicidade na avaliação prévia realizada. / The increase in the search for natural products by pharmaceutical, cosmetic and food markets requires researches in these products development. These are directed to obtaining substances of vegetal or animal origin, as well as biotechnological products. The research in relation to antibacterial activity of proteins and peptides is carried out. Among these substances, it is possible to mention the lysozyme, protein that catalyze the break of 1,4-beta-D glucosidic bond between N-acetylmuramic acid and N-acetilglicosamine which are present in peptidoglicane of the bacterial cell wall. Besides, there is kitinase activity, that is, they break the glicosidic bond of chitin which is present in fungal wall. The lysozymes show high specificity by microbial wall indicating apparent absence of toxicological effects to human beings. Therefore, it becomes the candidate to antimicrobial ingredient in cosmetic and pharmaceutical dosage forms. The hen egg white lysozyme has antimicrobial activity, however there were no studies related to spoiled microorganism usually found in pharmaceutical and cosmetic products. In addition, there were not studies about microbial activity of recombinant Musca domestica lysozyme 1 (MdL1). The aim of this research was: 1) To obtain MdL1; 2) Evaluation of MdL1 and hen egg white lysozyme (HEWL) antimicrobial activity against Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Micrococcus luteus (ATCC 4698), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Escherichia coli (ATCC 8739), Candida albicans (ATCC 10231) e Aspergillus niger (ATCC 16404); 3) Evaluation of lysozyme toxicity in fibroblast cells culture (ATCC CCL-92). The MdL1 was expressed as recombinant protein in Pichia pastoris GS115 (Invitrogen), concentrated using polyethylene glycol 6000 and dialyzed against deionized water through the selective porosity of 12kDa membrane. The homogeneity was analyzed by electrophoresis in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and the catalytic activity was evaluated using lyophilized cells of Micrococcus luteus as substract. The antimicrobial activity was evaluated using specific methods for each enzyme. The sample toxicity was evaluated by cell viability using ATCC CCL-92 fibroblasts. The MdL1 obtained presented suitable homogeneity characteristics and activity of 108.35 U/mg. The HEWL has showed activity against S. aureus, M. luteus e C. albicans. MdL1 only showed activity against M. luteus. Due to the absence of antimicrobial activity of MdL1 in the evaluated concentration it was not submitted to the cytotoxicity test. Regarding HEWL, it has not showed citotoxicity in the previous test.

Neste trabalho estudamos por espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) quatro diferentes sistemas de interesse biológico. Visamos investigar a auto-agregação de proteínas e de complexos proteicos que darão origem a fibras amilóides, interação proteína-proteína, simulando ambientes altamente concentrados, interação proteína-membrana simulando vesículas de matriz extracelular (MVs) de sistemas de biomineralização e interações proteína-agentes desnaturantes. No caso de formação de amilóides, investigamos a agregação do domínio GTPase da septina 6 (SEPT6G) e do complexo formado com o domínio GTPase da septina 2 (SEPT2G-SEPT6G). A temperaturas de até 15°C, tanto SEPT6G quanto SEPT2G-SEPT6G apresentam-se predominantemente diméricas em solução. Já a 25°C, o heterodímero SEPT2G-SEPT6G permanece estável enquanto agregados maiores de SEPT6G evoluem e coexistem em solução com SEPT6G-SEPT6G dimérica, sendo que a proporção de dímeros diminui com a temperatura. No estudo das MVs, mostramos que miméticos lipossomais de DPPC e DPPC:DPPS (9:1) possuem as mesmas características estruturais na ausência e presença de cálcio na solução. A interação da proteína anexina V humana (A5), envolvida em processos de biomineralização, impacta na membrana modelo induzindo a formação de nanoporos. A adição da fosfatase alcalina tecido não-específico (TNAP) não altera as propriedades estruturais do proteolipossomo na presença de A5. A ação do surfactante dodecil sulfato de sódio (SDS) a 30 mM não altera a conformação da albumina soro bovina (BSA), de maneira que é observada a formação de micelas de SDS coexistindo com a proteína livre em solução. Já a adição de 50 mM de SDS induz um desenovelamento parcial da proteína, identificado pela análise das curvas de SAXS via modelo de \"colar de pérolas\". A ação de uréia a 3 M e 8 M promove um desenovelamento parcial e total da BSA, respectivamente, com subsequente agregação de proteína dependente da temperatura (T > 30°C). A adição de 6 mM de SDS em proteínas parcialmente desenoveladas pela ação da uréia promove um desenovelamento mais acentuado. O potencial efetivo resultante da interação entre duas proteínas distintas, BSA e lisozima a concentração total de 100 mg/mL em solução, pH 7.0, foi obtido da análise de curvas de SAXS. Para isto, utilizou-se uma análise simplificada (em primeira aproximação) considerando um potencial efetivo de interação entre BSA-BSA, lisozima-lisozima e lisozima-BSA. Variamos a razão molar BSA:LISO até 1:42. No pH estudado, BSA tem uma carga residual superficial de -11e, enquanto a lisozima possui +9e. Conforme variamos a razão molar BSA:LISO, observamos dois regimes para o potencial efetivo resultante: i) até BSA:LISO 1:2, a carga efetiva do sistema é praticamente nula com um potencial resultante de caráter atrativo e ii) para razões entre BSA:LISO 1:3 a 1:42, a carga efetiva aumenta e o potencial resultante tem caráter repulsivo. Assim, lisozima e BSA coexistem sem agregar, através de um delicado balanço de forças atrativas e repulsivas no sistema. / In this work we have used small-angle x-ray scattering (SAXS) to study four systems of biological interest. We aim to investigate the self aggregation of proteins and protein complexes that would form amyloid fibers; protein/protein interaction, simulating high concentrations; protein/cell-membrane interaction, simulating extracellular matrix vesicles (MVs) from biomineralizing systems; and protein/denaturating-agents interactions. On the case of amyloid formation, we have investigated the aggregation of G-domain of septin-6 (SEPT6G) and the protein complex formed with G-domain of septin-2 (SEPT2G-SEPT6G). At temperatures lower than 15°C, both SEPT6G and SEPT2G-SEPT6G were found predominantly as dimers. At 25°C, SEPT2G-SEPT6G heterodimer is still stable while aggregates of SEPT6G grow. Both coexist in solutions of SEPT2G-SEPT6G dimers, with the percentage of dimers decreasing the higher the temperature. As for the study of MVs, we have shown that DPPC and DPPC:DPPS (9:1) liposomal mimetics have the same structural characteristics at the absence or presence of Calcium. The interaction with human annexin V protein (A5), related to biomineralization processes, affects the model membrane by the creation of nanopores. The addition of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) does not change the structural properties of the proteoliposome when A5 is present. The addition of SDS surfactant (30 mM) does not alters the conformation of bovine serum albumin (BSA), and we have observed the formation of SDS micelles coexisting with free protein in solution. The addition of 50 mM of SDS, on the other hand, induces the partial unraveling of the protein, as seen by the analysis of SAXS data via the pearl necklace\'\' model. The effect of adding 3M and 8M urea is, respectively, the partial and total unraveling of BSA, with ensuing aggregation of the protein dependent on the temperature (T > 30°C). The introduction of SDS 6mM promotes further unraveling in proteins that were previously partially unraveled by urea. The resulting effective potential for the interaction between BSA and lysozyme at total concentration of 100mg/ml and 7.0 pH has been obtained from the analysis of SAXS curves. In order to obtain this result we have used a simplified analysis (first order approximation) in which were considered the effective potentials for the interactions between BSA-BSA, lysozyme-lysozyme and lysozyme-BSA. We have varied the BSA:LISO molar ratio up to 1:42. At the studied pH, BSA has a surface residual charge of -11e, and lysozyme has +9e. As we changed the BSA:LISO molar ratio, we have found two regimens for the resulting effective potential: i) up to BSA:LISO 1:2, the effective charge of the system is virtually zero and the resulting potential is attractive; and ii) for BSA:LISO between 1:3 and 1:42 the effective charge increases, and the resulting potential is repulsive. Therefore, both lysozyme and BSA coexist without forming aggregates, by a delicate balance of attractive and repulsive forces.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-08-18T15:38:40Z No. of bitstreams: 1 Claudio Henrique Clemente Fernandes.pdf: 1914599 bytes, checksum: da7b1a519963cc8ffa30d5c1998aa94f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-18T15:38:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Claudio Henrique Clemente Fernandes.pdf: 1914599 bytes, checksum: da7b1a519963cc8ffa30d5c1998aa94f (MD5) Previous issue date: 2007-02-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The bovine enzootic leucosis (BEL) is a contagious infect disease cosmopolitan, with immune depressor potential, characterized by chronic evolution and great injuries that cause to the national cattle- breeding. The general objective of the achievement of this study was to contribute to the Bovine Leukosis Virus (BLV), realizing immune serologic essay to find dimension of the infection (serum-prevalent) and establish a parameter for evaluation of the immune condition (levels of serum lysozyme) of milky cattle breeding raised in the north region of Tocantins state. It was colleted serum samples of 38 bovine herds, totalizing 881 samples submitted to the double radial immune diffusion test of Ouchterlony in agar gel. From this universe of samples, 400 samples were divided in 2 groups. According to the immune serologic result obtained. G1 200 BLV negative samples, G2 BLV positive samples. The samples were still submitted to a simple radial immunodiffusion of Mancini to define the serum concentration of lysozyme which obtained results were statistically analyzed by t- student test. The results demonstrated that the BEL is amply disseminated in bovine herds examined (94,7% - 36/38), with a prevalence of serum antibodies anti BLV of the studied population corresponding to 37% (328/821) this is the first register of the infection in Tocantins State. The serum levels of lysozyme found G1 8,94 /ml e G2 7,05 /ml, knowing that the average difference between the two groups was 1,92 /ml, so, more elevated in the BLV negative animals than in the BLV positive ones, this revealed how significant is that difference. It can signalize an immune depression state of the immunity system. The obtained results demonstrated the large dissemination of BEL, being the influence, of risk factors in connection with a reduction of levels of lysozyme in animals BLV positives, and suggest that immune serologic tests realized, make possible the validation of an important parameter of evaluation of immune state of BLV positive bovine contributing, this way, to elucidation of immune depressor paper of bovine leucosis virus. / A Leucose Enzoótica dos Bovinos (LEB) é uma doença infecto-contagiosa, cosmopolita, de potencial imunodepressor, caracterizada pela evolução crônica e pelos grandes prejuízos que determina a pecuária bovina nacional. O objetivo geral com a realização deste estudo foi contribuir para a elucidação do papel imunodepressor do Vírus da Leucose Bovina (VLB), realizando ensaios imunossorológicos para dimensionar a infecção (soroprevalência) e estabelecer um parâmetro de avaliação do estado imunitário (teores de lisozima sérica) de bovinos leiteiros criados na Região Norte do Estado do Tocantins. Foram colhidas amostras séricas de 38 rebanhos bovinos, totalizando 882 amostras submetidas ao teste de Imunodifusão Radial Dupla de Ouchterlony em gel de ágar. Desse universo amostral, 400 amostras foram divididas em dois grupos, em função do resultado imunossorológico obtido: G1 200 amostras VLB negativos e G2 200 amostras VLB positivos. As amostras foram submetidas, ainda, à Imunodifusão Radial Simples de Mancini para determinar a concentração sérica da lisozima, cujos resultados obtidos foram analisados estatisticamente pelo teste t-Student. Os resultados demonstraram que a LEB encontra-se amplamente disseminada nos rebanhos examinados (94,7% - 36/38), com uma prevalência de anticorpos séricos anti-VLB da população estudada igual a 37,0% (326/881), sendo este o primeiro registro da infecção no Estado do Tocantins. Os níveis séricos de lisozima encontrados foram G1 8,94 g/ml e G2 7,05 g/ml, sendo que a diferença média entre os dois grupos foi de 1,92 g/ml, portanto, mais elevado nos animais VLB negativos do que nos VLB positivos, diferença esta que se revelou significante, sinalizando um estado imunitário de imunodepressão. Os resultados obtidos demonstraram a ampla disseminação da LEB, sob a influência de fatores de risco, em conexão com a redução dos teores de lisozima nos animais VLB positivos, e sugerem que os ensaios imunossorológicos realizados possibilitaram a validação de um importante parâmetro de avaliação do estado imunitário de bovinos VLB positivos, contribuindo, desta forma, para a elucidação do papel imunodepressor do Vírus da Leucose Bovina.

Orientadores: Cesar Costapinto Santana, Marisa Masumi Beppu / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-07T05:42:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Torres_MarcoAntonio_D.pdf: 1417582 bytes, checksum: 10045a785cc6ab8b5ff6c19e8efd00d0 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Neste trabalho foram produzidas microesferas de quitosana com tamanho controlado e porosidade influenciada pela técnica de atomização e coagulação. As condições de produção foram definidas pelo planejamento de experimentos. As microesferas obtidas foram modificadas quimicamente com anidrido acético, epicloridrina e glutaraldeído com objetivos de melhorar suas características iniciais de resistência e estabilidade. As possibilidades de uso apresentadas por essas matrizes se devem ao reconhecimento observado entre adsorbato e adsorvente e à realização de modificações químicas e estruturais. Após essas modificações as microesferas obtidas foram analisadas quanto às suas propriedades estruturais, capacidade de adsorção e dessorção. As microesferas foram utilizadas em sistemas de adsorção em banho finito e coluna de leito fixo. Os adsorbatos utilizados foram as proteínas BSA, lisozima e um concentrado protéico (condição real) obtido do soro do leite. As proteínas BSA e lisozima apresentam pontos isoelétricos distintos de 4,8 e 11, respectivamente, permitindo assim avaliar o sistema adsorvente-adsorbato pelas isotermas de adsorção, cinética de equilíbrio, capacidade de dessorção e regeneração dos adsorventes, em condições distintas de pH. O modelo de Langmuir descreveu bem os valores de adsorção obtidos experimentalmente. As capacidades máximas de adsorção para as proteínas BSA e lisozima foram de 9,24 mg/g e 11,95 mg/g, respectivamente, utilizando as microesferas de quitosana reticuladas com glutaraldeído. Os maiores valores de adsorção foram encontrados próximos aos pontos isoelétricos, mostrando que as interações eletrostáticas, fundamentais para o processo em toda a faixa de pH estudada, não estão agindo isoladamente no sistema. Comparando-se os métodos de tanque agitado e coluna de leito fixo foi possível observar diminuição significativa na adsorção e dessorção da solução artificial de proteínas do primeiro para o segundo método. Esses resultados podem ser explicados por limitações no tamanho da coluna do leito, tempo de residência e conseqüentemente pela baixa transferência de massa. Com um extrato real ocorreu diminuição, mais significativa ainda, da capacidade de adsorção quando comparado com a solução artificial de proteínas. Estes resultados refletem a complexidade das interações e a existência de competição pelos sítios de adsorção da superfície interna e externa das microesferas de quitosana reticuladas com glutaraldeído. Essa competição ocorre possivelmente entre as proteínas do extrato e outros grupos moleculares / Abstract: This work is concerned with production of chitosan microspheres with sizes controlled and porosity influenced by spraying and coagulation process. The production conditions were defined through experimental planning. The microspheres were modified chemically with glutaraldehyde, epichlorohydrin and acetic anhydride in order to improve its initial characteristics of resistance and stability. The possibilities of use exhibited by these matrices are due to recognition adsorbate-adsorbent and the accomplishments these chemical and structural modifications. Soon after the gotten microspheres their structural, adsorption and dessorption properties were analyzed. The microspheres were used in adsorption system in two methods: stirred tank and fixed bed. The adsorbates used were the BSA and lysozyme proteins and a proteinic extract from milk serum. The BSA and lysozyme proteins have different isoeletric points, 4.8 and 11, respectively. This allowed study the adsorbent­absorbate system by adsorption isotherms, equilibrium kinetics, dessorption capability and regeneration of adsorbents, in different conditions of pH. The Langmuir described well the experimental values of capacity of adsorption. The maximum adsorption capacities were 9,24 mg/g and 11,95 mg/g for BSA and lysozyme proteins, respectively. The higher values of adsorption were found close to the isoelectric points, showing that the electrostatic interactions, important to the process during all pH range studied, it are not acting alone in the system. Comparing the methods of stirred tank with fixed bed happened significant reduction in the adsorption and dessorption from proteins artificial solution. These results may be explained by the limitations in the size of column, time of residence and consequently in the mass transfer. With a real extract occurred important reduction of the adsorption capacity when compared with synthetic proteins. These results show the complexity of the interactions and the competition between the extract proteins and others chemical groups by adsorption sites in the internal and external surface of chitosan microspheres crosslinked with glutaraldehyde / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química