Listeria monocytogenes é um bastonete Gram-positivo, anaeróbio facultativo, psicrotrófico, patogênico a humanos e transmitido por alimentos. É causador da listeriose, doença severa que acomete grupos de risco específicos, tais como idosos, imunocomprometidos, gestantes, crianças e recém-nascidos. Neste trabalho foi investigada a expressão diferencial de L. monocytogenes na presença de óleo essencial extraído de Baccharis psiadioides, planta da família Asteraceae popularmente chamada de “alecrim-do-campo”, “vassoura” ou “erva formiga”, utilizada pela população como planta medicinal. Além disso, os genomas de dois diferentes sorotipos de L. monocytogenes, frequentemente associados a surtos de listeriose, foram sequenciados através de plataforma MiSeq Illumina, sequências estas depositadas no GenBank, e comparados com genomas de referência. Anteriormente à execução das análises genômica e transcriptômica, foi determinada a composição do óleo essencial extraído de B. psiadioides utilizado nos experimentos, através de cromatografia gasosa com espectrômetro de massa (GC – MS), a qual demonstrou uma maior quantidade de β-pineno na fração composta majoritariamente por monoterpenos, composto este frequentemente encontrado em plantas medicinais aromáticas e apontado como um dos responsáveis pelo potencial antimicrobiano das mesmas. Os demais resultados obtidos no presente trabalho indicam que o óleo essencial testado apresenta potencial ação bacteriostática na concentração estudada, sendo que genes relacionados à virulência do microrganismo foram menos transcritos na sua presença, ao contrário do que foi observado para genes de resposta ao estresse, que apresentaram maiores níveis de transcrição nesta condição. A comparação genômica entre os genomas bacterianos sequenciados neste trabalho e as cepas referência sugere um maior número de proteínas expressas em L. monocytogenes do sorotipo 4b relacionadas à defesa e metabolismo do microrganismo, indicando mecanismos que podem estar envolvidos com a capacidade deste sorotipo estar mais envolvido nos casos humanos de listeriose. / LLiisstteerriiaa mmoonnooccyyttooggeenneess is a Gram-positive rod-shaped microorganism, facultative anaerobic, psychrotrophic, pathogenic to humans and transmitted by food. It causes listeriosis, a severe disease that affects specific risk groups such as elderly, immunocompromised, pregnant women, children and newborns. In this study, differential expression of LL.. mmoonnooccyyttooggeenneess in the presence of essential oil extracted from BBaacccchhaarriiss ppssiiaaddiiooiiddeess, a plant from AAsstteerraacceeaaee family popularly named as "alecrim-do-campo", "vassoura" or "erva formiga" used by population as a medicinal plant, was investigated. In addition, the genomes of two different LL.. mmoonnooccyyttooggeenneess serotypes, often associated with listeriosis outbreaks, were sequenced through the MiSeq Illumina platform. These sequences were deposited in GenBank and compared with reference genomes. Prior to the execution of genomic and transcriptomic analyzes, composition of the essential oil extracted from BB.. ppssiiaaddiiooiiddeess used in the experiments was determined by gas chromatography with mass spectrometer (GC-MS), which demonstrated a higher amount of β-pinene in the fraction composed mainly by monoterpenes. This compound is often found in aromatic medicinal plants and also pointed as one of those responsible for their antimicrobial potential. The other results obtained in the present study indicate that the essential oil tested has a potential bacteriostatic activity at the concentration studied, and genes related to the virulence of the microorganism were less transcribed in its presence, contrary to what was observed for stress response genes, which presented higher transcription levels on that condition. Comparative genomics between the bacterial genomes sequenced in this work and the reference strains suggests a higher number of proteins expressed in LL.. mmoonnooccyyttooggeenneess serotype 4b related to the defense and metabolism of the microorganism, indicating mechanisms that may be involved with the greater ability of this serotype to cause human listeriosis.

Ready to eat (RTE) meat products are subject to recontamination after industrial processing, mainly by Listeria monocytogenes, a pathogenic microorganism that can persist for a long time in the environment. A RTE meat product that is contaminated with L. monocytogenes due to cross contamination during some stage after industrial processing, such as weighing, slicing or wrapping, can be an important causer of disease, due to absence of a kill step before consumption. The objective of this project was to measure the transfer of L. monocytogenes during slicing of cooked ham (cross contamination) at retail, simulating in the laboratory the practices in commercial slicing, and to develop a predictive model capable of describing this transfer. It was observed that in the first slices obtained after the experimental contamination of the slicer, the counts and the transfer rates of L. monocytogenes were higher than in the subsequent slices, and the counting curves presented a long tail as the slices were obtained. The data demonstrate that the slicer may be a relevant source of cross contamination of L. monocytogenes for RTE meat products, regardless of the level of contamination of the slicer. With the data obtained, a new transfer model was proposed called 4p-2se, as it contained four parameters (4p) and two environments (2se), and was independent of the quantification of the pathogen transferred to the slicer. The proposed model was compared to two pathogen transfer models previously described, and the predicted data presented lower RMSE (Root Mean Sum of squared errors) values than the other models. The 4p-2se model was able to satisfactorily predict the pathogen transfer data during slicing of cooked ham, which could assist the food retail establishments and regulatory agencies in the evaluation and control of cross contamination of RTE foods and in the design of proper risk management strategies. / Os produtos derivados da carne que são prontos para consumo estão sujeitos à recontaminação após o processamento industrial, principalmente por Listeria monocytogenes, um microrganismo patogênico capaz de persistir por longo tempo no ambiente. Um produto cárneo pronto para consumo que se contamina com L. monocytogenes devido à contaminação cruzada durante alguma etapa após o processamento industrial, tal como pesagem, fatiamento ou acondicionamento, pode ser um importante causador de enfermidade, pois não há uma etapa de eliminação do patógeno antes do consumo. Este projeto teve por objetivo mensurar a transferência de L. monocytogenes durante o fatiamento de presunto cozido (contaminação cruzada), simulando em laboratório práticas adotadas nos estabelecimentos comerciais de fatiamento de produtos prontos para o consumo, e desenvolver um modelo preditivo capaz de descrever esta transferência. Foi observado que nas primeiras fatias obtidas após a contaminação experimental do fatiador, as contagens e as taxas de transferência de L. monocytogenes eram mais altas que nas subsequentes, observando-se que as curvas de contagem apresentavam uma longa cauda ao longo do fatiamento. Os dados demonstram que o fatiador pode ser uma fonte importante de contaminação cruzada de L. monocytogenes para produtos cárneos prontos para o consumo fatiados, independentemente do nível de contaminação do fatiador. Com os dados obtidos, foi possível sugerir um novo modelo de transferência, denominado 4p-2se, formado por uma equação com apenas quatro parâmetros (4p) e dois ambientes (2se,) sendo esse modelo independente da quantificação do patógeno transferido para o fatiador. O modelo sugerido foi comparado a outros dois modelos de transferência previamente descritos, observando os dados preditos no modelo 4p-2se apresentavam valores de RMSE (Root Mean Sum of squared erros) mais baixos que os demais modelos. O modelo proposto mostrou-se capaz de predizer satisfatoriamente os dados de transferência de patógeno durante o fatiamento de presunto cozido, podendo auxiliar os estabelecimentos comerciais de alimentos e as agências reguladoras na avaliação e controle da contaminação cruzada de alimento prontos para consumo e na concepção de estratégias adequadas de gestão de risco.

O controle da contaminação de alimentos por Listeria monocytogenes é um desafio para a indústria, pois a bactéria é tolerante a muitas condições adversas que são empregadas para conservação de alimentos. L. monocytogenes é uma bactéria patogênica e pode causar doença de natureza não entérica grave, em pessoas imunocomprometidas, idosas e durante a gestação. No presente estudo foi avaliada a expressão gênica de duas linhagens L. monocytogenes IAL 633 sorotipo 1/2a mais comumente isoladas de alimentos e L. monocytogenes ATCC 19115 sorotipo 4b mais comumente encontradas em surtos hospitalares, utilizando caldos modelos formulados a partir de extratos de carne e peptona de peixe, suplementados ou não com glicose, cloreto de sódio, orégano, pimenta do reino e uma mistura desses ingredientes. Os caldos modelos formulados e suplementados ou não com os ingredientes foram incubados por 1 hora a 25ºC e em seguida, foi realizada extração de RNA e síntese de DNA complementar (cDNA). O cDNA foi amplificado e quantificado por PCR em tempo real, com primers para os genes alvos prfA, inlA, actA e hly, que codificam respectivamente o fator regulador positivo, internalina A, actina e hemolisina, relacionados à virulência desta bactéria. L. monocytogenes IAL 633 sorotipo 1/2a cultivada em caldo de carne acrescido de glicose diminuiu a expressão de prfA, actA e hly, enquanto que em caldo de peixe acrescido do mesmo ingrediente, foi observada maior expressão para os genes inlA, actA e hly. Nos caldos de carne acrescidos de cloreto de sódio houve aumento da expressão de hly em L. monocytogenes ATCC 19115 sorotipo 4b, mas o mesmo ingrediente causou redução da expressão dos genes inlA, actA e hly em L. monocytogenes IAL 633. Em caldo de peixe adicionado de cloreto de sódio, houve concordância no efeito observado para as duas culturas de L. monocytogenes avaliadas, com menor expressão dos genes inlA e prfA. Com pimenta do reino em caldo carne foi observado aumento da expressão de actA para L. monocytogenes ATCC 19115 e redução dos genes prfA, inlA, actA e hly para L. monocytogenes IAL 633. Já em caldo de peixe acrescido de pimenta do reino, a modulação gênica ocorreu somente para L. monocytogenes ATCC 19115, com redução do gene prfA e aumento inlA e actA. O orégano foi o ingrediente que mais afetou a expressão gênica de L. monocytogenes nas condições estudadas, com aumento da expressão de actA em caldo de carne e redução de hly, para L. monocytogenes ATCC 19115. Em contrapartida, para L. monocytogenes IAL 633 ocorreu a repressão dos mesmos genes e também de inlA e prfA, enquanto que em caldo de peixe ocorreu redução somente para o gene prfA. Ainda, em caldo de peixe acrescido de orégano foi observado redução da expressão dos genes prfA e inlA, porém aumento na expressão de actA e hly para L. monocytogenes ATC 19115. A combinação de todos os condimentos também afetou a expressão gênica, sendo que em caldo de carne houve aumento da expressão dos genes prfA e inlA, porém foi reduzida a expressão de actA para L. monocytogenes ATCC 19115. Para a mesma linhagem (ATCC 19115), em caldo de peixe ocorreu a redução da expressão dos genes prfA, inlA e actA. L. monocytogenes IAL 633 em caldo de carne com a mistura de ingredientes teve reduzida a expressão dos genes inlA e actA, essa redução também foi detectada em caldo de peixe para o gene prfA. No presente estudo foi possível observar uma repressão de todos os genes alvos estudados para L. monocytogenes IAL 633 sorotipo 1/2a quando incubada em caldo de carne suplementado com os diferentes ingredientes, mas o mesmo padrão não foi observado para L. monocytogenes ATCC 19115 sorotipo 4b, indicando a complexidade da expressão gênica em função dos componentes de alimentos. / The control of food contamination by Listeria monocytogenes is a challenge for the industry because the bacterium is tolerant to many adverse conditions applied in food preservation. L. monocytogenes can cause serious non-enteric disease in immunocompromised persons, in the elderly and during pregnancy. In the present study it was evaluated the gene expression of two strains, L. monocytogenes IAL 633 serotype 1/2a (most commonly isolated from food) and Listeria monocytogenes ATCC 19115 serotype 4b (more common in clinical cases). Model broths were prepared with meat extract and fish peptone, supplemented or not with glucose, sodium chloride, oregano, black pepper and a mixture of these ingredients. The formulated model broths supplemented or not with the ingredients were incubated for 1 hour at 25° C and next, RNA extraction was performed and complementary DNA (cDNA) was synthesized. The cDNA was amplified and quantified by Real Time PCR with primers for the target genes: positive regulatory factor (prfA), internalin A (inlA), actin (actA) and hemolysin (hly). L. monocytogenes IAL 633 serotype 1/2a grown in meat broth plus glucose decreased expression prfA, actA and hly, while in fish broth, increased expression was observed for inlA, hly, and actA genes. In meat broth added sodium chloride, increased hly expression was observed for L. monocytogenes ATCC 19115 serotype 4b but the same ingredient caused a decrease of the expression of genes inlA and hly in L. monocytogenes IAL 633. In fish broth added sodium chloride, for the two cultures of L. monocytogenes evaluated there was a lower expression of inlA and prfA gene in comparison with the control. With meat broth containing black pepper, it was observed an increased actA expression for L. monocytogenes ATCC 19115 and lower expression of prfA, inlA, actA gene; for L. monocytogenes IAL 633 lower expression of hly was observed in this broth formulation. In fish gravy plus black pepper, modulation of gene expression occurred only in L. monocytogenes ATCC 19115 that showed decrease for prfA and increase for inlA and actA. Oregano was the ingredient that affected most the gene expression of L. monocytogenes under the conditions studied, with increased actA expression in broth and hly reduction for L. monocytogenes ATCC 19115. However, for L. monocytogenes IAL 633 there was repression of the inlA and prfA genes, in fish stock was reduced only for prfA gene. Also in fish stock plus oregano was observed reduction of prfA and inlA genes, but increased expression of the actA and hly for L. monocytogenes ATC 19115. The combination of all the condiments also caused different effects on gene expression, and in broth increased the expression of genes prfA and inlA, but reduced the actA expression for L. monocytogenes ATCC 19115, for the same strain (ATCC 19115) broth fish was a reduction of prfA, inlA and actA genes. L. monocytogenes IAL 633 in broth with the mixture of ingredients reduced the expression of inlA and actA genes, this reduction were also seen in fish broth for the prfA gene. L. monocytogenes has complexity of the modulation of the expression of virulence factors in food, but in the present study it was possible to observe a repression in the modulation pattern of all target genes studied L. monocytogenes IAL 633 serotype 1/2a when incubated in broth supplemented with different ingredients, which did not occur for L. monocytogenes ATCC 19115 serotype 4b.

Alimentos minimamente processados refrigerados prontos para o consumo podem veicular a bactéria Listeria monocytogenes, causadora de infecções graves principalmente em pessoas imunocomprometidas e mulheres grávidas. A aplicação de tratamentos combinados em alimentos é uma alternativa promissora para inibição efetiva de L. monocytogenes e, neste sentido, no presente trabalho foi estudado efeito inibitório de preparações de alecrim pimenta e de bactérias láticas. Foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) de preparações líquidas e secas de alecrim pimenta, em diferentes temperaturas, combinadas ou não com linhagens da bactéria lática C. maltaromaticum (C2, A9b- e A9b+). O uso combinado de culturas de C. maltaromaticum produtoras (C2, A9b+) e não produtora de bacteriocina (A9b-) com ou sem EAP (extrato hidroalcoólico de alecrim pimenta) frente a L. monocytogenes também foi determinado em sistemas de pescado (caldo de peixe modelo, caldo de surubim e homogeneizado de surubim) mantidos a 5ºC por 35 dias. Os resultados de CIM de EAP frente a L. monocytogenes foram de 1,34µl/ml e 0,89µl/ml, respectivamente a 37°C e 5°C, mostrando que houve sinergismo entre EAP e temperatura de refrigeração. Dentre as preparações de alecrim pimenta testadas, EAP apresentou a maior atividade antilisteriana, mas também inibiu as carnobactérias. Não ocorreu sinergismo de EAP combinado com a bacteriocina de C. maltaromaticum C2. Em experimentos de co-inoculação em modelos de pescados, as monoculturas de L. monocytogenes e de C. maltaromaticum (C2, A9b+ e A9b-) alcançaram populações finais entre 106-108 UFC/ml. Em caldo de peixe modelo, EAP sozinho e combinado com culturas de C. maltaromaticum (C2 ou A9b- ou A9b+) apresentou efeito inibitório frente L. monocytogenes. Contudo, C. maltaromaticum (C2 ou A9b- ou A9b+) sem EAP causou pequena inibição de L. monocytogenes. Em caldo de surubim, C. maltaromaticum C2 foi a bactéria lática mais eficiente para inibir L. monocytogenes e houve produção de bacteriocina. Em homogeneizado de surubim com alto nível de inoculação, EAP sozinho e combinado com culturas de C. maltaromaticum (A9b- ou A9b+) apresentou maior efeito inibitório frente L. monocytogenes, enquanto que C. maltaromaticum C2 com EAP inibiu transitoriamente L. monocytogenes, que atingiu população final de aproximadamente 106 UFC/ml. C. maltaromaticum C2 ou A9b- inoculados em homogeneizado de surubim com alto nível de inoculação e sem EAP reduziram 3 log de UFC/ml de L. monocytogenes, mas na mesma condição foi observada a inibição de apenas 1 log de UFC/ml para C. maltaromaticum A9b+. Em homogeneizado de surubim com baixas populações iniciais de L. monocytogenes (<10 UFC/ml) foi observado que EAP sozinho e combinado com culturas de C. maltaromaticum (C2 ou A9b- ou A9b+) apresentou efeito anilisteriano. Entretanto, C. maltaromaticum (C2 ou A9b- ou A9b+) sem EAP não inibiu L. monocytogenes. Foi observado que o uso de EAP e de culturas de carnobactérias tem potencial para inibir L. monocytogenes em pescados e que as aplicações devem ser estudadas cuidadosamente, considerando a influência da matriz alimentícia. / Minimally processed ready-to-eat foods may be contaminated with Listeria monocytogenes, which causes severe infection mainly in immunocompromised persons and in pregnant women. The application of combined treatments in foods is a promising alternative for the effective inhibition of L. monocytogenes and, in this work, the inhibitory effect of alecrim pimenta (Lippia sidoides Cham.) and lactic acid bacteria was studied. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of liquid and dried preparations of alecrim pimenta was determined in different temperatures, combined or not with strains of Carnobacterium maltaromaticum (C2, A9b- and A9b+). The combined use of cultures of C. maltaromaticum bacteriocin-producing (C2 and A9b+).and non bacteriocin-producing (A9b-) with or without EAP (hydroalcoholic extract of alecrim pimenta) towards L. monocytogenes was also determined in model fish systems (fish model broth, surubim fish broth and surubim homogenate, at 5°C for 35 days. The results of MICs of EAP against L. monocytogenes were 1.34 µl/ml and 0.89 µl/ml, respectively at 37ºC and 5°C, indicating synergistic effect between EAP and low temperature. Among the preparations of alecrim pimenta tested, EAP showed the highest antilisterial activity, but it also inhibited carnobacteria. No synergistic effect of EAP combined with bacteriocin of C. maltaromaticum C2 was observed. In co-inoculation studies in model fish systems, monocultures of L. monocytogenes and C. maltaromaticum (C2, A9b+ and A9b-) reached final populations of 106-108 CFU/ml. In fish model broth, EAP alone and combined with cultures of C. maltaromaticum (C2- or A9b or A9b+) presented inhibitory effect against L. monocytogenes. However, C. maltaromaticum (C2 or A9b- or A9b+) without EAP caused weak inhibition of L. monocytogenes. In surubim fish broth, C. maltaromaticum C2 was the most efficient culture for inhibiting L. monocytogenes and bacteriocin was produced. In surubim homogenate with high inoculation level, EAP alone and combined with cultures of C. maltaromaticum (A9b- or A9b+) presented stronger inhibitory effect towards L. monocytogenes, while C. maltaromaticum C2 with EAP caused only initial inhibition of L. monocytogenes, that reached final population of ca. 106 CFU/ml. C. maltaromaticum C2 or A9b- inoculated in surubim homogenate with high inoculation level without EAP reduced 3 log of CFU/ml of L. monocytogenes, but in the same condition it was observed only the reduction of 1 log of CFU/ml for C. maltaromaticum A9b+. In surubim homogenate with low initial populations of L. monocytogenes (<10 CFU/ml) it was observed that EAP alone and combined with co-cultures of C. maltaromaticum (C2 or A9b- or A9b+) presented antilisterial effect. However, C. maltaromaticum (C2 or A9b- or A9b+) without EAP did not inhibit L. monocytogenes. It was observed that the use of EAP and cultures of carnobacteria have potential to inhibit L. monocytogenes in fish and that the applications should be carefully studied, considering the influence of food matrix.

Devido à gravidade da manifestação clínica e pelas altas taxas de mortalidade em populações de risco, o controle e a prevenção da listeriose, doença causada pela L. monocytogenes, representa um importante desafio às autoridades sanitárias. A dificuldade de recuperar organismos envolvidos nos surtos, a sub-notificação e a demora na realização de análises convencionais são alguns dos fatores que retardam ou impedem intervenções em situações de surto. Com o advento da biologia molecular,novas técnicas têm sido empregadas para a identificação e tipificação da L. monocytogenes, com o intuito de contribuir com os estudos epidemiológicos e de vigilância sanitária de alimentos. O presente estudo visou confirmar a taxonomia e o perfil genotípico de 31 cepas isoladas de diversos tipos de carne, supostamente identificadas como L. monocytogenes, por intermédio das técnicas de Reação de Cadeia pela Polimerase (PCR), com o emprego de iniciadores de identificação dos genes 16S rRNA e Internalina A e B, para confirmação da espécie. Os resultados indicaram que apenas 20 (65%) das cepas foram confirmadas como sendo da espécie investigada. Foi realizada ainda a avaliação de similaridade nas 20 cepas confirmadas, através da Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE), que revelou grande diversidade genotípica, caracterizada por 18 diferentes perfis, segundo o coeficiente de similaridade de Pearson. Os resultados demonstraram que as técnicas moleculares são de grande utilidade para a identificação e tipificação de L. monocytogenes, caracterizando-se como importantes ferramentas epidemiológicas. / Due to the seriousness of clinical manifestations and high rates of mortality of the listeriosis disease in populations at risk, control and prevention of this disease, caused by L. monocytogenes, represent an important challenge to sanitation authorities. Difficulties of recovering organisms involved in outbreaks; sub notification; and, the delay in accomplishing conventional analysis are some of the factors that slow-down or even prevent health interventions in outbreak occurrences. With the advent of the molecular biology, new techniques have been employed for identifying and typifying the L. monocytogenes aiming at contributing to studies on epidemiology and sanitary surveillance of foods. The present study aimed at ratifying the taxonomy and the genotypic profile of 31 isolated stocks of varied types of meats supposedly identified as L. monocytogenes by means of the Polymerase Chain Reaction (PCR) employing identification starters of genes 16 rRNA and A and B Internalin in order to confirm the species. Results indicated that only 20 (65.0%) of the stocks were confirmed as being from the investigated species. Another evaluation of similarity were also carried out along with the 20 stocks ratified through pulsed field gel electrophoresis (PFGE), which disclosed a great genotypic diversity characterized by 18 different profiles, according to the Pearson’s similarity coefficient. Results demonstrated that the molecular techniques are very helpful for identifying and typifying the L. monocytogenes, characterizing themselves as important epidemiological tools.

A nisina é uma bacteriocina produzida por Lactococcus factis subsp. lactis e seu uso é permitido como conservador de alimentos em diversos países. Em 1998, o Ministério da Agricultura e Abastecimento do Brasil, em atitude pioneira, autorizou a aplicação de 200 ppm de Nisaplin® em solução de ácido fosfórico grau alimentício na superfície de produtos cárneos embutidos, tais como salsichas, como alternativa tecnológica para aumentar a segurança microbiológica e a vida-de-prateleira desses produtos. Este trabalho avaliou a eficiência deste tratamento na inibição da deterioração microbiana e controle da multiplicação de Listeria monocytogenes em salsichas tratadas com nisina conforme preconizado, e armazenadas sob refrigeração (8°C) e abuso de temperatura (12°C). Salsichas foram coletadas em uma planta processadora da cidade de São Paulo e submetidas a tratamento por imersão em solução de 200 ppm de Nisaplin® em ácido fosfórico grau alimentício a 0,1 % durante 1 minuto. Para o estudo da eficiência do tratamento sobre Listeria monocytogenes, as salsichas foram contaminadas experimentalmente após o tratamento através de imersão em suspensões contendo L. monocytogenes Scott A, resultando em dois níveis de contaminação superficial denominados baixo (103-104UFC/cm2) e alto (106-107 UFOcm2). Controles não tratados e não inoculados foram realizados concomitantemente. As amostras foram embaladas a vácuo e armazenadas a 8°C e 12°C durante 42 dias. A enumeração das populações de microrganismos aeróbios mesófilos, bactérias láticas, microrganismos psicrotróficos e L. monocytogenes foi realizada semanalmente até o final do período de estocagem. Os resultados indicam que não há diferença estatisticamente significativa entre as populações de bactérias aeróbias mesófilas, psicrotróficas e bactérias láticas em produtos tratados e não tratados com solução de Nisaplin® e armazenados a 8°C ou a 12°C. A redução das populações de L. monocytogenes em salsichas tratadas com Nisaplin® quando a contaminação superficial foi de 103 a 104UFC/cm2 e o produto foi armazenado a 8°e foi pequena (<1 log UFC/cm2), porém estatisticamente significativa. Esses resultados indicam serem necessárias medidas adicionais para garantir a segurança do produto. / Nisin is a bacteriocin produced by Lactococcus lactis subsp lactis and its use is permitted as a food preservative in severaI countries. In 1998, the Brazilian Ministry of Agriculture authorized the application of 200 ppm nisin (Nisaplin®) on the surface of meat products by immersion or spraying, as a technological alternative to increase safety and shelf-life of cooked frankfurters. This work intended to evaluate the effectiveness of this treatment on inhibition of microbial spoilage and control of growth of Listeria monocytogenes in frankfurters during storage under refrigeration (8°C) and temperature abuse (12°C). Frankfurters from a local meat industry were submerged for 1 min in nisin solution (200 ppm) in 0.1% phosphoric acid and experimentally contaminated with low (103-104 CFU/cm2) and high (106-107CFU/cm2) levels of L. monocytogenes. Non-treated and non-inoculated controls were also prepared. Counts of lactic acid bacteria, aerobes (mesophilic and psychrotrophic) and L. monocytogenes were carried out weekly up to 42 days, in four genuine repetitions. Results available indicate that the differences of counts of mesophilic and psychrotrophic aerobes, lactic acid bacteria in nisin-treated and non-treated controls are not significant. Reduction of L. monocytogenes populations in nisin-treated frankfurters experimentally contaminated with low (103-104CFU/cm2) leveis of L. monocytogenes stored under refrigeration (8°C) was low (<1 log UFC/cm<SUP2), but statistically significant. Results indicate that additional measures are necessary to ensure the safety of these products.

Alimentos minimamente processados refrigerados prontos para o consumo podem veicular a bactéria Listeria monocytogenes, causadora de infecções graves principalmente em pessoas imunocomprometidas e mulheres grávidas. A aplicação de tratamentos combinados em alimentos é uma alternativa promissora para inibição efetiva de L. monocytogenes e, neste sentido, no presente trabalho foi estudado efeito inibitório de preparações de alecrim pimenta e de bactérias láticas. Foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) de preparações líquidas e secas de alecrim pimenta, em diferentes temperaturas, combinadas ou não com linhagens da bactéria lática C. maltaromaticum (C2, A9b- e A9b+). O uso combinado de culturas de C. maltaromaticum produtoras (C2, A9b+) e não produtora de bacteriocina (A9b-) com ou sem EAP (extrato hidroalcoólico de alecrim pimenta) frente a L. monocytogenes também foi determinado em sistemas de pescado (caldo de peixe modelo, caldo de surubim e homogeneizado de surubim) mantidos a 5ºC por 35 dias. Os resultados de CIM de EAP frente a L. monocytogenes foram de 1,34µl/ml e 0,89µl/ml, respectivamente a 37°C e 5°C, mostrando que houve sinergismo entre EAP e temperatura de refrigeração. Dentre as preparações de alecrim pimenta testadas, EAP apresentou a maior atividade antilisteriana, mas também inibiu as carnobactérias. Não ocorreu sinergismo de EAP combinado com a bacteriocina de C. maltaromaticum C2. Em experimentos de co-inoculação em modelos de pescados, as monoculturas de L. monocytogenes e de C. maltaromaticum (C2, A9b+ e A9b-) alcançaram populações finais entre 106-108 UFC/ml. Em caldo de peixe modelo, EAP sozinho e combinado com culturas de C. maltaromaticum (C2 ou A9b- ou A9b+) apresentou efeito inibitório frente L. monocytogenes. Contudo, C. maltaromaticum (C2 ou A9b- ou A9b+) sem EAP causou pequena inibição de L. monocytogenes. Em caldo de surubim, C. maltaromaticum C2 foi a bactéria lática mais eficiente para inibir L. monocytogenes e houve produção de bacteriocina. Em homogeneizado de surubim com alto nível de inoculação, EAP sozinho e combinado com culturas de C. maltaromaticum (A9b- ou A9b+) apresentou maior efeito inibitório frente L. monocytogenes, enquanto que C. maltaromaticum C2 com EAP inibiu transitoriamente L. monocytogenes, que atingiu população final de aproximadamente 106 UFC/ml. C. maltaromaticum C2 ou A9b- inoculados em homogeneizado de surubim com alto nível de inoculação e sem EAP reduziram 3 log de UFC/ml de L. monocytogenes, mas na mesma condição foi observada a inibição de apenas 1 log de UFC/ml para C. maltaromaticum A9b+. Em homogeneizado de surubim com baixas populações iniciais de L. monocytogenes (<10 UFC/ml) foi observado que EAP sozinho e combinado com culturas de C. maltaromaticum (C2 ou A9b- ou A9b+) apresentou efeito anilisteriano. Entretanto, C. maltaromaticum (C2 ou A9b- ou A9b+) sem EAP não inibiu L. monocytogenes. Foi observado que o uso de EAP e de culturas de carnobactérias tem potencial para inibir L. monocytogenes em pescados e que as aplicações devem ser estudadas cuidadosamente, considerando a influência da matriz alimentícia. / Minimally processed ready-to-eat foods may be contaminated with Listeria monocytogenes, which causes severe infection mainly in immunocompromised persons and in pregnant women. The application of combined treatments in foods is a promising alternative for the effective inhibition of L. monocytogenes and, in this work, the inhibitory effect of alecrim pimenta (Lippia sidoides Cham.) and lactic acid bacteria was studied. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of liquid and dried preparations of alecrim pimenta was determined in different temperatures, combined or not with strains of Carnobacterium maltaromaticum (C2, A9b- and A9b+). The combined use of cultures of C. maltaromaticum bacteriocin-producing (C2 and A9b+).and non bacteriocin-producing (A9b-) with or without EAP (hydroalcoholic extract of alecrim pimenta) towards L. monocytogenes was also determined in model fish systems (fish model broth, surubim fish broth and surubim homogenate, at 5°C for 35 days. The results of MICs of EAP against L. monocytogenes were 1.34 µl/ml and 0.89 µl/ml, respectively at 37ºC and 5°C, indicating synergistic effect between EAP and low temperature. Among the preparations of alecrim pimenta tested, EAP showed the highest antilisterial activity, but it also inhibited carnobacteria. No synergistic effect of EAP combined with bacteriocin of C. maltaromaticum C2 was observed. In co-inoculation studies in model fish systems, monocultures of L. monocytogenes and C. maltaromaticum (C2, A9b+ and A9b-) reached final populations of 106-108 CFU/ml. In fish model broth, EAP alone and combined with cultures of C. maltaromaticum (C2- or A9b or A9b+) presented inhibitory effect against L. monocytogenes. However, C. maltaromaticum (C2 or A9b- or A9b+) without EAP caused weak inhibition of L. monocytogenes. In surubim fish broth, C. maltaromaticum C2 was the most efficient culture for inhibiting L. monocytogenes and bacteriocin was produced. In surubim homogenate with high inoculation level, EAP alone and combined with cultures of C. maltaromaticum (A9b- or A9b+) presented stronger inhibitory effect towards L. monocytogenes, while C. maltaromaticum C2 with EAP caused only initial inhibition of L. monocytogenes, that reached final population of ca. 106 CFU/ml. C. maltaromaticum C2 or A9b- inoculated in surubim homogenate with high inoculation level without EAP reduced 3 log of CFU/ml of L. monocytogenes, but in the same condition it was observed only the reduction of 1 log of CFU/ml for C. maltaromaticum A9b+. In surubim homogenate with low initial populations of L. monocytogenes (<10 CFU/ml) it was observed that EAP alone and combined with co-cultures of C. maltaromaticum (C2 or A9b- or A9b+) presented antilisterial effect. However, C. maltaromaticum (C2 or A9b- or A9b+) without EAP did not inhibit L. monocytogenes. It was observed that the use of EAP and cultures of carnobacteria have potential to inhibit L. monocytogenes in fish and that the applications should be carefully studied, considering the influence of food matrix.

A tecnologia da microencapsulação apresenta várias aplicações na indústria de alimentos. Sabendo-se que diferentes fatores intrínsecos e extrínsecos dos alimentos podem influenciar a produção e atividade antimicrobiana das bacteriocinas produzidas pelas bactérias láticas, este estudo teve como principal objetivo avaliar a funcionalidade da encapsulação de bactérias láticas (BAL) bacteriocinogênicas em alginato de cálcio no controle de Listeria monocytogenes em salame experimentalmente contaminado. Para atingir este objetivo, foram isoladas novas cepas de BAL a partir de salame, que foram identificadas e caracterizadas quanto às propriedades das bacteriocinas produzidas, avaliando-se a influência do processo de encapsulação na produção de bacteriocinas. Foram isoladas quatro cepas produtoras de bacteriocinas, identificadas como Lactobacillus sakei (uma cepa), Lactobacillus curvatus (duas cepas) e Lactobacillus plantarum (uma cepa), nomeadas MBSa1, MBSa2, MBSa3 e MBSa4, respectivamente. As bacteriocinas produzidas pelas quatro cepas foram termoestáveis e com exceção da cepa MBSa2, sensíveis a pH acima de 8. Todas inibiram todas as cepas de Listeria monocytogenes testadas e várias espécies de BAL, mas foram inativas contra bactérias Gram negativas. As bacteriocinas foram purificadas por cromatografia de troca iônica seguida de cromatografia de interação hidrofóbica sequencial e cromatografia de fase reversa, observando-se que L. sakei MBSa1 produz um peptídeo de 4303 Da, com uma sequência parcial de aminoacidos idêntica à sequência presente em sakacina A. As cepas MBSa2 e MBSa3 produzem dois peptídeos ativos cada, idênticos nas duas cepas, um de 4457 Da e outro de 4360 Da, que apresentam sequências parciais idênticas às presentes na sakacina P e na sakacina X, respectivamente. Aparentemente, a cepa L. plantarum MBSa4 produz uma bacteriocina composta por duas sub-unidades. O DNA genômico da cepa L. sakei MBSa1 contém os genes da sakacina A e curvacina A, enquanto o DNA da cepa L. plantarum MBSa4 foi positivo para o gene da plantaricina W. A cepa L. curvatus MBSa2 foi encapsulada em alginato de cálcio e testada quanto à produção de bacteriocinas in vitro, observando-se que o processo de encapsulação não influenciou a produção de bacteriocina. Quando testada in situ, ou seja, no salame experimentalmente contaminado com Listeria monocytogenes, não foi observada ação anti-Listeria por L. curvatus MBSa2 encapsulado e não encapsulado, durante o 30 dias de fabricação do salame. / The microencapsulation technology has several applications in the food industry. Knowing that different intrinsic and extrinsic factors can influence production and antimicrobial activity of bacteriocins produced by lactic acid bacteria in foods, this study aimed at evaluating the functionality of the encapsulation of bacteriocinogenic lactic acid bacteria (LAB) in calcium alginate in the control of Listeria monocytogenes in experimentally contaminated salami. To achieve this goal, new strains of LAB were isolated from salami, identified and characterized for the properties of the produced bacteriocins, evaluating the influence of the encapsulation process in the bacteriocins production. Four bacteriocin producing strains were isolated and identified as Lactobacillus sakei (one strain), Lactobacillus curvatus (two strains) and Lactobacillus plantarum (one strain), named MBSa1, MBSa2, MBSa3 and MBSa4 respectively. The bacteriocins produced by the four strains were thermostable and with the exception of strain MBSa2, sensitive to pH above 8. All inhibited all tested Listeria monocytogenes strains and various species of LAB but were inactive against Gram-negative bacteria. The bacteriocins were purified by cation-exchange followed by sequential hydrophobic-interaction and reversed-phase chromatography, indicating that L. sakei MBSa1 produces a peptide of 4303 Da, with a partial amino acid sequence identical to the sequence present in sakacin A. L. curvatus MBSa2 and MBSa3 produce two active peptides, identical in the two strains, one of 4457 Da and the other of 4360 Da, with partial aminoacid sequences identical to those present in sakacin X and sakacin P, respectively. Apparently, L. plantarum MBSa4 produces a bacteriocin composed of two subunits. Genomic DNA of L. sakei MBSa1indicated that this strain contains genes for sakacin A and curvacin A, while the DNA of L. plantarum MBSa4 was positive for the plantaricin W gene. The strain L. curvatus MBSa2 was encapsulated in calcium alginate and tested for bacteriocin production in vitro, observing that the encapsulation process did not affect the production of bacteriocin. When tested in situ, i.e. in the salami experimentally contaminated with L. monocytogenes was not observed anti-Listeria<i/> action by L. curvatus MBSa2 encapsulated and non-encapsulated during the 30 day manufacture of salami.

Listeria monocytogenes est une bactérie à Gram+, ubiquiste, pathogène intracellulaire d’origine alimentaire, responsable chez l’homme, de nombreuses infections telles que les infections foeto-maternelles, des méningo-encéphalites et des septicémies. La bactérie utilise préférentiellement le glucose qui est transporté via le système phosphoenolpyruvate:sucre phsosphotransferase (PTS) et des perméases non-PTS. Les deux principaux transporteurs de glucose chez L. monocytogenes seraient des PTS de la classe mannose. Le premier est codé par l’opéron manLMN (man) et le deuxième, par l’opéron mpoABCD (mpo). Nous avons, dans un premier temps, mis en évidence le transport de glucose par ces PTS chez L. monocytogenes et aussi identifier d’autres transporteurs non-PTS de glucose. Des tests de croissance en milieu minimum (MM) additionné de glucose et des tests de consommation de glucose ont permis de montrer que les mutants ΔmanL (manL code pour l’EIIABMan) et ΔmanM (manM code pour l’EIICMan) utilisent moins vite le glucose que la souche sauvage AML73 ou EGDe (3 à 4 fois moins vite). Le mutant ΔmpoA (mpoA code pour l’EIIAMpo) montre un phénotype similaire à la souche sauvage tandis que le mutant ΔmpoB (mpoB code pour l’EIIBMpo) utilise 4 à 5 fois moins vite le glucose que la souche sauvage. Des tests de qRT-PCR ont par ailleurs permis de montrer que la délétion du gène mpoA permet une expression constitutive de l’opéron man tandis que la délétion du gène mpoB entraîne une inhibition de l’expression de cet opéron. Nous avons aussi montré que l’opéron man est induit par le glucose et l’opéron mpo est exprimé constitutivement. Le PTSMan est le principal système de transport de glucose chez L. monocytogenes et le PTSMpo pourrait fonctionner comme un senseur de glucose qui en présence de ce sucre stimule l’expression de l’opéron man en régulant l’activité de ManR. Le mutant ΔptsI (ptsI code pour la protéine générale EI du PTS) utilise 8 à 10 fois moins vite le glucose que la souche sauvage et présente une très faible expression de l’opéron man. L’utilisation du glucose (bien que faible) par le mutant ΔptsI permet d’affirmer qu’il existerait des transporteurs non-PTS qui permettraient à ce mutant d’utiliser le glucose. Des tests de complémentation hétérologue dans la souche E. coli LJ140 (incapable de transporter le glucose) ont permis de montrer que les trois protéines GlcU (GlcU1, GlcU2 et GlcU3, identifiées par homologie de séquences aux GlcU d’autres firmicutes) permettent le transport de glucose chez L. monocytogenes mais avec une très faible affinité. Un rôle potentiel du PTS et des transporteurs non-PTS dans la régulation de PrfA a également été mis en évidence par des tests de dosage β-D-glucuronidase à partir de cultures bactériennes réalisées en milieux liquides ou sur géloses et aussi par des tests de qRT-PCR (pour l’expression des gènes actA et hly). Ces tests ont été réalisés à partir de la souche L. monocytogenes AML73 (portant la fusion Phly-gus) et des mutants ΔmanL, ΔmanM, ΔmpoB, ΔmpoA, ΔptsI et glcU (construits dans cette souche). Les mutations manL, manM, mpoB, ptsI entraînent une augmentation de l’activité de PrfA (de 2 à 14 fois) et une augmentation de l’expression des gènes de virulence PrfA-dépendants (hly et actA) est également observée dans les mutants ΔmanL, ΔmanM et ΔmpoB. Les mutations glcU et mpoA ne montrent aucun effet sur l’activité de PrfA. Les mutants montrant une forte activité de PrfA contiennent peu ou pas de protéine EIIABMan qui est supposée jouer un rôle dans la régulation de l’activité de PrfA par le glucose. L’effet des mutations PTS observé sur l’expression des gènes de virulence dépend de PrfA car cet effet disparaît quand le gène prfA est délété dans les mutants ΔmanL, ΔmanM et ΔmpoB. Les mutations montrant un effet sur l’activité de PrfA ont également été étudiées in vitro par des infections des cellules épithéliales (Caco-2 et Jeg-3) avec les différents mutants et également in vivo dans la souris. La délétion du gène ptsI montre un effet dans l’infection plus particulièrement dans l’entrée des bactéries dans les cellules / L. monocytogenes is a ubiquitous foodborne pathogenic Gram-positive bacterium, which can multiply in host cells and infect humans causing septicemia, spontaneous abortion and méningoencephalitis. This bacterium transports glucose via phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase systems (PTS) and non-PTS permeases. Two major glucose-transporting PTSs belong to the mannose class. One is encoded by the manLMN (man) operon and the second by the mpoABCD (mpo) operon. One goal was to study the transport of glucose by the proteins encoded by these operons and to identify non-PTS glucose transporters. Growth studies in MM supplemented with glucose and glucose consumption assays with several mutants revealed that deletion of manL (encodes EIIABMan) or manM (encodes EIICMan) significantly slowed glucose utilization (3- to 4-fold) compared to the WT AML73 or EGDe strain. Deletion of mpoA (encodes EIIAMpo) had no significant effect on glucose utilization (same phenotype as the WT) whereas deletion of mpoB (encodes EIIBMpo) significantly slowed glucose utilization (4- to -5 fold). By using qRT-PCR, we show that expression of the man operon is induced by glucose, whereas the mpo operon is expressed constitutively. Nevertheless, deletion of mpoA causes constitutive man operon expression whereas deletion of mpoB inhibits it. The PTSMpo therefore functions as a constantly synthesized glucose sensor regulating man operon expression. Deletion of ptsI (encodes the general PTS component EI) also inhibits man expression and the ΔptsI mutant was most strongly impeded in glucose utilization. The residual glucose uptake probably owes to three GlcU-like non-PTS transporters. The successful heterelogous complementation of the E. coli LJ140 strain, wich is unable to transport glucose, suggests that the L. monocytogenes GlcU proteins, GlcU1, GlcU2 and GlcU3 (identified by sequences homology to GlcU proteins in other firmicutes) are indeed capable of transporting glucose.A potential role of PTS and non-PTS components in PrfA regulation was studied in the L. monocytogenes AML73 strain (contains a Phly-gus fusion) and in the ΔmanL, ΔmanM, ΔmpoB, ΔmpoA, ΔptsI, glcU mutants derived from it. For that purpose, I carried out β-D-glucuronidase activity tests with bacteria grown either in liquid or on solid medium and qRT-PCR experiments (expression of actA and hly genes). Interestingly, deletion of ptsI, manL, manM and mpoB caused elevated PrfA activity (2- to -14 fold) and elevated expression of virulence gene expression (actA and hly) in the ΔmanL, ΔmanM and ΔmpoB mutants was observed. Nevertheless, glcU inactivation and mpoA deletion had no effect on PrfA activity. The elevated PrfA activity disappeared when the prfA gene was also deleted in the ΔmanL, ΔmanM and ΔmpoB mutants, confirming that the stimulatory effect of the various mutations on virulence gene expression is PrfA-dependent. All mutants exhibiting elevated virulence gene expression contain no or only little unphosphorylated EIIABMan, which we therefore suspect to play a major role in glucose-mediated PrfA inhibition. The effect of the PTS mutations was also tested in in vitro host cells infection assays (Caco-2, Jeg-3 cells) and in an in vivo mouse model. Deletion of ptsI led to elevated infection of the host cells, which probably owes to the elevated synthesis of the InlA protein.

Listeria monocytogenes est un pathogène d'origine alimentaire à multiples facettes caractérisé par sa capacité d'adaptation dans des conditions défavorables et par sa prolifération dans une vaste gamme d'environnements, du sol aux cellules hôtes des mammifères. L'hétérogénéité génétique de L. monocytogenes se reflète dans sa structure clonale diversifiée, ce qui corrèle, dans une certaine mesure, avec des traits phénotypiques tels que la virulence ou la résistance au stress. La thèse portait sur deux phénotypes les plus éminents, la formation d'un biofilm et le potentiel de virulence, sous différents angles et à l'aide des technologies les plus récentes. Tout au long des études, des grands panels d'isolats ont été utilisés pour représenter la diversité intraspécifique. Stimulants défavorables tels que le choc froid et la privation d'éléments nutritifs induits par l'étape d'adhésion bactérienne. L'ajout de NaCl aux cultures de croissance a stimulé la production de biofilm et, de manière surprenante, il a considérablement intensifié la maturation du biofilm de cellules privées de nutriments. Un degré élevé de variation de la productivité relative du biofilm a été observé parmi les sérotypes, les génotypes, de même que les isolats selon les conditions de culture. Cependant, un certain génotype (complexe clonal 26) a révélé de manière caractéristique une production de biofilm plus élevée à froid (10°C), suggérant une association du génotype avec le phénotype du biofilm. Pan-GWAS a identifié un certain nombre de gènes parmi lesquels ceux impliqués dans des fonctions telles que la ‘transformation/compétence’, les ‘gènes liés aux phages’ et le ‘métabolisme du phosphate’ devront faire l'objet d'études plus approfondies sur leur rôle dans la formation du biofilm. L'analyse du séquençage de l'ARN a révélé une grande hétérogénéité intraspécifique dans les profils de transcriptome basal qui mettaient en évidence le rôle du réseau de régulation, y compris certains facteurs transcriptionnels avec des rôles clés dans la virulence tels que σB, PrfA, et CodY. La plasticité transcriptomique entre les lignées I et II ainsi que les génotypes hyper et hypovirulents ont confirmé les caractéristiques évolutives et épidémiologiques de L. monocytogenes. De plus, la voie métabolique centrale a été impliquée dans l'infection dans le système modèle de Galleria mellonella. En conclusion, la thèse a exploré la diversité intraspécifique de L. monocytogenes et a donné lieu à de nombreux résultats phénotypiques, génomiques et transcriptomiques. Grâce à l'approche intégrative des omiques en listeriologie, le présent travail contribuera à dévoiler la physiologie et la pathogenèse de la bactérie. / Conditions and proliferation in a wide range of environments from soil to mammalian host cells. The genetic heterogeneity in L. monocytogenes is reflected on its diversified clonal structure which correlates, to some extent, with phenotypic traits such as virulence or stress resistance. The thesis investigated two most prominent phenotypes, biofilm formation and virulence potential, from various perspectives using state-of-the art technologies. Throughout the studies, large panels of isolates were used to represent the intraspecific diversity. Unfavourable stimuli such as cold shock and nutrient deprivation induced bacterial adhesion step. Addition of NaCl to growth cultures stimulated biofilm production and, surprisingly, it significantly intensified biofilm maturation of nutrient-deprived cells. High degree of variation in relative biofilm productivity was observed among serotypes, genotypes, as well as isolates across culture conditions, however, certain genotype (clonal complex 26) revealed distinctively higher biofilm production under cold temperature (10°C) suggesting an association of genotype with biofilm phenotype. Pan-GWAS identified a number of genes among which those implicated in functions such as ‘transformation/competence’, ‘phage-related genes’, and ‘metabolism of phosphate’ will need further investigations for their roles in biofilm formation. RNA sequencing analysis revealed high intraspecific heterogeneity in basal transcriptome profiles that featured the role of regulatory network including certain transcriptional factors with key roles in virulence such as σB, PrfA, and CodY. The transcriptomic plasticity between lineage I and II as well as hyper- and hypovirulent genotypes supported the evolutionary and epidemiological characteristics of L. monocytogenes. Moreover, the central metabolic pathway was implicated in the infection in Galleria mellonella model system. Conclusively, the thesis explored intraspecific diversity in L. monocytogenes and resulted in ample phenotypic, genomic, and transcriptomic findings. With the integrative omics approach in listeriology, the present work will contribute to unveiling the physiology and pathogenesis of the bacterium.