HVEM est une molécule exprimée à la surface des mélanomes (M) qui pourrait contribuer à la croissance tumorale en se liant à BTLA, un co-récepteur inhibiteur exprimé par les lymphocytes T infiltrants les tumeurs (TILs). Nos objectifs étaient 1-d’explorer la valeur pronostique de l’expression d’HVEM par les M; 2-de confirmer l’existence d’une interaction HVEM/BTLA in vivo à l’interface mélanome-TILs; 3- de comprendre les mécanismes de régulation d’HVEM..Méthodes: L’expression d’HVEM a été analysée par immunohistochimie et corrélée à la survie globale des patients. Ces résultats ont été renforcés par l'étude de données transcriptomiques du TCGA. L’analyse de l’expression d’HVEM à la surface des cellules de M et de BTLA à la surface des TILs a été réalisée par cytométrie en flux et co-immunoflorescence afin de confirmer l’existence d’interactions HVEM-BTLA in vivo. Enfin, les mécanismes de régulation d’HVEM ont été explorés par des analyses bio-informatiques couplées à des techniques de siRNA.Résultats : Les patients ayant une expression élevée d’HVEM par leur M avaient une survie globale significativement plus réduite que ceux ayant une expression faible d’HVEM à la fois en immunohistochimie (p= 0,0124) et en transcriptomique (p=0,0282).D’un point de vue mécanistique: HVEM exprimé par les M interagissait avec BTLA exprimé par les TILs et l’expression d’HVEM n’était ni liée au statut mutationnel, ni induite par l’interféron gamma . Nous avons également montré que les gènes co-exprimés avec HVEM formaient une signature d’agressivité et que MITF contrôlait l’expression d’HVEM.Conclusion : HVEM ou BTLA pourraient être des cibles thérapeutiques de choix dans le M. / Purpose: Upon engagement with HVEM, BTLA triggers inhibitory signals in T cells. Using melanoma, we correlated HVEM expression with clinical outcomes and confirmed the occurrence of HVEM-BTLA interaction inside melanoma. Moreover, we determined regulatory mechanisms accounting for the complementary pattern of expression we observed for HVEM and PD-L1.Experimental design: HVEM expression levels were analyzed by immunohistochemistry in melanoma metastases and correlated with overall survival (OS). Coincident expression of HVEM and its ligand BTLA was studied in tumor cells and tumor-infiltrated-lymphocytes (TILs) by flow cytometry and co-immunofluorescence. Candidate genes controlling HVEM expression on melanoma were defined by bioinformatics studies and validated by siRNA.Result: Patients with high HVEM expression on melanoma cells had a significantly poorer OS than those with a low expression as documented by immunohistochemistry (p=0.0124) and TCGA (p=0.0282). From a mechanistic point of view, we showed (1) that HVEM expressed at the surface of melanoma cells interacts with BTLA expressed by TILs, (2) that HVEM expression is neither linked to the melanoma mutational status nor inducible by IFN 3) that genes co-expressed with HVEM are associated with an aggressive gene signature, and (4) that MITF controls HVEM expression.Conclusion: In contrast to PD-L1, HVEM expression is constitutive and correlated with the expression of genes involved in aggressive features. Therefore, high HVEM expression on melanoma cells is a pejorative prognostic marker, substantiating the use of checkpoint inhibitors directed at HVEM and BTLA in the treatment of melanoma

Le mélanome cutané métastatique était un cancer au pronostic particulièrement péjoratif, jusqu’au développement récent de 2 classes pharmacologiques: l’immunothérapie, pour tous les mélanomes, et les thérapies ciblées, principalement pour les mélanomes porteurs de la mutation BRAF (50% des mélanomes cutanés). Mais l’apparition de résistance, et l’absence de thérapies ciblées sur les mélanomes non mutés BRAF, incitent à rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre travail portait sur l’étude in vitro de la phosphodiestérase de type 4 (PDE4), une enzyme régulant la voie de l’AMPc, principale voie de différenciation mélanocytaire. L’objectif était d’évaluer le rôle de PDE4 dans le mélanome, et l’effet de son inhibition par des molécules pharmacologiques déjà disponibles sur le marché.Dans une première partie, nous avons étudié le rôle de PDE4 dans les cellules de mélanomes mutés sur BRAF. Nous avons montré que l’isoforme PDE4D5 est surexprimée dans le mélanome, et régule l’invasion cellulaire par un mécanisme faisant intervenir la focal adhesion kinase, FAK. Dans les tumeurs nous avons observé une association entre le niveau d’expression de PDE4D5 et le degré d’invasion du mélanome.Dans une seconde partie, nous avons étudié l’effet de l’inhibition de PDE4 sur la prolifération cellulaire. Nous avons montré que la croissance des cellules de mélanome muté BRAF cultivées sous forme de mélanosphères, enrichies en cellules initiatrices de tumeurs, est réduite en présence d’inhibiteurs de PDE4. De plus les lignées BRAF muté résistantes aux inhibiteurs de BRAF gardent une sensibilité aux inhibiteurs de PDE4. Ces résultats, et ceux de l’équipe établis dans le mélanome muté sur RAS, corroborent l’hypothèse que PDE4 pourrait être une cible thérapeutique d’intérêt dans le traitement du mélanome métastatique / Metastatic melanoma was associated with a pejorative prognosis, until the recent development of 2 pharmacological classes: immunotherapy for all types of melanomas and targeted therapies, mainly for melanomas carrying the BRAF mutation (50% of skin melanomas). However, the emergence of resistance, and the absence of targeted therapies to treat non-mutated BRAF melanomas, prompt further research to study new therapeutic targets.Our work focused on the in vitro study of phosphodiesterase type 4 (PDE4), an enzyme regulating the cAMP pathway, the main pathway controlling melanocyte differentiation. The objective was to evaluate the role of PDE4 in melanoma and the effect of its inhibition by already available pharmacological molecules.First, we studied the role of PDE4 in BRAF mutated melanoma cells. We found that the PDE4D5 isoform is overexpressed in melanoma cells, and regulates cell invasion through a mechanism involving a focal adhesion kinase (FAK). We observed in tumor samples an association between the level of expression of PDE4D5 and the degree of invasion by melanoma cells.Second, we studied the effect of PDE4 inhibition on cell proliferation. We found that the proliferation of BRAF mutated melanoma cells grown as melanospheres, enriched with tumor-initiating cells, is reduced in the presence of PDE4 inhibitors. In addition, mutated BRAF strains resistant to BRAF inhibitors remain sensitive to PDE4 inhibitors. These results corroborate the hypothesis that PDE4 could be a potential target in the treatment of metastatic melanoma

L'émergence de nouvelles approches thérapeutiques, basées sur des inhibiteurs de points de contrôle immunitaire (ICI), telles que les anti-CTLA-4 et anti-PD-1, ont révolutionné la prise en charge du mélanome. Cependant les taux de réponses objectives à ces traitements restent relativement faibles et de sévères effets indésirables ou des résistances peuvent survenir. Il est donc nécessaire de comprendre les mécanismes de résistance et d'identifier des biomarqueurs prédictifs de la réponse aux ICI afin d'adapter la stratégie thérapeutique. Notre groupe a identifié des perturbations du métabolisme de la sphingosine 1-phosphate (S1P) dans les cellules de mélanome. Notamment, la surexpression de la Sphingosine Kinase-1 (SK1), une enzyme de production de la S1P qui favorise la progression tumorale en induisant des modifications phénotypiques du microenvironnement tumoral (TME), telles que la stromagenèse, l'angiogenèse et la polarisation M2 des macrophages. Or, la S1P joue un rôle important dans l'immunité car elle régule de nombreux processus comme l'activation, la différenciation et le trafic de nombreuses cellules immunitaires. L'objectif de cette thèse a été de déterminer si l'inhibition de la SK1 affecte la réponse immunitaire anti-tumorale et améliore l'efficacité des ICI. Nous avons mis en évidence que l'expression accrue de SK1 dans les cellules tumorales est significativement associée à une survie plus courte chez les patients atteints de mélanome métastatique traités par anti-PD-1. Ensuite, nous avons démontré, dans un modèle murin, que la diminution de l'expression de SK1 dans la tumeur induit une réduction de la croissance du mélanome qui est associée à une diminution de l'expression de diverses molécules immunosuppressives dans le TME. Cette modification du TME diminue la prolifération mais aussi l'infiltration des lymphocytes T régulateurs (Treg) et par conséquent induit une augmentation du ratio CD8+/Treg, ce qui est associé à un bon pronostic. Une signature immunosuppressive dépendante de SK1 a également été observée dans des biopsies de mélanome humain. De manière importante, nos données révèlent que l'inhibition de SK1 améliore fortement l'efficacité des ICI, tels que les anti-CTLA-4 ou les anti-PD-1, conduisant au rejet des tumeurs et à une amélioration significative de la survie des animaux dans un modèle murin de mélanome. Des résultats significatifs ont également été obtenus dans des modèles de cancer du sein et du côlon. Ici, nous montrons que: i) le ciblage de SK1 dans les mélanomes conduit à une augmentation du rapport intratumoral CD8+/Treg, ii) la combinaison de l'inhibition de SK1 avec des ICI améliore grandement la survie des souris et iii) la SK1 pourrait constituer un nouveau biomarqueur prédictif de la réponse aux ICI chez l'Homme. Par conséquent, nos données ont identifié la SK1 comme une kinase lipidique agissant comme un nouveau point de contrôle immunitaire, qui pourrait être ciblée afin d'améliorer la réponse aux ICI dans différents cancers. / The emergence of new therapeutic approaches, thanks to immune checkpoint inhibitors (ICI), such as anti-CTLA-4 and anti-PD-1, have revolutionized the management of melanoma. However, the objective response rates to these treatments remain relatively low and severe adverse events or resistance can occur. This is why it is essential to understand the mechanisms that underlie resistance and identify predictive biomarkers of the response to ICI in order to adapt the therapeutic strategy. Our group identified perturbations of sphingosine 1-phosphate (S1P) metabolism in melanoma cells. In particular, the overexpression of sphingosine kinase (SK1), an S1P-producing enzyme that promotes tumor progression by stimulating stromagenesis, angiogenesis and polarization of macrophages toward M2 Phenotype. Interestingly, S1P is a well-known regulator of the activation, differentiation and trafficking of many immune cells. This thesis aims at determining whether the inhibition of SK1 improves the anti-tumor immune response as well as the efficacy of ICI. We found that an increased expression of SK1 in tumor cells is significantly associated with shorter survival in patients with metastatic melanoma treated with anti-PD-1. In a mouse model, we also demonstrated that a decreased SK1 expression in tumors leads to reduction of melanoma growth as well as expression of several immunosuppressive factors in the TME. These modifications are associated to significant reduction of proliferation, infiltration of regulatory T cells (Treg) and consequently to an increase in the CD8+/Treg ratio, which is associated with good prognosis. A SK1-dependent immunosuppressive signature has also been observed in human melanoma biopsies. Importantly, our data reveal that inhibition of SK1 strongly enhances the efficacy of ICI, such as anti-CTLA-4 or anti-PD-1, leading to tumor rejection and improved survival in a mouse model of melanoma. Significant results have also been obtained in breast and colon cancer models. Overall, we show that: i) SK1 targeting in melanomas leads to an increase of the intratumoral CD8 + / Treg ratio, ii) the combination of SK1 inhibition with ICI greatly enhances mice survival, iii) SK1 could be a new predictive biomarker of response to ICI in humans. Altogether, our data identified SK1 as a new checkpoint lipid kinase that could be targeted to improve response to ICI in several cancers.

Le mélanome est un cancer qui représente la grande majorité de la morbidité et de la mortalité causées par tout cancer de la peau en raison de son implication dans les métastases. Parmi plusieurs biomarqueurs rapportés, les récepteurs du domaine de la discoïdine (DDR) et la métalloprotéinase Matrix (MMP) sont également considérés comme des acteurs potentiels du mélanome. Des études récentes démontrent que les DDR et les MMP sont surexprimés dans les mélanomes de mauvais pronostic, ce qui nécessite le recours à des sondes théranostiques à biomarqueurs spécifiques. De nombreux progrès ont été réalisés pour réduire le risque associé au mélanome métastatique à l'aide d'anticorps monoclonaux traditionnels, mais les inconvénients tels que la complexité de la production, la variabilité d'un lot à l'autre, la courte durée de conservation, l'immunogénicité, la réactivité croisée et le coût élevé ne peuvent être négligés. Par conséquent, au cours des dernières années, les aptamères ont acquis un grand intérêt comme substitut d’anticorps pouvant être synthétisés chimiquement avec un faible coût de production et dépassant les limitations associées aux anticorps. Les aptamères sont de courts oligonucléotides à haute affinité et spécificité vis-à-vis de la molécule cible, développés par une méthode combinatoire appelée SELEX (Evolution systématique de ligands par enrichissement exponentiel). Au cours de ma thèse, nous avons réalisé une étude SELEX contre les biomarqueurs DDR1, DDR2 et HMMP14 sur la base de supports alternatifs pour le tri des candidats et le séquençage à haut débit. Un groupe d'aptamères a été sélectionné contre DDR1 et le meilleur candidat a ensuite été dopé pour effectuer davantage de tours de sélection contre DDR1. Finalement, un aptamère contre DDR1 a été sélectionné avec un Kd dans la gamme nanomolaire basse. Cet aptamère peut être utilisé comme outil théranostique dans les études sur le mélanome associé à DDR1. Comme les aptamères présentent un avantage en termes de conjugaison et de modifications aux positions désirées, nous visons en outre à conjuguer cet aptamère avec des nanoparticules pour des études in vivo. / Melanoma is a cancer that accounts for the vast majority of morbidity and mortality caused by any skin cancer due to its involvement in metastasis. Among several reported biomarkers, Discoidin Domain Receptors (DDRs) and Matrix metalloproteinase (MMPs) are also considered as potential actors in melanoma. Recent studies demonstrate that DDRs and MMPs are overexpressed in melanoma with poor prognosis which demands the need of biomarkers specific theranostics probes. Though many advances has been made in order to reduce the risk associated with metastatic melanoma with the help of traditional monoclonal antibodies, but the drawbacks like production complexity, batch to batch variability, short shelf life, immunogenicity, cross reactivity and high cost cannot be neglected. Therefore in recent years, aptamers have gained high interests as a substitute of antibodies that can be synthesized chemically with low production cost and overcomes the limitations associated to antibodies. Aptamers are short oligonucleotides with high affinity and specificity against its target molecule, raised by a combinatorial method known as SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). During my thesis, we performed a SELEX against DDR1, DDR2 and HMMP14 biomarkers based on alternative supports for candidates sorting and high throughput sequencing. A group of aptamers were selected against DDR1 and the best candidate was further doped to perform more rounds of selection against DDR1. Finally an aptamer against DDR1 was selected with a Kd in low nano-molar range. This aptamer can be used as a theranostics tool in DDR1 associated melanoma studies. As aptamers have an advantage of conjugation and modifications at desired positions so we further aim to conjugate this aptamer with nanoparticles for In-vivo studies.

Le mélanome métastatique est resté longtemps synonyme de pronostic catastrophique en raison de la faible efficacité des traitements disponibles. Depuis quelques années, de nombreuses innovations thérapeutiques ont révolutionné la prise en charge de ces patients, avec l’autorisation de mise sur le marché de traitements modulateurs de l’immunothérapie d’une part et de thérapies ciblant la voie des MAP kinases destinées aux patients porteurs de la mutation BRAF (présente dans environ 50% des mélanomes) d’autre part.Les inhibiteurs de BRAF et de MEK sont à l’origine de réponses spectaculaires, mais le contrôle de la maladie est généralement limité dans le temps, avec l’apparition de résistances au traitement entraînant une progression de la maladie. Etablir des stratégies thérapeutiques permettant de retarder ou de contourner ces résistances s’avère donc primordial. Pour ce faire, des biomarqueurs ou outils prédictifs de la réponse, in vitro et in vivo, peuvent contribuer à mieux stratifier les patients, et personnaliser leur prise en charge.Dans une première partie, nous avons comparé l’apport respectif d’un traceur de prolifération cellulaire, la 18F-FLT, et du traceur de consommation de glucose le 18F-FDG, dans l’évaluation thérapeutique d’une xénogreffe de mélanome BRAF muté traité par un inhibiteur de BRAF. Nous avons confirmé la place prépondérante du 18F-FDG, et étayé l’intérêt des index volumiques pour le suivi thérapeutique, notamment avec la 18F-FLT.Dans une seconde partie nous avons évalué in vivo la capacité d’un schéma d’administration intermittente à retarder l’apparition de résistance par rapport à un schéma d’administration continue dans des xénogreffes BRAF mutées traitées par une combinaison d’inhibiteurs BRAF/MEK. Dans nos modèles expérimentaux, il ne semblait pas y avoir de supériorité de l’administration intermittente. Toutefois nos expérimentations n’ont pas permis de trancher de façon formelle la question.Dans une troisième partie, nous avons voulu reproduire le schéma d’administration intermittent ex vivo en utilisant la technique d’histocultures. Nous avons par ailleurs évalué la possibilité pour des histocultures issues de tumeurs de patients de prédire la réponse aux thérapies ciblées chez ces mêmes patients. Les histocultures semblent un outil fiable pour guider les choix thérapeutiques. La documentation des modifications génétiques et de l’hétérogénéité moléculaire du mélanome pourrait également inciter à adapter la stratégie en fonction de l’agressivité présumée du mélanome chez un patient donné / Metastatic melanoma has long been synonymous of dismal prognosis, due to the weak efficacy of available treatments. Numerous therapeutic innovations have profoundly modified the management of these patients, with marketing authorizations of therapies targeting the MAP Kinases pathway for patient with BRAF mutated melanoma (about 50% of patients) on the one hand and immune checkpoint inhibitors on the other hand.BRAF and MEK inhibitors result in dramatic responses, but disease control is generally short-lived, with onset of drug resistance leading to disease progression. Designing therapeutic strategies allowing delaying or bypassing this resistance phenomenon is of primary importance. Thus, in vitro and vivo biomarkers or tools predictive of response could help stratifying patients, and personalize each patient’s management.In the first part, we compared the respective value of a proliferation tracer, 18F-FLT, and of the glucose consumption tracer, 18F-FDG for therapeutic evaluation of a BRAF mutated melanoma xenograft, treated by a BRAF inhibitor. We confirmed the predominant role of 18F-FDG, and backed up the potential interest of volumetric parameters for therapeutic follow-up, especially with 18F-FLT.In a second part we assessed in vivo the ability of an intermittent schedule to delay resistance onset, compared with a continuous schedule in BRAF mutated xenografts treated by a BRAF/MEK inhibitors combination. In our experimental models, there did not seem to be any superiority for the intermittent schedule. However our experiments did not allow us to draw any final conclusions on the subject.In a third part, we tried to reproduce ex vivo the intermittent schedule with histocultures device. We also assessed the possibility for histocultures with patient derived tumours to predict response to targeted therapies in the same patients. Histocultures appear as a relevant tool to guide therapeutic choice. Determination of genetic modifications and molecular heterogeneity may also prompt tailoring therapeutic strategy depending on the supposed aggressiveness of a melanoma in a given patient

Le mélanome est la forme la plus rare et la plus grave des cancers de la peau. Il présente un fort pouvoir métastatique et à l'heure d'aujourd’hui, il n'y a pas de traitement efficace contre le mélanome disséminé. Le travail présenté dans ce mémoire s'inscrit dans la continuité d'une stratégie de d'adressage spécifique de pro-drogues vers le mélanome initiée au sein de notre laboratoire. Notre concept repose sur la conjugaison d'ICF01012, vecteur à fort tropisme pour les mélanines, avec un principe actif modèle (IUdR) sous forme de pro-drogues à espaceurs clivables de type disulfure d'éthyle carbonate ou pnitrobenzylcarbonate pour une double spécificité (i.e. distribution tumorale et libération spécifique de la tumeur). Un premier travail de fonctionnalisation d'ICF01012 a abouti à la synthèse de sept nouveaux vecteurs qui ont été radio-marqués à l'iode 125 afin d'évaluer leur comportement in vivo chez des souris C57Bl/6J porteuses de mélanome B16F0 par scintigraphie plane gamma et biodistribution ex vivo. Le vecteur radio-iodé présentant le profil pharmacocinétique le plus favorable (fixation tumorale forte, spécifique et durable) a été ensuite sélectionné en vue d'une première validation de notre concept de prodrogues vectorisées. Les entités "IUdR-espaceurs clivables" et leurs analogues non clivables à base d'espaceurs de type mercaptoéthylcarbonate ou benzylcarbonate ont également été synthétisés. L'étude de leur comportement au contact de 2S,3S-dithiothreitol et d'hydrosulfite de sodium (mimant l'action du glutathion et de conditions hypoxiques, respectivement) a montré que la libération de l'IUdR est quasitotale et qu'elle est bien induite par la présence du pont disulfure et du groupement nitré. Sur la base de ces résultats, deux pro-drogues ainsi que leurs analogues non clivables ont été synthétisés par association de la partie vectrice avec l'IUdR et les espaceurs clivables ou non clivables. Les études de biodistribution in vivo de l'IUdR et de la pro-drogue à espaceur disulfure radio-marquées à l'iode 125 ont démontré une absence de vectorisation, imputable à une métabolisation très rapide de la pro-drogue par la suite d'un clivage extrêmement rapide de l'espaceur disulfure in vivo provoquant la libération instantanée de l'IUdR dès les premières minutes qui suivent l'injection de la pro-drogue. Néanmoins, des voies de synthèse et des méthodes de suivi de clivages chimiques transposables ont été mises au point et peuvent être utilisées dans les futures études s'inscrivant dans le cadre d'une chimiothérapie vectorisée du mélanome. / Melanoma is the rarest and the most serious form of skin cancer. It has a high metastatic potential and in today's time, there is no effective treatment against disseminated melanoma. The present work is a continuation of a melanoma targeted prodrug therapy approach initiated in our laboratory. Our concept is based on the combination of ICF01012, vector that displays a high tropism for melanin, with IUdR, a drug model, as cleavable prodrugs containing a disulfide ethyl carbonate or a pnitrobenzylcarbonatespacer type for a dual specificity (i.e. tumoral distribution and specific delivery to the tumor). Functionalization of ICF01012 led to the synthesis of seven new vectors that were 125Iradiolabeled in order to evaluate their behavior in vivo (planar gamma scintigraphy and ex vivo biodistribution) in B16F0 melanoma-bearing mice. The radioiodinated vector having the most favorable pharmacokinetic profile (high, specific and long lasting tumoural uptake) was then selected for a first validation of our targeted prodrugs concept. Entities "IUdR-cleavable spacers" and their analogs with noncleavable spacers (mercaptoéthylcarbonate or benzylcarbonate kind) were also synthesized. The study of their behavior in contact with 2S,3S-dithiothreitol and sodium hydrosulfite (mimicking glutathione and hypoxic conditions actions, respectively) showed that the release of IUdR is almost complete and it is induced by the presence of the disulfide bridge and the nitro group. Based on these results, two prodrugs and their non-cleavable analogs were synthesized by combining the vector part with IUdR and cleavable or non-cleavable spacers. The in vivo biodistribution studies of 125I-radiolabeled IUdR and disulfide spacer based-prodrug showed no vectorization due to a very rapid metabolism of the prodrug following extremely rapid cleavage of the disulfide spacer in vivo causing instantaneous IUdR release in the firstminutes after prodrug injection. However, transposable synthetic routes and cleavage studies have been developed and can be used in future studies within the framework of melanoma targeted prodrug therapy

Le mélanome représente 8000 nouveaux cas par an et plus d'un millier de décès. Dés l'apparition de métastases, le pronostic devient très mauvais en raison de l'inefficacité de tous les traitements. Enfin, bien que des résultats encourageants aient été obtenus récemment avec des thérapies ciblées, ces réponses restent insuffisantes. L'identification de nouvelles molécules candidates est donc un élément essentiel pour le traitement du mélanome. Pendant la 1ère partie de ma thèse, je me suis intéressé à la metformine. Nous avons observé une diminution de l’invasion des cellules de mélanome dépendante de l'activation de l’axe AMPK/ p53 en réponse à la metformine. Ainsi, nous avons démontré pour la 1ère fois que la metformine peut être utilisée pour inhiber l'invasion des cellules de mélanome. Ensuite, je me suis intéressé à d'autres antidiabétiques, les TZD. Grâce à un criblage structure / activité, nous avons identifié une nouvelle molécule, le HA15, dérivé des TZD et ayant une très forte activité anti-mélanome. Nous avons montré que le HA15 induit un stress du RE (UPR), par l'intermédiaire de la protéine chaperon Bip, conduisant à l'activation de l'apoptose et de l'autophagie, entraînant ainsi la mort des cellules. Cette étude a permis d’identifier une nouvelle molécule efficace contre le mélanome et renforce l'idée que l'UPR pourrait être une cible thérapeutique pour le traitement du mélanome. / Melanoma accounts for 8000 new cases each year and more than a thousand deaths. If diagnosed early enough, wide surgical excision may be sufficient to treat. However, at the onset of metastasis, the prognosis becomes very bad due to the ineffectiveness of all treatments. Finally, although encouraging results were recently obtained with B-Raf inhibitors and immunotherapy, these responses are insufficient. So identification of new candidate molecules is an essential element for melanoma treatment. During the first part of my PhD, I was interested in metformin, the most commonly used molecule for the treatment of type 2 diabetes mellitus. It had been shown in our laboratory that metformin reduces melanoma cells viability in vitro and in vivo. Melanoma is a highly metastatic cancer, so I focused on the potential effect of metformin on melanoma cells invasion. We observed a decrease of melanoma cells invasion dependent on the activation of AMPK / p53 axis in vitro and in vivo. So we have shown for the first time that metformin can be used to inhibit melanoma cells invasion.During the second part of my PhD, I have been interested in other antidiabetic drugs, thiazolidinediones (TZD). Through a structure / activity screening we identified a molecule, HA15, derived from TZD and having a very strong anti-melanoma activity in vitro and in vivo. We showed that HA15 induced unfolded protein response (UPR), via the chaperone protein Bip, leading to autophagy and apoptosis activation, and resulting in cell death. This study identified a new molecule potentially effective against melanoma and reinforces the idea that UPR could be a therapeutic target for melanoma treatment.

La plupart des cellules cancéreuses présentent une reprogrammation métabolique qui favorise la glycolyse et diminue la phosphorylation oxydative. Cette reprogrammation a reçu le nom d’effet Warburg et permet aux cellules tumorales de proliférer même en conditions adverses. Bien que l’effet Warburg ait été, pendant longtemps, associé à un dysfonctionnement mitochondrial, plusieurs études ont montré que dans les cellules cancéreuses les mitochondries ne sont pas dysfonctionnelles et jouent même un rôle important dans la tumorigénèse. Cependant, les mécanismes qui régulent cette reprogrammation métabolique dans le mélanome restent encore à être bien évalués. Dans ce contexte, nous avons montré que les mélanomes présentent une faible activité mitochondriale caractérisée par une diminution de la consommation d’oxygène. Ce profil métabolique est contrôlé au moins en partie par le facteur de transcription HIF-1, via l’expression de la pyruvate déshydrogénase kinase 3 (PDK3). L’inhibition pharmacologique de la PDK3, utilisant le Dichloroacetate (DCA) est suffisante pour réactiver la phosphorylation oxydative et induire la production des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Ainsi, la combinaison du DCA avec la molécule pro-oxydant elesclomol permet de potentialiser l’effet antitumural de cette dernière, de manière synergique. Fait intéressant, cette combinaison est également efficace dans les cellules ayant développé une résistance au vemurafenib, un inhibiteur de la protéine BRAFV600E. Dans ce contexte, dans la deuxième partie de cette étude, nous avons évalué si les cellules résistantes au vemurafenib présentent une modification métabolique qui pourrait expliquer leur sensibilité à la combiniasion DCA+eleslclomol. Nous avons montré que le vemurafenib induit une diminution de la glycolyse rendant les cellules dépendantes à la phosphorylation oxydative et augmente la biogénèse mitochondriale de manière dépendante ou indépendante de la réactivation de la voie MITF/PGC1α. En accord avec ces résultats, les cellules résistantes au vemurafenib présentent une augmentation de la consommation d’oxygène et de la production de ROS par rapport aux cellules sensibles. Le nouveau profil métabolique des cellules résistantes les rende plus sensibles aux agents pro-oxydants tels que l’elesclomol Nos résultats ont permis de montré la possibilité de cibler les modifications métaboliques par une approche pro-oxydant dans le but d’éradiquer de manière efficace les cellules de mélanome. / Most cancer cells undergo a metabolic rewiring from oxidative phosphorylation to glycolysis that allows them to proliferate even under stressful conditions. This phenomenon is known as the Warburg Effect and has been often associated to mitochondrial dysfunction. Although, many studies have shown that mitochondria is still active in cancer cells and seems to play a key role in tumorigenesis little is know about the mechanisms that regulate this metabolic swift. In this context, we first focused in the study of melanoma metabolism in different cell lines as in samples coming from patients. We first found that melanoma cells present low mitochondrial activity characterized by low oxidative phosphorylation. This metabolic behavior is at least partially controlled by the hypoxia-inducible factor-1α HIF-1α witch is constitutively express in melanoma cells even under nomoxic conditions. Inhibition of this factor induces a strong decrease in the expression and activity of PDK3. Pharmacological inhibition of PDK3 activity by dichloroacetate (DCA) is enough to reactivate mitochondrial oxidative phosphorylation and reactive oxygen species (ROS) production. Furthermore DCA increases in a synergistic manner elesclomol’s induced ROS production and cell death. Interestingly, BRAF V600E melanoma cells that were resistant to the BRAF inhibitor vemurafenib show were also sensible to this combination. Consequently, as a second part of this work we looked for to understand, why resistant cells were so sensible to these agents and if there were some metabolic modifications that could explain this behavior. We found that vemurafenib BRAFV600E induced inhibition causes an important decrease in glycolysis and renders melanoma cells addicted to oxidative phosphorylation by increasing mitochondria biogenesis dependently or not of MTIF/PCG1 axis. Conversely, vemurafenib resistant melanoma cell lines show higher mitochondrial activity associated with higher ROS production. Thus these cells are more sensible to elesclomol induced cell death than vemurafenib sensible cell lines. Our findings provide new insights into the metabolic pathways that allow cells to adapt to difficult microenvironment, showing that these metabolic modifications, especially in terms of ROS production, can be used to target and eradicate melanoma cells.

Le traitement du mélanome métastatique est longtemps resté cantonné à quelques chimiothérapies cytotoxiques à efficacité limitée. Récemment, le développement des immunothérapies et des thérapies ciblées a constitué une avancée majeure dans la prise en charge du mélanome. La découverte de mutations oncogéniques sur les voies de signalisation de la cellule tumorale a permis de définir de nouvelles cibles pour le développement d’ inhibiteurs pharmacologiques. Parmi ces mutations, la mutation BRAF V600E est présente dans 50% des mélanomes. Une des molécules anti-BRAF développée est le vémurafenib. L’efficacité de cette molécule a permis l’allongement de la durée de survie des patients en situation métastatique de 6 à 8 mois. Malheureusement, malgré la réponse initiale, l’échappement est la règle. Les mécanismes moléculaires responsables de la résistance acquise aux inhibiteurs de BRAF sont multiples et conduisent à l’activation de nombreuses voies de signalisation pour suppléer l’inhibition de BRAF. Actuellement la prise en charge des patients résistants aux inhibiteurs de BRAF n’est pas codifiée et s’avère complexe étant donné la multiplicité des mécanismes d’échappement. Dans le cadre de cette nouvelle approche de médecine personnalisée, de nouveaux outils doivent être développés dans le but (i) de tester l’efficacité de nouvelles molécules et (i) de tenter de prédire l’efficacité/la résistance des différents traitements disponibles. L’un de ces outils sont les xénogreffes de tumeurs issues directement des patients (Patient Derived Tumor Xenograft ou PDTX) ou « avatars ». Mon travail a consisté à mettre en place ce type d’outil pour répondre aux questions suivantes : Les modèles animaux développés sont-ils un bon modèle préclinique translationnel ? Permettent-ils d’étudier les modes d’action des nouvelles thérapies ciblées et d’explorer leurs mécanismes de résistance ? Si tel est le cas, peuvent-ils prédire une réponse clinique ? Différents modèles murins de xénogreffes de mélanome ont été mis au point et exploités. Des cellules tumorales puis des fragments de tumeurs ont été greffées en sous-cutané chez la souris immunodéficiente SCID. Les tumeurs ont été caractérisées en histologie et en biologie moléculaire pour montrer leur stabilité dans le modèle. Après plusieurs passages dans différentes générations de souris, les tumeurs conservent leurs mutations particulières. Par ailleurs différents traitements ont été administrés et la réponse à différentes stratégies thérapeutiques a été évaluée. Ce modèle nous a permis de valider l’efficacité des thérapies ciblées antiBRAF (vémurafenib) mais aussi d’autres approches visant les particularités métaboliques du mélanome. Le modèle avatar a permis de tester in vivo une association thérapeutique innovante qui associe un accélérateur de la phosphorylation mitochondriale, le DCA, et une molécule pro-oxydante, l’elesclomol, confirmant l’effet synergique obtenu in vitro. Par ailleurs l’elesclomol a pu être testé in vivo sur une tumeur devenue résistante à l’inhibiteur de BRAF, le vemurafenib. En outre, le modèle avatar constitue un bon modèle préclinique permettant d’aider directement le clinicien dans ses choix thérapeutiques. En effet nous avons réalisé une PDTX tout au long de l’évolution métastatique d’une patiente. Cette PDTX a permis de tester l’efficacité du vemurafenib et de réintroduire ce traitement à la patiente qui a pu bénéficier d’une amélioration clinique notable. 7 autres PDTX de patients ont été développées permettant de renforcer le modèle et de suivre de manière personnalisée le traitement de ces patients.Grâce à ce travail, nous définissons la place que peuvent prendre les avatars dans la prise en charge actuelle du mélanome métastatique. Ces modèles donnent une réponse précoce quant à leur résistance et aux alternatives thérapeutiques de seconde ligne. / For a long time the standard treatment for metastatic melanoma has been confined to a few cytotoxic chemotherapies with limited efficacy. Recently, the development of immunotherapies and targeted therapies represents major headways in melanoma care management. The discovery of oncogenic mutations on the signaling pathways of the tumor cell allowed the definition of new targets for developing inhibitor drugs. Among these mutations, BRAF V600E is seen in 50% of all melanomas. Vemurafenib is one of the anti-BRAF molecules recently developed. It has shown its efficacy with metastatic patients showing a survival increased by 6 to 8 months. Unfortunately, in spite of the initial positive reaction, the development of a resistance mechanism is ineluctable. There are numerous molecular mechanisms responsible for the acquired resistance to BRAF inhibitors which activate numerous signaling pathways to make up for the BRAF inhibition. Today, there are no standards of care for patients who become resistant to BRAF inhibitors. In the framework of this new personalized care approach, new tools must be developed to (i) test the efficacy of new molecules and (ii) try to predict the efficacy/resistance of the various treatments available. One of these tools is the Patient Derived Tumor Xenograft or PDTX, i.e. xenografts from tumors directly harvested on patients.My work consisted in implementing this type of tool to try and bring an answer to the following questions: Are the developed animal models a good tool for preclinical cross-sectional studies? Can they help study the action modes of new targeted therapies and explore their resistance mechanisms? If this is the case, can they predict a clinical response? Various murine models of melanoma xenografts have been designed and used. Tumor cells and later on tumor fragments were grafted subcutaneously in immunosuppressed SCID mice. Tumors were characterized in histology and molecular biology to show the stability of the model. After several passages in various generations of mice, the tumors retain their specific mutations. Furthermore, various treatments have been administered and the answers to the various therapeutic strategies have been evaluated. This model allowed us to validate the efficacy of antiBRAF targeted therapies (vemurafenib) but also other approaches targeting the metabolic characteristics of melanoma. This avatar model enabled to test in vivo an innovating therapeutic combination, associating an accelerator of oxidative phosphorylation, DCA, to a pre-oxidative molecule, elesclomol, validating the synergic effect obtained in vitro. Furthermore, elesclomol was tested in vivo on a tumor which became resistant to BRAF, vemurafenib. Furthermore, PTDX is a good preclinical tool to guide clinicians in their therapeutic choices. In fact we were able to develop a PDTX during the entire metastatic progression of a patient. This PDTX enabled us to test the efficacy of vemurafenib and reintroduce the treatment to the patient, who showed noticeable clinical improvements. Seven other PDTX were developed in order to reinforce the model and follow, in a personalized manner, the treatment of these seven patients. Thanks to this work, we are able to define the role of avatars in the care management of metastatic melanoma. These models give an early answer regarding tumor resistance and alternative second-line therapies.

Le mélanome est un cancer cutané dérivé de la transformation maligne des mélanocytes, cellules responsables de la pigmentation de la peau. Aujourd'hui, il est clairement reconnu que la progression tumorale est le produit d'une interaction dynamique entre les cellules tumorales et leur microenvironnement. Parmi les modes de communication intercellulaire, la sécrétion de nanovésicules appelées exosomes apparaît depuis une vingtaine d'années comme des acteurs majeurs de cette communication. En effet, ils permettent le transport d'un matériel complexe qui pourra impacter le devenir des cellules réceptrices. Bien que différentes données de la littérature aient mis en évidence le rôle des exosomes dans la progression du mélanome ainsi que la résistance aux traitements, les mécanismes moléculaires associés restent peu connus. Le premier objectif de ma thèse a consisté en l'identification du contenu protéique des exosomes de mélanome. Pour cela, nous avons identifié par spectrométrie de masse l'exoprotéome de sept lignées de mélanome d'agressivités différentes. L'analyse de ces résultats nous a permis de mettre en évidence une signature spécifique au niveau des exosomes sécrétés par les cellules les plus agressives. Cette signature a pu être corrélée à des propriétés fonctionnelles portées par ces vésicules. En effet, le traitement de cellules moins agressives par ces vésicules suffit à augmenter leur potentiel migratoire. Ces résultats montrent le rôle joué par les exosomes de mélanome dans la communication entre cellules cancéreuses et la progression tumorale. Parmi les cellules composant le microenvironnement d'un mélanome invasif, les adipocytes présents dans l'hypoderme représentent un acteur émergeant favorisant la progression tumorale. L'équipe dans laquelle j'ai effectué ma thèse a été l'une des premières à montrer, dans un modèle de cancer du sein, l'importance des adipocytes dans l'agressivité tumorale. Bien que différentes études aient montré l'impact des adipocytes sur la progression du mélanome, les mécanismes moléculaires associés restent peu connus. Le second aspect de ma thèse a consisté en l'étude du rôle des adipocytes dans la progression de ce type de tumeurs. Ces derniers stimulent le potentiel migratoire de cellules de mélanome et cet effet est médié par les exosomes sécrétés par les adipocytes (ad-exos). De façon intéressante, nous avons observé que les ad-exos contiennent des protéines impliquées dans chaque étape du métabolisme des acides gras et induisent une reprogrammation métabolique des cellules cancéreuses. L'augmentation de la migration des cellules tumorales induite par les ad-exos est dépendante de ce remodelage métabolique. Ces résultats montrent que les ad-exos participent au dialogue délétère entre mélanome et adipocytes. Ce dialogue pourrait être amplifié dans des conditions d'obésité expliquant le pronostic défavorable observé chez ce sous-groupe de patients. Nous avons montré, qu'en condition d'obésité, la sécrétion d'exosomes par les adipocytes est augmentée. De plus, à quantité égale d'exosomes, l'effet des ad-exos de souris obèses sur la migration des cellules cancéreuses est amplifié. Les ad-exos pourraient donc en partie être responsables du mauvais pronostic observé pour les individus obèses. En conclusion, nous avons montré que les exosomes sont des acteurs majeurs de la progression du mélanome. La signature spécifique que nous avons mise en évidence dans les vésicules sécrétées par les lignées métastatiques pourrait, à terme, être utilisée pour le pronostic de ce cancer. D'autre part, les ad-exos induisent un remodelage métabolique des cellules cancéreuses conduisant à l'augmentation du potentiel migratoire. La compréhension du rôle joué par ces vésicules permettra à terme d'interrompre le dialogue délétère entre adipocytes et cellules tumorales, en particulier chez les individus obèses. / Melanoma is a skin cancer derived from the malignant transformation of melanocytes, cells involved in the skin pigmentation. It is now clearly established that tumor progression results in a dynamic interaction between tumor cells and their microenvironment. Among the different modes of cell communication, the secretion of nanovesicles called exosomes has been extensively studied in the last twenty years and they appear to be major actors in this communication. Indeed, they enable the transport of complex biological material that may impact the behavior of recipient cells. Whereas melanoma exosomes have been implicated in tumor progression and chemoresistance, the mechanisms associated with these processes are little known. The first part of my thesis consisted in the identification of the protein content of melanoma cell exosomes. We identified the exoproteome of seven melanoma lines with various degrees of agressivity using mass spectrometry. The obtained results highlighted the presence of a specific signature in the exosomes secreted by the most aggressive cells. Moreover, this signature was correlated with functional properties of the vesicles. Indeed, incubation of less aggressive cells with these vesicles promoted their migratory abilities. These results show the role of melanoma exosomes in cancer cell communication and in tumor progression. Among the cells composing the microenvironment of invasive melanoma, adipocytes, present in the hypodermis, represent an emerging actor in tumor progression. The group in which I did my PhD was one of the first to highlight the importance of fat cells in breast cancer aggressiveness. Whereas different studies have shown the role of adipocytes in melanoma progression, the mechanisms associated are little known. The second aim of my thesis therefore consisted in the study of the role of adipocytes in melanoma progression. We have shown that adipocytes stimulate the migratory abilities of melanoma cells and that this effect is mediated by exosomes secreted by adipocytes. Interestingly, we observed that these vesicles contain proteins involved in every step of fatty acid metabolism and induce a metabolic reprogramming of cancer cells. The increase in tumor cell migration induced by adipocyte exosomes is dependent on this metabolic remodeling. These results show that adipocyte exosome are actors of the deleterious dialogue between melanoma and adipocytes. This dialogue could be amplified in obese conditions and could explain the poor prognostic of this subtype of patients. We have shown that in obese conditions, exosome secretion by adipocytes is increased. In addition, at equal concentrations in exosomes, the effect of the vesicles secreted by adipocytes from obese mice on cancer cell migration is amplified. Adipocyte exosomes could therefore participate in the poor prognosis of obese patients. In conclusion, we have shown that exosomes represent a major player in melanoma progression. The specific pattern contained in the exosomes from aggressive cells could be used as prognostic biomarkers in melanoma. On the other hand, adipocyte exosomes induce a metabolic reprogramming of cancer cells and this leads to an increase in their migratory abilities. Understanding the role of adipocyte exosomes in tumor progression could help to stop the deleterious dialogue between adipocytes and tumor cells, particularly in obese individuals.