A análise das proteínas transportadoras de compostos biliares, antes restrita à fisiologia e à fisiopatologia de colestases, recentemente passou a incluir neoplasias hepato-biliares. O presente estudo teve como objetivo caracterizar a expressão das proteínas ABC de transporte biliar BSEP, MDR3, MRP2 e MRP3 em amostras retrospectivamente colecionadas de 80 casos de autópsias de carcinoma hepatocelular (CHC) e 56 casos de ressecção cirúrgica de colangiocarcinoma (CC). Áreas representativas das neoplasias foram organizadas em tissue microarrays e submetidas à pesquisa imuno-histoquímica (IHQ) com o anticorpo policlonal anti-BSEP (HPA019035) e os anticorpos monoclonais anti-BSEP (F6), anti-MDR3 (P3 II-26), anti-MRP2 (M2 III-6) e anti-MRP3 (DTX-1) com amplificação de sinal mediante uso de sistema de polímeros curtos conjugados à peroxidase. A comparação entre a positividade das reações imuno-histoquímicas para cada anticorpo e as variáveis anatomopatológicas foi realizada através dos testes de qui-quadrado de Pearson ou Exato de Fisher. A positividade das reações IHQ cujos anticorpos propiciaram melhor distinção do sinal positivo vs coloração inespecífica de fundo e detecção de casos positivos e/ou melhor capacidade de discriminar as duas neoplasias hepáticas foi comparada com a positividade observada para as reações IHQ com os anticorpos anti-CEA policlonal, anti-Hep-par-1 e anti-Arginase-1. A expressão canalicular de BSEP nos CHC foi observada em 77,3% (58/75) com o anticorpo monoclonal e 75,9% (60/79) com o anticorpo policlonal. Não foi detectada associação significativa da expressão de BSEP em relação ao tamanho, número dos nódulos e grau de diferenciação de CHC, tendo apenas sido significativamente reduzida (P < 0,05) tal reação nos casos de padrão arquitetural mais complexo. A reatividade dos CHC para o anticorpo monoclonal anti-BSEP foi aparentemente menor que a obtida com a expressão canalicular de CEA, Hep-par-1 e Arginase-1 no CHC, mas esses valores não atingiram significância estatística. Todos os casos de colangiocarcinoma foram negativos para reações IHQ para pesquisa de BSEP, resultado significativamente diferente (P=0,0001) do obtido com uso do Ac policlonal anti-CEA (padrão circunferencial) e Hep-par-1, não tendo sido demonstrada diferença significativa (P=0,222) da expressão de BSEP e de Arginase-1. A expressão canalicular de MDR3 foi observada em 56,4% (44/78) dos casos de CHC, não tendo sido detectada associação significativa quanto ao tamanho e número de nódulos. Foi observada expressão significativamente menor de MDR3 nos casos de CHC de padrão mais complexo (P=0,009), e nos casos de maior grau histológico (P=0,005). A expressão de MDR3 em CHC foi significativamente menor que a de CEA, Hep-par-1 e Arginase-1 (P < 0,05). Todos os casos de colangiocarcinoma foram negativos para a avaliação da expressão de MDR3, diferindo significativamente em relação a expressão de CEA (P=0,001), mas não em comparação a Hep-par-1 e Arginase-1 (P > 0,05). As reações IHQ para detecção de MRP2 exibiram positividade canalicular em 92,3% dos casos de CHC e em 96,3% nos casos de CC. A detecção da alta expressão de MRP2 no CHC foi constante (P > 0,05) em comparação ao tamanho, número dos nódulos, padrão arquitetural e grau histológico de diferenciação de CHC assim como, também não apresentou associação (P > 0,05) com a localização, padrão de crescimento e grau de diferenciação do CC. A reação IHQ para MRP3 resultou positiva em 15/80 casos de CH (18,8%). A reatividade IHQ para MRP foi detectada em 24/54 (44,5%) de CC. Diferente dos transportadores descritos acima, a expressão de MRP3 foi preferencialmente basolateral. A positividade para MRP3 não variou (P > 0,05) em relação ao número, tamanho dos nódulos, padrão arquitetural (inclusive os sólidos), e grau de diferenciação (inclusive os menos diferenciados). A proteína MRP3 esteve expressa regularmente (P > 0,05) em todos os casos de CC, apresentando-se reduzida apenas no subtipo histológico ductular (P=0,023). Em conclusão, o excelente contraste de reação, a frequência razoavelmente alta de positividade de CHC e a plena negatividade de CC para BSEP levam-nos a recomendar a introdução do anticorpo monoclonal anti-BSEP no painel adotado para o diagnóstico diferencial dessas duas neoplasias. A alta expressão de MRP2 no CHC e no CC é conservada independentemente dos parâmetros anatomopatológicos avaliados. A expressão do transportador MRP3 mostrou variação dentre os subtipos histológicos de CC, aspecto que torna promissoras pesquisas futuras para avaliação mais detalhada da expressão deste marcador nos colangiocarcinomas / The assessment of biliary transporters, previously restricted to the physiology and pathophysiology of cholestasis, has recently included hepato-biliary neoplasms. The present study aimed to characterize the expression of BSEP, MDR3, MRP2 and MRP3 biliary transport proteins in retrospectively collected samples from 80 cases of autopsy of hepatocellular carcinoma (HCC) and 56 cases of surgical resection of cholangiocarcinoma (CC). Representative areas of the neoplasms were organized into tissue microarrays and submitted to immunohistochemical (IHC) reaction with polyclonal antibody anti-BSEP (HPA019035) and monoclonal antibodies anti-BSEP (F6), MDR3 (P3 II-26), MRP2 (M2 III-6) and MRP3 (DTX-1). Signal amplification was achieved with a short polymer system conjugated to peroxidase. The comparison between the positivity of the immunohistochemical reactions for each antibody and the pathological variables was performed using the Pearson chi-square test or the Fisher\'s exact test. The performance of antibodies which provided a better distinction of the positive signal vs nonspecific background staining and yield better discrimination between the two hepatic neoplasms was compared with that achieved with the already accepted HCC markers polyclonal anti-CEA, Hep-par-1 and Arginase-1. The canalicular expression of BSEP in HCC was observed in 77.3% (58/75) with the monoclonal antibody and 75.9% (60/79) with the polyclonal antibody. BSEP expression levels were not significantly different according to tumor size, number of nodules and degree of differentiation. The frequency of positive reaction of HCC cases with the monoclonal anti-BSEP was apparently lower than that achieved with the canalicular expression of CEA, Hep-par-1 and Arginase-1, but these values did not reach statistical significance. All cases of cholangiocarcinoma were negative for IHC reactions to BSEP, which was significantly different (P=0.0001) from the results obtained with polyclonal anti-CEA (circumferential pattern) and Hep-par-1, but not from the resultas achieved with Arginase-1 (P=0.222). The canalicular expression of MDR3 was observed in 56.4% (44/78) of HCC cases. Among histological variables, only the finding of more complex architecture (P=0.009) and higher histological grade (P=0.005) of HCC yielded, significantly lower expression of MDR3. The expression of MDR3 in HCC was significantly lower than that of CEA, Hep-par-1 and Arginase-1 (P < 0.05). All cases of cholangiocarcinoma were negative for the evaluation of MDR3 expression, differing significantly with that achieved with polyclonal anti-CEA (P=0.001) but not with that achieved with Hep-par-1 or with Arginase-1 (P > 0.05). The IHC reactions with the MRP2 antibody exhibited canalicular positivity in 92.3% of HCC cases and 96.3% in CC cases. High expression of MRP2 in HCC was constant (P > 0.05) despite changes in size, number of nodules, architectural pattern and histological degree of HCC differentiation, as well as no association (P > 0.05) with the location, pattern of growth and degree of differentiation of CC. The IHC reaction for MRP3 was positive in 15/80 cases of HCC (18.8%) and in 24/54 (44.5%) of CC. Unlike the carriers described above, the hepatocellular expression of MRP3 was preferentially basolateral. Positivity for MRP3 did not vary (P > 0.05) in relation to number, nodule size, architectural standard (including solids), and degree of differentiation. The MRP3 protein was expressed regularly (P > 0.05) in different presentations of CC, but significant lower frequency of positivity was found in the ductular histological subtype (P=0.023). In conclusion, the excellent signal-to-noise ratio, reasonably high frequency of HCC positivity and full negativity of CC to BSEP lead us to recommend the introduction of the anti-BSEP monoclonal antibody in the panel adopted for the differential diagnosis of these two neoplasms. The high expression of MRP2 in HCC and in CC is conserved independently of the pathological parameters evaluated herein. The frequency of expression of the MRP3 transporter varied among the histological subtypes of CC, which makes promising future research for a more detailed assessment of the expression of this marker in the cholangiocarcinomas

A carcinogênese é um processo longo que envolve múltiplas etapas na transformação das células normais em malignas. Duas hipóteses têm sido propostas para explicar o potencial heterogêneo de células neoplásicas e o processo de desenvolvimento de neoplasias: o modelo estocástico, em que uma população distinta de células neoplásicas adquire um conjunto de mutações somáticas e desenvolve capacidade metastática e o modelo hierárquico, no qual neoplasias primárias e suas metástases são iniciadas por um número pequeno de células, conhecidas \"cancer stem cells\" (CSC). Assim, o HCC poder ser originado de células tronco/progenitoras hepáticas ou células ovais e hepatócitos. Aventou-se a hipótese neste trabalho que a BI reduz o número de células ovais hepáticas, regulando proteínas (CK19, &#946;-catenina e ALDH1A1) que possam estar relacionadas ao papel destas células na hepatocarcinogênese. Ratos Wistar foram submetidos ao modelo de hepatocarcinogênese do \"Hepatócito Resistente\" e receberam durante 4 semanas consecutivas: 16mg/100g p.c. de &#946;-ionona (BI) ou somente 0,25mL/100g p.c. de óleo de milho (grupo controle - OM). Estes animais foram distribuídos em 4 pontos de eutanásia (P0, P1, P2 e P3 - 7, 14, 21 e 35 dias após a HP respectivamente), para avaliação da cinética das células ovais hepáticas. Foi observado que o tratamento com BI diminuiu a presença de células ovais GST-P positivas e reduziu o percentual de LPN positivas para ALDH1A1, &#946;-catenina e CK19 quando comparado ao do respectivo grupo controle OM. Em conclusão, o tratamento com BI reduziu o número das células ovais, bem como os níveis de proteínas a elas relacionadas e que conferem ao HCC mau prognóstico e maior agressividade. / Carcinogenesis is a long process that involves multiple phases in the transformation of normal cells into malignant. Two hypotheses have been proposed to explain the heterogeneous potential of neoplastic cells and the process of carcinogenesis: a stochastic model in which a distinct population of neoplastic cells acquires a set of somatic mutations and develops metastatic capacity and hierarchical model in which the primary tumors and their metastases are initiated by a small number of cells, known \"cancer stem cells\" (CSC). Therefore, the HCC can be originate from stem/progenitor cells or hepatic oval cells and hepatocytes. Ventured the hypothesis in this work that &#946;-ionone (BI) reduces the number of hepatic oval cells, regulating proteins (CK19, &#946;-catenin and ALDH1A1) that may be related to the role of these cells in hepatocarcinogenesis. Wistar rats were submitted to hepatocarcinogenesis model of \"Resistant Hepatocyte\" and received for 4 consecutive weeks: 16mg/100g body weight of BI or 0,25 mL/100g body weight of corn oil (control group - CO). These animals were euthanized at 4 points (P0, P1, P2 and P3 - 7, 14, 21 and 35 days after PH, respectively) to evaluate the kinetics of hepatic oval cells. It was observed that the treatment of BI decreased the presence of GST-P oval cells positive and reduced the percentage of positive ALDH1A1 LPN, &#946;-catenin and CK19 compared to the respective control group OM. In conclusion, the treatment with BI reduced the number of oval cells as well as the levels of proteins related to them and gives a poor prognosis in HCC and increased aggressiveness.

Introdução: A setorectomia lateral esquerda (SLE) é uma das ressecções hepáticas em que a cirurgia minimamente invasiva tem maior aplicabilidade, sendo considerada um procedimento exequível e passível de padronização técnica. Apesar da crescente aceitação da SLE laparoscópica, o corpo de evidência que suporta a segurança do método, bem como os potenciais benefícios em relação à abordagem convencional são, na sua maioria, provenientes de estudos retrospectivos com número limitado de pacientes. Apenas recentemente, estudos populacionais com grande número de pacientes e estudos randomizados foram publicados acerca do tema. No entanto, estes novos dados não foram avaliados adequadamente por meio de revisão sistemática e metanálise. Desta forma, ainda há carência de evidência de melhor qualidade que possa comprovar os reais benefícios do método. Método: Foi realizada revisão sistemática da literatura nas bases de dados Medline, EMBASE, Cochrane Library Central e LILACS. A data limite de busca foi 31 de dezembro de 2017. Foram incluídos estudos comparativos (retrospectivos e prospectivos) que comparassem os resultados perioperatórios de pacientes submetidos à SLE minimamente invasiva e convencional. Foram excluídos estudos com pacientes submetidos à SLE para doação de fígado. Os desfechos estudados foram taxa de conversão, tempo operatório, perda sanguínea, taxa de transfusão, tempo de internação, morbidade e mortalidade perioperatória (até 90 dias). Resultados: Foram avaliados inicialmente 2.838 artigos, sendo 23 estudos incluídos na metanálise (21 observacionais e 2 randomizados), totalizando 3.415 pacientes. A taxa de conversão foi de 7,4%. Os pacientes submetidos à SLE laparoscópica apresentaram menor perda sanguínea (diferença de médias [DM]=-119,81ml; IC95% -127,90 a -111,72; p < 0,00001; I2=32%; n=618), menor taxa de transfusão (4,1% vs. 10,1%; diferença de risco [DR]=-0,06; IC95% -0,08 a -0,05; p < 0,00001; I2=13%; n=2.968) e menor tempo de internação (DM=-2,02 dias; IC95% -2,15 a -1,89; p < 0,00001; I2=77%; n=3.160). Observou-se ainda diminuição marginal na frequência de complicações (21,4% vs. 27,5%; DR=-0,03; IC95% -0,06 a 0,00; p=0,05; I2=0%; n=3.268) e mortalidade perioperatória (0,3% vs. 1,5%; DR=-0,01; IC95% -0,02 a 0,00; p=0,01; I2=0%, n=3.332) nos pacientes submetidos à cirurgia minimamente invasiva. Não houve diferença quanto ao tempo operatório, complicações biliares, cardíacas e pulmonares entre os grupos. Conclusão: As evidências atuais suportam a abordagem minimamente invasiva como via de acesso padrão para SLE, sendo um procedimento exequível, seguro e associado à redução da perda sanguínea, menor taxa de transfusão e menor tempo de internação hospitalar / Introduction: Left lateral sectionectomy (LLS) is considered a safe and straightforward procedure that can be standardized. Despite increasingly performed, studies comparing laparoscopic and open LLS are mostly retrospective with underpowered sample size. Recently, population-based studies and prospective trials brought new data, however this new evidence was not evaluated in a systematic review and meta-analysis. Therefore, a high quality evidence of the actual benefits of minimally invasive LLS is still lacking. Methods: A systematic review until 31st December 2017 was performed in Medline, EMBASE, Cochrane Library Central and LILACS. Randomized and observational studies comparing perioperative results between laparoscopic and open LLS were included. Studies with patients submitted to LLS for living donation were excluded. Treatment outcomes, including conversion rate, estimated blood loss, transfusion rate, operative time, hospital stay, morbidity and mortality (up to 90th day) were evaluated. Results: A total of 2,838 articles were initially evaluated, and 23 studies (21 observational and 2 randomized trials) were included in the meta-analysis (3,415 patients). The conversion rate was 7.4%. Patients submitted to laparoscopic LLS showed lower blood loss (mean difference [MD]=-119.81ml, 95%CI -127.90 to -111.72, P < 0.00001, I2=32%, N=618), lower transfusion rate (4.1% vs. 10.1%; risk difference [RD]=-0.06, 95%CI -0.08 to -0.05, P < 0.00001, I2=13%, N=2,968), and shorter hospital stay (MD=-2.02 days, 95% CI -2.15 to -1.89, P < 0.00001, I2=77%, N=3,160). Additionally, marginal decrease in overall complications (21.4% vs. 27.5%; RD=-0.03, 95%CI -0.06 to 0.00, P=0.05, I2=0%, N=3,268) and perioperative mortality (0.3% vs. 1.5%; RD=-0.01, 95%CI -0.02 to 0.00, P=0.01, I2=0%; N=3,332) were observed. There was no difference regarding operative time, biliary, cardiac and pulmonary complications between groups. Conclusion: Current evidence supports that laparoscopic LLS is a safe and feasible procedure associated with reduced blood loss, lower transfusion rate and shorter hospital stay. Laparoscopic should be recommended as the gold-standard approach for LLS

By using the acridine orange (AO) staining method to examine the release of contents from lysosomes, it was found that PD released AO into the cytosol in both cell lines. However, the releasing pattern of HepG2 and RHepG2 was quite different. Upon PD treatment, the release of AO in HepG2 cells was graduate and slow while that in RHepG2 was sudden and sharp. / Cancer is one of the leading causes of death in the world. During cancer treatment, development of multidrug resistance (MDR) is always the major cause of failures of chemotherapy in human cancers. In our project, hepatocarcinoma HepG2 and its drug-resistant derivatives RHepG2 with MDR towards doxorubicin (Dox), fenretinide and Taxol were used to examine the differences in their response towards various anti-cancer agents. / From the AO staining, most of the lysosomes were found in the cytosol near the nucleus. However, some lysosomes were found inside the nucleus occasionally. When we double stained the HepG2 cells with DiOC6(3), it was found that the lysosomes were actually located inside the nuclear tubules. However, no such lysosome migration was observed after treating the HepG2 cells with PD. Thus, lysosomes inside the nuclear tubules might not be involved in the PD-induced lysosomal pathway. The mechanism that leads to the migration of lysosomes into the nuclear tubules is still unclear. / From the Western blot analysis, cathepsin D (Cat D) and cathepsin L (Cat L) were both released from the lysosomes after treating the two cell lines with PD. Also, it seemed likely that Cat L was released earlier than that of cyt c. This implies that lysosomal permeabilization is an early event in apoptosis. With the use of siRNA technology, it was found that RHepG2 with the knockdown of Cat D and Cat L were more tolerant and vulnerable towards PD, respectively. These suggest that Cat D and Cat L might act oppositely in the apoptotic pathway. Furthermore, the addition of Cat D inhibitor, pepstatin A, blocked the PD-mediated cell death in RHepG2 cells further confirms that Cat D is a pro-apoptotic protein that is involved in the apoptotic pathway. / In conclusion, PD was a potent anti-cancer agent that could reverse the MDR properties of RHepG2 and kill more RHepG2 cells through lysosomal and mitochondrial apoptotic pathway. / Next, we investigated the underlying killing mechanism and found out that PD switched on both the mitochondrial and lysosomal apoptotic pathway in both cell lines. Our results indicate that PD was able to depolarize mitochondrial membrane potential and release apoptosis inducing factor (AIF) and cytochrome c (cyt c) from the mitochondria to cytosol. Also, PD was able to act on isolated mitochondria directly, causing a stronger mitochondrial membrane permeabilization and more AIF release from the RHepG2 than that of the parental cells. / Polyphyllin D (PD) is a saponin found in a tradition Chinese herb, Paris polyphylla, which has been used to treat liver cancers in China for many years. Interestingly, from the MTT assays, we found out that RHepG2 (IC50: 2.0 muM) was more sensitive towards PD when compared to that of its parental cells (IC50: 3.9 muM). To keep the MDR properties, RHepG2 cells were routinely cultured with 1.2 muM of Dox. When we cultured RHepG2 in the absence of Dox but with 1.2 muM of PD for 28 days, the Pgp expression could not be maintained. However, such high expression level of Pgp was maintained when RHepG2 cells were treated with vincristine (1.2 muM) in the absence of Dox. This indicates that vincristine was a substrate of Pgp to keep the Pgp expression in RHepG2 cells while PD was not. / When incubated with different concentrations of Dox, RHepG2 accumulated less Dox than that of its parental HepG2 cells. When probed by the antibody against P-glycoprotein (Pgp), RHepG2 showed a strong Pgp expression. With the addition of Pgp modulator, verapamil, RHepG2 accumulated more Dox. All these findings indicate that Pgp is a mediator giving rise the MDR in RHepG2 cells. However, RHepG2 had a higher resistance to Dox than its parental line even co-cultured with verapamil. RHepG2 remained viable at the intracellular Dox concentration that was toxic to HepG2 cells. These observations suggest that the MDR properties of RHepG2 involved multiple mechanisms in addition to the effect of Pgp. / Lee, Kit Ying Rebecca. / "August 2007." / Source: Dissertation Abstracts International, Volume: 69-08, Section: B, page: 4735. / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2007. / Includes bibliographical references (p. 241-253). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Electronic reproduction. [Ann Arbor, MI] : ProQuest Information and Learning, [200-] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstracts in English and Chinese. / School code: 1307.

Submitted by Fabíola Silva (fabiola.silva@famerp.br) on 2017-08-03T12:25:59Z No. of bitstreams: 1 andrerodrigueirocpdeoliveira_tese.pdf: 1590220 bytes, checksum: c85526dbe8e00ebf97a87b9215d49485 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-03T12:25:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 andrerodrigueirocpdeoliveira_tese.pdf: 1590220 bytes, checksum: c85526dbe8e00ebf97a87b9215d49485 (MD5) Previous issue date: 2015-11-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP / Introduction: Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor and the sixth most common type of cancer. Liver cirrhosis (LC) and viral hepatitis are their main risk factors. Injured tissues and development process tissues need new blood vessels, i. e., angiogenic process, that initiates by means of vascular endothelial growth factors secretion, that is translated by VEGFA gene and regulated by non-coding RNA, miRNA, that consists of a single strand of approximately 22 nucleotides and has the function of binding to mRNA strand, to inhibit protein translation. Objectives: To quantify VEGFA gene expression and 17 miRNAs predicted as its regulator in HCC and liver cirrhosis; to assess VEGFA gene expression in relation to miRNAs expression and quantify VEGFA protein expression in HCC and liver cirrhosis tissues. Patients and methods: Sixteen samples of HCC tissue, 23 samples of liver cirrhosis tissue and 12 samples of normal liver tissue were collected. Total RNA and proteins were isolated by mirVana PARIS kit. VEGFA gene mRNA quantification and 17 miRNAs predicted as regulators expression was performed by real time quantitative PCR. Customized plates, TaqMan miRNA custom plate, were used for miRNAs. Statistical analysis was performed by one sample t test, Wilcoxon tests and Mann-Whitney test. Results: VEGFA gene expression was found downregulated in HCC and there is negative correlation between gene expression and tumor extension. MicroRNA hsa-miR-637 has showed significance and was down-regulated on samples (mean 0.2003, p=0.0004) in LC, whereas miRNAs hsa-miR-15b (median 0.04015; p=0.0005), hsa-miR-125b (median 0.01876; p=0.0005), hsa-miR-423 (median 0.02650; p=0.0005), hsa-miR-424 (median 0.00462; p=0.0156), hsa-miR-494 (median 0.00877; p=0.0010), hsa-miR-497 (median 0.04487; p=0.0005), hsa-miR-612 (median 0.00679; p=0.0039) and hsamiR-637 (median 0.00166; p=0.0039) are down-regulated in HCC. Conclusions: VEGFA gene expression is down-regulated in HCC. MicroRNA hsa-miR-637 is down-regulated in LC. MicroRNAs hsa-miR-15b, hsa-miR-125b, hsa-miR-423, hsa-miR-424, hsa-miR-494, hsa-miR-497, hsa-miR-612 e hsa-miR-637 are down-regulated in HCC. VEGFA protein expression is low in HCC, corroborating to gene expression found in HCC. / Introdução: O Carcinoma hepatocelular (CHC) é o tipo de tumor primário do fígado e o quinto tipo de câncer mais comum. A cirrose hepática (CH) e as hepatites virais são seus principais fatores de risco. Tecidos lesionados e em processo de crescimento necessitam de novos vasos sanguíneos, ou seja, processo angiogênico, que é iniciado por meio da secreção de fatores de crescimento endoteliais vasculares. Este é produzido a partir do gene VEGFA e regulado por RNA não codificante, o microRNA, que é constituído por uma fita simples de aproximadamente 22 nucleotídeos e tem a função de ligação ao mRNA, para inibição da tradução de proteínas. Objetivos: Quantificar a expressão do gene VEGFA e 17 miRNAs preditos como seus reguladores em CHC e cirrose hepática; avaliar a expressão do gene VEGFA em relação à expressão dos miRNAs e quantificar a expressão das proteínas VEGFA em CHC e cirrose hepática. Casuística e métodos: Foram coletadas 16 amostras de tecido de CHC, 23 amostras de tecido cirrose hepática e 12 amostras de tecido hepático normal para controle. A extração de RNA e proteínas totais foi realizada por meio do kit mirVana PARIS. A quantificação do mRNA do gene VEGFA e dos 17 miRNAs selecionados preditos como reguladores do gene foi realizada por meio da técnica de PCR quantitativa em tempo real. Para os miRNAs foram utilizadas placas customizadas TaqMan miRNA custom plates. A análise estatística foi realizada por teste t de uma amostra, teste de Wilcoxon e teste de Mann-Whitney. Resultados: O gene VEGFA foi encontrado em expressão diminuída em CHC e há correlação negativa entre a expressão e a extensão do tumor. O miRNA hsa-miR-637 mostrou significância e sua expressão foi encontrada diminuída nas amostras (média=0,2003, p=0,0004) em CH, enquanto que os miRNAs hsa-miR-15b (mediana 0,04015; p=0,0005), hsa-miR- 125b (mediana 0,01876; p=0,0005), hsa-miR-423 (mediana 0,02650; p=0,0005), hsa-miR-424 (mediana 0,00462; p=0,0156), hsa-miR-494 (mediana 0,00877; p=0,0010), hsa-miR-497 (mediana 0,04487; p=0,0005), hsa-miR-612 (mediana 0,00679; p=0,0039) e hsa-miR-637 (mediana 0,00166; p=0,0039) estão em expressão diminuída em CHC. Conclusão: A expressão do gene VEGFA encontra-se diminuída em CHC. O microRNA hsa-miR-637 encontra-se em expressão diminuída em CH. Os miRNAs hsa-miR-15b, hsa-miR-125b, hsa-miR- 423, hsa-miR-424, hsa-miR-494, hsa-miR-497, hsa-miR-612 e hsa-miR-637 encontram-se em expressão diminuída em CHC. A expressão das proteínas VEGFA está diminuída em carcinoma hepatocelular, corroborando com o encontrado para a expressão gênica em CHC.

INTRODUÇÃO: O transplante (TX) de fígado corresponde ao tratamento de escolha em pacientes com cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC) precoce irressecável. A recidiva do CHC pós-transplante, entretanto, ainda apresenta impacto na sobrevida dos pacientes transplantados com este tumor. As taxas de recidiva, nos estudos mais recentes, variam de 8 a 20%. O tamanho e número de nódulos, a presença de invasão vascular e de nódulos satélites no explante, são fatores de risco relacionados à recidiva tumoral pós-transplante. No Brasil, observamos um crescimento importante do número de transplantes de fígado, inclusive por CHC. Entretanto, existem poucos estudos nacionais analisando os resultados do transplante hepático por CHC. Os objetivos do nosso estudo foram analisar as características demográficas, clínicas e a evolução dos pacientes submetidos a transplante hepático com CHC no Brasil, avaliando os fatores prognósticos relacionados com a recidiva do CHC pós-transplante e sobrevida e estudar o desempenho dos critérios de seleção para transplante utilizados no nosso país, os \"Critérios de Milão Brasil\" (CMB). MÉTODOS: Estudo de coorte retrospectivo, multicêntrico, para analisar os resultados do transplante de fígado em pacientes com CHC, após a implantação do sistema MELD. Foram incluídos 1.119 pacientes transplantados com CHC, de 07/2006 até 07/2015, em 13 centros de transplante, no Brasil. Características clínicas, demográficas, exames laboratoriais e de imagem e dados anatomopatológicos, foram retrospectivamente analisados e correlacionados com a sobrevida e recidiva do CHC pós-transplante. RESULTADOS: A maioria dos pacientes era do sexo masculino (81%), com uma idade média no TX de 58 anos. A etiologia mais associada ao tumor foi a Hepatite C (VHC), presente em 60% dos casos. O tempo médio de espera em lista foi de 9,8 meses. Setenta e oito pacientes (8%) foram incluídos por \"Down-staging\". Nos exames de imagem do diagnóstico, a maioria dos casos (67%) apresentava um nódulo, com tamanho médio de 30 mm; 85% estavam dentro dos Critérios de Milão (CM), 8% fora dos CM, mas dentro dos \"Critérios de Milão Brasil\" (CMB) e 7% fora de ambos os critérios. O tratamento do CHC em lista foi realizado em 67% dos pacientes. Na análise do explante, 44% apresentavam tumor uninodular, com tamanho médio de 26 mm e a maioria (71%) tinha CHC moderadamente diferenciado. A invasão vascular foi observada em 26% dos casos e nódulos satélites em 22%. No explante, 70% dos pacientes estavam dentro dos CM, 20,5% fora dos CM, mas dentro dos CMB e 9,5%fora de ambos os critérios. A sobrevida global foi de 79% em 1 ano, 72,5% em 3 anos e 63%, em 5 anos, com um tempo médio de seguimento de 28 meses. Excluindo os pacientes que foram a óbito no pós-operatório ( < 30 dias pós-transplante), a sobrevida global foi de 89% em 1 ano e 75%, em 5 anos. A recidiva do CHC pós-TX ocorreu em 8% (86/1.119) dos casos, em um tempo médio de 12 meses. A sobrevida livre de recidiva (SLR) foi de 94,4% em 1 ano e 88,3%, em 5 anos. A recidiva do CHC foi extra-hepática em 55% dos casos, hepática em 27% e hepática e extra-hepática em 18%. Os pacientes transplantados que evoluíram com recidiva tumoral apresentaram alta mortalidade, com uma sobrevida em 1 ano de 34% e em 5 anos de 13%. Em relação aos fatores prognósticos, os pacientes transplantados dentro dos Critérios de Milão apresentaram melhor sobrevida e SLR quando comparados aos pacientes transplantados fora dos CM, mas dentro dos CMB, tanto quando analisamos os dados do diagnóstico, quanto através da análise do explante. Os pacientes transplantados após realização de \"Down-staging\" apresentaram taxas de recidiva e sobrevida semelhantes aos pacientes transplantados sem \"Down-staging\". Os níveis séricos elevados de alfa-fetoproteína (AFP) foram um fator prognóstico importante de sobrevida e recidiva tumoral. Os melhores pontos de corte de AFP encontrados para avaliação do risco de recidiva e sobrevida foram: AFP > 400 ng/ml, no momento do diagnóstico e AFP > 200 ng/ml pré-transplante. Realizamos, também, uma comparação dos \"Critérios de Milão Brasil\" com os Critérios de Milão, através do índice IDI (Integrated Discrimination Index) e os CMB apresentaram performance inferior aos CM, na capacidade de classificar corretamente os pacientes em relação ao risco de recidiva tumoral. Os níveis séricos elevados de AFP, o estádio fora dos Critérios de Milão no momento do diagnóstico e no explante e a presença e invasão vascular no explante, foram fatores de risco independentes de recidiva do CHC pós-transplante e pior sobrevida. A idade > 60 anos e a etiologia da hepatopatia (VHC), também foram fatores prognósticos negativos de sobrevida. CONCLUSÕES: A presença de recidiva tumoral teve grande impacto na sobrevida do paciente transplantado com CHC. O estadiamento tumoral no diagnóstico e no explante, avaliado através dos Critérios de Milão, os níveis séricos elevados de AFP e a presença de invasão vascular no explante foram fatores prognósticos importantes de recidiva do CHC pós-transplante e sobrevida. Os pacientes transplantados após \"Down-staging\" apresentaram evolução pós-transplante semelhante a dos pacientes transplantados sem \"Down-staging\". Os pacientes transplantados fora dos CM, mas dentro dos CMB, apresentaram pior sobrevida, quando comparados aos pacientes dentro dos CM. Os CMB apresentaram desempenho inferior aos CM na capacidade de classificar corretamente os pacientes em relação ao risco de recidiva tumoral / INTRODUCTION: Liver transplantation (LT) is the treatment of choice for patients with cirrhosis and unresectable early hepatocellular carcinoma (HCC). HCC post-transplant recurrence, however, still has an impact on survival. In recent studies, the incidence of HCC recurrence after transplantation ranged from 8% to 20%. Tumor number, size, vascular invasion and satellite nodules have emerged as risk factors for HCC recurrence. In Brazil, in the last decade, we observed a significant increase in the number of liver transplants performed, including in patients with HCC. However, there are few national studies analyzing the results of liver transplantation for HCC. The aim of this multicentric study was to analyze the demographic characteristics, clinical features and outcomes of patients submitted to liver transplantation with HCC in Brazil, evaluate prognostic factors related to HCC post-transplant recurrence and survival, and study the performance of the national selection criteria for liver transplantation, the \"Brazilian Milan Criteria\" (BMC). METHODS: We conducted a national, multicentric, retrospective study to analyze the results of liver transplantation in patients with HCC, in \"MELD era\". Medical records of 1,119 transplanted patients with HCC between 07/2006 and 07/2015, from 13 transplant centers in Brazil, were collected. Patient and tumor characteristics, radiologic and pathologic data were retrospectively analyzed and correlated with post-transplant HCC recurrence and survival. RESULTS: Of the 1,119 HCC transplanted patients, median age was 57 years and 81% were male. Etiology of liver disease was HCV in 60%. Median time on transplant list was 9.8 months. Seventy-eight patients (8%) were included after \"Down-staging\". At diagnosis, most patients had uninodular HCC (67%) and median tumor burden was 30 mm. At diagnosis, in imaging studies, 85% of patients were within the Milan criteria (MC), 8% out of the MC but within the \"Brazilian Milan Criteria\" (BMC) and 6% out of both criteria. During the waiting list period, HCC treatment was performed in 67%. In explant analysis, tumor was uninodular in 46% and moderately differentiated in the majority of cases (71%). Median HCC size was 26 mm. Vascular invasion and satellite nodules were observed in 26% and 22% of patients, respectively. In explant, 70% of patients were within Milan Criteria, 20.5% outside MC but within BMC and 9.5% out of both criteria. Mean follow-up was 28 months, an overall survival was 79% in 1 year, 72.5% in 3 years and 63% in 5 years. Excluding patients who died within 30 days after surgery, overall survival was 89% in 1 year and 75% in 5 years. HCC post-transplant recurrence occurred in 86/1,119 (8%) cases, at a mean time of 12 months. Recurrence-free survival (RFS) was 94.4% in 1 year and 88.3% in 5 years. Sites of recurrence were extrahepatic in 55%, hepatic in 27% and both hepatic and extrahepatic in 18%. Transplanted patients with tumor recurrence presented high mortality, with 1-year survival rate of 34% and 5-year survival rate of 13%. Analyzing the prognostic factors, patients transplanted under Milan Criteria, in radiologic or explant analysis, presented better survival and RFS when compared to patients transplanted outside MC, but within BMC. Patients submitted to liver transplantation after \"Down-staging\" present long-term survival and RFS similar to patients transplanted without \"Down-staging\". Alpha-fetoprotein (AFP) levels were an important pre-transplant prognostic factor for tumor survival and recurrence. The best AFP cut off points found for relapse risk and survival assessment were: AFP at diagnosis > 400 ng / ml and AFP pre-transplant > 200 ng / ml. We also performed a comparison of the \"Brazilian Milan Criteria\" with the Milan Criteria through the Integrated Discrimination Index (IDI). The BMC presented a lower performance than the MC, in the ability to correctly classify patients in relation to the risk of relapse. Elevated AFP levels before liver transplantation, tumor outside Milan Criteria at diagnosis and in explant, and vascular invasion, were independent risk factors for post-transplant HCC recurrence and worse survival. Age > 60 years and etiology of liver disease (HCV), were also negative prognostic factors for survival. CONCLUSIONS: The presence of tumor recurrence had a major impact on survival of transplanted patients with HCC. Tumor staging, evaluated by Milan Criteria on imaging studies or explant analysis, high serum AFP levels and presence of vascular invasion in explant were important prognostic factors for post-transplant HCC recurrence and survival. Patients transplanted after Down-staging presented long-term outcomes similar to patients transplanted under conventional criteria. Patients transplanted outside Milan Criteria, but within \"Brazilian Milan Criteria\" presented worse survival, when compared to patients within MC. The BMC showed lower performance than MC in the ability to correctly classify patients in relation to the risk of tumor recurrence

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2006. / Härtill 4 uppsatser.

Thesis (Ph. D.)--University of Oklahoma. / Bibliography: leaves 155-161.

A análise das proteínas transportadoras de compostos biliares, antes restrita à fisiologia e à fisiopatologia de colestases, recentemente passou a incluir neoplasias hepato-biliares. O presente estudo teve como objetivo caracterizar a expressão das proteínas ABC de transporte biliar BSEP, MDR3, MRP2 e MRP3 em amostras retrospectivamente colecionadas de 80 casos de autópsias de carcinoma hepatocelular (CHC) e 56 casos de ressecção cirúrgica de colangiocarcinoma (CC). Áreas representativas das neoplasias foram organizadas em tissue microarrays e submetidas à pesquisa imuno-histoquímica (IHQ) com o anticorpo policlonal anti-BSEP (HPA019035) e os anticorpos monoclonais anti-BSEP (F6), anti-MDR3 (P3 II-26), anti-MRP2 (M2 III-6) e anti-MRP3 (DTX-1) com amplificação de sinal mediante uso de sistema de polímeros curtos conjugados à peroxidase. A comparação entre a positividade das reações imuno-histoquímicas para cada anticorpo e as variáveis anatomopatológicas foi realizada através dos testes de qui-quadrado de Pearson ou Exato de Fisher. A positividade das reações IHQ cujos anticorpos propiciaram melhor distinção do sinal positivo vs coloração inespecífica de fundo e detecção de casos positivos e/ou melhor capacidade de discriminar as duas neoplasias hepáticas foi comparada com a positividade observada para as reações IHQ com os anticorpos anti-CEA policlonal, anti-Hep-par-1 e anti-Arginase-1. A expressão canalicular de BSEP nos CHC foi observada em 77,3% (58/75) com o anticorpo monoclonal e 75,9% (60/79) com o anticorpo policlonal. Não foi detectada associação significativa da expressão de BSEP em relação ao tamanho, número dos nódulos e grau de diferenciação de CHC, tendo apenas sido significativamente reduzida (P < 0,05) tal reação nos casos de padrão arquitetural mais complexo. A reatividade dos CHC para o anticorpo monoclonal anti-BSEP foi aparentemente menor que a obtida com a expressão canalicular de CEA, Hep-par-1 e Arginase-1 no CHC, mas esses valores não atingiram significância estatística. Todos os casos de colangiocarcinoma foram negativos para reações IHQ para pesquisa de BSEP, resultado significativamente diferente (P=0,0001) do obtido com uso do Ac policlonal anti-CEA (padrão circunferencial) e Hep-par-1, não tendo sido demonstrada diferença significativa (P=0,222) da expressão de BSEP e de Arginase-1. A expressão canalicular de MDR3 foi observada em 56,4% (44/78) dos casos de CHC, não tendo sido detectada associação significativa quanto ao tamanho e número de nódulos. Foi observada expressão significativamente menor de MDR3 nos casos de CHC de padrão mais complexo (P=0,009), e nos casos de maior grau histológico (P=0,005). A expressão de MDR3 em CHC foi significativamente menor que a de CEA, Hep-par-1 e Arginase-1 (P < 0,05). Todos os casos de colangiocarcinoma foram negativos para a avaliação da expressão de MDR3, diferindo significativamente em relação a expressão de CEA (P=0,001), mas não em comparação a Hep-par-1 e Arginase-1 (P > 0,05). As reações IHQ para detecção de MRP2 exibiram positividade canalicular em 92,3% dos casos de CHC e em 96,3% nos casos de CC. A detecção da alta expressão de MRP2 no CHC foi constante (P > 0,05) em comparação ao tamanho, número dos nódulos, padrão arquitetural e grau histológico de diferenciação de CHC assim como, também não apresentou associação (P > 0,05) com a localização, padrão de crescimento e grau de diferenciação do CC. A reação IHQ para MRP3 resultou positiva em 15/80 casos de CH (18,8%). A reatividade IHQ para MRP foi detectada em 24/54 (44,5%) de CC. Diferente dos transportadores descritos acima, a expressão de MRP3 foi preferencialmente basolateral. A positividade para MRP3 não variou (P > 0,05) em relação ao número, tamanho dos nódulos, padrão arquitetural (inclusive os sólidos), e grau de diferenciação (inclusive os menos diferenciados). A proteína MRP3 esteve expressa regularmente (P > 0,05) em todos os casos de CC, apresentando-se reduzida apenas no subtipo histológico ductular (P=0,023). Em conclusão, o excelente contraste de reação, a frequência razoavelmente alta de positividade de CHC e a plena negatividade de CC para BSEP levam-nos a recomendar a introdução do anticorpo monoclonal anti-BSEP no painel adotado para o diagnóstico diferencial dessas duas neoplasias. A alta expressão de MRP2 no CHC e no CC é conservada independentemente dos parâmetros anatomopatológicos avaliados. A expressão do transportador MRP3 mostrou variação dentre os subtipos histológicos de CC, aspecto que torna promissoras pesquisas futuras para avaliação mais detalhada da expressão deste marcador nos colangiocarcinomas / The assessment of biliary transporters, previously restricted to the physiology and pathophysiology of cholestasis, has recently included hepato-biliary neoplasms. The present study aimed to characterize the expression of BSEP, MDR3, MRP2 and MRP3 biliary transport proteins in retrospectively collected samples from 80 cases of autopsy of hepatocellular carcinoma (HCC) and 56 cases of surgical resection of cholangiocarcinoma (CC). Representative areas of the neoplasms were organized into tissue microarrays and submitted to immunohistochemical (IHC) reaction with polyclonal antibody anti-BSEP (HPA019035) and monoclonal antibodies anti-BSEP (F6), MDR3 (P3 II-26), MRP2 (M2 III-6) and MRP3 (DTX-1). Signal amplification was achieved with a short polymer system conjugated to peroxidase. The comparison between the positivity of the immunohistochemical reactions for each antibody and the pathological variables was performed using the Pearson chi-square test or the Fisher\'s exact test. The performance of antibodies which provided a better distinction of the positive signal vs nonspecific background staining and yield better discrimination between the two hepatic neoplasms was compared with that achieved with the already accepted HCC markers polyclonal anti-CEA, Hep-par-1 and Arginase-1. The canalicular expression of BSEP in HCC was observed in 77.3% (58/75) with the monoclonal antibody and 75.9% (60/79) with the polyclonal antibody. BSEP expression levels were not significantly different according to tumor size, number of nodules and degree of differentiation. The frequency of positive reaction of HCC cases with the monoclonal anti-BSEP was apparently lower than that achieved with the canalicular expression of CEA, Hep-par-1 and Arginase-1, but these values did not reach statistical significance. All cases of cholangiocarcinoma were negative for IHC reactions to BSEP, which was significantly different (P=0.0001) from the results obtained with polyclonal anti-CEA (circumferential pattern) and Hep-par-1, but not from the resultas achieved with Arginase-1 (P=0.222). The canalicular expression of MDR3 was observed in 56.4% (44/78) of HCC cases. Among histological variables, only the finding of more complex architecture (P=0.009) and higher histological grade (P=0.005) of HCC yielded, significantly lower expression of MDR3. The expression of MDR3 in HCC was significantly lower than that of CEA, Hep-par-1 and Arginase-1 (P < 0.05). All cases of cholangiocarcinoma were negative for the evaluation of MDR3 expression, differing significantly with that achieved with polyclonal anti-CEA (P=0.001) but not with that achieved with Hep-par-1 or with Arginase-1 (P > 0.05). The IHC reactions with the MRP2 antibody exhibited canalicular positivity in 92.3% of HCC cases and 96.3% in CC cases. High expression of MRP2 in HCC was constant (P > 0.05) despite changes in size, number of nodules, architectural pattern and histological degree of HCC differentiation, as well as no association (P > 0.05) with the location, pattern of growth and degree of differentiation of CC. The IHC reaction for MRP3 was positive in 15/80 cases of HCC (18.8%) and in 24/54 (44.5%) of CC. Unlike the carriers described above, the hepatocellular expression of MRP3 was preferentially basolateral. Positivity for MRP3 did not vary (P > 0.05) in relation to number, nodule size, architectural standard (including solids), and degree of differentiation. The MRP3 protein was expressed regularly (P > 0.05) in different presentations of CC, but significant lower frequency of positivity was found in the ductular histological subtype (P=0.023). In conclusion, the excellent signal-to-noise ratio, reasonably high frequency of HCC positivity and full negativity of CC to BSEP lead us to recommend the introduction of the anti-BSEP monoclonal antibody in the panel adopted for the differential diagnosis of these two neoplasms. The high expression of MRP2 in HCC and in CC is conserved independently of the pathological parameters evaluated herein. The frequency of expression of the MRP3 transporter varied among the histological subtypes of CC, which makes promising future research for a more detailed assessment of the expression of this marker in the cholangiocarcinomas

A carcinogênese é um processo longo que envolve múltiplas etapas na transformação das células normais em malignas. Duas hipóteses têm sido propostas para explicar o potencial heterogêneo de células neoplásicas e o processo de desenvolvimento de neoplasias: o modelo estocástico, em que uma população distinta de células neoplásicas adquire um conjunto de mutações somáticas e desenvolve capacidade metastática e o modelo hierárquico, no qual neoplasias primárias e suas metástases são iniciadas por um número pequeno de células, conhecidas \"cancer stem cells\" (CSC). Assim, o HCC poder ser originado de células tronco/progenitoras hepáticas ou células ovais e hepatócitos. Aventou-se a hipótese neste trabalho que a BI reduz o número de células ovais hepáticas, regulando proteínas (CK19, &#946;-catenina e ALDH1A1) que possam estar relacionadas ao papel destas células na hepatocarcinogênese. Ratos Wistar foram submetidos ao modelo de hepatocarcinogênese do \"Hepatócito Resistente\" e receberam durante 4 semanas consecutivas: 16mg/100g p.c. de &#946;-ionona (BI) ou somente 0,25mL/100g p.c. de óleo de milho (grupo controle - OM). Estes animais foram distribuídos em 4 pontos de eutanásia (P0, P1, P2 e P3 - 7, 14, 21 e 35 dias após a HP respectivamente), para avaliação da cinética das células ovais hepáticas. Foi observado que o tratamento com BI diminuiu a presença de células ovais GST-P positivas e reduziu o percentual de LPN positivas para ALDH1A1, &#946;-catenina e CK19 quando comparado ao do respectivo grupo controle OM. Em conclusão, o tratamento com BI reduziu o número das células ovais, bem como os níveis de proteínas a elas relacionadas e que conferem ao HCC mau prognóstico e maior agressividade. / Carcinogenesis is a long process that involves multiple phases in the transformation of normal cells into malignant. Two hypotheses have been proposed to explain the heterogeneous potential of neoplastic cells and the process of carcinogenesis: a stochastic model in which a distinct population of neoplastic cells acquires a set of somatic mutations and develops metastatic capacity and hierarchical model in which the primary tumors and their metastases are initiated by a small number of cells, known \"cancer stem cells\" (CSC). Therefore, the HCC can be originate from stem/progenitor cells or hepatic oval cells and hepatocytes. Ventured the hypothesis in this work that &#946;-ionone (BI) reduces the number of hepatic oval cells, regulating proteins (CK19, &#946;-catenin and ALDH1A1) that may be related to the role of these cells in hepatocarcinogenesis. Wistar rats were submitted to hepatocarcinogenesis model of \"Resistant Hepatocyte\" and received for 4 consecutive weeks: 16mg/100g body weight of BI or 0,25 mL/100g body weight of corn oil (control group - CO). These animals were euthanized at 4 points (P0, P1, P2 and P3 - 7, 14, 21 and 35 days after PH, respectively) to evaluate the kinetics of hepatic oval cells. It was observed that the treatment of BI decreased the presence of GST-P oval cells positive and reduced the percentage of positive ALDH1A1 LPN, &#946;-catenin and CK19 compared to the respective control group OM. In conclusion, the treatment with BI reduced the number of oval cells as well as the levels of proteins related to them and gives a poor prognosis in HCC and increased aggressiveness.