Made available in DSpace on 2016-04-04T12:45:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 joao_neto_ioc_mest_2013.pdf: 1253667 bytes, checksum: d031c93a4aceeafda254d56260f64a77 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Toxoplasma gondii é o agente causador da toxoplasmose, doença distribuída em grande parte do globo infectando vertebrados endotérmicos. T. gondii é um parasita intracelular obrigatório e não sintetiza colesterol, recrutando-o da célula hospedeira. Esse parasito é dividido em grupos, de acordo com a virulência, sendo a cepa RH e a cepa ME-49 representantes de parasitos de maior e de moderada virulência, respectivamente. Semelhante a outros parasitos protozoários, T. gondii expõem fosfatidilserina (PS) na membrana externa, sendo um exemplo do mimetismo apoptótico, o que tem sido sugerido como mecanismo de evasão. Corpúsculos lipídicos (CL) são organelas lipídicas comumente encontradas em uma gama de diferentes células, de plantas, parasitos e animais. CL são modulados positivamente por diferentes fatores, incluindo células apoptóticas, parasitos como Trypanosoma cruzi, Leishmania spp. e Plasmodium falciparum e citocinas, como o fator de transformação do crescimento (TGF-\03B2). Nosso trabalho visou investigar se a PS exposta na membrana plasmática de T. gondii pode induzir CL em macrófagos. Independente da virulência da cepa utilizada, T gondii foi capaz de induzir CL em macrófagos infectados. A indução foi maior com aumento da relação parasito/macrófago. Subpopulações de T. gondii, PS positivos (PS+) e PS negativo (PS-) foram obtidas e a subpopulação de PS + induziu mais CL em relação a subpopulação de PS-. A neutralização da PS dos parasitos PS+ ou da população total com anexina-V foi capaz de reduzir o número de CL nas células hospedeiras. Lipossomos contendo PS induziram mais CL em macrófagos quando comparados aos lipossomos sem PS Curiosamente, parasitos PS- também foram capazes de aumentar o número de CL em macrófagos, sugerindo a participação de outros fatores nesse processo indutor. Após a interação de macrófagos com T. gondii, observamos aumento no número de CL tanto em células que continham o parasita quanto em células vizinhas não parasitadas. Esse achado sugere uma sinalização 18 parácrina entre as células. O TGF-\03B2 é descrito como sendo secretado após infecção por T. gondii, e sua neutralização causou inibição da formação de CL induzido por T. gondii, revelando sua participação nesse processo. Concluímos que T. gondii é capaz de induzir CL em macrófagos, e essa indução tem a participação da PS exposta em sua membrana. A indução dessas organelas ocorreu independente da virulência da cepa. Esse processo é potencializado pela ação parácrina do TGF-\03B2 / Toxoplasma gondii is the causative agent of toxoplasmosis, a disease largely spread across the globe infecting almost any endothermic vertebrates. T. gondii is an obligatory intracellular par asite that can not synthesize cholesterol thus relying on recruiting it from the host cell. This parasite is divided into groups according to the virulence, and the RH strain and the ME - 49 strain representing highly and moderate virulen t parasites, respect ively. Similar to other protozoan parasites, T. gondii exposes phosphatidylserine (PS) on the outer membrane , an example of the apoptotic mimicry , which has been suggested as a mechanism of evasion ,. Lipid bodies (LB) are lipid organelles commonly found in a range of different cells of plants, animals and parasites. LB are positively modulated by different factors, including apoptotic cells, parasites such as Trypanosoma cruzi , Leishmania spp. and Plasmodium falciparum and cytokines such as transforming gro wth factor (TGF - β) . Our study aimed to investigate whether the PS exposed on the plasma membrane of T. gondii in macrophages can induce LB . T gondii was capable of inducing LB in infected macrophages, i ndependently of the virulence of the strain used . T he LB induction was greater with increase in parasite / macrophage ratio. Subpopulations of T gondii posi tive PS (PS +) and negative (PS - ) were obtained and PS+ subpopulation induced significantly greater LB formation compared to PS - subpopulation. The neutra lization of PS with annexin - V was able to reduce the number of LB o n PS+ parasites or on the total parasite population , but not on PS - parasites. Liposomes containing PS induced more LB than liposomes without PS. Interestingly, PS - parasites induced LB f ormation in macrophages, suggesting the involvement of other factors. After interaction of T. gondii with macrophages , we observed increased LB formation both in cells containing internalized parasite s as well as in bystander cells without internalized par asites , suggestive of a paracrine signaling. TGF - β is described as being secreted after infection with T. gondii and its neutralization caused inhibition of T. gondii - induced LB formation , pointing to TGF - β participation in this process. We conclude that T. gondii is able to induce LB formation in macrophages . The induction of these organelles was independent of strain virulence. T. gondii - induced LB formation occurs through signaling triggered by PS exposed on the parasite membrane. This process is also amplified by TGF - β a cting in a paracrine fashion

Magister en fisiología / Las patologías inflamatorias/infecciosas están frecuentemente asociadas con cambios dinámicos en la activación de macrófagos en las que se modifica el equilibrio entre células M1 y M2 en favor del fenotipo pro-inflamatorio con incremento de la producción de mediadores tales como citoquinas y quimoquinas (11). En los equinos existen dos grandes patologías asociadas con el aumento excesivo de citoquinas inflamatorias secundario a la activación de macrófagos que pueden causar la muerte del ejemplar: Infosura o Laminitis y Síndrome de Abdomen Agudo. Entre los tratamientos propuestos para estas patologías se incluye el uso de Pentoxifilina (PTX), fármaco inhibidor no específico de la fosfodiesterasa, que además tiene propiedades anti-inflamatorias conocidas, pero con mecanismos de acción no bien aclarados. En esta investigación, nos propusimos evaluar si los efectos anti-inflamatorios de PTX están mediados por la inhibición del fenotipo M1 de los macrófagos o con la capacidad de modificar este fenotipo hacia el fenotipo anti-inflamatorio (M2). Para ello se utilizó células equinas derivadas de PBMC obtenidos de sangre venosa periférica de 4 ejemplares fina sangre de carrera (F.S.C.) clínicamente sanos. Las células equinas fueron estimuladas con LPS (25ng/ml) por y con hIL-4 (20ng/ml) por 18 horas en presencia o no de PTX (250μg/ml por 90 minutos). Posteriormente se cuantificó el contenido celular del mRNA de citoquinas pro- y anti- inflamatorias (TNF-α e IL-10). Se demostró que células equinas tratadas con LPS, PTX indujo una disminución significativa del mRNA de TNF-α. Interesantemente se observó que en los cultivos de LPS con PTX el contenido del mRNA de IL10 fue significativamente mayor al observado en presencia de LPS solo. Además, en células equinas cultivadas solo con PTX, se observó un incremento significativo del mRNA de IL10, efecto similar al inducido por hIL4. Así mismo, los cultivos de PTX + hIL4 mostraron que el contenido de IL10 en células equinas fue mayor al observado en los cultivos por separado. Los resultados aquí obtenidos demuestran por primera vez que PTX inhibe la actividad de macrófagos del fenotipo M1 a la vez que potencia la diferenciación hacia el fenotipo M2, resultando en una posibilidad cierta que el tratamiento con PTX en patologías que cursan con procesos inflamatorios agudos obtiene beneficios tanto por el control de la inflamación aguda como por el favorecer la reparación de los tejidos dañados, restableciendo así el equilibrio entre las células pro- inflamatorias y anti-inflamatorias. / Inflammatory / infectious diseases are often associated with dynamic changes in macrophage activation in which the balance between M1 and M2 macrophages is modified in favor of the proinflammatory phenotype with increased production of mediators such as cytokines and chemokines (11) . In horses, there are two major diseases associated with excessive increase of secondary inflammatory cytokine macrophage activation that can cause death: Laminitis and Syndrome or Acute Abdomen. Among the proposed treatments for these conditions the use of pentoxifylline (PTX) is recommended. This is a non-specific phosphodiesterase inhibitor drug, which also has known anti-inflammatory properties, but it mechanisms of action are not well clarified included. In this research, we decided to evaluate whether the anti-inflammatory effects of PTX are mediated by inhibition of macrophage phenotype M1 or by ability to modify the phenotype to the anti-inflammatory phenotype (M2). For this purpose PBMC equine cells obtained from peripheral venous blood of four healthy thoroughbred (F.S.C.) was used. Monocytes-derived macrophages were stimulated with LPS (25ng / ml) for 18 hours in the presence or absence of PTX (250μg / ml for 90 minutes) and with hIL-4 (20ng/ml) in the presence or absence of PTX (250μg / ml for 90 minutes). Then, the mRNA of pro- and anti-inflammatory cytokines (TNF-α and IL-10) cell content was quantified. Our results shown that equine cells cultured with LPS, PTX induced a significant decrease of TNF-α mRNA content. Interestingly, cells cultured with LPS and PTX, the IL-10 mRNA content was significantly greater than with LPS alone. Furthermore, we observed in equine cells cultured with PTX a significant increase IL-10 mRNA content, it was similar to hIL4 induced. Likewise, cells cultured in presence of PTX and hIL4 together, IL10 mRNA content was greater than that observed in cultures separately. Here demonstrated for the first time that PTX inhibits the activity of macrophages phenotype M1 and differentiation towards the M2 phenotype. We postulate that, PTX treatments in equine acute inflammatory pathologies is recommended for it properties to control of acute inflammation and favoring the repair of damaged tissue, thus restoring the balance between anti-inflammatory and pro-inflammatory cells.

A aterosclerose é uma doença pró-inflamatória, caracterizada por disfunção endotelial e pela presença de placa de ateroma, formada pela fagocitose de oxLDL por macrófagos da região subíntima. As espécies reativas apresentam um papel importante na doença, sendo responsáveis diretos pela oxidação da LDL. Os macrófagos podem apresentar dois fenótipos, o classicamente ativado, M1 (pró-inflamatório), e o alternativamente ativado, M2 (anti-inflamatório). Entretanto, o papel desses fenótipos na aterosclerose ainda carece de um maior entendimento. Portanto, nosso objetivo foi, em um primeiro momento, revisar os dados presentes na literatura sobre oxidação de LDL e fenótipos de macrófagos em aterosclerose. Em um segundo momento, objetivamos comparar (através de estudo de bioinformática) as expressões de grupos de genes antioxidantes (HAG), de genes relacionados ao fenótipo M1 e de genes relacionados ao fenótipo M2 entre macrófagos de pessoas com aterosclerose e de pessoas saudáveis e entre placas de aterosclerose humanas em estágio avançado e em estágio inicial. Os dados de expressão foram obtidos do repositório GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), enquanto as interações funcionais foram obtidas com os programas STRING (http://string-db.org/) e Medusa (http://coot.embl.de/medusa/). As análises estatísticas foram conduzidas com o programa ViaComplex (http://lief.if.ufrgs.br/pub/biosoftwares/viacomplex/) ze com a plataforma GSEA (http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp). A expressão dos grupos de genes HAG e M1 aumentou nas placas em estágio avançado em comparação às placas em estágio inicial. A expressão dos grupos de genes HAG, M1 e M2 aumentou nos macrófagos de pessoas com aterosclerose em comparação com os macrófagos de pessoas saudáveis, mas somente o grupo de genes M1 teve sua expressão aumentada em células espumosas (foam cells) de pessoas com aterosclerose em comparação com pessoas saudáveis. Por outro lado, houve uma diminuição na expressão do grupo de genes M1 em foam cells de pessoas saudáveis em comparação com macrófagos do mesmo grupo de indivíduos. Portanto, nossos resultados sugerem que, diferente do que acontece em câncer, na aterosclerose não há uma polarização dos fenótipos de macrófagos. Na verdade, ambos estão aumentados e mais estudos são necessários para melhor elucidar os mecanismos envolvidos. Palavraschave: antioxidantes, aterosclerose, macrófagos, polarização, M1/M2. / Atherosclerosis is a pro-inflammatory disease, which is characterized by endothelial dysfunction and atheroma plaque formation, as a result of oxLDL phagocytosis by macrophages in subintima region. Reactive species play an important role, being involved with the LDL oxidation process. Macrophages can present two phenotypes, classically activated, M1 (pro-inflammatory), and the alternatively activated, M2 (antiinflammatory). However, the role of these phenotypes needs to be better explained. Therefore, our objective is to review the literature data about LDL oxidation and macrophage phenotypes in atherosclerosis. Thereafter, we aimed to compare, through bioinformatics study, the expression of human antioxidant genes (HAG), M1 phenotype-related genes and M2 phenotype-related genes groups between healthy people macrophages and atherosclerotic people macrophages, and between human advanced atherosclerotic plaques and human initial atherosclerotic plaques. Expression data were obtained from GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), while functional interactions were from STRING (http://string-db.org/) and Medusa (http://coot.embl.de/medusa/). The statistical analysis was conducted with ViaComplex (http://lief.if.ufrgs.br/pub/biosoftwares/viacomplex/) and GSEA (http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp). The expression of HAG e M1 groups increased in advanced plaques compared to initial plaques, while the expression of HAG, M1 e M2 groups increased in atherosclerotic people macrophages compared to healthy people macrophages. Nevertheless, only M1 group had its expression elevated in atherosclerotic people foam cells compared to healthy people foam cells. On the other hand, there was a decreased expression of M1 group in healthy people foam cells compared to the macrophages from the same individuals set. Thus, our results suggest that in atherosclerosis there is not a macrophage phenotype polarization, differently of what happens for cancer. Actually, both phenotypes are increased and more studies are needed to better elucidate the involved mechanisms. Key-words: antioxidants, atherosclerosis, macrophages, polarization, M1/M2.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-01-31T03:14:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 343392.pdf: 1319407 bytes, checksum: 24b8974ed11565d9a00fd25cb59af3c1 (MD5) Previous issue date: 2016 / Atualmente, as doenças cardiovasculares representam a principal causa de mortalidade e morbidade no mundo. Por sua vez, a aterosclerose, principal causa das doenças cardiovasculares, é uma doença inflamatória crônica e progressiva caracterizada pelo acúmulo de lipídios e elementos celulares na túnica íntima das artérias de médio e grande calibre. A produção anormal de espécies reativas relacionada a diversos fatores de risco para essa patologia, e a consequente modificação oxidativa da lipoproteína de baixa densidade (LDL) desempenham papeis importantes na patogênese dessa condição. Um possível método para prevenir a aterosclerose seria a administração de substancias antioxidantes de maneira a deixar a LDL menos sensível ao processo oxidativo, impedindo ou retardando a progressão da doença. Por esse motivo, a inclusão de antioxidantes dietéticos representa uma alternativa concreta no controle da progressão da aterogênese. A fucoxantina, um carotenóide extraído de algas marrons comestíveis, possui excelentes atividades anti-inflamatórias e antioxidantes já demonstradas em diversos modelos experimentais. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi investigar os potenciais efeitos antioxidante e antiaterogênico do composto fucoxantina sobre a inibição da oxidação da LDL humana isolada, assim como em macrófagos J774 expostos à LDL oxidada (LDLox). Inicialmente, avaliamos os efeitos protetores da fucoxantina frente à oxidação de LDL humana induzida por Cu2+. O composto inibiu de maneira dependente de concentração a lipoperoxidação da LDL. Além disso, a oxidação proteica da LDL humana isolada foi igualmente inibida de forma dependente da concentração. Considerando os efeitos protetores antioxidantes da fucoxantina, e considerando o envolvimento da LDLox na patogênese da aterosclerose, investigamos os efeitos protetores da fucoxantina sobre danos citotóxicos induzidos pela exposição de macrófagos murinos J774 à LDLox. O pré-tratamento por 24 horas com fucoxantina reduziu efeitos citotóxicos causados pela LDLox, i.e., a produção elevada de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (EROs/ERNs), distúrbio na homeostase do .NO, redução dos níveis intracelulares de glutationa reduzida (GSH), comprometimento na bioenergética mitocondrial e formação de células espumosas. O potencial efeito antiaterogênico da fucoxantina foi relacionado à sua capacidade de sequestrar radicais livres, assim como de ativar fatores de transcrição como Nrf-2, e inibir a atividade do NF-?B, já relatadas na literatura. Os resultados indicam um papel benéfico da fucoxantina na aterogênese, impedindo eventos oxidativos que possam contribuir para a progressão da doença.<br> / Abstract : Nowadays, cardiovascular diseases are the leading cause of mortality and morbitidy worldwide. In turn, atherosclerosis, mainly cause of cardiovascular diseases, it?s a inflammatory and chronic pathology characterized by the accumulation of lipids and cellular elements in the intima layer of arteries of medium and large caliber. Abnormal production of reactive species related to several risk factors for this pathology, and consequently the oxidative modification of low density lipoprotein (LDL) play an important role in the pathogenesis of this condition. One possible method to prevent atherosclerotic diseases would be the administration of antioxidant substances thereby making LDL less sensitive to this oxidative process, preventing or delaying the disease progression. For this reason, the inclusion of dietary antioxidants represents a concrete alternative in controlling the progression of atherogenesis. Fucoxanthin, a carotenoid extracted from edible brown seaweed, has excellent anti-inflamatory and antioxidative activities already demonstrated in several experimental models. In this context, the objective of this study was to investigate the potencial antioxidant and antiatherogenic effects of the compound fucoxanthin on the inhibition of human isolated LDL oxidation, as well on macrophages J774 expose to oxidized LDL (oxLDL). Initially, we evaluated the protective effects of fucoxanthin on human Cu2+-induced human LDL oxidation. The compound caused a concentration-dependent inhibition on the LDL lipoperoxidation. Furthermore, the protein moieties oxidation from human isolated LDL was also inhibited in a concentration-dependent manner. Considering the antioxidative protective effects of fucoxanthin, and considering the involvement of oxLDL in the pathogenesis of atherosclerosis, we investigated the protective effects of fucoxanthin on oxLDL-mediated cytotoxic effects in murine macrophage cells. The 24 hours pre-treatment with fucoxanthin reduced the cytotoxic effects caused by oxLDL, including elevated production of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS), disturbance of .NO homeostasis, reduction of intracellular levels of reduced glutathione (GSH), foam cell formation and impairment in mitochondrial bioenergetics. The potential antiatherogenic effect of fucoxanthin was related to its ability of scavenging free radicals, as well as activating transcription factors as Nrf-2, and inhibit the activity of NF-?B, as reported in the literature. The results indicate a beneficial role of fucoxanthin in atherogenesis by preventing oxidative events that may contribute to disease progression.

A aterosclerose é uma doença extremamente grave que leva à morte milhares de pessoas em todo o mundo. A ruptura do balanço intracelular que leva ao acúmulo de colesterol é uma das principais características observadas nas células que participam do desenvolvimento da lesão aterosclerótica. Estudos de nosso grupo mostraram que as prostaglandinas ciclopentenônicas (CP-PGs), em particular a PGA2, desviam o metabolismo lipídico de macrófagos e macrófagos-foam cells reduzindo a síntese de novo de colesterol e ésteres de colesterol e induzindo a síntese de fosfolípides, no lugar dos derivados do colesterol. Além disso, as CP-PGs são potentes agentes antiinflamatórios por promoverem diretamente a inibição da ativação do fator nuclear NF-κB e, indiretamente, pela ativação das proteínas de choque térmico (HSP), o que também leva à citoproteção. O resultado combinado dessas alterações é que a PGA2 induz uma potente redução na quantidade de colesterol total em macrófagos-foam cells revertendo seu fenótipo ao de uma célula normal. Assim, e tendo em vista que a aterogênese e o acúmulo de lipídios por macrófagos está relacionado a disfunções na capacidade de regulação de síntese e exportação de lipídios, o objetivo deste estudo foi investigar o mecanismo de ação da PGA2 sobre a atividade e expressão de enzimas que participam do metabolismo do colesterol, a saber, acil-coenzima A: colesterol acil-transferase (ACAT) e 3- hidróxi-3-metilglutaril-coenzima A redutase (HMG-CoA redutase). Foi estudada, também, a possibilidade de que o efeito desta prostaglandina pudesse dar-se pela indução de alterações no estado redox celular e expressão de proteínas relacionadas à iniciação e desenvolvimento da lesão ateromatosa em macrófagos. Verificamos que, apesar de a PGA2 inibir a atividade da ACAT em macrófagos/foam cells, o mesmo não ocorre com macrófagos normais. Contudo, a PGA2 apresenta um potente efeito inibitório sobre a atividade da HMG-CoA redutase, mas não sobre a expressão da proteína ou de seu mRNA. Os dados obtidos com a PGA2, que é um agente eletrofílico, são mimetizados e potencializados por manobras que alteram as concentrações intracelulares de glutationa (GSH) e dissulfeto de glutationa (GSSG) e confirmados pela expressão de proteínas cujos fatores de transcrição específicos são sensíveis ao estado redox, como a HSP70 (via HSF), MRP1 (via Nrf2/Keap1) e iNOS (via NF-κB). Os resultados implicam as CP-PGs como uma nova classe de agentes hipocolesterolemiantes através da modulação do estado redox celular. / Atherosclerosis is a leading cause of death in the world. Disruption of the intracellular lipid balance, which leads to cholesterol accumulation is one of the features of cells that participate of the development of atherosclerotic lesions. Evidence form our laboratory indicates that cyclopentenone prostaglandins (CP-PGs), particularly PGA2, deviate lipid metabolism from the synthesis of cholesterol and cholesteryl esters to the synthesis of phospholipids in foam cell macrophages. Moreover, CP-PGs are powerful anti-inflammatory agents by directly inhibiting nuclear factor NF-κB, and indirectly through the activation of heat shock protein (HSP) pathway, which, in turn, confers cytoprotection. The combined effect of such alterations is that PGA2 dramatically reduces cholesterol contents in foam cell macrophages, thus reversing its phenotype to that of a normal cell. Hence, and since atherogenesis and lipid accumulation by macrophages are related with dysfunctions in the ability of regulating lipid synthesis and export, the aim of this study was to investigate the mechanism of action of PGA2 on the activity and expression of enzymes related to cholesterol metabolism, namely, acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase (ACAT) and 3-hidroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase (HMG-CoA reductase). The possibility that the effects of this CP-PG were modulated by alterations in the intracellular redox status and expression of proteins related to the initiation and development of atheromatous lesions in macrophages was also investigated. We found that, although PGA2 did inhibit ACAT activity in foam cell macrophages, the same was not true for normal macrophages. However, PGA2 showed a powerful inhibitory effect of HMG-CoA reductase activity but not in the expression of both protein or mRNA. The data obtained with PGA2, which is an electrophilic agent, were mimicked and potentialized by certain maneuvers that alter intracellular glutathione (GSH) and glutathione disulphide (GSSG) contents and were confirmed by the expression of proteins whose specific transcription factors areredox-sensitive, such as HSP70 (via HSFs), MRP1 (via Nrf2/Keap1) and iNOS (via NF-κB). The results indicate CP-PGs as a new class of hypocholesterolemic drugs by virtue of their capacity to modulate intracellular redox status.

Orientador: Luciane Dias de Oliveira / Coorientador: Mariella Vieira Pereira Leão / Banca: Antonio Olavo Cardoso Jorge / Banca: Renata Falchete do Prado / Resumo: De acordo com a literatura, o uso frequente de probióticos em humanos favorece a modulação do sistema imunológico, por mecanismos ainda não totalmente definidos. O objetivo do presente estudo foi avaliar a capacidade de Lactobacillus rhamnosus ou seus produtos induzirem a liberação de mediadores pró e anti-inflamatórios (TNF-α, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 e óxido nítrico) por macrófagos de camundongo (RAW 264.7). Para tanto, foram realizadas 3 preparações do microrganismo: SpL: suspensão de bactérias vivas (5 x 107 UFC/mL), SpLA: suspensão de bactérias autoclavadas a 121ºC por 15 min (5 x 107 células/mL); e SnLA: sobrenadante da suspensão anterior (SpLA) após centrifugação. As células (macrófagos RAW 264.7) foram cultivadas (37ºC, 5% de CO2) em três diferentes situações: na presença de SpL, SpLA ou SnLA. Após 2 h e 30 min de cultivo, o meio de cultura foi trocado e as células foram cultivadas por mais 16 h. Em seguida, os sobrenadantes foram removidos e estocados em freezer (-80ºC) para posterior análise. Como controle positivo foi utilizado LPS de Escherichia coli (10 EU/mL) e como controle negativo solução fisiológica. A quantificação de citocinas foi realizada pelo teste imunoenzimático (ELISA) utilizando anticorpos específicos. A produção de óxido nítrico foi determinada indiretamente pela concentração de nitrito detectada pelo reagente de Griess. Os resultados foram analisados estatisticamente, pela análise de variância ANOVA, com nível de significância de 5%, e pelo teste de Tukey. As suspensões SpL e SpLA foram capazes de induzir produção significativamente superior de TNF-α, IL-6, IL-10 e óxido nítrico em relação ao controle negativo (p<0,05). SnLA também induziu aumento significativo na... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: According to the literature, the frequent use of probiotics in humans favors the modulation of the immune system by mechanisms not yet fully defined. The aim of this study was to evaluate the ability of Lactobacillus rhamnosus or their products induce the release of proinflammatory mediators and anti-inflammatory (TNF-α, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 and nitric oxide) by mouse macrophages (RAW 264.7). To this end, there were three preparations of the microorganism: SPL: suspension of live bacteria (5 x 107 UFC/ mL), SPLA: bacteria suspension autoclaved at 121 ° C for 15 min (5 x 107 UFC / mL) and SnLA: supernatant (SPLA) after centrifugation. The cells (RAW 264.7 macrophages) were cultured (37 ° C, 5% CO2) in three different situations: in the SpL, SPLA or SnLA presence. After 2 h 30 min cultivation, the culture medium was changed and cells were cultured for more 16 h. Then, the supernatants were removed and stored in a freezer (-80 °C) for later analysis. As positive control was used Escherichia coli LPS (10 EU / mL) and physiological solution as negative control. Cytokine quantitation was performed by immunoenzymatic test (ELISA) using specific antibodies. The production of nitric oxide was indirectly determined by nitrite concentration detected by the Griess reagent. The results were statistically analyzed by ANOVA with a significance level of 5%, and Tukey test. SPL and SPLA suspensions were able to induce significantly higher production of TNF-α, IL-6, IL-10 and nitric oxide than the negative control (p <0.05). SnLA also induced a significant increase in the production of TNF-α, IL-10 and nitric oxide (p <0.05), however, did not induce significant production of IL-6 in relation to the negative control (p> 0.05). It was not observed production of IL-4 and IL-1β, by any of the suspensions analyzed. In relation to... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Iracilda Zeppone Carlos / Banca: Cleni Mara Marzocchi Machado / Banca: Maria Terezinha Serrão Peraço / Resumo: O câncer é o principal problema mundial de saúde e nos últimos anos o Brasil obteve um avanço considerável no índice de mortalidade por câncer. O câncer de cólon afeta igualmente homens e mulheres, sendo uma doença tratável e freqüentemente curável. O sistema imune é responsável pela defesa do organismo contra patógenos e alguns tumores, que desencadeiam uma resposta imune especifica na tentativa de suprimir seu crescimento. Associado à atuação dos macrófagos, o consumo de produtos derivados da soja está sendo muito difundido atualmente, podendo diminuir o risco de determinadas doenças, inclusive dos tumores, melhorando as condições de saúde. As bactérias ácido láticas são utilizadas em alimentos probióticos e são capazes de promover uma estimulação do sistema imune, influenciando através do aumento da fagocitose de patógenos e também quanto à produção de citocinas. Neste trabalho, avaliou-se a resposta imune no desenvolvimento de câncer de cólon induzido quimicamente com 1,2 dimetilhidrazina em ratos que receberam produto de soja fermentado com Enterococcus faecium CRL 183 e Lactobacillus helveticus ssp. jugurti 416, os quais foram suplementados ou não com cálcio. Os animais com e sem tumores receberam o produto fermentado de soja ou o produto fermentado de soja suplementado com cálcio. Aos controles não foi administrado o produto fermentado de soja ou suplementado. Estes grupos tiveram a atividade imunológica avaliada através da produção de mediadores como peróxido de hidrogênio (H2O2), óxido nítrico (NO), interleucina (IL)-1 , fator de necrose tumoral-a (TNF-a) e IL-6, produzidos pelos macrófagos, e interferon- (IFN-g) e IL-4 produzidos pelas células esplênicas. Os resultados demonstram que com... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Cancer is the main problem of health and in the last years Brazil had a considerable progress in the mortality rate for cancer. Colon cancer affects men and women equally, and it is a treatable and frequently curable disease. Immune system is responsible for the organism defense against pathogenic substances and some tumors that unchain a specific immune response in the attempt of suppressing its growth. Combined the macrophages performance, the consumption of products derived from soy is being very spread now, could reduce the risk certain diseases, including tumors, improving health condition. Lactic acid bacteria is utilized in probiotic food and can promote a stimulation of immune system influencing through the increase of the pathogen phagocytosis and also the cytokines production. In this work, the immune response was evaluated in the development of colon cancer induced chemically with 1,2 dimethylhydrazine in rats that received soy product fermented with Enterococcus faecium CRL 183 and Lactobacillus helveticus ssp. jugurti 416; which were supplemented or not with calcium. Animals with or without tumors that received the fermented soy product or the fermented soy product supplemented with calcium and to controls groups that didn’t receive the fermented soy product or supplement with calcium. In these groups the immunological activity was evaluated through production of mediators such as hydrogen peroxide (H2O2), nitric oxide (NO), interleukin (IL)-1 , tumoral necrosis factor- (TNF- ) and IL-6, produced by macrophages, and interferon- (IFN- ) and IL-4, produced by spleen cells. Results demonstrate that in tumor presence and fermented product there is a higher immune system stimulation observed in H2O2 production, as well as the animals without tumor and that received soy treatment. In the animals with tumors that... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Graziella Nuernberg Back Brito. / Banca: Luciane Dias de Oliveira / Banca: Marcos Roberto Furlan / Resumo: Hamamelis virginiana L. é uma planta nativa dos Estados Unidos da América que foi inserida no Brasil por conta de suas vastas atividades biológicas, como ação antimicrobiana e anti-inflamatória. As pesquisas com extratos desse vegetal são vastas, embora não haja estudos com extrato glicólico da mesma. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana e anti-inflamatória do extrato glicólico de Hamamelis virginiana L. sobre cepas padrão de leveduras do gênero Candida (Candida albicans, C. dubliniensis, C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei e C. tropicalis), espécies de bactérias Gram-positivas (Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans) e Gram-negativas (Acinetobacter baumanii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae), nas fases planctônica e biofilme; além de avaliar a citotoxicidade e atividade anti-inflamatória. A atividade antimicrobiana foi realizada por teste de microdiluição em caldo para a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Microbicida Mínima (CMM), sendo os resultados utilizados como parâmetro para análise em biofilmes monotípicos. A atividade citotóxica foi analisada pelo teste MTT e quantificação da produção das citocinas interleucina-1β (IL-1β) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) por ELISA, sendo a avaliação da atividade anti-inflamatória realizada por meio de exposição da cultura de macrófagos de camundongo (RAW 264.7) a lipopolissacarídeo (LPS) de E. coli seguido por tratamento com o extrato de H. virginiana L. Os resultados que apresentaram distribuição normal foram analisados por ANOVA e teste Tukey (p≤ 0,05); já os sem distribuição normal foram analisados por Kruskal-Wallis e pós teste Dunns. Os resultados obtidos revelam que o extrato glicólico de Hamamelis virginiana L. proporcionou atividade antimicrobiana sobre os micro-organismos testados no presente estudo e o teste de citoxicidade.... / Abstract: Hamamelis virginiana L. is a North American plant that was insert in Brasil because their biological activities, like antimicrobial and anti-inflamatory activities. Large researchs are development with H. virginiana L. extracts, although there are no studies with glycolic extract from it. The objective of this work was to evaluate the antimicrobial and anti-inflammatory activity of glycolic extract of Hamamelis virginiana L. over standard strains of genus Candida yeast (C. albicans, C. dubliniensis, C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei e C. tropicalis), species of Gram-positive bacteria (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans) and Gram-negative (Acinetobacter baumanii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae), in plankton communities and biofilm; besides the cytotoxicity and anti-inflammatory. The antimicrobial activity was performed by microdiluition test in broth for determining the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) e Minimum Microbicide Concentration (MMC), and the results used for antimicrobial analysis in biofilms monotypic. The cytotoxic activity was analyzed by the MTT test and quantification of production of the cytokines IL-β 1 and TNF-α by ELISA., being that the anti-inflamatory activity was performed with exposition of macrophages mouse culture to E. coli lipopolissacaride (LPS) and extract post-treatment. The results were analyzed by ANOVA and Tukey Test (p ≤ 0.05) if the results present normal distribuition; and Kruskal Wallis and post-test Dunn if the results don't presente normal distribuition (p ≤ 0.05). Results shows that the H. virginiana L. glycolic extract have antimicrobial activity about test micro-organisms and the cytotoxicity test shows high cellular viability or equal the control, except for the 100 mg/mL for 24 h contact time. Cytokines weren't produced by macrophages. Nitric oxide was produced by cells in a con... / Mestre

Orientador: Beatriz Maria Machado de Medeiros / Banca: Cleni Mara Marzocchi Machado / Banca: Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro / Banca: Dagmar Ruth Stach-Machado / Banca: Maria Teresinha Serrão Peraçoli / Resumo: O objetivo deste estudo foi verificar a influência da infecção por Y. enterocolitica na modulação de macrófagos M1 e M2 em camundongos suscetíveis (BALB/c) e resistentes (C57BL/6). Camundongos de ambas as linhagens foram infectados com Y. enterocolitica O:8 WA 2707. Células do lavado peritoneal e células esplênicas foram retiradas no 1º, 3º e 5º dia pós-infecção. Em cultura de macrófagos foi verificada a atividade das enzimas iNOS e arginase, medidas por seus produtos NO/citrulina e ornitina, respectivamente, e a produção de TGFb-1. Em cultura de linfócitos foram verificadas as respostas Th1 e Th2, avaliadas pela produção das citocinas IFN-g e IL-4. No 1º e 3º dia após infecção com Y. enterocolitica, os macrófagos de camundongos C57BL/6 aumentaram a produção de NO/citrulina e não produziram TGFb-1; enquanto que os macrófagos de BALB/c aumentaram a produção de ornitina e de TGFb-1. Os linfócitos de C57BL/6 aumentaram a produção de IFN-g e não produziram IL-4, enquanto que os BALB/c apresentaram um aumento mais discreto nos níveis de IFN-g e produziram IL-4 no 5º dia pós-infecção. / Abstract: The objective of this study was to verify the modulation of Y. enterocolitica infection in M1 and M2 macrophage modulation in susceptible (BALB/c) and resistant (C57BL/6) mice. Both strains of mice were infected with Y. enterocolitica O:8 WA 2707. Peritoneal macrophages and spleen cells were obtained on days 1, 3 and 5 post-infection. We verified the iNOS and the arginase activities in macrophage cultures, measured by their NO/citruline and ornithine products, respectively. The TGF b-1 production was also measured in supernatants of macrophage cultures. The Th1 and Th2 responses were evaluated in supernatants of lymphocyte cultures, by IFNg and IL-4 production. In the 1st and 3rd day after infection with Y. enterocolitica, macrophages from C57BL/6 mice increased their NO/citruline production and they didn't produce TGF b-1 ; while macrophages from BALB/c mice increased their ornithine and TGF b-1 production. The lymphocytes from C57BL/6 mice increased their IFNg production and didn't produce IL-4, while BALB/c showed a discreet increase in the IFNg levels and produced IL-4 in the 5th day post-infection. / Doutor

Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Patologia Molecular, 2010. / Submitted by Jadiana Paiva Dantas (jadi@bce.unb.br) on 2011-06-30T00:12:53Z No. of bitstreams: 1 2010_ LauraMariaBarbosaGoncalves.pdf: 1387249 bytes, checksum: 55e77b2f20ba208c8e0b1f186285b97d (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-07-14T22:29:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_ LauraMariaBarbosaGoncalves.pdf: 1387249 bytes, checksum: 55e77b2f20ba208c8e0b1f186285b97d (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-14T22:29:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_ LauraMariaBarbosaGoncalves.pdf: 1387249 bytes, checksum: 55e77b2f20ba208c8e0b1f186285b97d (MD5) / Paracoccidioides brasiliensis é o agente causador da paracoccidioidomicose (PCM), doença granulomatosa crônica que acomete principalmente os pulmões, pele, mucosas e linfonodos. O fungo P. brasiliensis apresenta dimorfismo termo-dependente, desenvolvendo-se na forma de levedura em vida parasitária ou quando cultivado em meios de cultura a 37ºC. A adesão e invasão de células são eventos essenciais envolvidos na infecção e disseminação do patógeno. A ativação adequada dos macrófagos alveolares e a expressão de genes que ativam os mecanismos microbicidas dos macrófagos são elementos chaves na erradicação desta doença. Dados previamente descritos na literatura demonstram que a fração F1 isolada do fungo, cujo principal componente é a β-1,3-glicana, é um importante imunomodulador, promovendo o recrutamento de células inflamatórias e estimulando a produção de citocinas pró-inflamatórias incluindo o Tnf-α. Outro componente importante na interação entre o hospedeiro e o fungo é a fração F2, constituída pela α-1,3-glicana que está comumente relacionada à virulência. A mudança na composição da parede celular durante a infecção, como ocorre em P. brasiliensis, pode ser considerada como um mecanismo de escape da resposta imune inata. Com o objetivo de compreender melhor os eventos iniciais desse processo infectivo, o RNA total dos macrófagos tratados e não tratados foram analisados por meio do RT-PCR em Tempo Real avaliando a expressão de genes chaves TNF-α e Cxcl4 (pró-inflamatórios), CD14, Clec2 e Itga5 (proteínas de membrana), Stat6 (transdução de sinal), Nfkb e Nfkr (regulação transcricional), Toll2 e Toll4 (receptores de reconhecimento padrão), MyD88 (molécula adaptadora) envolvidos no processo inflamatório utilizando macrófagos alveolares-MHS numa cinética de interação de 6, 24 e 48 horas com P. brasiliensis e seus componentes de parede. O estudo revelou a indução de genes responsáveis por processos quimiotáticos que facilitam a adesão célula-célula e genes relacionados à internalização e adesão do patógeno como Clec2, sendo importante no intenso recrutamento de fagócitos para o sítio da infecção. Os genes dos receptores de reconhecimento padrão (Toll2, Toll4) e a molécula adaptadora MyD88, não apresentaram um papel relevante no sentido do estabelecimento da imunidade protetora contra o P. brasiliensis. Desta forma este trabalho revelou a indução de genes que codificam para proteínas que irão participar do processo de inflamação tais como migração celular e ativação da capacidade microbicida dos macrófagos, principalmente durante o estágio inicial da cinética de interação. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Paracoccidiodes brasiliensis is the agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a chronic granulomatous disease that affects mainly the lungs, skin, mucous membranes and lymph nodes. The fungus P. brasiliensis shows thermo dependent dimorphism, growing as yeast in parasitic life or when cultured in medium at 37°C. The adhesion and invasion of host cells are essentials events involved in infection and dissemination of pathogen. The adequate activation of alveolar macrophages and expression of genes that activate the microbicidal mechanisms of macrophages are key elements in the eradication of this disease. Data previously reported demonstrated that the F1 fraction extracted the fungus, whose the major component is the β-1,3-glucan, is an important immunomodulator by promoting the inflammatory cells recruitment and stimulating the proinflammatory cytokines production, including TNF–α. Another important component in interaction of host and fungus is the fraction F2, consisting of α-1,3-glucan, that is usually associated with virulence. The change in cell wall composition during infection, as occurs in P. brasiliensis, can be considered as escape mechanism to innate immune response. In order to better understand the initial events of this infectious process, total RNAs of macrophages treated and non-treated were analyzed by Real-Time RT-PCR and were evaluated the key genes TNF-α and Cxcl4 (proinflamatory), CD14, Itga5 and Clec2 (membrane proteins), STAT6 (signal transduction), NFkB and Nfkr (transcriptional regulation), Toll2 and Toll4 (pattern recognition receptors), MyD88 (adapter molecule) expression involved in inflammatory process. In these experiments were used alveolar macrophages (MHS) incubated with P. brasiliensis and its wall components, in the interaction kinetics (6, 24 and 48 hours). The study demonstrated gene induction involved in chemotaxis processes, which facilitate cell-cell adhesion, and gene induction related to pathogen internalization and adherence, as Clec2, that triggers intense phagocytes recruitment to the infection site. The genes of pattern recognition receptors (Toll2, Toll4) and the adapter molecule MyD88, did not show significant role towards establishment of protective immunity against P. brasiliensis. Thus this study revealed induction of genes that code for proteins that will participate in the process of inflammation such as cell migration and activation of microbicide activity of macrophage, especially during the initial stage of the kinetic of interaction.