京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第25177号 / 医博第5063号 / 新制||医||1071(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 川口 義弥, 教授 山中 伸弥, 教授 湊谷 謙司 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

Yes / Type 2 diabetes mellitus prevalence is growing globally, and the leading cause of mortality in these patients is cardiovascular disease. Epigenetic mechanisms such as microRNAs (miRs) and DNA methylation may contribute to complications of type 2 diabetes mellitus. We discovered an aberrant type 2 diabetes mellitus–smooth muscle cell phenotype driven by persistent up-regulation of miR-145. This study aimed to determine whether elevated expression was due to changes in methylation at the miR-145 promoter. Smooth muscle cells were cultured from saphenous veins of 22 non-diabetic and 22 type 2 diabetes mellitus donors. DNA was extracted, bisulphite treated and pyrosequencing used to interrogate methylation at 11 CpG sites within the miR-145 promoter. Inter-patient variation was high irrespective of type 2 diabetes mellitus. Differential methylation trends were apparent between non-diabetic and type 2 diabetes mellitus–smooth muscle cells at most sites but were not statistically significant. Methylation at CpGs −112 and −106 was consistently lower than all other sites explored in non-diabetic and type 2 diabetes mellitus–smooth muscle cells. Finally, miR-145 expression per se was not correlated with methylation levels observed at any site. The persistent up-regulation of miR- 145 observed in type 2 diabetes mellitus–smooth muscle cells is not related to methylation at the miR-145 promoter. Crucially, miR-145 methylation is highly variable between patients, serving as a cautionary note for future studies of this region in primary human cell types.

MicroRNAs (miRNAs) sind eine Klasse von ca. 22 nt langen, nicht-kodierenden RNAs, welche mittels Basenpaarung die Translationsrate und Stabilität von mRNAs herabsetzen. Die vorliegende Studie untersucht mittels Hochdurchsatz-Sequenzierung Expressionsveränderungen von miRNAs nach Infektion von kultivierten Wirtszellen mit dem mikrobiellen Modellpathogen Salmonella enterica serovar Typhimurium. In Makrophagen, welche eine Schlüsselfunktion in der Orchestrierung der angeborenen Immunität spielen, wurde im Zuge der Infektion eine Induktion der miRNAs miR-21, miR-146 und miR-155 beobachtet. Darüberhinaus stellten sich alle Mitglieder der evolutionär konservierten let-7 miRNA Familie in infizierten Makrophagen als herab reguliert heraus. Es konnte gezeigt werden, dass let-7 miRNAs die zentralen Makrophagen-Zytokine IL6 und IL10 post-transkriptional reprimieren. Konsequenterweise bewirkt eine Reduktion der let-7 Expression in mikrobiell aktivierten Makrophagen eine Erhöhung der IL6 und IL10 Produktion. Weiterhin konnten den miRNAs miR-146 und miR-155 wichtige Funktionen in der Steuerung der Sensitivität und Aktivität von Makrophagen gegenüber mikrobiellen Stimuli nachgewiesen werden: während miR-146 primär die Aktivität des plasmamembranständigen Lipopolysaccharid-Rezeptors TLR4 herabsetzte und damit einer vorzeitigen inflammatorischen Makrophagenantwort vorbeugte, blieb miR-155 strikt an letztere gekoppelt, um die Aktivität diverser pro-inflammatorischer Signalwege zu begrenzen. Es konnte gezeigt werden, dass eine Stimulation des cytosolischen Immunrezeptors NOD2 eine inflammatorische Makrophagenantwort und die resultierende miR-155 Induktion begünstigt und der negativen Kontrolle durch miR-146 entzieht. Dies verhindert möglicherweise eine Hyposensitivität gegenüber zellinvasiven Pathogenen. Zusammenfassend legen diese Beobachtungen nahe, dass miRNAs zentrale Funktionen in der post-transkriptionalen Steuerung der Wirtszellantwort auf mikrobielle Pathogene ausüben. / MicroRNAs (miRNAs) are a class of approx. 22 nt long non-coding RNAs that interfere with mRNA translation and stability. Using high-throughput sequencing the present study investigated miRNA expression changes after infection of cultured host cells with the microbial model pathogen Salmonella enterica serovar Typhimurium. In macrophages, which play a key role in the orchestration of innate immunity, infection caused the induction of miRNAs miR-21, miR-146 and miR-155. Moreover, all members of the evolutionarily conserved let-7 miRNA family were down-regulated in infected macrophages. This work reports let-7 miRNAs to function in the macrophage inflammatory response by repressing the major cytokines IL6 and IL10 post-transcriptionally. Consequently a reduction of let-7 expression in microbially activated macrophages results in a specific increase in IL6 and IL10 production. Furthermore, miR-146 and miR-155 could be assigned important functions in the control of the sensitivity and activity of macrophages to microbial stimuli: while miR-146 primarily reduced the activity of the plasma membrane associated lipopolysaccharide receptor TLR4, thereby preventing a premature macrophage inflammatory response, miR-155 stayed strictly coupled to inflammation in order to limit the activity of various pro-inflammatory signaling pathways. Interestingly, it could be shown that stimulation of the cytosolic immune receptor NOD2 favors the macrophage inflammatory response and the concomitant induction of miR-155, while bypassing the negative control by miR-146. This may prevent hyposensitivity to cell-invasive pathogens. In summary, these observations suggest that miRNAs exert key functions in the post-transcriptional control of the host cell response to microbial pathogens.

L’hème oxygénase-1 (HO-1), enzyme antioxydante, est capable de prévenir l’initiation tumorale tandis qu’elle promeut la progression de certaines tumeurs et l’angiogenèse. Ce travail a recherché si HO-1 peut moduler les microARNs et régule le développmemnt du carcinome pulmonaire humain non à petites cellules (NSCLC). La surexpression stable de HO-1 dans les cellules du NSCLC NCI-H292 accroit la production globale des miARNs et diminue significativement l’expression des oncomirs et angiomirs, tandis qu’elle augmente les miARNs suppresseurs de tumeurs. Le plus amplement diminué est le miR-378. Dans les cellules surexprimant HO-1 la p53 est aussi augmentée, Ang-1 et MUC5AC diminuées, prolifération migration et potentiel angiogéniques réduits. Les effets de HO-1 sur la prolifération tumorale, la migration et et l’expression de miR-378 sont modulées par CO. Au contraire, la surexpression stable de miR-378 décroit celle de HO-1 et de p53 tandis qu’elle accroît celle de MUC5AC, VEGF, IL-8 et Ang-1 et en conséquence accroit la prolifération, migration la stimulation des cellules endothéliales. L’ajout de HO-1 à des cellules surexprimant miR-378 réverse l’effet de miR-378 sur la prolifération et la migration des cellules cancéreuses. In vivo, les tumeurs surexprimant HO-1 sont de taille réduite, moins vascularisées et oxygénées et moins métastatiques tandis que la surexpression de miR-378 produit les effets inverses. Conformément, chez les patients NSCLC, l’expression de HO-1est réduite dans les métastases lymphatiques par rapport à la tumeur primaire tandis que miR-378 n’est pas modifié de manière significative. En conclusion, les résultats in vitro et in vivo indiquent que l’action coordonnée entre HO-1 et miR-378 module de manière significative la progression et l’angiogenèse du carcinome humain pulmonaire non à petites cellules. / Heme oxygenase-1 (HO-1), an antioxidant enzyme can prevent tumor initiation while it has been demonstrated to promote various tumors progression and angiogenesis. Here it was investigated whether HO-1 can modulate microRNAs and regulate human non-small cell lung cancer (NSCLC) development. Stable HO-1 overexpression in NSCLC NCI-H292 cells enhanced global production of miRNAs and significantly diminished expression of oncomirs and angiomirs, whereas upregulated tumor suppressive miRNAs. The most potently downregulated was miR-378. HO-1 overexpressing cells displayed also upregulated p53, downregulated Ang-1 and MUC5AC, reduced proliferation, migration and diminished angiogenic potential. CO was a mediator of HO-1 effects on tumor cells proliferation, migration and miR-378 expression. In contrast, stable miR-378 overexpression decreased HO-1 and p53 while enhanced expression of MUC5AC, VEGF, IL-8 and Ang-1 and consequently increased proliferation, migration and stimulation of endothelial cells. Adenoviral delivery of HO-1 to miR-378 overexpressing cells reversed miR-378 effect on proliferation and migration of cancer cells. In vivo, HO-1 overexpressing tumors were smaller, less vascularized and oxygenated and less metastatic, whereas miR-378 overexpression exerted the opposite effects. Accordingly, in patients with NSCLC, HO-1 expression was lower in metastases to lymph nodes than in primary tumors while miR-378 did not differ significantly. To conclude, in vitro and in vivo data indicate that interplay between HO-1 and miR-378 significantly modulates NSCLC progression and angiogenesis.

Dans un marché en permanente progression et pour répondre aux besoins des brasseurs en malt de qualité, la maîtrise du procédé de maltage est indispensable. La qualité du malt est fortement dépendante des conditions opératoires, en particulier des conditions de trempe, mais également de la qualité de la matière première : l'orge. Dans cette étude, nous avons établi des modèles polynomiaux qui mettent en relation les conditions opératoires et la qualité du malt. Ces modèles ont été couplés à nos algorithmes génétiques et nous ont permis de déterminer les conditions optimales de maltage, soit pour atteindre une qualité ciblée de malt (friabilité), soit pour permettre un maltage à faible teneur en eau (pour réduire la consommation en eau et maîtriser les coûts environnementaux de production) tout en conservant une qualité acceptable de malt. Cependant, la variabilité de la matière première est un facteur limitant de notre approche. Les modèles établis sont en effet très sensibles à l'espèce d'orge (printemps, hiver) ou encore à la variété d'orge utilisée. Les modèles sont surtout très dépendants de l'année de récolte. Les variations observées sur les propriétés d'une année de récolte à une autre sont mal caractérisées et ne sont donc pas intégrées dans nos modèles. Elles empêchent ainsi de capitaliser l'information expérimentale au cours du temps. Certaines propriétés structurelles de l'orge (porosité, dureté) ont été envisagées comme nouveaux facteurs pour mieux caractériser la matière première mais ils n'ont pas permis d'expliquer les variations observés en malterie.Afin de caractériser la matière première, 394 échantillons d'orge issus de 3 années de récolte différentes 2009-2010-2011 ont été analysés par spectroscopie MIR. Les analyses ACP ont confirmé l'effet notable des années de récolte, des espèces, des variétés voire des lieux de culture sur les propriétés de l'orge. Une régression PLS a permis, pour certaines années et pour certaines espèces, de prédire les teneurs en protéines et en béta-glucanes de l'orge à partir des spectres MIR. Cependant, ces résultats, pourtant prometteurs, se heurtent toujours à la variabilité. Ces nouveaux modèles PLS peuvent toutefois être exploités pour mettre en place des stratégies de pilotage du procédé de maltage à partir de mesures spectroscopiques MIR / In a continuously growing market and in order to meet the needs of Brewers in high quality malt, control of the malting process is a great challenge. Malt quality is highly dependent on the malting process operating conditions, especially on the steeping conditions, but also the quality of the raw material: barley. In this study, we established polynomial models that relate the operating conditions and the malt quality. These models have been coupled with our genetic algorithms to determine the optimal steeping conditions, either to obtain a targeted quality of malt (friability), or to allow a malting at low water content while maintaining acceptable quality of malt (to reduce water consumption and control the environmental costs of malt production). However, the variability of the raw material is a limiting factor for our approach. Established models are very sensitive to the species (spring and winter barley) or to the barley variety. The models are especially highly dependent on the crop year. Variations on the properties of a crop from one to another year are poorly characterized and are not incorporated in our models. They thus prevent us to capitalize experimental information over time. Some structural properties of barley (porosity, hardness) were considered as new factors to better characterize barley but they did not explain the observed variations.To characterize barley, 394 samples from 3 years of different crops 2009-2010-2011 were analysed by MIR spectroscopy. ACP analyses have confirmed the significant effect of the crop-years, species, varieties and sometimes of places of harvest on the properties of barley. A PLS regression allowed, for some years and for some species, to predict content of protein and beta-glucans of barley using MIR spectra. These results thus still face product variability, however, these new PLS models are very promising and could be exploited to implement control strategies in malting process using MIR spectroscopic measurements

Le travail présenté dans cette thèse repose sur l'expertise du groupe VeCSEL du l'Institut d'Électronique de Sud (IES) dans la conception, la réalisation et l'étude des VeCSEL dans le proche et le moyen infrarouge. Avant de s'engager dans le travail présenté ici, les VeCSELs développés au sein de notre laboratoire concernaient l'habituel fonctionnement monofréquence avec un faisceau TEM00, mais repoussé à forte puissance et à haute cohérence. L'objectif de cette thèse est d'aller au delà de cet état conventionnel, et explore d'autres états cohérents du photon, inhabituels dans le domaine de l'émission laser. Ces nouveaux états concernent aussi bien l'aspect transverse (spatial) que longitudinal (temporel) de l'onde. Plus particulièrement, l'émission laser de haute cohérence et de forte puissance sur les modes d'ordre supérieur Laguerre-Gauss dégénérés et non-dégénérés (vortex optiques), et les lasers large bande cohérents appelé aussi «~laser sans mode~». / The work presented in this thesis is based on the expertise of the VECSEL group of the Institut d'Électronique de Sud (IES) in the design, implementation and study of VECSEL in the near and mid infrared. Before engaging in the work presented here, the VeCSELs developed in our laboratory involved the usual single-frequency operation with a TEM 00 beam, but pushed to high power and high coherence. The objective of this thesis is to go beyond this conventional state and to explore other coherent states of the photon, unusual in the field of laser emission. These new states apply to both the transverse appearance (spatial) and longitudinal (time) of the wave. More specifically, the laser emission of high power and high coherence on the Laguerre-Gauss higher order modes degenerate and non-degenerate (optical vortex), and the wide band coherent lasers also called "modeless lasers".

No description available.

Les carcinomes spinocellulaires cutanés (cSCCs) sont le deuxième type de cancer par ordre de fréquence et sont responsables de 25% des décès dus aux cancers de la peau. Il est donc essentiel de caractériser les mécanismes responsables de la cancérisation de l'épiderme afin de développer de nouveaux traitements. Dans ce contexte, les miRNAs apparaissent comme des cibles de choix pour le développement de futures thérapies anti-tumorales. Toutefois, leur implication dans la physiopathologie des cSCCs est encore peu documentée. Au cours de cette étude, j’ai identifié, par séquençage à haut débit, 112 miRNAs dont l’expression est altérée au cours du développement tumoral dans un modèle murin de carcinogénèse chimique cutanée. J’ai ensuite focalisé mon attention sur le cluster miR-193b/365a et sur miR-708 dont les niveaux diminuent au cours de la progression tumorale, suggérant des fonctions de suppresseurs de tumeur. En accord avec cette hypothèse, l’expression ectopique de ces miRNAs inhibe la prolifération, la survie et la migration de cellules tumorales, alors que le blocage de leur action par des anti-sens stimule ces fonctions cellulaires dans des kératinocytes normaux. L’association d’approches in silico et d’analyses du transcriptome de cellules de cSCC sur-exprimant ces miRNAs m’a permis d’identifier leurs gènes cibles potentiels. J’ai validé KRAS et MAX comme cibles communes de miR-193b et miR-365a, et montré par l’utilisation de siRNAs que la répression de ces cibles mime les effets de ces miRNAs. Ces résultats suggérent que le ciblage de ces gènes pourrait médier en partie les effets suppresseurs de tumeur de miR-193b et de miR-365a dans les cSCCs. / Cutaneous squamous cell carcinomas (cSCCs) are the second most common cancer and are responsible for up to 25% of all skin cancer deaths. It is therefore essential to characterize the mechanisms responsible for epidermis carcinogenesis to develop new treatments. In this context, miRNAs appear to be prime targets for the development of future anti-tumor therapies. However, their involvement in the pathophysiology of cSCCs is still poorly documented. In this study, I identified using Small RNA sequencing, 112 miRNAs whose expression is altered during tumor development in a mouse model of cutaneous two-stage chemical carcinogenesis. Then, I focused my attention on the miR-193b/365a cluster and on miR-708, that are down-regulated during tumorigenesis, suggesting tumor suppressor functions. Consistent with this hypothesis, the ectopic expression of these miRNAs inhibit the proliferation, survival and migration of tumor cells, while blocking their action with antisense oligonucleotides stimulates these cellular functions in normal keratinocytes. Combining in silico target-prediction approaches and transcriptome analyzes of cSCC cells over-expressing these miRNAs, I identified their potential target genes. I validated KRAS and MAX as direct targets of miR-193b and miR-365a, and I showed that repression of these genes using siRNAs mimics the effects of these miRNAs. These results suggest that targeting these genes might mediate, at least in part, the tumor suppressor action of miR-193b and miR-365a in cSCCs.

Chez les vertébrés, le battement coordonné des cils motiles présents par centaines à la surface apicale des cellules multiciliées (MCC) est requis pour propulser directionnellement les fluides biologiques à l’intérieur de certains organes (voies respiratoires, ventricules cérébraux, trompes utérines ou certaines structures embryonnaires). De nombreuses pathologies humaines sont associées à des défauts ciliaires ou à une perte des MCC (dyskinésies ciliaires, mucoviscidose, asthme,...). Dans ce contexte, mon travail de thèse a consisté à élucider les mécanismes complexes contrôlant la différenciation des MCC et donc la formation des cils motiles (multiciliogenèse). Par des approches de génomiques fonctionnelles à partir de deux modèles d’épithéliums multiciliés évolutivement éloignés (épithélium respiratoire humain et épiderme d’embryon de Xénope) nous avons identifié la famille des microARN (petits ARN non-codants régulateurs de l’expression génique) miR-449 comme majoritairement exprimée dans les MCC. Nous avons montré que miR-449 contrôle la multiciliogenèse i) en bloquant le cycle cellulaire, ii) en réprimant directement la voie de signalisation Notch et iii) en inhibant l’expression de la petite GTPase R-Ras. Enfin, nos travaux montrent que l’ensemble de ces mécanismes est conservé chez les vertébrés. En conclusion, miR-449 est un nouveau régulateur clé de la multiciliogenèse conservé au cours de l’évolution. Nos résultats pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques utilisant des petits ARN régulateurs dans le traitement de certaines pathologies associées à des défauts ciliaires. / In vertebrates, the coordinated beating of hundreds of motile cilia present at the apical surface of multiciliated cells (MCC) is required for propel directionally flow of biological fluids inside some organs (airways, cerebral ventricles, fallopian tubes or some embryonic structures). Many human diseases are associated with ciliary defects or loss of MCC (ciliary dyskinesia, cystic fibrosis, asthma ...). In this context, my thesis has sought to elucidate the complex mechanisms that control the differentiation of MCC and thus the formation of motile cilia (multiciliogenesis). By functional genomic approaches from two evolutionarily distant models of multiciliated epithelia (human respiratory epithelium and epidermis of Xenopus embryo) we identified the miR-449 family of microRNAs (small non-coding RNAs regulating gene expression) as mainly expressed in MCC. Then, we showed that miR-449 controlled multiciliogenesis by i) blocking the cell cycle ii) directly suppressing the Notch pathway and iii) by inhibiting the expression of the small GTPase R-Ras. Finally, we have demonstrated that all these mechanisms were conserved in vertebrates. In conclusion, miR-449 is a new key and conserved regulator of multiciliogenesis. Our findings could pave the way for new therapeutic strategies using small regulatory RNAs in the treatment of several diseases associated with ciliary defects.

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est la maladie auto-immune la plus fréquente d’une prévalence de 1%. Les cellules résidentes de la cavité synoviale, les fibroblast-like synoviocytes (FLS), sont des acteurs majeurs de la PR. Leur activation par des récepteurs de l’immunité innée participe à l’acquisition d’un phénotype agressif menant à la destruction ostéo-articulaire. Dans cette étude, nous avons évalué le rôle régulateur de miARN sur les voies de signalisation des Toll-like receptors (TLR). L’activation de TLR2 et de TLR4 dans les FLS induit la diminution de l’expression de plusieurs miARN, dont miR-19a et b (miR-19), alors que TLR2 est surexprimé. Nous avons pu ainsi montrer que miR-19 régule Tlr2 et que la transfection de mir-19 dans les FLS activés induit une diminution de l’expression de TLR2 et de la synthèse d’IL-6 et de MMP-3. Mir-19 appartient au cluster miR-17~92, dont l’expression est abaissée dans les FLS. Il code pour 6 miARN dont miR-20a. miR-20a est également sous-régulé après activation de TLR2 et TLR4 dans les FLS et les THP-1. Nous avons montré que miR-20a régule directement l’expression d’Ask1, impliquée et surexprimée après activation de TLR4. La transfection de miR-20a in vitro nous a permis de montrer que miR-20a contrôle l’expression d’ASK1 et induit une inhibition de la synthèse de cytokines majeures de la PR dans les FLS et les THP-1. Des résultats équivalents ont été obtenus ex vivo chez la souris. Ces travaux ont permis d’identifier dans les FLS rhumatoïdes des miARN anti-inflammatoires dont la baisse d’expression permet une augmentation de l’expression de TLR2 et d’ASK1. Ces miARN pourraient donc constituer de nouvelles cibles thérapeutiques. / Rheumatoid arthritis (RA) is the most frequently autoimmune disease with a prevalence of 1%. Resident cells of joints, the fibroblast-like synoviocytes (FLS), act as key players in RA. Their activation through Pattern-recognition receptors leads to an aggressive phenotype, leading in the osteo-articular destruction of the joints. In this study, we aimed to discuss the link between Toll-like receptors (TLR) and miRNA pathway. We established the down-regulation of a few miRNA when FLS were activated through TLR2 and TLR4, including miR-19a and miR-19b (miR-19). We showed that miR-19 regulates directly Tlr2 and that transfection of miR-19 mimics leads to a decrease of IL-6 and MMP-3 synthesis in FLS. miR-19 belongs to the cluster miR-17~92, which is also down-regulated in activated FLS. This primary transcript encodes for 6 miRNA, including miR-20a, which is also down regulated upon TLR2 and TLR4 activation in FLS and further in THP-1, a monocyte cell-line. Then, we validated the predicted regulation of miR-20a on Ask1, an important kinase involved in TLR4 pathway. The transfection of miR-20a mimics in vitro represses ASK1 expression and inhibits several major cytokines in RA both in FLS and THP-1. Further, we confirmed these results on ex vivo experiments on peritoneal macrophages. These works allowed us to identify new anti-inflammatory miRNA that are downregulated and allow overexpression of TLR2 and ASK1 in RA FLS. These results open new experiments on in vivo models. All together, these data give new insights for identify new therapeutics in RA.