Résumé : Le syndrome du X fragile (SXF) est la première cause de déficience intellectuelle héréditaire et résulte de mutations dans le gène FMR1 menant à l’absence d’expression de la protéine FMRP. Chez la souris déficiente en FMRP (KO-fmr1), des travaux récents ont montré une suractivation de la voie ERK qui jouerait un rôle important dans la physiopathologie du SXF. La lovastatine est un inhibiteur de la HMG-CoA réductase, utilisée pour traiter l’hypercholestérolémie. Parmi ses effets pléiotropes, elle inhiberait également ERK. Nous avons émis l’hypothèse que la lovastatine pourrait compenser en partie l’absence de FMRP et avoir des effets cognitifs positifs chez les individus avec SXF. Objectifs: Évaluer l’efficacité de la lovastatine à réduire le score global de l’ABC-C (Aberrant Behavior Checklist-Community), ainsi que le score de chaque sous-domaine d’ABC-C. Vérifier l’innocuité de la lovastatine pendant le traitement. Méthodes : Une étude prospective, non-randomisée a été réalisée sur une période de 12 semaines. Seize participants avec SXF (âgés de 10 à 31 ans), ont reçu des doses croissantes de la lovastatine (20 mg et 40 mg). Résultats : Des améliorations ont été observées au niveau du comportement aberrant soit le score total de l’ABC-C (p=0.005), ainsi que les sousdomaines: Hyperactivité (p=0.002), Léthargie(p=0.011), Stéréotypie (p=0.025) et Retrait social (p=0.003). Comme attendu, la lovastatine a été bien toléré sans aucun effet indésirable grave observé. Conclusion : Nos résultats suggèrent que la lovastatine peut avoir des effets bénéfices chez les individus avec le SXF. Une étude randomisée, placébocontrôlée est nécessaire pour valider nos trouvailles. / Abstract : Background: Fragile X Syndrome (FXS) results from dynamic mutations leading ultimately to the absence of expression of the Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP). It is characterized by synaptic upregulated protein synthesis and immature dendritic spines associated with altered brain plasticity and cognitive functions. Recent work in Fmr1 knockout mice has shown that lovastatin, an inhibitor of Ras-ERK1/2, normalized hippocampus protein synthesis. We hypothesize that lovastatin, as a diseasemodifying drug, would counterweigh the absence of FMRP and improve brain development and learning abilities. Here we report a phase I study to assess the safety and efficacy of lovastatin in individuals with FXS. Methods: A total of 15 subjects (13 males, 6-31 years old) were treated with escalating doses of lovastatin (up to 40 mg) for three months. Their behaviour were assessed before and after treatment using the Aberrant Behavioral Checklist – Community (ABC-C) total score (primary outcome), as well as domains of the FXS validated version of the ABC-C (secondary outcomes). Results: The treatment was well tolerated and minimal adverse effects were reported. Significant improvement in the primary outcome (P < 0.005), as well as in secondary outcomes, were observed in the majority of the subjects (12/15). Conclusions: We believe long-term sustained treatment with diseased-modifying drugs would be necessary in order to improve behaviour and learning. Lovastatin, well known for its long-term security profile, reveals itself as a strong candidate to that purposes. Nevertheless, a larger placebo-controlled trial of lovastatin in this population is warranted in order to confirm its efficacy.

Die Strahlenreaktion der Mundschleimhaut ist die häufigste und Dosis limitierende frühe Nebenwirkung der Radio(chemo)therapie von Kopf-Hals-Tumoren. Sie führt zu einer starken Beeinträchtigung des Allgemeinzustandes sowie der Lebensqualität der Patienten. Nicht selten muss die Strahlentherapie unterbrochen werden, wodurch sich die Tumorheilungschance deutlich reduziert. Trotz zahlreicher experimenteller und klinischer Ansätze konnte bisher kein allgemein gültiges Konzept zur Prophylaxe und Therapie der radiogenen Mucositis enoralis in der Klinik etabliert werden. Die Pathogenese der oralen Mukositis ist komplex. Sie wird durch eine Vielzahl von Faktoren beeinflusst, darunter verschiedene Signalkaskaden, wie die Rho- und Ras-vermittelte Signaltransduktion. Die vorliegende tierexperimentelle Arbeit untersuchte deshalb den Ein-fluss des 3-Hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoenzymA-Reduktase-Hemmers Lovastatin, welcher unter anderem die genannten Signalkaskaden modifiziert, auf die Reaktion der Mundschleimhaut auf fraktionierte Bestrahlung. Ergänzende histologische Untersuchungen sollen weitere Anhaltspunkte auf den Wirkmechanismus von Lovastatin geben. Alle Untersuchungen erfolgten am etablierten Tiermodell der Schleimhaut der Zungenunter-seite der Maus (Inzucht-Stamm C3H/Neu). Die Bestrahlung wurde als fraktionierte, perkutane Schnauzenbestrahlung (200 kV Röntgenstrahlung) mit wöchentlich 5x3 Gy über eine (Tag 0-4) bzw. zwei Wochen (Tag 0-4 und 7-11) durchgeführt. Das Bestrahlungsfeld war dabei so definiert, dass die gesamte Schnauze bis zu einer Ebene von den Augen bis zur Kehle, und damit die gesamte Zunge, eingeschlossen wurden. Daraus resultierte zunächst nur ein subklinischer Effekt an der Mundschleimhaut. Durch die lokale Testbestrahlung (25 kV Röntgen-strahlung) eines 3x3 mm² großen Feldes auf der Zungenunterseite wurde eine klinische Reaktion indiziert. Die lokale Bestrahlung erfolgte mit jeweils 5 gestaffelten Dosisgruppen (je-weils 10 Tiere zur Generierung vollständiger Dosis-Effekt-Kurven (Logit-Analyse). Als quantaler Endpunkt diente das Auftreten einer Ulzeration, entsprechend einer konfluenten Mukositis Grad 3 nach RTOG/EORTC-Klasifikation. Die Latenzzeit zwischen lokaler Bestrahlung und Diagnosestellung und die Dauer der Ulzeration bis zur Reepithelialisierung beschreiben den zeitlichen Verlauf der Veränderungen. Der Beschreibung des Dosiseffektes dienten die ED50-Werte (Dosis, bei der bei 50 % der Tiere eine Ulzeration innerhalb des Testfeldes zu erwarten ist) und deren Standardabweichung σ bzw. deren 95 %-Vertrauensbereiche. Für histologische Untersuchungen wurden an 16 aufeinander folgenden Tagen jeweils 3 Tiere einer Versuchsgruppe getötet. Als Kontrolle dienten 3 unbehandelte Tiere. Die Zungen wurden entnommen und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbte Schnitte angefertigt. Anschließend erfolgte die lichtmikroskopische Auswertung von mindestens 2 mm Epithellänge pro Präparat, wobei die Zahl der kernhaltigen Zellen in der Funktions- und Germinativschicht sowie die Dicken der Germinativ-, Funktions- und Keratinschicht bestimmt wurden. Lovastatin (1A Pharma, Oberhaching) wurde in einer Dosierung von 16 mg/kg, entsprechend der empfohlenen Dosis beim Menschen, appliziert. Die Gabe des in destillierten Wasser suspendierten Medikamentes, erfolgte täglich per os über eine Schlundsonde. Bei fraktionierter Bestrahlung über 1 Woche erhielten die Versuchstiere Lovastatin von Tag -3 (bezogen auf den Tag der ersten Fraktion) bis Tag +7 oder bis zur Ausheilung der Ulzerationen. Bei fraktionierter Bestrahlung über 2 Wochen wurden 4 Behandlungszeiträume von Lovastatin getestet: Tag -3 bis +4, Tag +7 bis +14, Tag 0 bis +14 oder Tag 0 bis zur Heilung der Ulzeration. Für die histologischen Untersuchungen erfolgte eine fraktionierte Bestrahlung mit 10x3 Gy über 2 Wochen. An den Tagen 0-14 bzw. 7-14 wurde Lovastatin verabreicht. Als Kontrolle dienten die Versuchsgruppen, welche eine alleinige Bestrahlung bzw. Lovastatingabe erhielten. Zur Testung der Verträglichkeit des Medikamentes erhielten zunächst 5 Versuchstiere einmal täglich 16 mg/kg Lovastatin über einen Zeitraum von 25 Tagen. Dabei konnten keine wesentlichen unerwünschten Arzneimittelwirkungen beobachtet werden. Die alleinige Einzeitbestrahlung ergab einen ED50-Wert von 11,5±1,0 Gy mit einer signifikan-ten Dosisabhängigkeit der Ulkusfrequenz (p=0,0007). Die Latenzzeit war 12,2±0,5 Tage, die Ulkusdauer 3,1±0,6 Tage. Der ED50-Wert für die alleinige fraktionierte Bestrahlung über 1 Woche war 8,6±1,4 Gy (p=0,0002). Es wurden für die Latenzzeit 9,7±0,8 Tage und für die Ulkusdauer 5,4±1,1 Tage bestimmt. In beiden Versuchsprotokollen mit Lovastatingabe und fraktionierter Bestrahlung über eine Woche konnte eine signifikante Erhöhung der ED50-Werte gegenüber der alleinigen Fraktionierung festgestellt werden. Bei Medikamentengabe von Tag -3 bis +7 war die ED50 10,1±0,1 Gy, von Tag -3 bis zur Ausheilung 11,6±0,7 Gy. Die mittleren Latenzzeiten waren gegenüber der Kontrolle nicht signifikant verändert, es konnte jedoch in beiden Versuchsarmen eine Verkürzung der mittleren Ulkusdauer um ca. 2 Tage festgestellt werden. Für die Testbestrahlung nach alleiniger fraktionierter Bestrahlung über 2 Wochen ergab sich ein ED50-Wert von 7,9±1,3 Gy (p=0,0002). Für die Latenzzeit wurden 11,8±0,8 Tage und für die Ulkusdauer 4,5±1,0 Tage ermittelt. Die Gabe von Lovastatin führte in allen Behandlungs-protokollen zu einer signifikanten Erhöhung der ED50-Werte: Tag -3 bis +4: 12,7±0,9 Gy; Tag +7 bis +14: 11,6±0,9 Gy; Tag 0 bis 14: 14,3±1,2 Gy, Tag 0 bis Ausheilung der Ulzeration: 12,9±1,3 Gy. Ebenso wie bei fraktionierter Bestrahlung über eine Woche, konnte eine Verkürzung der Ulkusdauer um ca. 2 Tage festgestellt werden. Außerdem wurde eine Verkürzung der mittleren Latenzzeit von 2,4 Tagen (Medikamentengabe von Tag -3 bis +4) bis 4,1 Tagen (Tag 0 bis zur Ausheilung) gefunden. Bei fraktionierter Bestrahlung über 2 Wochen konnte für den gesamten Behandlungszeitraum eine gegenüber der unbehandelten Kontrolle reduzierte Gesamtzellzahl (Minimalwert Tag 4: 51%) festgestellt werden. Erst am Tag 16 wurde der Ausgangswert wieder erreicht. Demgegenüber ergab die alleinige Applikation von Lovastatin von Tag 0 bis 14 im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle signifikant höhere Gesamtzellzahlen (Maximalwert Tag 9: 144% des Ausgangswertes). Bei fraktionierter Bestrahlung und Lovastatingabe konnten gegenüber der Kontrolle reduzierte, jedoch höhere Gesamtzellzahlen als bei alleiniger Fraktionierung festgestellt werden. Die Gesamtschichtdicken aller 4 Behandlungsprotokolle ergaben ähnliche Verläufe ohne signifikante Unterschiede. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Applikation von Lovastatin während fraktionierter Bestrahlung einen mukoprotektiven Effekt aufweist. In allen Behandlungsprotokollen war eine signifikante Erhöhung der isoeffektiven Dosen festgestellt werden. Dabei scheint der mukoprotektive Effekt umso größer zu sein, je länger die Behandlung mit Lovastatin andauerte. Lovastatin führte zu einer eindeutigen Akumulation der epithelialen Zellproliferation. Die exakten Wirkmechanismen der Mukoprotektion durch Statine sind jedoch bisher nicht geklärt und bedürfen weitergehender Untersuchungen.:ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 4 1 EINLEITUNG 6 2 LITERATURÜBERSICHT 9 2.1 Tumorerkrankungen im Kopf-Hals-Breich 9 2.2 Behandlung von Kopf-Hals-Tumoren 11 2.2.1 Chirurgische Therapie 11 2.2.2 Strahlentherapie 11 2.2.3 Zytostatische Therapie 14 2.2.4 Kombinierte Radiochemotherapie 14 2.3 Nebenwirkungen der Strahlentherapie 14 2.3.1 Frühe Strahlenfolgen 15 2.3.2 Späte (chronische) Strahlenfolgen 16 2.3.3 Konsekutive Späteffekte 17 2.4 Radiogene Nebenwirkungen im Kopf-Hals-Bereich 17 2.4.1 Frühreaktionen 17 2.4.2 Spätfolgen 19 2.5 Radiogene Mucositis enoralis 20 2.5.1 Pathogenese und zeitlicher Verlauf 20 2.5.2 Klassifizierungssysteme 22 2.5.3 Inzidenz und klinische Bedeutung 25 2.5.4 Prophylaxe und Therapie 26 2.6 Aufbau und Proliferationskinetik der Mundschleimhaut 30 2.6.1 Humane Mundschleimhaut 30 2.6.1.1 Aufbau der Mundschleimhaut des Menschen 30 2.6.1.2 Proliferationskinetik 31 2.6.2 Murine Mundschleimhaut 31 2.6.2.1 Besonderheiten im Aufbau der Zungenschleimhaut der Maus 31 2.6.2.2 Proliferationskinetik 32 2.7 Tiermodelle zur Untersuchung der radiogenen Mucositis enoralis 33 2.7.1 Maus 33 2.7.2 Hamster 34 2.7.3 Ratte 34 2.8 Einflussfaktoren der Strahlenempfindlichkeit 35 2.8.1 Intrinsische Strahlenempfindlichkeit und Stammzellkonzept 35 2.8.2 Recovery (Erholung) 36 2.8.3 Repopulierung 37 2.8.4 Redistribution 38 2.8.5 Reoxygenierung 39 2.8.6 Volumeneffekt 39 2.9 Lovastatin 40 2.9.1 Lipidsenkende Wirkung von Lovastatin 41 2.9.2 Pharmakodynamik und Pharmakokinetik 42 2.9.3 Nebenwirkungen 42 2.9.4 Weitere Wirkungen von Lovastatin (pleiotrope Effekte) 44 2.10 Zielstellung der vorliegenden Arbeit 45 3 MATERIAL UND METHODEN 46 3.1 Versuchstiere 46 3.2 Bestrahlung 47 3.2.1 Bestrahlungsanlagen 47 3.2.1.1 Perkutane Bestrahlung 47 3.2.1.2 Lokale Zungenbestrahlung 48 3.2.2 Dosimetrie 48 3.2.2.1 Perkutane Bestrahlung 48 3.2.2.2 Lokale Zungenbestrahlung 49 3.3 Durchführung der Bestrahlung 49 3.3.1 Perkutane Schnauzenbestrahlung 49 3.3.2 Lokale Zungenbestrahlung 50 3.4 Beurteilung der Strahlenreaktion 51 3.5 Beschreibung der durchgeführten Experimente 52 3.5.1 Alleinige Lovastatingabe (Versuch L) 53 3.5.2 Lokale Einzeitbestrahlung (Versuch E) 53 3.5.3 Versuche mit fraktionierter Bestrahlung (Versuch F) 54 3.6 Statistische Auswertung 54 3.6.1 Analyse von Dosis-Wirkungs-Beziehungen 54 3.6.2 Analyse des zeitlichen Verlaufs der oralen Mukositis 55 3.6.3 Analyse der histologischen Parameter 55 3.7 Histologische Untersuchungen 55 4 ERGEBNISSE 57 4.1 Verträglichkeit von Lovastatin (Versuch L) 57 4.2 Lokale Einzeitbestrahlung (Versuch E) 58 4.2.1 Dosisabhängigkeit der Strahlenreaktion (Ulkus) 58 4.2.2 Klinisches Erscheinungsbild und Verlauf der Strahlenreaktion 58 4.3 Strahlenreaktion nach einwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F1/0) 60 4.3.1 Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz 60 4.3.2 Zeitlicher Verlauf der Schleimhautreaktion 61 4.4 Strahlenreaktion nach zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F2/0) 62 4.4.1 Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz 62 4.4.2 Zeitlicher Verlauf der Schleimhautreaktion 62 4.5 Lovastatingabe bei einwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F1/X) 63 4.5.1 Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz 64 4.5.2 Zeitlicher Verlauf der Strahlenreaktion 65 4.6 Lovastatingabe bei zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F2/X) 66 4.6.1 Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz 66 4.6.2 Zeitlicher Verlauf der Strahlenreaktion 67 4.7 Histologische Untersuchungen 68 4.7.1 Unbehandeltes beziehungsweise ausschließlich bestrahltes Epithel der Zungenunterseite (H0 und H1) 69 4.7.1.1 Zellzahlen 69 4.7.1.2 Schicht- und Epitheldicke 71 4.7.2 Alleinige Lovastatingabe über 14 Tage (H2) 71 4.7.2.1 Zellzahlen 71 4.7.2.2 Schicht- und Epitheldicke 71 4.7.3 Fraktionierte Bestrahlung mit 10x3 Gy und Lovastatingabe 75 4.7.3.1 Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 (Versuch H3) 75 4.7.3.2 Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 (Versuch H4) 76 5 DISKUSSION 79 5.1 Klinischer Hintergrund der radiogenen Mucositis enoralis 79 5.2 Zungenepithel der Maus als Tiermodell 80 5.2.1 Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den Menschen 80 5.2.2 Reproduzierbarkeit der Ergebnisse 81 5.2.3 Strahlenreaktion der Mundschleimhaut nach fraktionierter Bestrahlung 82 5.3 Applikation von Lovastatin 82 5.3.1 Dosierung 82 5.3.2 Verträglichkeit 83 5.4 Beeinflussung der Ausprägung der radiogenen Mucositis enoralis durch Lovastatin 83 5.4.1 Lovastatinwirkung bei Einzeitbestrahlung 83 5.4.2 Lovastatinwirkung bei fraktionierter Bestrahlung 84 5.5 Histologische Untersuchungen 85 5.5.1 Veränderungen im Epithel bei alleiniger Bestrahlung 86 5.5.2 Veränderungen im Epithel bei alleiniger Lovastatingabe 87 5.5.3 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung und Lovastatingabe 88 5.6 Weitere Untersuchungen zur Modifikation der Strahlenreaktion von Normalgeweben durch Statine 88 5.7 Mögliche Wirkmechanismen von Statinen 90 5.7.1 Hemmung der Rho- und Ras-vermittelten Signaltransduktion 90 5.7.2 Beeinflussung der Entzündungsreaktion 92 5.7.3 Beeinflussung der Gefäßreaktion 93 5.8 Mögliche Wirkung von Lovastatin auf Tumorgewebe 94 6 AUSBLICK 95 7 ZUSAMMENFASSUNG 96 8 SUMMARY 99 9 THESEN 102 10 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 104 11 TABELLENVERZEICHNIS 106 12 LITERATURVERZEICHNIS 107 13 ANHANG 127 DANKSAGUNG 131 ERKLÄRUNG ZUR ERÖFFNUNG DES PROMOTIONSVERFAHRENS 132 ERKLÄRUNG ZUR EINHALTUNG RECHTLICHER VORSCHRIFTEN 133 / The radiation response of oral mucosa is a frequent and dose-limiting side effect of radio(chemo)therapy of tumours in the head-and-neck region. Oral mucositis substantially im-pacts on the general condition and the quality of life of the patients. It necessitates treatment interruptions in a number of patients, with the consequence of a marked reduction of the tumour cure probability. Despite various experimental and clinical approaches, no general strategy for the prophylaxis or management of radiation-induced oral mucositis has so far been established in clinical routine. The pathogenesis of oral mucositis is complex and is influenced by a variety of factors, including miscellaneous signalling cascades, such as rho- and ras-dependent signal transduction. The present preclinical study in experimental animals was hence initiated to characterize the effect of the 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoenzymeA-reductase inhibitor Lovastatin, which modulates the latter signalling chains, on the response of oral mucosa to fractionated irradiation. Accompanying histological studies were performed to illuminate the mechanism of action of Lovastatin. All investigations were performed in the mucosa of the lower surface of mouse tongue (C3H/Neu inbred strain) as an established animal model. Irradiation was administered as fractionated, percutaneous treatment of the entire snout of the animals (200 kV X-rays). The protocols comprised the application of 5x3 Gy/week over 1 week (days 0-4) or 2 weeks (days 0-4, 7-11). The treatment volume encompassed the snout of the animals to a plane from the eyes to the throat, thus including the entire tongue. With snout irradiation, only a subclinical mucosal effect was induced. Subsequent local test irradiation (25 kV X-rays) yielded a clinically manifest reaction within a 3x3 mm2 test area at the lower tongue surface. Local irradiation was performed in 5 graded dose groups with 10 animals each, in order to generate complete doseeffect curves (logit analyses). For this, mucosal ulceration, corresponding to confluent mucositis grade 3 according to the RTOG/EORTC classification, was analyzed as the quantal endpoint. The latent time between test irradiation and first ulcer diagnosis and the ulcer duration until reepithelialisation served as parameters of the time course of the radiation response. The dose effect was described by ED50 values (dose at which an ulceration within the test area is expected in 50 % of the animals) and their standard deviation  or their 95 % confidence intervals. For histological studies, 3 mice of each experimental group (see below) were sacrificed per day over a period of 16 days. Three untreated mice served as controls. The tongues were excised and the sections stained with haematoxylin and eosin. At least 2 mm epithelial length were examined by standard light microscopy, and the number of nucleated cells in the functional and germinal layers as well as the thickness of the individual epithelial layers was quantified. Lovastatin (1A Pharma, Oberhaching, Germany) was administered at a dose of 16 mg/kg, according to the recommended dose in patients. The drug was suspended in A. dest. and applied daily per os via gavage. With fractionated irradiation over 1 week, Lovastatin was administered from day -3 (before the first fraction) until day 7 or until clinical healing of all reactions. Fractionated irradiation over 2 weeks was combined with Lovastatin in 4 admini-stration intervals: day -3 to +4, day +7 to +11, day 0 to +14 or day 0 until clinical healing of all ulcerations. For the histological investigations, irradiation was applied with 10x3 Gy over 2 weeks. Lovastatin was administered on days 0-14 or 7-14, respectively. Groups that received either radiation alone or Lovastatin alone in similar protocols served as controls. To test for tolerability of the drug, 5 animals were treated daily with 16 mg/kg Lovastatin over 25 days. No adverse events were observed. Single dose irradiation alone resulted in an ED50 value of 11.5±1.0 Gy, with a significant dose dependence of ulcer frequency (p=0.0007). The latent time was 12.2±0.5 d, ulcer duration 3.1±0.6 d. The ED50 value for test irradiation after fractionated irradiation over 1 week was 8.6±1.4 Gy (p=0.0002). Latent time was 9.7±0.8 d, ulcer duration 5.4±1.1d. In both protocols with Lovas-tatin, a significant increase of the ED50 values was observed, with 10.1±0.1 Gy and 11.6±0.7 Gy for drug administration from day -3 to +7 and day -3 to ulcer healing, respectively. The mean latencies were not significantly different from the control. However, mean ulcer duration was shortened by ca. 2 d. For test irradiation after 2 weeks of fractionation alone, the ED50 was 7.9±1.3 Gy (p=0.0002). Mean latency was 11.8±0.8 d, mean ulcer duration 4.5±1.0 d. Lovastatin administration yielded a significant increase in ED50 values in all experimental protocols, with 12.7±0.9 Gy for day -3 to +4, 11.6±0.9 Gy for day +7 to +14, 14.3±1.2 Gy for day 0 to +14 and 12.9±1.3 Gy for day 0 until healing. Similar to one week of fractionation, a shortening of ulcer duration by ca. 2 d was found. Mean latencies were reduced by 2.4 days (drug administration day -3 to +4) to 4.1 days (day 0 to healing). Epithelial cell numbers were clearly reduced by fractionated irradiation (minimum day 4: 51 % of the control). Original values were not observed before day 16. In contrast, administration of Lovastatin alone significantly increased the total cell numbers in the epithelium (maximum day 9: 144 % of control). The combination of irradiation and Lovastatin resulted in total cell numbers that were reduced compared to the control, but markedly higher than with irradiation alone. No differences were found for epithelial thickness in comparison to irradiation alone. In conclusion, the administration of Lovastatin during fractionated irradiation showed a substantial mucoprotective effect. Isoeffective doses were significantly increased in all Lovastatin treatment arms. The longer the interval of drug administration was, the more pronounced was the effect. Lovastatin yielded a clear stimulation of epithelial cell proliferation. The detailed mechanisms of action of Lovastatin, however, remain unclear and require further investigation.:ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 4 1 EINLEITUNG 6 2 LITERATURÜBERSICHT 9 2.1 Tumorerkrankungen im Kopf-Hals-Breich 9 2.2 Behandlung von Kopf-Hals-Tumoren 11 2.2.1 Chirurgische Therapie 11 2.2.2 Strahlentherapie 11 2.2.3 Zytostatische Therapie 14 2.2.4 Kombinierte Radiochemotherapie 14 2.3 Nebenwirkungen der Strahlentherapie 14 2.3.1 Frühe Strahlenfolgen 15 2.3.2 Späte (chronische) Strahlenfolgen 16 2.3.3 Konsekutive Späteffekte 17 2.4 Radiogene Nebenwirkungen im Kopf-Hals-Bereich 17 2.4.1 Frühreaktionen 17 2.4.2 Spätfolgen 19 2.5 Radiogene Mucositis enoralis 20 2.5.1 Pathogenese und zeitlicher Verlauf 20 2.5.2 Klassifizierungssysteme 22 2.5.3 Inzidenz und klinische Bedeutung 25 2.5.4 Prophylaxe und Therapie 26 2.6 Aufbau und Proliferationskinetik der Mundschleimhaut 30 2.6.1 Humane Mundschleimhaut 30 2.6.1.1 Aufbau der Mundschleimhaut des Menschen 30 2.6.1.2 Proliferationskinetik 31 2.6.2 Murine Mundschleimhaut 31 2.6.2.1 Besonderheiten im Aufbau der Zungenschleimhaut der Maus 31 2.6.2.2 Proliferationskinetik 32 2.7 Tiermodelle zur Untersuchung der radiogenen Mucositis enoralis 33 2.7.1 Maus 33 2.7.2 Hamster 34 2.7.3 Ratte 34 2.8 Einflussfaktoren der Strahlenempfindlichkeit 35 2.8.1 Intrinsische Strahlenempfindlichkeit und Stammzellkonzept 35 2.8.2 Recovery (Erholung) 36 2.8.3 Repopulierung 37 2.8.4 Redistribution 38 2.8.5 Reoxygenierung 39 2.8.6 Volumeneffekt 39 2.9 Lovastatin 40 2.9.1 Lipidsenkende Wirkung von Lovastatin 41 2.9.2 Pharmakodynamik und Pharmakokinetik 42 2.9.3 Nebenwirkungen 42 2.9.4 Weitere Wirkungen von Lovastatin (pleiotrope Effekte) 44 2.10 Zielstellung der vorliegenden Arbeit 45 3 MATERIAL UND METHODEN 46 3.1 Versuchstiere 46 3.2 Bestrahlung 47 3.2.1 Bestrahlungsanlagen 47 3.2.1.1 Perkutane Bestrahlung 47 3.2.1.2 Lokale Zungenbestrahlung 48 3.2.2 Dosimetrie 48 3.2.2.1 Perkutane Bestrahlung 48 3.2.2.2 Lokale Zungenbestrahlung 49 3.3 Durchführung der Bestrahlung 49 3.3.1 Perkutane Schnauzenbestrahlung 49 3.3.2 Lokale Zungenbestrahlung 50 3.4 Beurteilung der Strahlenreaktion 51 3.5 Beschreibung der durchgeführten Experimente 52 3.5.1 Alleinige Lovastatingabe (Versuch L) 53 3.5.2 Lokale Einzeitbestrahlung (Versuch E) 53 3.5.3 Versuche mit fraktionierter Bestrahlung (Versuch F) 54 3.6 Statistische Auswertung 54 3.6.1 Analyse von Dosis-Wirkungs-Beziehungen 54 3.6.2 Analyse des zeitlichen Verlaufs der oralen Mukositis 55 3.6.3 Analyse der histologischen Parameter 55 3.7 Histologische Untersuchungen 55 4 ERGEBNISSE 57 4.1 Verträglichkeit von Lovastatin (Versuch L) 57 4.2 Lokale Einzeitbestrahlung (Versuch E) 58 4.2.1 Dosisabhängigkeit der Strahlenreaktion (Ulkus) 58 4.2.2 Klinisches Erscheinungsbild und Verlauf der Strahlenreaktion 58 4.3 Strahlenreaktion nach einwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F1/0) 60 4.3.1 Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz 60 4.3.2 Zeitlicher Verlauf der Schleimhautreaktion 61 4.4 Strahlenreaktion nach zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F2/0) 62 4.4.1 Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz 62 4.4.2 Zeitlicher Verlauf der Schleimhautreaktion 62 4.5 Lovastatingabe bei einwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F1/X) 63 4.5.1 Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz 64 4.5.2 Zeitlicher Verlauf der Strahlenreaktion 65 4.6 Lovastatingabe bei zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F2/X) 66 4.6.1 Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz 66 4.6.2 Zeitlicher Verlauf der Strahlenreaktion 67 4.7 Histologische Untersuchungen 68 4.7.1 Unbehandeltes beziehungsweise ausschließlich bestrahltes Epithel der Zungenunterseite (H0 und H1) 69 4.7.1.1 Zellzahlen 69 4.7.1.2 Schicht- und Epitheldicke 71 4.7.2 Alleinige Lovastatingabe über 14 Tage (H2) 71 4.7.2.1 Zellzahlen 71 4.7.2.2 Schicht- und Epitheldicke 71 4.7.3 Fraktionierte Bestrahlung mit 10x3 Gy und Lovastatingabe 75 4.7.3.1 Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 (Versuch H3) 75 4.7.3.2 Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 (Versuch H4) 76 5 DISKUSSION 79 5.1 Klinischer Hintergrund der radiogenen Mucositis enoralis 79 5.2 Zungenepithel der Maus als Tiermodell 80 5.2.1 Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den Menschen 80 5.2.2 Reproduzierbarkeit der Ergebnisse 81 5.2.3 Strahlenreaktion der Mundschleimhaut nach fraktionierter Bestrahlung 82 5.3 Applikation von Lovastatin 82 5.3.1 Dosierung 82 5.3.2 Verträglichkeit 83 5.4 Beeinflussung der Ausprägung der radiogenen Mucositis enoralis durch Lovastatin 83 5.4.1 Lovastatinwirkung bei Einzeitbestrahlung 83 5.4.2 Lovastatinwirkung bei fraktionierter Bestrahlung 84 5.5 Histologische Untersuchungen 85 5.5.1 Veränderungen im Epithel bei alleiniger Bestrahlung 86 5.5.2 Veränderungen im Epithel bei alleiniger Lovastatingabe 87 5.5.3 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung und Lovastatingabe 88 5.6 Weitere Untersuchungen zur Modifikation der Strahlenreaktion von Normalgeweben durch Statine 88 5.7 Mögliche Wirkmechanismen von Statinen 90 5.7.1 Hemmung der Rho- und Ras-vermittelten Signaltransduktion 90 5.7.2 Beeinflussung der Entzündungsreaktion 92 5.7.3 Beeinflussung der Gefäßreaktion 93 5.8 Mögliche Wirkung von Lovastatin auf Tumorgewebe 94 6 AUSBLICK 95 7 ZUSAMMENFASSUNG 96 8 SUMMARY 99 9 THESEN 102 10 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 104 11 TABELLENVERZEICHNIS 106 12 LITERATURVERZEICHNIS 107 13 ANHANG 127 DANKSAGUNG 131 ERKLÄRUNG ZUR ERÖFFNUNG DES PROMOTIONSVERFAHRENS 132 ERKLÄRUNG ZUR EINHALTUNG RECHTLICHER VORSCHRIFTEN 133

MACC1 wurde als prognostischer Biomarker für die Tumorprogression und das Metastasen-freie Überleben im KRK sowie in anderen soliden Tumoren beschrieben. Das Gen induziert Zellmotilität und Proliferation in Zellkultur sowie die Metastasierung im Mausmodell. Damit stellt MACC1 ein vielversprechendes Ziel für die Intervention bei Tumorprogression und –metastasierung und damit für die Behandlung von KRK-Patienten dar. Unser Ziel war es, die Transkription von MACC1 zu inhibieren. Hierfür identifizierten wir zunächst die Promoter-Region von MACC1 und untersuchten MACC1s transkriptionelles Regulationsnetzwerk. Durch ortsgerichtete Mutagenese, Chromatin Immunopräzipitation und Electrophoretic Mobility Shift Assay ermittelten wir, dass Transkriptionsfaktoren wie Ap-1, Sp1, C/EBPs und GIPC1 an den MACC1-Promoter binden und die Transkription des MACC1-Gens kontrollieren. Darüberhinaus konnten wir durch Hochdurchsatz-Screening die bisher ersten Inhibitoren gegen MACC1 identifizieren: Rottlerin und Lovastatin. Wir zeigten, dass diese spezifisch auf den endogenen MACC1-Promoter wirken, was eine zeit- und konzentrationsabhängige Reduktion der MACC1-Expression zur Folge hatte. Beide Inhibitoren begrenzten das Expressionsniveau von Sp1 und interferierten mit der Bindung von c-Jun mit dem MACC1-Promoter, was in einer Inhibition der MACC1-Transkription resultierte. Ferner führte die tägliche Behandlung von Xenograft-Mausmodellen mit Rottlerin zu einer Inhibition der MACC1-Expression im Primärtumor und einer damit einhergehenden Begrenzung des Tumorwachstums. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal der MACC1-Promoter und seine transkriptionelle Regulation beleuchtet wurden. Die neuen Erkenntnisse wurden zur Identifizierung der ersten Inhibitoren gegen MACC1 genutzt. Zur Behandlung von KRK-Patienten mit einem hohen Risiko für MACC1-induzierte Metastasierung könnten diese Inhibitoren Potential für die klinische Anwendung beherbergen. / MACC1 has been reported as a prognostic biomarker for tumor progression and metastasis-free survival in CRC along with other solid tumors. It induces cell motility and proliferation in cell culture and metastasis in mouse models. Consequently, targeting MACC1 to intervene in tumor progression and metastasis formation holds a promising approach to treat CRC patients. We designed a strategy to inhibit MACC1 via targeting its transcription. We first identified MACC1 gene promoter by creating various promoter-luciferase constructs. We then established that transcription factors such as Ap-1, Sp1, C/EBPs and GIPC1 bind to the MACC1 promoter and govern MACC1 transcription, expression and thus motility in vitro and in CRC patients. Using a high throughput screening targeting the MACC1 promoter, we identified small molecule MACC1 inhibitors, Rottlerin and Lovastatin. These inhibitors specifically restricted endogenous MACC1 promoter leading to reduced MACC1 expression in a time- and concentration-dependent manner. In vitro functional assays demonstrated the impact of the small molecule inhibitors on retarding cell proliferation and motility. Both inhibitors restricted Sp1 levels and interfered with the binding of c-Jun to the MACC1 promoter, thereby inhibiting MACC1 transcription. The study further described the effect of Rottlerin on a CRC-xenografted mouse model. Daily treatment of xenografted mice with Rottlerin resulted in the inhibition of MACC1 expression in the primary tumor accompanied with the restricted tumor growth. To summarize, this is the first study unraveling the MACC1 promoter, its transcriptional regulation and identification of newly identified MACC1 inhibitors. In clinical settings, inhibition of MACC1 expression using these inhibitors might provide immense potential for the treatment of CRC patients who are at high risk for MACC1-induced metastasis linked to shorter survival.

Bei der Bestrahlung von Kopf-Hals-Tumoren tritt die orale Mukositis als wichtigste und dosislimitierende frühe Nebenwirkung auf. Verschiedene prophylaktische und therapeutische Maßnahmen wurden untersucht, jedoch konnte bisher keine Methode in der klinischen Routine etabliert werden. Ein neuer Ansatz ist die Verwendung des Cholesterinsynthese-hemmers Lovastatin. Für diesen Wirkstoff konnte in vorhergehenden Untersuchungen ein mukoprotektiver Effekt nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen diesem schleimhaut-schützenden Effekt und der Expression von induzierbarer Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS), Nitrotyrosin (NT) und CD105 betrachtet. Das Enzym iNOS ist an Entzündungsreaktionen beteiligt; NT stellt ein Folgeprodukt des durch iNOS gebildeten Stickstoffmonoxids dar. CD105 wird von aktivierten Monozyten und Makrophagen exprimiert. Ausgangsmaterial für die vorliegende Studie waren 174 Präparate aus dem vorangegangenen Tierversuch. In diesem wurde bei Mäusen eine fraktionierte Schnauzenbestrahlung zum Teil mit einer Lovastatingabe kombiniert. Zusätzlich wurden Tiere alleinig mit Lovastatin behandelt. Für diesen Versuch wurden Mäuse des Stammes C3H/Neu verwendet. Die Bestrahlung erfolgte mit 5 x 3 Gy über zwei Wochen. Lovastatin wurde in einer Dosis von 16 mg/kg oral verabreicht. Gegenstand der aktuellen Untersuchung war - neben der allgemeinen histologischen Charakterisierung - die immunhistochemische Darstellung von iNOS, NT und CD105 im Epithel der Zungenunterseite sowie im subepithelialen Gewebe. Ausgewertet wurden die Gesamtzellzahl im Epithel, die Zahl iNOS- und NT-positiver Zellkerne in Germinativ- und funktioneller Schicht sowie jeweils die Farbintensität der positiven Epithelzellen. In der L. propria und L. muscularis wurden die CD105-, iNOS-, und NT-positiven Makrophagen sowie die weiteren iNOS- und NT-positiven Immunzellen erfasst und ihre Farbintensität bestimmt. Weiterhin wurde die Homogenität und Intensität der Expression von iNOS im Endothel bewertet. Die Auswertung umfasst die deskriptive Darstellung der Werteverläufe dieser Parameter. Aufgrund der geringen Anzahl von drei Versuchstieren je Tag und Gruppe wurde auf die Berechnung der statistischen Signifikanz der Ergebnisse verzichtet. Die Gesamtzellzahl im Zungenepithel zeigte bei Bestrahlung eine deutliche Reduktion auf 65 % des Ausgangswertes. Mit Beendigung der Behandlung war eine entsprechende Erholung zu sehen. Die alleinige Lovastatinbehandlung bewirkte dagegen eine Steigerung der Gesamtzell-zahl auf ca. 110 %. Während iNOS sowohl im unbehandelten als auch im behandelten Epithelgewebe nachweisbar war, war NT im unbehandelten Epithel kaum vorhanden. Die Ausgangswerte betrugen 22 % iNOS-positive Kerne in der Germinativschicht und 8 % in der funktionellen Schicht, sowie 2 % und 1 % für die NT-Färbung. In der Germinativschicht waren sowohl bei alleiniger Bestrahlung als auch bei alleiniger Lovastatintherapie 30 - 50 % der Zell-kerne iNOS-positiv. Bei zweiwöchiger Kombinationstherapie lagen die Werte teils darunter; bei Lovastatingabe ab Tag 7 lagen sie vornehmlich in dem oberen Bereich. In der funktionellen Schicht spiegelten sich diese Verteilungsmuster wider, allerdings lag die Anzahl positiver Kerne insgesamt überwiegend unter 30 %. Die Zahl NT-positiver Zellkerne stieg in beiden Schichten infolge der Bestrahlung auf ca. 50 - 60 %. Unter alleiniger Lovastatintherapie lag sie unter 30 %. Die zweiwöchige Kombination zeigte ebenfalls eine Tendenz zum niederen Bereich. Bei Lovastatingabe ab Tag 7 lagen die Werte geringgradig vermehrt im höheren Bereich. Die Anfärbung der Makrophagen gegen CD105 verdeutlichte bei allen Gruppen eine Reduktion der Makrophagenzahl auf ca. 50 % des Ausgangswertes. Auch die Zahl iNOS-positiver Makrophagen reduzierte sich in allen Behandlungsgruppen einheitlich auf unter 80 % der Norm. Die Zahl NT-positiver Makrophagen lag näher am Ausgangswert. Im Gegensatz dazu waren die restlichen Immunzellen unter Behandlung vermehrt iNOS-positiv. Die Werte lagen häufig weit oberhalb des Referenzbereichs. Dabei zeigte im Vergleich die alleinige Bestrahlung die niedrigsten Werte mit maximal 136 % der Norm. Bei der Färbung gegen NT konnten nur bei alleiniger Lovastatinverabreichung konstant Werte oberhalb des Ausgangswertes festgestellt werden. Innerhalb der Untersuchungen konnte das Endothel nur mit iNOS-AK auswertbar angefärbt werden. Es zeigte in allen Gruppen eine durchgängig homogene Färbung. Die Farbintensität war mittelmäßig und wurde in allen Behandlungsgruppen zum Ende des Untersuchungszeitraums kräftiger. Als Resultat dieser Arbeit ist festzuhalten, dass bei allen vier Behandlungsvarianten iNOS und NT in hohem Maße in der Germinativschicht des Epithels exprimiert wurden. In der funktionellen Schicht war die Expression von iNOS schwächer, während die NT-expression nahezu gleich blieb. Damit muss NT eine längere Halbwertszeit haben. Des Weiteren waren nicht alle aktivierten (CD105-positiven) Makrophagen iNOS-positiv und wiederum produzierte iNOS nicht in allen Zellen NT. Dies wurde auch durch die deutlich höhere Zahl iNOS-positiver Immunzellen in den Ll. propriae und musculares deutlich. Die biochemischen Abläufe, durch welche Lovastatin zur Reduktion der radiogenen Mucositis enoralis führt, bleiben daher weiterhin zu erforschen. In der durchgeführten Untersuchung zeigte sich kein eindeutiger Hinweis auf einen Zusammenhang mit dem iNOS-NT-Signaltransduktionsweg.:Abkürzungsverzeichnis VIII 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Bedeutung von Tumorerkrankungen bei Mensch und Tier 3 2.2 Kopf-Hals-Tumoren 4 2.2.1 Tumorvorkommen beim Menschen 4 2.2.2 Tumorvorkommen bei Hund und Katze 4 2.2.3 Symptome beim Kleintier 5 2.2.4 Behandlungsmethoden 5 2.2.4.1 Chirurgie 5 2.2.4.2 Chemotherapie 5 2.2.4.3 Radiotherapie 6 2.2.4.4 Radiochemotherapie 7 2.2.5 Nebenwirkungen der Tumorbehandlung 7 2.2.5.1 Nebenwirkungen der Chemotherapie 7 2.2.5.2 Nebenwirkungen der Radiotherapie 8 2.3 Mucositis enoralis 8 2.3.1 Aufbau von Zunge und Zungenepithel 8 2.3.2 Pathogenese und zeitlicher Verlauf der radiogenen oralen Mukositis 10 2.3.2.1 Stadien der Mukositis und klinisches Erscheinungsbild 10 2.3.2.2 Reaktionskette der Strahlenwirkung 11 2.3.3 Einteilung des Schweregrades der Mukositis 12 2.3.3.1 Einteilung für die Humanmedizin 12 2.3.3.2 Einteilung für die Veterinärmedizin 13 2.3.4 Aktuelle Herangehensweise an die radiogene orale Mukositis 13 2.4 Lovastatin 14 2.4.1 Struktur und Anwendung 14 2.4.2 Weitere Wirkmechanismen von Statinen 14 2.4.2.1 Die apoptotische Wirkung der Statine 15 2.4.3 Eigenschaften im Tiereinsatz 15 2.5 Induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase und Nitrotyrosin 16 2.5.1 Die NOS und Nitrotyrosinbildung 16 2.5.2 Vorkommen von iNOS und Nitrotyrosin 17 3 Zielstellung der Arbeit 19 4 Material und Methoden 20 4.1 Versuchstiere 20 4.2 Perkutane Schnauzenbestrahlung 20 4.3 Applikation von Lovastatin 22 4.4 Versuchsprotokoll 22 4.5 Histologische Aufbereitung 23 4.5.1 Antikörper 23 4.5.1.1 Induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) 23 4.5.1.2 Nitrotyrosin 23 4.5.1.3 CD105 ... 23 4.5.1.4 Kontroll-Antikörper 23 4.5.2 Färbeprotokolle 24 4.5.2.1 iNOS und CD105 24 4.5.2.2 Nitrotyrosin 26 4.5.2.3 Optimierung der Konzentration der primären Antikörper 27 4.5.3 Histologische Auswertung 29 4.5.3.1 Epithel .. 29 4.5.3.2 L. propria und L. muscularis 30 4.5.3.3 Endothel 31 4.6 Analyse 31 5 Ergebnisse 32 5.1 Zellzahlen im Epithel 32 5.1.1 Kontrollgruppe 32 5.1.2 Alleinige Bestrahlung 32 5.1.3 Alleinige Lovastatinbehandlung 33 5.1.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 34 5.1.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 34 5.2 Expression von iNOS 36 5.2.1 Kontrollgruppe 36 5.2.2 Alleinige Bestrahlung 36 5.2.3 Alleinige Lovastatingabe 38 5.2.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 41 5.2.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 43 5.3 Expression von Nitrotyrosin 45 5.3.1 Kontrollgruppe 45 5.3.2 Alleinige Bestrahlung 45 5.3.3 Alleinige Lovastatinbehandlung 47 5.3.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 49 5.3.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 51 5.4 Expression von CD105 54 5.4.1 Alleinige Bestrahlung 54 5.4.2 Alleinige Lovastatinbehandlung 54 5.4.3 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 55 5.4.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 55 6 Diskussion 57 6.1 Klinischer Hintergrund 57 6.2 Tiermodelle für die radiogene orale Mukositis 58 6.2.1 Maus 58 6.2.2 Ratte 58 6.2.3 Hamster 58 6.3 Eigenschaften des unbehandelten Zungengewebes 59 6.3.1 Epithel der Zungenunterseite 59 6.3.1.1 Zellzahl . .59 6.3.1.2 Nachweis von iNOS 59 6.3.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 60 6.3.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 60 6.3.2.1 Nachweis von iNOS 60 6.3.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 60 6.3.2.3 Nachweis von CD105 60 6.3.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 60 6.4 Veränderungen bei konventioneller fraktionierter Bestrahlung 61 6.4.1 Epithel der Zungenunterseite 61 6.4.1.1 Zellzahl . 61 6.4.1.2 Nachweis von iNOS 61 6.4.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 62 6.4.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 62 6.4.2.1 Nachweis von iNOS 62 6.4.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 62 6.4.2.3 Nachweis von CD105 63 6.4.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 63 6.5 Veränderungen bei alleiniger Lovastatinbehandlung 63 6.5.1 Epithel der Zungenunterseite 63 6.5.1.1 Zellzahl . 63 6.5.1.2 Nachweis von iNOS 63 6.5.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 64 6.5.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 64 6.5.2.1 Nachweis von iNOS 64 6.5.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 64 6.5.2.3 Nachweis von CD105 64 6.5.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 65 6.6 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung mit zusätzlicher Lovastatinbehandlung über 2 Wochen 65 6.6.1 Epithel der Zungenunterseite 65 6.6.1.1 Zellzahl . 65 6.6.1.2 Nachweis von iNOS 65 6.6.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 66 6.6.2 Immunzellen in den L. propria und L. muscularis 66 6.6.2.1 Nachweis von iNOS 66 6.6.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 67 6.6.2.3 Nachweis von CD105 67 6.6.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 67 6.7 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung mit zusätzlicher Lovastatinbehandlung ab Tag 7 68 6.7.1 Epithel der Zungenunterseite 68 6.7.1.1 Zellzahl . 68 6.7.1.2 Nachweis von iNOS 68 6.7.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 68 6.7.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 69 6.7.2.1 Nachweis von iNOS 69 6.7.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 69 6.7.2.3 Nachweis von CD105 69 6.7.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 70 6.8 Zusammenfassende Einschätzung der Ergebnisse 70 7 Ausblick 72 8 Zusammenfassung 73 9 Summary 75 10 Abbildungsverzeichnis 77 11 Tabellenverzeichnis 80 12 Literatur 81 13 Anhang 92 14 Danksagung 100 / During radiation of head-and-neck-cancer oral mucositis is the most important and dose-limiting early side effect. Different preventive and theoretical procedures were investigated, but so far there has been no method established in clinical routine. A new approach is the application of the cholesterol synthesis inhibitor lovastatin. Previous investigtions proved a mucoprotective effect of this agent. In this investigation the correlation between this mucoprotective effect and the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS), nitrotyrosine (NT) and CD105 was observed. The enzyme iNOS takes part in inflammtory reactions; NT is a secondary product of the nitric oxide produced by iNOS. CD105 is expressed by activated monocytes and macrophages. The source material for this study were 174 preparations from previous animal examinations. In this investigation a daily fractionated radiation of the snout was partly combined with lovastatin applications. In addition some mice were treated with lovastatin only. For this research mice of the line C3H/Neu were used. Radiation was performed with 5 x 3Gy over two weeks. Lovastatin was used at an oral dose of 16mg/kg. The matter of the research was - next to general histological characterisation - the immunohistochemical exposure of iNOS, NT and CD105 in the epithelial layer of the undersurface of the tongue and in the subepithelial tissue. The total cell count in the epithelium, the number of iNOS- and NT-positive nuclei in the germinal and the functional layer, as well as the intensity of the staining were evaluated. In the l. propria and l. muscularis CD105-, iNOS-, and NT-positive macrophages and other iNOS- and NT-positive immune cells were identified and the intensity of their staining was determined. Furthermore the homogeneity and intensity of the expression of iNOS in the endothelium were rated. The analysis contains the descriptive presentation of the value patterns of these parameters. Because of the small number of three test animals per day and group the statistical significance of the results was not determined. In consequence of radiotherapy the total cell count in the epithelium decreased to 65% of origin. Recovery was visible after termination of the treatment. With lovastatin medication only, the cell count increased to approximately 110%. While iNOS was present in the untreated as well as in the treated tissue, NT was hardly visible in the untreated one. The basic values were 22% of iNOS-positive nuclei in the germinal layer and 8% in the functional layer, and 2% and 1% for the NT-staining. Both, sole radiation and sole lovastatin therapy, showed 30-50% iNOS-positive nuclei in the germinal layer. With combined therapy for two weeks the values were partially lower, with lovastatin treatment from day 7 they were in the upper range. This group distribution was reflected in the functional layer, although altogether the quantity of positive nuclei was mostly under 30%. Due to radiation the number of NT-positive nuclei increased to 50-60% in both layers. With sole lovastatin therapy it was under 30%. Combined therapy over two weeks showed a tendency to the lower range too. With lovastatin treatment from day 7 the values were situated a little bit more in the upper range. The macrophage staining against CD105 revealed a reduction of macrophage cell count to approximately 50% of origin in all groups. Likewise the number of iNOS-positive macrophages decreased in all groups consistently to less than 80% of normal. The number of NT-positive macrophages was closer to the origin. In contrast to this, the other immunocompetent cells were increasingly iNOS-positive under treatment. Often values were high above the reference range. In comparison sole radiation therapy showed the lowest values with a maximum of 136% of normal. Regarding the staining against NT only sole lovastatin treatment showed values constantly above origin. Within this study the only evaluable staining for the endothelium was with iNOS-antibody. It showed a constant homogeneous staining in all groups. The intensity of the staining was moderate and increased in all treatment groups towards the end of the examination. Therefore it can be concluded that under treatment iNOS and NT were both highly expressed in the germinal layer. In the functional layer the expression of iNOS was reduced whereas the expression of NT remained about the same. So NT must have a longer half-life. In addition not all activated (CD105-positive) macrophages were also iNOS-positive and again iNOS did not produce NT in all cells. This was also proven by the distinct higher number of iNOS-positive immunocompetent cells in the ll. propriae and musculares. Therefore the biochemical processes, because of which lovastatin leads to the reduction of the radiogenic mucositis enoralis, remain to be investigated. During the present investigation there was no distinct hint for a correlation with the iNOS-NT-pathway.:Abkürzungsverzeichnis VIII 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Bedeutung von Tumorerkrankungen bei Mensch und Tier 3 2.2 Kopf-Hals-Tumoren 4 2.2.1 Tumorvorkommen beim Menschen 4 2.2.2 Tumorvorkommen bei Hund und Katze 4 2.2.3 Symptome beim Kleintier 5 2.2.4 Behandlungsmethoden 5 2.2.4.1 Chirurgie 5 2.2.4.2 Chemotherapie 5 2.2.4.3 Radiotherapie 6 2.2.4.4 Radiochemotherapie 7 2.2.5 Nebenwirkungen der Tumorbehandlung 7 2.2.5.1 Nebenwirkungen der Chemotherapie 7 2.2.5.2 Nebenwirkungen der Radiotherapie 8 2.3 Mucositis enoralis 8 2.3.1 Aufbau von Zunge und Zungenepithel 8 2.3.2 Pathogenese und zeitlicher Verlauf der radiogenen oralen Mukositis 10 2.3.2.1 Stadien der Mukositis und klinisches Erscheinungsbild 10 2.3.2.2 Reaktionskette der Strahlenwirkung 11 2.3.3 Einteilung des Schweregrades der Mukositis 12 2.3.3.1 Einteilung für die Humanmedizin 12 2.3.3.2 Einteilung für die Veterinärmedizin 13 2.3.4 Aktuelle Herangehensweise an die radiogene orale Mukositis 13 2.4 Lovastatin 14 2.4.1 Struktur und Anwendung 14 2.4.2 Weitere Wirkmechanismen von Statinen 14 2.4.2.1 Die apoptotische Wirkung der Statine 15 2.4.3 Eigenschaften im Tiereinsatz 15 2.5 Induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase und Nitrotyrosin 16 2.5.1 Die NOS und Nitrotyrosinbildung 16 2.5.2 Vorkommen von iNOS und Nitrotyrosin 17 3 Zielstellung der Arbeit 19 4 Material und Methoden 20 4.1 Versuchstiere 20 4.2 Perkutane Schnauzenbestrahlung 20 4.3 Applikation von Lovastatin 22 4.4 Versuchsprotokoll 22 4.5 Histologische Aufbereitung 23 4.5.1 Antikörper 23 4.5.1.1 Induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) 23 4.5.1.2 Nitrotyrosin 23 4.5.1.3 CD105 ... 23 4.5.1.4 Kontroll-Antikörper 23 4.5.2 Färbeprotokolle 24 4.5.2.1 iNOS und CD105 24 4.5.2.2 Nitrotyrosin 26 4.5.2.3 Optimierung der Konzentration der primären Antikörper 27 4.5.3 Histologische Auswertung 29 4.5.3.1 Epithel .. 29 4.5.3.2 L. propria und L. muscularis 30 4.5.3.3 Endothel 31 4.6 Analyse 31 5 Ergebnisse 32 5.1 Zellzahlen im Epithel 32 5.1.1 Kontrollgruppe 32 5.1.2 Alleinige Bestrahlung 32 5.1.3 Alleinige Lovastatinbehandlung 33 5.1.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 34 5.1.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 34 5.2 Expression von iNOS 36 5.2.1 Kontrollgruppe 36 5.2.2 Alleinige Bestrahlung 36 5.2.3 Alleinige Lovastatingabe 38 5.2.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 41 5.2.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 43 5.3 Expression von Nitrotyrosin 45 5.3.1 Kontrollgruppe 45 5.3.2 Alleinige Bestrahlung 45 5.3.3 Alleinige Lovastatinbehandlung 47 5.3.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 49 5.3.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 51 5.4 Expression von CD105 54 5.4.1 Alleinige Bestrahlung 54 5.4.2 Alleinige Lovastatinbehandlung 54 5.4.3 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 55 5.4.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 55 6 Diskussion 57 6.1 Klinischer Hintergrund 57 6.2 Tiermodelle für die radiogene orale Mukositis 58 6.2.1 Maus 58 6.2.2 Ratte 58 6.2.3 Hamster 58 6.3 Eigenschaften des unbehandelten Zungengewebes 59 6.3.1 Epithel der Zungenunterseite 59 6.3.1.1 Zellzahl . .59 6.3.1.2 Nachweis von iNOS 59 6.3.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 60 6.3.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 60 6.3.2.1 Nachweis von iNOS 60 6.3.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 60 6.3.2.3 Nachweis von CD105 60 6.3.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 60 6.4 Veränderungen bei konventioneller fraktionierter Bestrahlung 61 6.4.1 Epithel der Zungenunterseite 61 6.4.1.1 Zellzahl . 61 6.4.1.2 Nachweis von iNOS 61 6.4.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 62 6.4.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 62 6.4.2.1 Nachweis von iNOS 62 6.4.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 62 6.4.2.3 Nachweis von CD105 63 6.4.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 63 6.5 Veränderungen bei alleiniger Lovastatinbehandlung 63 6.5.1 Epithel der Zungenunterseite 63 6.5.1.1 Zellzahl . 63 6.5.1.2 Nachweis von iNOS 63 6.5.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 64 6.5.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 64 6.5.2.1 Nachweis von iNOS 64 6.5.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 64 6.5.2.3 Nachweis von CD105 64 6.5.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 65 6.6 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung mit zusätzlicher Lovastatinbehandlung über 2 Wochen 65 6.6.1 Epithel der Zungenunterseite 65 6.6.1.1 Zellzahl . 65 6.6.1.2 Nachweis von iNOS 65 6.6.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 66 6.6.2 Immunzellen in den L. propria und L. muscularis 66 6.6.2.1 Nachweis von iNOS 66 6.6.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 67 6.6.2.3 Nachweis von CD105 67 6.6.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 67 6.7 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung mit zusätzlicher Lovastatinbehandlung ab Tag 7 68 6.7.1 Epithel der Zungenunterseite 68 6.7.1.1 Zellzahl . 68 6.7.1.2 Nachweis von iNOS 68 6.7.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 68 6.7.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 69 6.7.2.1 Nachweis von iNOS 69 6.7.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 69 6.7.2.3 Nachweis von CD105 69 6.7.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 70 6.8 Zusammenfassende Einschätzung der Ergebnisse 70 7 Ausblick 72 8 Zusammenfassung 73 9 Summary 75 10 Abbildungsverzeichnis 77 11 Tabellenverzeichnis 80 12 Literatur 81 13 Anhang 92 14 Danksagung 100

The ErbB family of receptors are key regulators of growth, differentiation, migration and survival of epithelial cells. CI-1033 is an irreversible pan-ErbB tyrosine kinase inhibitor that has the ability to inhibit EGFR function but has shown limited therapeutic efficacy. Lovastatin targets the activity of HMG-CoA reductase, the rate-limiting step in the mevalonate pathway. In this study, the ability of lovastatin to potentiate the cytotoxic effects of CI-1033 was evaluated. The combination of lovastatin and CI-1033 exhibited some cooperative cytotoxic activity in a squamous cell carcinoma–derived cell line. This combination resulted in enhanced cell death by induction of a potent apoptotic response. Furthermore, this drug combination inhibited EGF-induced EGFR autophosphorylation and activation of the downstream signaling effectors, ERK and AKT. These findings suggest that combining lovastatin and tyrosine kinase inhibitors may represent a novel combinational therapeutic approach in squamous cell carcinoma of the head and neck.

The ErbB family of receptors are key regulators of growth, differentiation, migration and survival of epithelial cells. CI-1033 is an irreversible pan-ErbB tyrosine kinase inhibitor that has the ability to inhibit EGFR function but has shown limited therapeutic efficacy. Lovastatin targets the activity of HMG-CoA reductase, the rate-limiting step in the mevalonate pathway. In this study, the ability of lovastatin to potentiate the cytotoxic effects of CI-1033 was evaluated. The combination of lovastatin and CI-1033 exhibited some cooperative cytotoxic activity in a squamous cell carcinoma–derived cell line. This combination resulted in enhanced cell death by induction of a potent apoptotic response. Furthermore, this drug combination inhibited EGF-induced EGFR autophosphorylation and activation of the downstream signaling effectors, ERK and AKT. These findings suggest that combining lovastatin and tyrosine kinase inhibitors may represent a novel combinational therapeutic approach in squamous cell carcinoma of the head and neck.

HMG-CoA reductase (HMGR) catalyzes the rate controlling step in cholesterol production. This enzyme is highly expressed in the liver where it is subject to extensive hormonal and dietary regulation. This study was undertaken to examine the occupancy and function of the hepatic HMGR promoter in regards to insulin and sterol regulation. HMGR protein and mRNA are substantially decreased in diabetic animals and rapidly restored by administration of insulin. Nuclear run-on assays revealed that HMGR transcription was substantially reduced in the diabetic rats, and fully restored within two hours after insulin treatment. In vivo footprinting revealed several areas of protein binding as shown by dimethyl sulfate protection or enhancement. The CRE was heavily protected in all conditions - including diabetes, cholesterol feeding, or statin treatment. Striking enhancements in footprints from diabetic animals were observed at -142 and at -161 (in the SRE). Protections at a newly ident ified NF-Y site at -70/-71 were seen in normal animals, and not in diabetics. This proximal NF-Y site was found to be required for efficient HMGR transcription. CREB-1 was able to bind the HMGR CRE in vitro, and to the promoter in vivo. The data supports an essential role for CREB in transcription of hepatic HMGR, and identifies at least two sites where in vivo occupancy is regulated by insulin. The technique of in vivo electroporation was utilized to perform the first functional analysis of the HMGR promoter in live animals. Analysis of a series of deletion constructs showed that deletion of the region containing the cyclic AMP response element (CRE) at -104 to -96 and the newly identified NF-Y site at -70 resulted in marked reduction of promoter activity. Possible sterol regulation of the promoter was investigated by raising tissue cholesterol levels by feeding cholesterol, or by inhibiting cholesterol synthesis with a statin (lovastatin). It was found that HMGR promoter constructs r esponded to lovastatin, in agreement with previous findings in cultured cells. This work sheds light on the regulation of the HMGR promoter in the liver, whose expression is a key determinant of serum cholesterol levels- a major risk factor for cardiovascular disease.

The ErbB family of receptors are key regulators of growth, differentiation, migration and survival of epithelial cells. CI-1033 is an irreversible pan-ErbB tyrosine kinase inhibitor that has the ability to inhibit EGFR function but has shown limited therapeutic efficacy. Lovastatin targets the activity of HMG-CoA reductase, the rate-limiting step in the mevalonate pathway. In this study, the ability of lovastatin to potentiate the cytotoxic effects of CI-1033 was evaluated. The combination of lovastatin and CI-1033 exhibited some cooperative cytotoxic activity in a squamous cell carcinoma–derived cell line. This combination resulted in enhanced cell death by induction of a potent apoptotic response. Furthermore, this drug combination inhibited EGF-induced EGFR autophosphorylation and activation of the downstream signaling effectors, ERK and AKT. These findings suggest that combining lovastatin and tyrosine kinase inhibitors may represent a novel combinational therapeutic approach in squamous cell carcinoma of the head and neck.

Mise en contexte : Le syndrome du X fragile (SXF) résulte de la perte d’expression de la protéine FMRP. L’absence de FMRP est responsable d’une série de perturbations signalétiques, notamment une hyperactivation de la voie MAPK/ERK. La lovastatine, un médicament hypocholestérolémiant, possède comme effet pléiotrope la capacité d’inhiber la voie MAPK/ERK et a permis de corriger certains phénotypes pathologiques clés du modèle murin du SXF, mettant en lumière son potentiel thérapeutique chez l’humain. Ainsi, nous avons réalisé en 2013 une étude ouverte visant à étudier l’effet d’un traitement de 12 semaines à la lovastatine sur les troubles cognitifs et comportementaux des enfants et des adultes avec SXF. La plupart des individus ont présenté des améliorations cognitives et comportementales, telles qu’évaluées par les échelles cliniques Vineland-II Adaptive Behavior Scale (VABS-II) et Aberrant Behavior Checklist-Community (ABC-C), respectivement. Ces échelles remplies par les tuteurs et les soignants sont toutefois évaluateur-dépendantes et sujettes à l’effet expérimentateur. Ces variables parasites, qui s’ajoutent à l’effet placebo inhérent à la conception ouverte de l’essai thérapeutique, peuvent ainsi avoir faussé l’évaluation de la réponse au traitement. Nous avons donc étudié si les cascades signalétiques des plaquettes sanguines peuvent être utilisées comme biomarqueurs objectifs pour surveiller la réponse au traitement. Méthode : Des échantillons sanguins des 15 individus SXF ayant participé à l’essai clinique ont été recueillis au début et à la fin de l’étude afin d’évaluer par Western Blot l’effet in vivo de la lovastatine sur l’activité de ERK dans les plaquettes sanguines, et ainsi de pouvoir corréler les réponses biologiques et cliniques. L’état de phosphorylation de ERK a également été étudié dans les plaquettes d’une cohorte contrôle. Résultats : Nos résultats démontrent une augmentation significative de près du double de la phosphorylation basale de ERK dans les plaquettes sanguines des individus avec SXF en comparaison avec les sujets contrôles (p=0,002). De plus, nous avons observé une normalisation de la phosphorylation de ERK chez 13 des 15 individus SXF après le traitement de 12 semaines à la lovastatine (p=0,007). Notre étude fournit ainsi les premières évidences d’un effet bénéfique de la lovastatine dans le SXF chez l’humain. Nous avons également démontré que les changements de la phosphorylation de ERK étaient partiellement corrélés à la réponse clinique, et ce, pour le score total et les scores des sous-domaines ‘socialisation’ et ‘compétences de la vie quotidienne’ de l’échelle VABS-II (p=0,003). Conclusion : De façon générale, ces résultats suggèrent que les cascades signalétiques plaquettaires peuvent être utilisées comme biomarqueurs pour évaluer de façon objective la réponse au traitement lors de futurs essais thérapeutiques. / Abstract: Background: Fragile X syndrome (FXS) results from loss of FMRP expression, which causes several signaling dysregulations, including the hyperactivation of the Mitogen-activated protein kinase (MAPK)/Extracellular signal-regulated kinase (ERK) pathway. Lovastatin, a drug used for the treatment of hypercholesterolemia, pleiotropically inhibits the MAPK/ERK cascade and has successfully corrected key pathological phenotypes in the FXS mouse model, underscoring its ‘disease-modifying’ potential. Thereby, we conducted in 2013 the first open-label clinical trial investigating the effect of a 12-week lovastatin regimen on cognitive and behavioral disabilities in FXS. Most individuals presented subtle positive cognitive changes as assessed by the Vineland-II Adaptive Behavior Scale (VABS-II) as well as behavior improvements using the widely used scale Aberrant Behavior Checklist-Community (ABC-C). The latter two scales are filled up by caregivers making them rater-dependent and prone to observer-expectancy effect. This might result in a placebo effect which is inherent to the open-label design of the trial. We therefore investigated whether blood platelets’ signaling cascades may be used as objective biomarkers to monitor treatment response. Methods: Blood samples were gathered from 15 FXS individuals during the trial in order to evaluate by quantitative Western Blotting the in vivo effect of lovastatin on ERK activity in blood platelets, and to correlate clinical and biological responses. The basal phosphorylation status of ERK was also assessed in platelets from a control cohort. Results: Our results showed a more than two-fold significant increase in FXS blood platelet basal ERK phosphorylation as compared to controls (p=0.002). Of note, we found that this hyperphosphorylation was normalized following the 12-week lovastatin trial (p=0.007) in 13 of the 15 FXS individuals enrolled in the trial. This represents the first evidence for a beneficial effect of lovastatin in human FXS. The extent of changes in ERK phosphorylation was also found to partly correlate with the clinical response scales’ scores, especially for the VABS-II. Indeed, the composite total score and the ‘daily living skills’ as well as the ‘socialization’ subscales scores of the VABS-II were correlated with the biological response (p=0.03). In comparison, no correlation was observed with the ABC-C scale. Conclusion: Broadly, these results suggest that platelets’ signaling cascades could be used as biomarkers to objectively assess treatment response during future clinical trials.

The ErbB family of receptors are key regulators of growth, differentiation, migration and survival of epithelial cells. CI-1033 is an irreversible pan-ErbB tyrosine kinase inhibitor that has the ability to inhibit EGFR function but has shown limited therapeutic efficacy. Lovastatin targets the activity of HMG-CoA reductase, the rate-limiting step in the mevalonate pathway. In this study, the ability of lovastatin to potentiate the cytotoxic effects of CI-1033 was evaluated. The combination of lovastatin and CI-1033 exhibited some cooperative cytotoxic activity in a squamous cell carcinoma–derived cell line. This combination resulted in enhanced cell death by induction of a potent apoptotic response. Furthermore, this drug combination inhibited EGF-induced EGFR autophosphorylation and activation of the downstream signaling effectors, ERK and AKT. These findings suggest that combining lovastatin and tyrosine kinase inhibitors may represent a novel combinational therapeutic approach in squamous cell carcinoma of the head and neck.