Orientador: João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T20:09:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Valerio_AmandaAbdalla_D.pdf: 3553304 bytes, checksum: 97ba97062f1c23d4b29447c0b9a7316d (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Glicosídeo hidrolases (EC 3.2.1.-) são enzimas que hidrolisam ligações glicosídicas. Neste trabalho realizamos estudos funcionais e estruturais de duas glicosídeo hidrolases: a celulase XF0810 de Xylella fastidiosa e a lisozima digestiva 1 de Musca domestica (MdL1). A celulase XF0810 está anotada no genoma da X. fastidiosa como membro da família 5 das glicosídeo hidrolases (EC 3.2.1.4). Após a amplificação, clonagem, expressão e purificação da mesma; prosseguimos com os experimentos de filtração em gel analítica, dicroísmo circular, DLS, ensaio enzimático e cristalização desta proteína. Foi feito um estudo de modelagem onde ficou evidenciado que a XF0810 não pertenceria à família 5 pois quatro dos sete resíduos conservados que caracterizam esta família foram substituídos, incluindo os dois resíduos catalíticos de glutamato essenciais para o mecanismo de clivagem de retenção. Isto foi comprovado através da ausência de atividade nos ensaios feitos com a proteína purificada. A MdL1 pertence à família 22 das glicosídeo hidrolases (EC 3.2.1.17) e foi cristalizada com o ligante Nacetilquitotetraosídeo para a difração de raios X. A resolução da estrutura (2H5Z no PDB) foi realizada por meio do método de substituição molecular tendo como modelo a estrutura nativa. A análise comparativa da MdL1 com outras lisozimas de quatro classes diferentes de animais mostrou grande semelhança e pequenas diferenças apenas na região das voltas. Estas diferenças foram utilizadas para explicar as características especiais de uma lisozima com função digestiva. A volta na região definida pelos resíduos 98-100 apresenta uma deleção na MdL1, tornado-a menos exposta ao solvente, podendo justificar a resistência à proteólise. O resíduo Gln100 participa de uma interação com o ligante. Os resíduos Thr107 e Asn46 são apontados como responsáveis pelo decréscimo dos pKa dos grupos carboxilas dos resíduos catalíticos Glu32 e Asp50, respectivamente. A diminuição dos pKa explica o pH ótimo mais ácido característico de lisozimas digestivas / Abstract: Glycoside hydrolases (EC 3.2.1.-) are enzymes that hydrolyze glycoside bonds. In this work we studied functional and structural features of two glycoside hydrolases: the cellulase XF0810 of Xylella fastidiosa and the digestive lysozyme 1 of Musca domestica (MdL1). The cellulase XF0810 is annotated in the genome of X. fastidiosa as member of family 5 of glycoside hydrolases (EC 3.2.1.4). After the amplification, cloning, expression and purification of XF0810; we continued with the experiments of analytical gel filtration, circular dichroism, DLS, enzymatic assay and crystallization of this protein. A homology model was built which showed that XF0810 did not belong to family 5 because four of seven conserved residues that characterize the family were substituted, including the two catalytic residues of glutamate that are essential for the retention hydrolysis mechanism. This was further confirmed by the absence of activity in the assays (exocellulase with PNPc) performed with the purified protein. The MdL1 belongs to the family 22 of glycoside hydrolases (EC 3.2.1.17) and was crystallized with the ligand N-acetilchitotetraose for X-ray diffraction. The resolution of the structure (2H5Z in PDB) was accomplished by molecular replacement with the native structure as the searching model. The comparative analysis of MdL1 with other lysozymes of four different classes of animals showed a high similarity and few differences appeared only in the loops¿ regions. These differences were used to explain the special characteristics of the lysozyme with a digestive function. The loop in the region defined by residues 98-100 presents one deletion in the MdL1, becoming less exposed to the solvent, this might justify the proteolysis resistance. The residue Gln100 participates directly in an interaction with the ligand. The residues Thr107 and Asn46 are pointed out as responsible for a reduction in the pKa of the carboxyl groups of catalytic residues Glu32 e Asp50, respectively. The reduction in pKa explains the more acidic pH optimum that characterizes the digestive lysozymes / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Neste trabalho estudamos por espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) quatro diferentes sistemas de interesse biológico. Visamos investigar a auto-agregação de proteínas e de complexos proteicos que darão origem a fibras amilóides, interação proteína-proteína, simulando ambientes altamente concentrados, interação proteína-membrana simulando vesículas de matriz extracelular (MVs) de sistemas de biomineralização e interações proteína-agentes desnaturantes. No caso de formação de amilóides, investigamos a agregação do domínio GTPase da septina 6 (SEPT6G) e do complexo formado com o domínio GTPase da septina 2 (SEPT2G-SEPT6G). A temperaturas de até 15°C, tanto SEPT6G quanto SEPT2G-SEPT6G apresentam-se predominantemente diméricas em solução. Já a 25°C, o heterodímero SEPT2G-SEPT6G permanece estável enquanto agregados maiores de SEPT6G evoluem e coexistem em solução com SEPT6G-SEPT6G dimérica, sendo que a proporção de dímeros diminui com a temperatura. No estudo das MVs, mostramos que miméticos lipossomais de DPPC e DPPC:DPPS (9:1) possuem as mesmas características estruturais na ausência e presença de cálcio na solução. A interação da proteína anexina V humana (A5), envolvida em processos de biomineralização, impacta na membrana modelo induzindo a formação de nanoporos. A adição da fosfatase alcalina tecido não-específico (TNAP) não altera as propriedades estruturais do proteolipossomo na presença de A5. A ação do surfactante dodecil sulfato de sódio (SDS) a 30 mM não altera a conformação da albumina soro bovina (BSA), de maneira que é observada a formação de micelas de SDS coexistindo com a proteína livre em solução. Já a adição de 50 mM de SDS induz um desenovelamento parcial da proteína, identificado pela análise das curvas de SAXS via modelo de \"colar de pérolas\". A ação de uréia a 3 M e 8 M promove um desenovelamento parcial e total da BSA, respectivamente, com subsequente agregação de proteína dependente da temperatura (T > 30°C). A adição de 6 mM de SDS em proteínas parcialmente desenoveladas pela ação da uréia promove um desenovelamento mais acentuado. O potencial efetivo resultante da interação entre duas proteínas distintas, BSA e lisozima a concentração total de 100 mg/mL em solução, pH 7.0, foi obtido da análise de curvas de SAXS. Para isto, utilizou-se uma análise simplificada (em primeira aproximação) considerando um potencial efetivo de interação entre BSA-BSA, lisozima-lisozima e lisozima-BSA. Variamos a razão molar BSA:LISO até 1:42. No pH estudado, BSA tem uma carga residual superficial de -11e, enquanto a lisozima possui +9e. Conforme variamos a razão molar BSA:LISO, observamos dois regimes para o potencial efetivo resultante: i) até BSA:LISO 1:2, a carga efetiva do sistema é praticamente nula com um potencial resultante de caráter atrativo e ii) para razões entre BSA:LISO 1:3 a 1:42, a carga efetiva aumenta e o potencial resultante tem caráter repulsivo. Assim, lisozima e BSA coexistem sem agregar, através de um delicado balanço de forças atrativas e repulsivas no sistema. / In this work we have used small-angle x-ray scattering (SAXS) to study four systems of biological interest. We aim to investigate the self aggregation of proteins and protein complexes that would form amyloid fibers; protein/protein interaction, simulating high concentrations; protein/cell-membrane interaction, simulating extracellular matrix vesicles (MVs) from biomineralizing systems; and protein/denaturating-agents interactions. On the case of amyloid formation, we have investigated the aggregation of G-domain of septin-6 (SEPT6G) and the protein complex formed with G-domain of septin-2 (SEPT2G-SEPT6G). At temperatures lower than 15°C, both SEPT6G and SEPT2G-SEPT6G were found predominantly as dimers. At 25°C, SEPT2G-SEPT6G heterodimer is still stable while aggregates of SEPT6G grow. Both coexist in solutions of SEPT2G-SEPT6G dimers, with the percentage of dimers decreasing the higher the temperature. As for the study of MVs, we have shown that DPPC and DPPC:DPPS (9:1) liposomal mimetics have the same structural characteristics at the absence or presence of Calcium. The interaction with human annexin V protein (A5), related to biomineralization processes, affects the model membrane by the creation of nanopores. The addition of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) does not change the structural properties of the proteoliposome when A5 is present. The addition of SDS surfactant (30 mM) does not alters the conformation of bovine serum albumin (BSA), and we have observed the formation of SDS micelles coexisting with free protein in solution. The addition of 50 mM of SDS, on the other hand, induces the partial unraveling of the protein, as seen by the analysis of SAXS data via the pearl necklace\'\' model. The effect of adding 3M and 8M urea is, respectively, the partial and total unraveling of BSA, with ensuing aggregation of the protein dependent on the temperature (T > 30°C). The introduction of SDS 6mM promotes further unraveling in proteins that were previously partially unraveled by urea. The resulting effective potential for the interaction between BSA and lysozyme at total concentration of 100mg/ml and 7.0 pH has been obtained from the analysis of SAXS curves. In order to obtain this result we have used a simplified analysis (first order approximation) in which were considered the effective potentials for the interactions between BSA-BSA, lysozyme-lysozyme and lysozyme-BSA. We have varied the BSA:LISO molar ratio up to 1:42. At the studied pH, BSA has a surface residual charge of -11e, and lysozyme has +9e. As we changed the BSA:LISO molar ratio, we have found two regimens for the resulting effective potential: i) up to BSA:LISO 1:2, the effective charge of the system is virtually zero and the resulting potential is attractive; and ii) for BSA:LISO between 1:3 and 1:42 the effective charge increases, and the resulting potential is repulsive. Therefore, both lysozyme and BSA coexist without forming aggregates, by a delicate balance of attractive and repulsive forces.

Lisozimas são enzimas que fazem parte do mecanismo de defesa contra bactérias, no entanto lisozimas com função digestiva também são encontradas no trato digestivo de vertebrados e no intestino médio de insetos. As lisozimas digestivas de insetos são do tipo c e assim compartilham semelhanças estruturais e mecanísticas com a lisozima da clara de ovo de galinha (HEWL). Entretanto, para desempenhar sua função digestiva, as lisozimas de insetos apresentam algumas propriedades particulares entre as quais se destaca um pH ótimo mais ácido em relação às lisozimas não-digestivas. Para elucidar as bases moleculares dessa diferença no pH ótimo, duas lisozimas digestivas (lisozima 1 AAQ20048 e lisozima 2 AAQ20047) da larva de Musca domestica (mosca Diptera Cyclorrhapha), clonadas em Pichia pastoris e purificadas, foram caracterizadas estruturalmente e cineticamente com o substrato sintético (MUQ3) e natural (cápsulas de Micrococcus lysodeikticus). Foi observado que o efeito do pH na atividade das lisozimas 1 e 2 sobre o MUQ3 é uma curva com formato de sino e pH ótimo mais ácido que o da HEWL. Essas curvas foram reflexos da diminuição simultânea dos valores de pKas do nucleófilo e do doador de prótons. Estruturas cristalográficas das lisozimas digestivas de Musca domestica foram obtidas a 1,9 Å e análise comparativa com a estrutura terciária da HEWL revelou resíduos de aminoácidos no ambiente do nucleófilo (N46) e do doador de prótons (S106 e T107) que podem estar envolvidos na modulação das constantes de ionização dos resíduos essenciais à catálise. Esses resíduos foram substituídos via mutagênese sítio-dirigida por D, V e A respectivamente e três mutantes simples (N46D, S106V e T107A) e um triplo (N46DS106V- T107A) foram produzidos e purificados. Caracterização revelou que as contribuições individuais da N46, S106 e T107 foram pequenas e próximas do limite de detecção da técnica utilizada. Por outro lado, o conjunto dos 3 aminoácidos foi responsável pelo pH ótimo ácido frente ao substrato sintético, elevando os valores de pKas do nucleófilo e doador de prótons para valores muito semelhantes ao da HEWL. Diferentemente, essa tripla mutação não foi suficiente para elevar o pH ótimo da lisozima 2 sobre cápsulas de Micrococcus lysodeikticus para valores próximos àqueles de HEWL, sugerindo que as bases moleculares do pH ótimo frente ao substrato natural e sintético são diferentes. Uma comparação estrutural entre lisozima 1 e HEWL sugere que os resíduos de aminoácidos carregados na superfície dessas lisozimas sejam importantes para determinação do pH ótimo. A investigação dessa hipótese foi feita substituindo 5 aminoácidos neutros e 1 ácido, via mutagênese sítio-dirigida, por resíduos básicos. A caracterização do mutante sêxtuplo revelou um aumento significativo nos valores de pH ótimo da lisozima 1, indicando que a redução da basicidade da superfície das lisozimas digestivas é determinante para seus pHs ótimos ácidos. / Lysozymes are enzymes that are part of the defence mechanism against bacteria, however lysozymes with digestive function are also found in the digestive tract of vertebrates and in the insect midgut. The digestive lysozymes from insects are c type, so they share similar structural and mechanistic characteristics with hen egg-white lysozyme (HEWL). However, to perform their digestive function, insect lysozymes present some particular properties among them a more acidic pH optimum than that of non-digestive lysozymes. To elucidate the molecular basis of this pH optimum difference, two digestive lysozymes (lysozyme 1 AAQ20048 and lysozyme 2 AAQ20047) from Musca domestica larvae (housefly Diptera Cyclorrhapha), cloned in Pichia pastoris and purified, were structurally and kinecticly characterized with synthetic (MUQ3) and natural (lyophilized cells of Micrococcus lysodeikticus) substrates. It was observed that the pH effect on the activity of lysozymes 1 and 2 upon MUQ3 is a bell shaped curve exhibiting a more acidic pH optimum than that of HEWL. These curves result from simultaneous decrease of pKas values of the nucleophile and proton donor. Crystallographic structures of these digestive lysozymes from Musca domestica were obtained at 1.9 Å and comparative analysis with the terciary structure of HEWL revealed amino acid residues in the catalytic nucleophile (N46) and proton donor environment (S106 and T107) that may be involved in the modulation of ionization constants of those catalytic residues. N46, S106, and T107 were replaced via site-directed mutagenesis by D, V and A respectively and three simple (N46D, S106V and T107A) and one triple (N46D-S106V-T107A) mutants were produced and purified. Their characterization revealed that the individual contributions of N46, S106 and T107 were small and close to the detection borderline of the technique utilized. On the other hand, a set of these 3 amino acids was responsible by acidic pH optimum upon synthetic substrate, increasing the pKas values of nucleophile and proton donor to similar values to that of the HEWL. Differently, this triple mutation was not enough to increase the pH optimum of lysozyme 2 upon lyophilized cells of Micrococcus lysodeikticus to values close to those of HEWL, suggesting that the molecular bases of pH optimum upon natural and synthetic substrates are different. A structural comparison between lysozyme 1 and HEWL suggests that the charged amino acid residues on the surface of these lysozymes are important for pH optimum determination. The investigation of this hypothesis was done replacing 5 neutral and 1 acidic amino acids, via site-directed mutagenesis, by basic residues. The characterization of this mutant revealed a significant increase in the pH optimum values of lysozyme 1, suggesting that the reduction of basicity on the surface of the digestive lysozymes is a important factor in the determination of their acidic pH optimum.

Lisozimas são enzimas que fazem parte do mecanismo de defesa contra bactérias, no entanto lisozimas com função digestiva também são encontradas no trato digestivo de vertebrados e no intestino médio de insetos. As lisozimas digestivas de insetos são do tipo c e assim compartilham semelhanças estruturais e mecanísticas com a lisozima da clara de ovo de galinha (HEWL). Entretanto, para desempenhar sua função digestiva, as lisozimas de insetos apresentam algumas propriedades particulares entre as quais se destaca um pH ótimo mais ácido em relação às lisozimas não-digestivas. Para elucidar as bases moleculares dessa diferença no pH ótimo, duas lisozimas digestivas (lisozima 1 AAQ20048 e lisozima 2 AAQ20047) da larva de Musca domestica (mosca Diptera Cyclorrhapha), clonadas em Pichia pastoris e purificadas, foram caracterizadas estruturalmente e cineticamente com o substrato sintético (MUQ3) e natural (cápsulas de Micrococcus lysodeikticus). Foi observado que o efeito do pH na atividade das lisozimas 1 e 2 sobre o MUQ3 é uma curva com formato de sino e pH ótimo mais ácido que o da HEWL. Essas curvas foram reflexos da diminuição simultânea dos valores de pKas do nucleófilo e do doador de prótons. Estruturas cristalográficas das lisozimas digestivas de Musca domestica foram obtidas a 1,9 Å e análise comparativa com a estrutura terciária da HEWL revelou resíduos de aminoácidos no ambiente do nucleófilo (N46) e do doador de prótons (S106 e T107) que podem estar envolvidos na modulação das constantes de ionização dos resíduos essenciais à catálise. Esses resíduos foram substituídos via mutagênese sítio-dirigida por D, V e A respectivamente e três mutantes simples (N46D, S106V e T107A) e um triplo (N46DS106V- T107A) foram produzidos e purificados. Caracterização revelou que as contribuições individuais da N46, S106 e T107 foram pequenas e próximas do limite de detecção da técnica utilizada. Por outro lado, o conjunto dos 3 aminoácidos foi responsável pelo pH ótimo ácido frente ao substrato sintético, elevando os valores de pKas do nucleófilo e doador de prótons para valores muito semelhantes ao da HEWL. Diferentemente, essa tripla mutação não foi suficiente para elevar o pH ótimo da lisozima 2 sobre cápsulas de Micrococcus lysodeikticus para valores próximos àqueles de HEWL, sugerindo que as bases moleculares do pH ótimo frente ao substrato natural e sintético são diferentes. Uma comparação estrutural entre lisozima 1 e HEWL sugere que os resíduos de aminoácidos carregados na superfície dessas lisozimas sejam importantes para determinação do pH ótimo. A investigação dessa hipótese foi feita substituindo 5 aminoácidos neutros e 1 ácido, via mutagênese sítio-dirigida, por resíduos básicos. A caracterização do mutante sêxtuplo revelou um aumento significativo nos valores de pH ótimo da lisozima 1, indicando que a redução da basicidade da superfície das lisozimas digestivas é determinante para seus pHs ótimos ácidos. / Lysozymes are enzymes that are part of the defence mechanism against bacteria, however lysozymes with digestive function are also found in the digestive tract of vertebrates and in the insect midgut. The digestive lysozymes from insects are c type, so they share similar structural and mechanistic characteristics with hen egg-white lysozyme (HEWL). However, to perform their digestive function, insect lysozymes present some particular properties among them a more acidic pH optimum than that of non-digestive lysozymes. To elucidate the molecular basis of this pH optimum difference, two digestive lysozymes (lysozyme 1 AAQ20048 and lysozyme 2 AAQ20047) from Musca domestica larvae (housefly Diptera Cyclorrhapha), cloned in Pichia pastoris and purified, were structurally and kinecticly characterized with synthetic (MUQ3) and natural (lyophilized cells of Micrococcus lysodeikticus) substrates. It was observed that the pH effect on the activity of lysozymes 1 and 2 upon MUQ3 is a bell shaped curve exhibiting a more acidic pH optimum than that of HEWL. These curves result from simultaneous decrease of pKas values of the nucleophile and proton donor. Crystallographic structures of these digestive lysozymes from Musca domestica were obtained at 1.9 Å and comparative analysis with the terciary structure of HEWL revealed amino acid residues in the catalytic nucleophile (N46) and proton donor environment (S106 and T107) that may be involved in the modulation of ionization constants of those catalytic residues. N46, S106, and T107 were replaced via site-directed mutagenesis by D, V and A respectively and three simple (N46D, S106V and T107A) and one triple (N46D-S106V-T107A) mutants were produced and purified. Their characterization revealed that the individual contributions of N46, S106 and T107 were small and close to the detection borderline of the technique utilized. On the other hand, a set of these 3 amino acids was responsible by acidic pH optimum upon synthetic substrate, increasing the pKas values of nucleophile and proton donor to similar values to that of the HEWL. Differently, this triple mutation was not enough to increase the pH optimum of lysozyme 2 upon lyophilized cells of Micrococcus lysodeikticus to values close to those of HEWL, suggesting that the molecular bases of pH optimum upon natural and synthetic substrates are different. A structural comparison between lysozyme 1 and HEWL suggests that the charged amino acid residues on the surface of these lysozymes are important for pH optimum determination. The investigation of this hypothesis was done replacing 5 neutral and 1 acidic amino acids, via site-directed mutagenesis, by basic residues. The characterization of this mutant revealed a significant increase in the pH optimum values of lysozyme 1, suggesting that the reduction of basicity on the surface of the digestive lysozymes is a important factor in the determination of their acidic pH optimum.

Compreender a função das diferentes proteínas e citocinas durante a vigência de alterações inflamatórias pode contribuir para um melhor conhecimento do sistema imunológico dos mamíferos marinhos e sua relação com os processos patológicos. A toninha, Pontoporia blainvillei, é um cetáceo costeiro e o único golfinho brasileiro considerado ameaçado de extinção devido às atividades antrópicas. O objetivo desse trabalho foi avaliar as imunoexpressões das citocinas TGF-β, TNF-α e IL-12 e proteínas S-100 e lisozima em amostras pulmonares e esplênicas de 34 espécimes de P. blainvillei. Com base nas alterações histopatológicas, os animais foram divididos em dois grupos: G1 (n = 8) - animais sem doença inflamatória pulmonar; G2 (n = 26) - animais com doenças inflamatórias pulmonares. Os fragmentos de pulmão e baço foram processados de acordo com os protocolos de rotina. A padronização das reações de imuno-histoquímica e análise morfométrica foram realizadas conforme procedimentos descritos na literatura. Os nossos dados demonstram que as P. blainvillei pertencentes ao G2 apresentam imunoexpressão pulmonar das citocinas TGF-β, TNF-α e IL-12 e proteínas S-100 e lisozima significativamente maior que os animais do G1. Tais resultados corroboram os dados disponíveis na literatura, indicando que a P. blainvillei apresenta citocinas com funções semelhantes às encontradas em outros mamíferos.Evidenciamos também, que as P. blainvillei pertencentes ao G2 não apresentam imunoexpressão esplênica das citocinas TGF-β, TNF-α e IL-12 e da proteína lisozima significativamente maior que os animais do G1. Estudos mais detalhados, incluindo aqueles relacionados com os métodos utilizados, são necessários para a adequada compreensão destes resultados. E finalmente, apesar de tratar-se de dados ainda preliminares, observou-se uma possível associação entre elevadas concentrações de organoclorados no tecido adiposo subcutâneo de parcela dos exemplares de P. blainvillei estudados na presente investigação e a ocorrência de depleção linfóide esplênica nestes animais. Tais dados ratificam a importância do desenvolvimento de análise mais detalhada sobre estes tópicos em futuras investigações científicas. / The understanding of the role of different proteins and cytokines during the inflammatory diseases could lead to better knowledge of the marine mammal immune system and its relation to pathological process. Franciscana dolphin, Pontoporia blainvillei, is a coastal cetacean and the only Brazilian dolphin considered threatened with extinction, due to the human activities. The aim of the current study was to investigate the immunoexpression of TGF-β, TNF-α and IL-12 cytokines, and S-100 and Lysozyme proteins in pulmonary and splenic samples of 34 Pontoporia blainvillei. Based on histopathological examination, the animals were divided in two groups: G1 (n = 8) animals without pulmonary inflammatory disease; G2 (n = 26) animals with pulmonary inflammatory diseases. Fragments of lung and spleen were processed according to routine protocols. The immunohistochemistry and morphometric procedures were tested and optimized according to proceedings described in literature. Our results showed that P. blainvillei from G2 presented significant increase in the pulmonary immunoexpression of TGF-β, TNF-α and IL-12 cytokines, and S-100 and Lysozyme proteins in comparison with animals from G1. These results are according to the literature and suggest that P. blainvillei presents same cytokines observed in other mammals. We evidenced also that the P. blainvillei belonging to the G2 did not show splenic immunoexpression to TGF-β, TNF-α and IL- 12 cytokines and Lysozyme protein significantly higher than animals from G1. Further studies, including those related to the methods used, are necessary for the proper understanding of these results. And finally, although these are still preliminary data, we observed a possible association between high concentrations of organochlorines in subcutaneous adipose tissue of a portion of P. blainvillei studied in this research and the occurrence of splenic lymphoid depletion in these animals. These data confirm the importance of developing more detailed analysis on these topics in future scientific investigations.

A transição sol-gel de lisozima dispersa em tetrametiluréia/água foi investigada em profundidade. Tais dispersões geraram sistemas de alta viscosidade que evoluíram para a formação de géis ?físicos?, i.e., sistemas de redes viscoelásticas mantidas por interações do tipo forças de van der Walls e ligações de hidrogênio. O enfoque deste trabalho foi dividido em duas frentes: a) estudo do sistema lisozima nas misturas binárias; b) estudo das misturas binárias indutoras do efeito de gelificação na ausência da proteína. Realizou-se um estudo cinético e dinâmico das dispersões e géis por meio de experimentos reológicos, espectroscópicos e calorimétricos. A partir dos resultados reológicos procurou-se correlacionar as propriedades mecânicas macroscópicas dos géis com suas propriedades microscópicas, tendo sido possível estabelecer o caráter fractal dos agregados formados. Os estudos espectroscópicos no infravermelho permitiram acompanhar mudanças estruturais da proteína durante o processo de gelificação, revelando o efeito do meio na estruturação secundária da lisozima. Observou-se que a mistura binária tende a causar um aumento de conteúdo de folhas b na proteína quando acima da concentração crítica de fração de massa de tetrametiluréia em água (wTMU > 0,6), com uma concomitante redução no teor de hélices alfa. Estudos calorimétricos revelaram uma dependência inversamente linear das entalpias e temperaturas de denaturação da lisozima com a concentração do co-solvente orgânico no sistema, observando-se ausência de qualquer evento térmico na região acima da concentração crítica do solvente misto. Com a finalidade de se sondar as características dinâmicas e estruturais das misturas binárias responsáveis pela indução do efeito de gelificação em lisozima, foram realizados estudos solvatocrômicos envolvendo as misturas binárias tetrametiluréia/co-solvente, em que os co-solventes ensaiados foram água e alguns álcoois. A comparação entre o efeito solvatocrômico das misturas TMU/água e TMU/álcool permitiu verificar o caráter estruturador da TMU em meio aquoso e seu efeito desestruturador nos meios alcoólicos. / Lysozyme sol-gel transition in tetramethylurea/water was investigated in depth. These dispersions produced highly viscous systems, which evolved to physical gels, i.e., systems where the gel backbone is maintained by van der Walls forces and hydrogen bonding. The work was conducted in two fronts: a) the study of lysozyme dispersions in binary mixtures; b) the study of the binary mixtures themselves. A kinetics and dynamical characterization of the dispersions and gels was undertaken by means of rheological, spectroscopic and calorimetric assays. In the light of the rheological data, correlations were proposed between the gel mechanical macroscopic behaviour and its microscopic properties. The fractal character of the gels was established and their dimensionality calculated. Infrared spectroscopic experiments revealed changes in the protein secondary structure during and well after the sol-gel transition induced by the binary solvent mixture. It was found that the binary mixture induces an increase in the b-sheet content with a concomitant reduction of the a-helix, when above its critical concentration, as expressed in mass fraction of tetramethylurea in the binary mixture (wTMU >0.6). Calorimetric studies revealed that both denaturation temperature and enthalpy decrease linearly with the increase of TMU mass fraction in the mixed solvent, with no thermal effect being noticed above the binary mixture critical concentration. In order to investigate the dynamic and structural characteristics of the binary mixtures responsible for lysozyme sol-gel transition, solvatochromic assays were carried out for several TMU/co-solvent systems, where the co-solvents assayed were water and a few alcohols. Results revealed that TMU has structure-maker behaviour in water and structure-breaker behaviour in alcohol systems.

Compreender a função das diferentes proteínas e citocinas durante a vigência de alterações inflamatórias pode contribuir para um melhor conhecimento do sistema imunológico dos mamíferos marinhos e sua relação com os processos patológicos. A toninha, Pontoporia blainvillei, é um cetáceo costeiro e o único golfinho brasileiro considerado ameaçado de extinção devido às atividades antrópicas. O objetivo desse trabalho foi avaliar as imunoexpressões das citocinas TGF-β, TNF-α e IL-12 e proteínas S-100 e lisozima em amostras pulmonares e esplênicas de 34 espécimes de P. blainvillei. Com base nas alterações histopatológicas, os animais foram divididos em dois grupos: G1 (n = 8) - animais sem doença inflamatória pulmonar; G2 (n = 26) - animais com doenças inflamatórias pulmonares. Os fragmentos de pulmão e baço foram processados de acordo com os protocolos de rotina. A padronização das reações de imuno-histoquímica e análise morfométrica foram realizadas conforme procedimentos descritos na literatura. Os nossos dados demonstram que as P. blainvillei pertencentes ao G2 apresentam imunoexpressão pulmonar das citocinas TGF-β, TNF-α e IL-12 e proteínas S-100 e lisozima significativamente maior que os animais do G1. Tais resultados corroboram os dados disponíveis na literatura, indicando que a P. blainvillei apresenta citocinas com funções semelhantes às encontradas em outros mamíferos.Evidenciamos também, que as P. blainvillei pertencentes ao G2 não apresentam imunoexpressão esplênica das citocinas TGF-β, TNF-α e IL-12 e da proteína lisozima significativamente maior que os animais do G1. Estudos mais detalhados, incluindo aqueles relacionados com os métodos utilizados, são necessários para a adequada compreensão destes resultados. E finalmente, apesar de tratar-se de dados ainda preliminares, observou-se uma possível associação entre elevadas concentrações de organoclorados no tecido adiposo subcutâneo de parcela dos exemplares de P. blainvillei estudados na presente investigação e a ocorrência de depleção linfóide esplênica nestes animais. Tais dados ratificam a importância do desenvolvimento de análise mais detalhada sobre estes tópicos em futuras investigações científicas. / The understanding of the role of different proteins and cytokines during the inflammatory diseases could lead to better knowledge of the marine mammal immune system and its relation to pathological process. Franciscana dolphin, Pontoporia blainvillei, is a coastal cetacean and the only Brazilian dolphin considered threatened with extinction, due to the human activities. The aim of the current study was to investigate the immunoexpression of TGF-β, TNF-α and IL-12 cytokines, and S-100 and Lysozyme proteins in pulmonary and splenic samples of 34 Pontoporia blainvillei. Based on histopathological examination, the animals were divided in two groups: G1 (n = 8) animals without pulmonary inflammatory disease; G2 (n = 26) animals with pulmonary inflammatory diseases. Fragments of lung and spleen were processed according to routine protocols. The immunohistochemistry and morphometric procedures were tested and optimized according to proceedings described in literature. Our results showed that P. blainvillei from G2 presented significant increase in the pulmonary immunoexpression of TGF-β, TNF-α and IL-12 cytokines, and S-100 and Lysozyme proteins in comparison with animals from G1. These results are according to the literature and suggest that P. blainvillei presents same cytokines observed in other mammals. We evidenced also that the P. blainvillei belonging to the G2 did not show splenic immunoexpression to TGF-β, TNF-α and IL- 12 cytokines and Lysozyme protein significantly higher than animals from G1. Further studies, including those related to the methods used, are necessary for the proper understanding of these results. And finally, although these are still preliminary data, we observed a possible association between high concentrations of organochlorines in subcutaneous adipose tissue of a portion of P. blainvillei studied in this research and the occurrence of splenic lymphoid depletion in these animals. These data confirm the importance of developing more detailed analysis on these topics in future scientific investigations.

Apesar de extensa investigação das modificações oxidativas irreversíveis sofridas pelas proteínas in vitro e in vivo, os produtos formados pela oxidação de resíduos de triptofano ainda permanecem apenas parcialmente conhecidos. Recentemente, nosso grupo caracterizou uma ligação cruzada de ditriptofano produzida pela recombinação de radicais hSOD1-triptofanila gerados pelo ataque do radical carbonato produzido durante a atividade peroxidásica da enzima superóxido dismutase humana (hSOD1). Neste trabalho, examinamos se a ligação ditriptofano pode ser formada em outras proteínas, além da hSOD1 e por outros oxidantes, além do radical carbonato. A lisozima da clara do ovo e a beta cristalino bovina foram utilizadas como alvos de oxidação. A lisozima foi utilizada por ser uma enzima pequena (129 aminoácidos) e de estrutura bem conhecida, contendo seis resíduos de Trp. Os resultados mostraram que o radical carbonato, gerado enzimatica ou fotoliticamente, promove a oxidação, dimerização e inativação da lisozima. Os principais produtos de oxidação caracterizados por análise de nano-ESI-Q-TOF-MS/MS foram hidroxi-triptofano e N-formilquinurenina juntamente com um dímero de lisozima (lisozima-Trp28-Trp28-lisozima) e um hetero dímero lisozima-hSOD1 (lisozima-Trp28-Trp32-hSOD1), ambos ligados por uma ligação ditriptofano. Também demonstramos que a irradiação da lisozima com luz UVC leva à formação do dímero lisozima-Trp28-Trp28-lisozima. Em consequência, resolvemos tratar a beta cristalino bovina com radical carbonato gerado fotoliticamente ou com luz UVC, e a proteína também sofreu oxidação, dimerização e agregação. Os principais produtos de oxidação caracterizados por nano-ESI-Q-TOF-MS/MS foram hidroxi-triptofano, N-formilquinurenina, DOPA e um dímero de beta cristalino (βB2-Trp151-Trp151-βB2). A irradiação com luz UVC também levou à formação de um dímero intra-cadeia, caracterizado como βA2-Trp78-Trp81. Quando a beta cristalino foi irradiada com um simulador de luz solar (UVA e UVB) também foi possível observar um dímero, caracterizado como βA2-Trp150-Trp150-βA2. A presença de produtos de oxidação de resíduos de Trp, dentre eles a ligação cruzada ditritpofano, também foi avaliada in vivo, utilizando o cristalino de pacientes que foram submetidos a cirurgia para remoção de catarata. Beta, alfa e gama cristalino foram as principais proteínas identificadas nas frações solúvel e insolúvel do cristalino. A principal modificação pós-traducionais identificada foi deamidação. Um alto conteúdo de resíduos de metionina e triptofano oxidados foram identificados nas proteínas presentes na fração insolúvel. Os principais produtos de oxidação de Trp identificados por nano-ESI-Q-TOF-MS/MS foram quinurenina e N-formilquinurenina. A presença de dímeros covalentes no cristalino com catarata foi confirmada por análises de massas. A completa caracterização desses dímeros (βB1-Trp127-Trp127-βB1 e βB1-Trp193-Trp193-βB1) confirmou que as cadeias polipeptídicas foram ligadas por uma ligação ditriptofano. Em síntese, nossos dados demonstraram que o radical carbonato e a luz UV podem produzir dímeros de ditriptofano em diferentes proteínas. Também, a presença da ligação cruzada de ditriptofano in vivo (catarata humana) foi pela primeira vez detectada. / Despite extensive investigation of irreversible oxidative modifications suffered by proteins in vitro and in vivo, the products formed by oxidation of tryptophan residues remain partially characterized. Our group recently described a ditryptophan cross-link produced by recombination of hSOD1-tryptophanyl radicals generated by attack of the carbonate radical produced during the peroxidase activity of the human superoxide dismutase (hSOD1) enzyme. Here, we examine whether the ditryptophan cross-link can be produced in others proteins besides the hSOD1 and by other oxidants, in addition to the carbonate radical. The egg white lysozyme and bovine beta crystalline were used as targets. Lysozyme was used because it is a small enzyme (129 amino acids) with a well-known structure, containing six Trp residues. The results showed that the carbonate radical, generated enzymatically or photolytically, promotes lysozyme oxidation, inactivation and dimerization. The major oxidation products characterized by nano-ESI-Q-TOF-MS/MS analysis were hydroxy-tryptophan and N-formylkynurenine together with a dimer of lysozyme (lysozyme-Trp28-Trp28-lysozyme) and a hetero dimer hSOD1-lysozyme (lysozyme-Trp28-Trp32-hSOD1), both bound by a ditryptophan cross-link. Also, it was demonstrated that lysozyme irradiation with UVC light leads to the formation of the dimer lysozyme-Trp28-Trp28-lysozyme. In view of these results, we decided to treat beta crystalline bovine with photolytically generated carbonate radical and UVC. Beta crystalline also suffered oxidation, dimerization and aggregation. The major oxidation products characterized were hydroxy-tryptophan, N-formylkynurenine, DOPA and a beta crystalline dimer (βB2-Trp151-Trp151-βB2) by nano-ESI-Q-TOF-MS/MS. Irradiation with UVC light also led to the formation of an intra-chain dimer, which was characterized as βA2-Trp78-Trp81. When beta crystalline was irradiated with a solar simulator (UVA and UVB), it was also possible to observe a dimer which was characterized as βA2-Trp150-Trp150-βA2. The presence of oxidized tryptophan products, including the ditryptophan cross-link, was also evaluated in vivo in the lenses of patients submitted to cataract removal. Beta, alpha and gamma crystalline were the main proteins identified in soluble and insoluble fractions of the lenses. The main post translational modification identified was deamidation. A high content of oxidized methionine and tryptophan residues were identified in proteins present in the insoluble fraction. The main tryptophan oxidation products identified by nano-ESI-Q-TOF-MS/MS were kynurenine and N-formylkynurenine. The presence of covalent dimers in the lenses with cataract was demonstrated by mass analysis. Full MS/MS characterization of the dimers βB1-Trp127-Trp127-βB1 and βB1-Trp193-Trp193-βB1 confirmed that they were linked by a ditryptophan bond. In summary, our data demonstrate that the carbonate radical and UV light can produce ditryptophan dimers in different proteins. Also, the presence of the ditryptophan cross-link was first detected in vivo (human cataract).

A transição sol-gel de lisozima dispersa em tetrametiluréia/água foi investigada em profundidade. Tais dispersões geraram sistemas de alta viscosidade que evoluíram para a formação de géis ?físicos?, i.e., sistemas de redes viscoelásticas mantidas por interações do tipo forças de van der Walls e ligações de hidrogênio. O enfoque deste trabalho foi dividido em duas frentes: a) estudo do sistema lisozima nas misturas binárias; b) estudo das misturas binárias indutoras do efeito de gelificação na ausência da proteína. Realizou-se um estudo cinético e dinâmico das dispersões e géis por meio de experimentos reológicos, espectroscópicos e calorimétricos. A partir dos resultados reológicos procurou-se correlacionar as propriedades mecânicas macroscópicas dos géis com suas propriedades microscópicas, tendo sido possível estabelecer o caráter fractal dos agregados formados. Os estudos espectroscópicos no infravermelho permitiram acompanhar mudanças estruturais da proteína durante o processo de gelificação, revelando o efeito do meio na estruturação secundária da lisozima. Observou-se que a mistura binária tende a causar um aumento de conteúdo de folhas b na proteína quando acima da concentração crítica de fração de massa de tetrametiluréia em água (wTMU > 0,6), com uma concomitante redução no teor de hélices alfa. Estudos calorimétricos revelaram uma dependência inversamente linear das entalpias e temperaturas de denaturação da lisozima com a concentração do co-solvente orgânico no sistema, observando-se ausência de qualquer evento térmico na região acima da concentração crítica do solvente misto. Com a finalidade de se sondar as características dinâmicas e estruturais das misturas binárias responsáveis pela indução do efeito de gelificação em lisozima, foram realizados estudos solvatocrômicos envolvendo as misturas binárias tetrametiluréia/co-solvente, em que os co-solventes ensaiados foram água e alguns álcoois. A comparação entre o efeito solvatocrômico das misturas TMU/água e TMU/álcool permitiu verificar o caráter estruturador da TMU em meio aquoso e seu efeito desestruturador nos meios alcoólicos. / Lysozyme sol-gel transition in tetramethylurea/water was investigated in depth. These dispersions produced highly viscous systems, which evolved to physical gels, i.e., systems where the gel backbone is maintained by van der Walls forces and hydrogen bonding. The work was conducted in two fronts: a) the study of lysozyme dispersions in binary mixtures; b) the study of the binary mixtures themselves. A kinetics and dynamical characterization of the dispersions and gels was undertaken by means of rheological, spectroscopic and calorimetric assays. In the light of the rheological data, correlations were proposed between the gel mechanical macroscopic behaviour and its microscopic properties. The fractal character of the gels was established and their dimensionality calculated. Infrared spectroscopic experiments revealed changes in the protein secondary structure during and well after the sol-gel transition induced by the binary solvent mixture. It was found that the binary mixture induces an increase in the b-sheet content with a concomitant reduction of the a-helix, when above its critical concentration, as expressed in mass fraction of tetramethylurea in the binary mixture (wTMU >0.6). Calorimetric studies revealed that both denaturation temperature and enthalpy decrease linearly with the increase of TMU mass fraction in the mixed solvent, with no thermal effect being noticed above the binary mixture critical concentration. In order to investigate the dynamic and structural characteristics of the binary mixtures responsible for lysozyme sol-gel transition, solvatochromic assays were carried out for several TMU/co-solvent systems, where the co-solvents assayed were water and a few alcohols. Results revealed that TMU has structure-maker behaviour in water and structure-breaker behaviour in alcohol systems.

Apesar de extensa investigação das modificações oxidativas irreversíveis sofridas pelas proteínas in vitro e in vivo, os produtos formados pela oxidação de resíduos de triptofano ainda permanecem apenas parcialmente conhecidos. Recentemente, nosso grupo caracterizou uma ligação cruzada de ditriptofano produzida pela recombinação de radicais hSOD1-triptofanila gerados pelo ataque do radical carbonato produzido durante a atividade peroxidásica da enzima superóxido dismutase humana (hSOD1). Neste trabalho, examinamos se a ligação ditriptofano pode ser formada em outras proteínas, além da hSOD1 e por outros oxidantes, além do radical carbonato. A lisozima da clara do ovo e a beta cristalino bovina foram utilizadas como alvos de oxidação. A lisozima foi utilizada por ser uma enzima pequena (129 aminoácidos) e de estrutura bem conhecida, contendo seis resíduos de Trp. Os resultados mostraram que o radical carbonato, gerado enzimatica ou fotoliticamente, promove a oxidação, dimerização e inativação da lisozima. Os principais produtos de oxidação caracterizados por análise de nano-ESI-Q-TOF-MS/MS foram hidroxi-triptofano e N-formilquinurenina juntamente com um dímero de lisozima (lisozima-Trp28-Trp28-lisozima) e um hetero dímero lisozima-hSOD1 (lisozima-Trp28-Trp32-hSOD1), ambos ligados por uma ligação ditriptofano. Também demonstramos que a irradiação da lisozima com luz UVC leva à formação do dímero lisozima-Trp28-Trp28-lisozima. Em consequência, resolvemos tratar a beta cristalino bovina com radical carbonato gerado fotoliticamente ou com luz UVC, e a proteína também sofreu oxidação, dimerização e agregação. Os principais produtos de oxidação caracterizados por nano-ESI-Q-TOF-MS/MS foram hidroxi-triptofano, N-formilquinurenina, DOPA e um dímero de beta cristalino (βB2-Trp151-Trp151-βB2). A irradiação com luz UVC também levou à formação de um dímero intra-cadeia, caracterizado como βA2-Trp78-Trp81. Quando a beta cristalino foi irradiada com um simulador de luz solar (UVA e UVB) também foi possível observar um dímero, caracterizado como βA2-Trp150-Trp150-βA2. A presença de produtos de oxidação de resíduos de Trp, dentre eles a ligação cruzada ditritpofano, também foi avaliada in vivo, utilizando o cristalino de pacientes que foram submetidos a cirurgia para remoção de catarata. Beta, alfa e gama cristalino foram as principais proteínas identificadas nas frações solúvel e insolúvel do cristalino. A principal modificação pós-traducionais identificada foi deamidação. Um alto conteúdo de resíduos de metionina e triptofano oxidados foram identificados nas proteínas presentes na fração insolúvel. Os principais produtos de oxidação de Trp identificados por nano-ESI-Q-TOF-MS/MS foram quinurenina e N-formilquinurenina. A presença de dímeros covalentes no cristalino com catarata foi confirmada por análises de massas. A completa caracterização desses dímeros (βB1-Trp127-Trp127-βB1 e βB1-Trp193-Trp193-βB1) confirmou que as cadeias polipeptídicas foram ligadas por uma ligação ditriptofano. Em síntese, nossos dados demonstraram que o radical carbonato e a luz UV podem produzir dímeros de ditriptofano em diferentes proteínas. Também, a presença da ligação cruzada de ditriptofano in vivo (catarata humana) foi pela primeira vez detectada. / Despite extensive investigation of irreversible oxidative modifications suffered by proteins in vitro and in vivo, the products formed by oxidation of tryptophan residues remain partially characterized. Our group recently described a ditryptophan cross-link produced by recombination of hSOD1-tryptophanyl radicals generated by attack of the carbonate radical produced during the peroxidase activity of the human superoxide dismutase (hSOD1) enzyme. Here, we examine whether the ditryptophan cross-link can be produced in others proteins besides the hSOD1 and by other oxidants, in addition to the carbonate radical. The egg white lysozyme and bovine beta crystalline were used as targets. Lysozyme was used because it is a small enzyme (129 amino acids) with a well-known structure, containing six Trp residues. The results showed that the carbonate radical, generated enzymatically or photolytically, promotes lysozyme oxidation, inactivation and dimerization. The major oxidation products characterized by nano-ESI-Q-TOF-MS/MS analysis were hydroxy-tryptophan and N-formylkynurenine together with a dimer of lysozyme (lysozyme-Trp28-Trp28-lysozyme) and a hetero dimer hSOD1-lysozyme (lysozyme-Trp28-Trp32-hSOD1), both bound by a ditryptophan cross-link. Also, it was demonstrated that lysozyme irradiation with UVC light leads to the formation of the dimer lysozyme-Trp28-Trp28-lysozyme. In view of these results, we decided to treat beta crystalline bovine with photolytically generated carbonate radical and UVC. Beta crystalline also suffered oxidation, dimerization and aggregation. The major oxidation products characterized were hydroxy-tryptophan, N-formylkynurenine, DOPA and a beta crystalline dimer (βB2-Trp151-Trp151-βB2) by nano-ESI-Q-TOF-MS/MS. Irradiation with UVC light also led to the formation of an intra-chain dimer, which was characterized as βA2-Trp78-Trp81. When beta crystalline was irradiated with a solar simulator (UVA and UVB), it was also possible to observe a dimer which was characterized as βA2-Trp150-Trp150-βA2. The presence of oxidized tryptophan products, including the ditryptophan cross-link, was also evaluated in vivo in the lenses of patients submitted to cataract removal. Beta, alpha and gamma crystalline were the main proteins identified in soluble and insoluble fractions of the lenses. The main post translational modification identified was deamidation. A high content of oxidized methionine and tryptophan residues were identified in proteins present in the insoluble fraction. The main tryptophan oxidation products identified by nano-ESI-Q-TOF-MS/MS were kynurenine and N-formylkynurenine. The presence of covalent dimers in the lenses with cataract was demonstrated by mass analysis. Full MS/MS characterization of the dimers βB1-Trp127-Trp127-βB1 and βB1-Trp193-Trp193-βB1 confirmed that they were linked by a ditryptophan bond. In summary, our data demonstrate that the carbonate radical and UV light can produce ditryptophan dimers in different proteins. Also, the presence of the ditryptophan cross-link was first detected in vivo (human cataract).