O objetivo do trabalho foi estudar uma forma alternativa para o controle do endurecimento dos frutos do maracujazeiro, pela produção de plantas transgênicas contendo o gene da proteína capsidial do Passionfruit woodness virus - PWV. O vetor de expressão foi construído utilizando-se os plasmídeos pCambia 2300 e pCambia 2301, que contêm o gene de seleção nptII, para resistência ao antibiótico canamicina. O plasmídeo pCambia 2301 contém também o gene repórter uidA (GUS). Os plasmídeos foram introduzidos em Agrobacterium tumefaciens, estirpes EHA 105 e LBA 4404, pelo método do choque térmico. Os explantes para transformação genética constituíram-se de discos de folhas jovens (6 mm de diâmetro), das variedades IAC 275 e IAC 277, coletados de plantas mantidas em sob fotoperíodo de 16 h luz, a 27 °C. Os explantes foram inoculados com suspensão bacteriana (5x108 UFC/mL) por 20 min e transferidos para placa de Petri contendo o meio de cultura MS + thidiazuron (TDZ - 0,25 mg/L) + nitrato de prata (AgNO3 - 4 mg/L) + acetoseringona (1 µM/L). O co-cultivo foi realizado à temperatura de 24 °C, em ausência de luz, por um período de 3 dias. Para seleção e regeneração de plantas os explantes foram transferidos para meio de cultura de seleção MS + TDZ (0,25 mg/L) + AgNO3 (4 mg/L) + canamicina (100 mg/L) + cefotaxime (500 mg/L). A incubação foi realizada a 27 °C, em ausência de luz, por um período de 4 - 6 semanas. As gemas adventícias desenvolvidas foram transferidas para o meio de cultura MSM + 10% de água de coco e incubadas sob fotoperíodo de 16 h de luz. A transformação genética foi identificada pelo teste histoquímico GUS e por PCR. Obteve-se um total de 22 plantas PCR positivas. Destas, 8 foram analisadas por Southern blot para confirmação da integração do transgene. A transcrição e expressão do transgene foram analisadas por Northern e Western blot, respectivamente. As plantas transgênicas avaliadas foram multiplicadas e inoculadas com 3 diferentes estirpes do PWV. A linhagem T2 apresentou resistência a infecção dos três isolados utilizados. / The main purpose of this work was to study an alternative way to control the Passionfruit woodiness virus - PWV through the production of transgenic plants which contained the Passionfruit woodness virus coat protein gene. The binary vector was built by using pCambia 2300 and pCambia 2301 plasmids, which contain the selection gene nptII. The pCambia 2301 plasmid also contains the reporter gene uidA (GUS). The plasmids were introduced into Agrobacterium tumefaciens, EHA 105 and LBA 4404 strains, via thermal shock method. The explants for the genetic transformation were young leaf disks (6 mm of diameter) of IAC 275 and IAC 277 varietys, extracted from plants kept under 16 h photoperiod, at 27 °C. The explants were inoculated with a bacterial suspension (5x108 UFC/mL) for 20 min and then transferred to Petri dishes containing cocolture medium MS + thidiazuron (TDZ - 0,25 mg/L) + silver nitrate (AgNO3 - 4 mg/L) + acetosyringone (1 µM/L). The co-culture was performed at 24 °C t, in the dark, for a three-day period. For the selection and regeneration of plants, the explants were transferred to the selection culture medium MS + TDZ (0,25 mg/L) + AgNO3 (4 mg/L) + kanamycin (100 mg/L) + cefotaxime (500 mg/L). The incubation was performed at 27 °C, in dark, for 4 - 6 weeks. The adventitious buds developed were then transferred to the culture medium MSM + 10% coconut water and kept incubated under 16 h photoperiod. The genetic transformation was identified through GUS and PCR tests. There were 22 PCR positive plants. Out of those, 8 were Southern blot analyzed for the confirmation of transgenc integration. The transgene transcription and expression were determined by Northern and Western blot respectively. The transgenic plants were then multiplied and inoculated with 3 different strains of PWV, and the line 2 showed resistance to the three strains used.

A bacteriose, ou mancha oleosa, doença causada por Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae, é um sério problema em muitas áreas de produção de maracujá no Brasil, especialmente se associada à antracnose. A transformação genética é uma alternativa para obter plantas resistentes. Proteínas bactericidas, como as atacinas encontradas na hemolinfa de insetos, têm sido usadas para conferir resistência a espécies vegetais. Como as atacinas têm um peptídeo sinal que as direciona para o espaço extracelular em insetos, nós iniciamos este estudo investigando o direcionamento da atacina A em plantas. A seqüência do gene da atacina A (attA) com e sem o peptídeo sinal foi fusionada com os genes repórteres uidA e gfp e epidermes de cebola foram transformadas, via biobalística, com essas construções gênicas. A atacina A, de fato, é acumulada no apoplasto onde, justamente, bactérias fitopatogênicas se multiplicam antes de invadir as células vegetais. Visando obter plantas transgênicas resistentes à bacteriose, foram transformados tecidos foliares e hipocotiledonares com as linhagens LBA 4404 e EHA 105 de Agrobacterium tumefaciens contendo o gene attA. De um total de 313 explantes infectados, foram obtidos 31 brotos PCR+, o que representa uma eficiência de transformação da ordem de 10%. A expressão do transgene foi confirmada por RT-PCR e a resistência ao patógeno foi avaliada pela inoculação de X. axonopodis pv. passiflorae em folhas destacadas de plantas mantidas in vitro. Em dez plantas não houve formação de lesão foliar, indicando uma possível resistência ao patógeno. / Bacterial spot disease caused by Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae is a serious problem in many passion fruit production areas in Brazil, especially if associated with anthracnose. Genetic transformation provides an alternative for obtaining resistant plants. Bactericide proteins such as attacins, found in the haemolymph of insects, have been used to confer resistance on plant species. As the attacins have a sign peptide that dispatches them to extracellular space in insects, we initiated our studies investigating the attacin A directing in plants. The attacin A gene (attA) sequence, with and without the sign peptide, was fused to uidA and gfp reporter genes, and onion epidermis were transformed using bioballistics with gene constructions. The protein did accumulate in the apoplast, where bacteria multiply before attacking plant cells. With the aim of obtaining transgenic plants of yellow passion fruit resistant to bacterial disease, leaf and hypocotyl-derived tissues were transformed with LBA 4404 and EHA 105 strains of Agrobacterium tumefaciens containing the attA gene. From a total of 313 infected explants, we obtained 31 PCR+ shoots, a transformation efficiency of 10%. Expression of the attA gene was confirmed by RT-PCR, and pathogen resistance evaluated by X. axonopodis pv. passiflorae inoculation in leaves obtained from in vitro plants. Leaf lesions were not observed in 10 shoots, suggesting a possible resistance to pathogen.

As sementes de maracujá-amarelo perdem rapidamente o poder germinativo quando são arbitrariamente armazenadas; assim, buscando embasamento para a definição de alternativas tecnológicas voltadas à desaceleração da deterioração durante o armazenamento, o objetivo da pesquisa foi o de estudar, através de variações no teor de água das sementes e na temperatura do ambiente, o comportamento fisiológico de sementes de maracujazeiro. A experimentação, realizada entre julho de 2002 e agosto de 2003 no Laboratório de Análise de Sementes localizado na Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz/ USP, foi conduzida com sementes de maracujá-amarelo (Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Deg.) produzidas em Mogi Mirim/ SP a partir de polinização aleatória entre plantas da Série IAC 270. Após a retirada da mucilagem das sementes, foi determinado o grau de umidade inicial do lote e, paralelamente, obtida a amostra representante do tratamento com o maior teor de água estudado (31%); as sementes remanescentes foram submetidas à secagem, em estufa com circulação de ar a 30°C ± 3°C, para a obtenção dos demais tratamentos referentes aos teores de água desejados (27%, 21%, 17%, 11% e 7%). Posteriormente, os tratamentos, correspondentes aos diferentes graus de umidade, foram armazenados em câmaras com temperaturas controladas de 10°C, 15°C e 20°C. Antes do armazenamento, e após 35, 70, 105, 140, 175, 210, 245, 280, 315 e 350 dias, as sementes foram submetidas às avaliações da qualidade. De acordo com os resultados obtidos, a combinação do grau de umidade de 7% com a temperatura de 10°C supera as demais no favorecimento à manutenção do potencial fisiológico das sementes de Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Deg. / Yellow passion fruit seeds quickly lose the germination capacity when erratically stored; thus, seeding grounds to define technological alternatives to delay deterioration during storage, the goal of this research was to study the physiological behavior of passion fruit (Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Deg.) seeds through varied seed water content and environmental temperature. The experiment was conducted at the Seed Analysis Laboratory of the Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz - USP, from July 2002 through August 2003, with yellow passion fruit seeds produced in Mogi Mirim/ SP, through random pollination among IAC 270 Series plants. Following seed mucilage removal, the initial moisture degree of the lot was determined and the representative sample of the treatment with the highest water content studied (31%) was obtained concurrently; the remaining seeds were dried in na air-circulating oven at 30°C ± 3°C to achieve other treatments regarding the intended water contents (27%, 21%, 17%, 11% and 7%). Further, the treatments - corresponding to different moisture levels - were stored in controlled-temperature chambers at 10°C, 15°C and 20°C. Previous to storage and 35, 70, 105, 140, 175, 210, 245, 280, 315 and 350 days later, the seeds were submited to quality assays. The results indicate that the combination between 7% moisture degree and 10°C temperature overcomes the remaining ones towards favoring the maintenance of the physiological potential of Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Deg. seeds.

Passiflora (Passifloraceae) é um grande gênero de espécies vegetais encontradas, principalmente, na flora tropical. Algumas passifloras são cultivadas como plantas ornamentais, frutíferas ou exploradas pelas suas propriedades medicinais. A principal espécie comercial brasileira, o maracujá-azedo (Passiflora edulis f. flavicarpa, 2n = 18), ocupa 95% da área plantada. Os frutos são consumidos in natura ou processados pela indústria de suco. Estudos genéticos e cromossômicos têm sido gerados para esta espécie. Entretanto, devido ao pequeno tamanho e a similaridade morfológica dos seus cromossomos, as medições do cariótipo convencional do maracujá-azedo têm levado a resultados inconsistentes, sendo necessário o desenvolvimento de marcadores cromossomos-específicos. Estes marcadores são produzidos a partir da identificação de sequências de cópia-única em clones de bibliotecas de BACs (Bacterial Artificial Chromosome), que são utilizadas como sondas em ensaios de FISH (Hibridização in situ Fluorescente). Neste trabalho, foi construída uma biblioteca genômica de maracujá-azedo em BACs contendo 82.944 clones, com tamanho médio dos insertos de 108 kb, e provendo uma cobertura de seis vezes o genoma. A biblioteca apresentou baixa contaminação com cpDNA e mtDNA (~0,04% e 0%, respectivamente), e foi possível o isolamento de oito clones contendo genes putativos de P. edulis f. flavicarpa. Estes clones foram marcados e utilizados como sondas em ensaios de FISH. Destas sondas, quatro apresentaram sinal único de hibridização, e foram mapeadas nos cromossomos 1 (gene ERS), 3 (gene ACCO) e 4 (genes G3PD e CYCD1). As demais sondas (genes LOX, NDID e MIPS) apresentaram sinais de hibridização subteloméricos ou pericentroméricos, indicando a presença de DNA repetitivo nos clones; a sonda contendo o gene EMB não revelou sinal fluorescente. Com base em análises de FISH, definiu-se, no presente trabalho, um novo cariótipo para o maracujá-azedo, com marcadores específicos para os cromossomos 1, 3 e 4, localizando, também, sítios de DNAr 45S nos cromossomos 7 e 8, e um sítio de DNAr 5S no cromossomo 5. A exploração da biblioteca de BAC, bem como o mapa físico aqui estabelecido, representa importantes avanços para guiar pesquisas futuras sobre o gênero Passiflora. / Passiflora (Passifloraceae) is a large genus of plant species essentially found in the tropical flora. Some passiflora are grown as ornamentals, cultivated for their edible fruits, or exploited due to their medicinal properties. The main Brazilian commercial species, the yellow passion fruit (Passiflora edulis f. flavicarpa, 2n = 18) occupies 95% of all planted orchards. The fruits are eaten fresh or used for industrial juice production. Genetic and chromosomal studies have been carried out on the species. However, due to the small size and morphological similarity of their chromosomes, the conventional measures of the karyotype have produced some inconsistent results, being imperative the development of chromosome-specific markers. These markers are produced by identifying BAC (Bacterial Artificial Chromosome) library clones that harbor single copy sequences, which are used as probes in FISH (Fluorescent in situ Hybridization) assays. In the present work, a yellow passion fruit genomic BAC library of 82.944 clones was constructed, with average insert sizes of 108 kb, and covering six times the genome equivalent. The library has shown a low level of cpDNA and mtDNA contamination (~0.04% and 0%, respectively), and it was possible the isolation of eight clones harboring putative genes of P. edulis f. flavicarpa. These clones were labeled and used as probes in FISH assays. Of these probes, four have shown single hybridization signals, and they were mapped on chromosome 1 (ERS gene), 3 (ACCO gene), and 4 (G3PD and CYCD1 genes). The other probes (LOX, NDID and MIPS gene) revealed subtelomeric or pericentromeric signals, suggesting the presence of repetitive DNA sequences in the clones; the probe harboring the EMB gene did not reveal any hybridization signal. Based on FISH analyses, a new karyotype for the passion fruit was established in the present work, with specific markers in chromosomes 1, 3 and 4; we also mapped 45S rDNA sites in chromosomes 7 and 8, and one 5S rDNA site in chromosome 5. The exploitation of the BAC library, as well as the physical map here established, represents novel and essential advances to guide future researches on the Passilfora genus.

O Passion flower little leaf mosaic virus (PLLMV) foi encontrado causando danos severos em plantios de maracujazeiro (Passilora edulis f. flavicarpa) em dois municípios do Estado da Bahia no ano de 2001. Nesses locais foi constatada que a incidência deste begomovirus estava relacionada à colonização das plantas por Bemisia tabaci, cujo biótipo não foi identificado. Até o momento este vírus não parece constituir grave ameaça a cultura do maracujazeiro, o que aparentemente esta relacionado ao fato de P. edulis f. flavicarpa não ser preferida para a alimentação desse aleyrodídeo. Assim, os objetivos deste trabalho foram: a) selecionar espécies silvestres de Passiflora resistentes a este begomovirus que possam ser úteis em futuro programa de melhoramento genético; b) identificar possíveis hospedeiros alternativos do patógeno entre algumas espécies da vegetação espontânea e cultivadas e c) avaliar se adultos de B. tabaci biótipo B presentes no Estado de São Paulo são capazes de transmitir esse vírus. A reação de espécies silvestres de Passiflora foi avaliada por enxertia em maracujazeiro amarelo infectado que serviu como de fonte de inóculo. As avaliações foram feitas por meio da expressão de sintomas, análise de PCR e teste de recuperação do vírus para maracujazeiro amarelo. As espécies P. alata, P. quadrangularis, P. morifolia, P. serrato-digitata, P. suberosa e P. foetida foram suscetíveis ao PLLMV, enquanto P. caerulea, P. cincinnata, P nitida, P. mucronata e P. giberti se mostraram resistentes a este vírus. No estudo de hospedeiros alternativos, primeiramente o PLLMV foi inoculado mecanicamente nas seguintes espécies vegetais: Capsicum annuum, Chenopodium quinoa, Solanum lycopersicon, S. tuberosum, P. edulis f. flavicarpa, Phaseolus vulgaris, Nicotiana benthamiana e Sida sp.. Somente N. benthamiana foi infectada sistemicamente. Posteriormente foram feitas tentativas de transmissão desse begomovirus por meio de enxertia, usando-se como fonte de inóculo (porta-enxerto), plantas infectadas de N. benthamiana. Foram avaliadas as seguintes espécies vegetais: S. pimpinellifolium, S. lycopersicon, S. tuberosum, N. benthamiana, D. stramonium, C. annuum, N. glutinosa e Sida rhombifolia. O vírus foi transmitido somente para plantas de S. pimpinellifolium. As sucessivas transmissões mecânicas do PLLMV em N. benthamiana permitiram a seleção de uma estirpe fraca e protetora deste begomovirus. B. tabaci biótipo B não foi capaz de transmitir o PLLMV. / The Passion flower little leaf mosaic virus (PLLMV) was found causing severe damage in passion flower (Passilora edulis f. flavicarpa ) orchards in two counties of Bahia state, in 2001. The high incidence of this begomovirus was related to the colonization of plants by Bemisia tabaci, whose biotype was not indentified. To date this virus doesnt seem to be a serious threat to the passion flower cultivation, which apparently is related to the fact that P. edulis f. flavicarpa is not a preferred specie for whitefly feeding. The aim of this work were: a) to select wild species of Passifloraceae resistant to PLLMV, that may be useful in future breeding program; b) to indentify some possible alternative hosts of the pathogen among some weed and cultivaded species and c) to evaluat whether adults of B. tabaci biotype B are capable of transmitting this virus. The reaction of wild species of Passifloracea was evaluated by grafting on infected yellow passion fruit that served as a source of inoculum. The evaluation of these plants were done by means of symptoms, PCR test and biological recovery of the virus to yellow passion fruit. The sepecies P. alata, P. quadrangularis, P. morifolia, P. serrato-digitata, P. suberosa and P. foetida were susceptible to PLLMV, while P. caerulea, P. cincinnata, P nitida, P. mucronata and P. giberti were resistant to this virus. In the study of alternative hosts, at first, PLLMV was mechanically inoculated in the following species: Capsicum annuum, Chenopodium quinoa, Solanum lycopersicon, S. tuberosum, Passiflora edulis f. flavicarpa, Phaseolus vulgaris, Nicotiana benthamiana and Sida sp. Only N. benthamiana was systematically infected. Subsequently, graft transmission of PLLMV was carried out using infected N. benthamiana as source of inoculum (root stock). The following species were evaluated: Solanum pimpinellifolium, S. lycopersicon, S. tuberosum, N. benthamiana, D. stramonium, C. annuum, N. glutinosa and Sida rhombifolia.The virus was transmited only to S. pimpinellifolium. Successive mechanical transmissions of PLLMV in N. benthamiana led to the selection of a mild and protective strain of this begomovirus. B. tabaci biotype B was not able to transmit the PLLMV.

Made available in DSpace on 2017-07-21T18:53:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Flavia Roberta Marenda.pdf: 1506229 bytes, checksum: 7e85c48845e1fc15cca9fa308082955b (MD5) Previous issue date: 2015-02-03 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The passion fruit industrial use reach only 25% of the total fruit and passion fruit peel, representing 50% of the total, are discarded, but can be used in the extraction of pectin. Recent studies indicate that pectin, modified so as native, has antitumor activity. This study aimed to evaluate the cytotoxicity of pectin of passion fruit peel in tumor cell lines. Extraction has been made and the chemical modification of pectin of passion fruit peel, subjected to three different treatments. Both the raw material and pectin were characterized by specific analyzes. The cytotoxicity of untreated pectins, modified autoclaved and autoclaved were evaluated in tumor lines Jurkat, HeLa and HRT-18. The peel of passion fruit represented 54.7% of total fruit. The passion fruit peel flour bleached untreated and shown to be rich in soluble and insoluble fibers. The flour autoclaved pectin showed higher content of phenolic compounds; however, bleached pectin retained more phenolic compounds from the raw material. The modified pectins had a lower degree of methoxylation and lower molecular weight compared to native pectins, confirming the modification process. The best effect Cytotoxicity in Jurkat cells treated with autoclaved pectin modified with IC50 of 2.63 mg mL-1. The calculation of the selectivity index indicated that the modified autoclaved pectin has a low toxicity to healthy cells. In conclusion, the results demonstrate a potential antitumor promising for autoclaved modified pectin, that needs to be further exploited. / O aproveitamento industrial do maracujá atinge apenas 25% do total do fruto e as cascas do maracujá, que representam 50% desse total, são descartadas, mas podem ser utilizadas na extração de pectina. Estudos recentes indicam que a pectina, tanto nativa quanto modificada, apresenta atividade antitumoral. Assim, este trabalho teve por objetivo avaliar a citotoxicidade de pectinas do albedo do maracujá em linhagens tumorais. Foi feita a extração e a modificação química da pectina do albedo de maracujá, submetido a três diferentes tratamentos. Tanto a matéria-prima quanto a pectina foram caracterizadas por análises específicas. A citotoxicidade das pectinas sem tratamento, autoclavada e autoclavada modificada, foram avaliadas em linhagens tumorais Jurkat, HeLa e HRT-18. A casca do maracujá representou 54,7% do total do fruto. As farinhas do albedo do maracujá sem tratamento e branqueada mostraram-se ricas em fibras solúveis e insolúveis. A farinha e a pectina autoclavada apresentaram maior teor de compostos fenólicos; no entanto, a pectina branqueada reteve mais compostos fenólicos provenientes da matéria prima. As pectinas modificadas apresentaram menor grau de metoxilação e menor massa molar, comparada às pectinas nativas, confirmando o processo de modificação. O melhor efeito de citotoxicidade foi obtido em células Jurkat tratadas com pectina autoclavada modificada, com IC50 de 2,63 mg mL-1. O cálculo do Índice de Seletividade (IS) indicou que que a pectina autoclavada modificada apresenta baixa toxicidade para células saudáveis. Em conclusão, os resultados demonstram promissor potencial antitumoral para a pectina autoclavada modificada, que precisa ser melhor explorado.

O Brasil é o principal produtor de maracujá amarelo. Entretanto, a produtividade é baixa, cerca de 1 0.000 t por hectare. A produção de frutos varia com o cultivar, condições climáticas, manejo e outros fatores, principalmente doenças causadas por bactérias e vírus. Metodologias de transformação genética são alternativas modernas para obter plantas resistentes. A proteína derivada de inseto, atacina A atua como bactericida, e tem sido utilizada para conferir resistência a espécies vegetais. Os objetivos do presente estudo foram (i) obter a regeneração de brotos in vitro, (ii) testar a eficiência de agentes seletivos durante o processo organogênico, (iii) construir o cassete contendo o gene atacína A, e (iv) determinar as condições físicas e biológicas para a transformação genética de plantas de maracujá amarelo utilizando o método de biobaiística. Em relação a estudos in vitro, três recipientes de cultura foram avaliados como também diferentes concentrações de benzylaminopurina (BA) e água de coco que foram adicionadas ao meio basal. Phytagei e agar também foram testados como agentes solidificantes. As culturas foram avaliadas quanto à resposta morfogênica dos discos foliares. O gene atacina A foi sequenciado e clonado para receber o promotor CAMV 35S com um enhancer duplicado e o terminador 35S. Este vetor foi denominado pFFatacina. O cassete de expressão foi cionado nos vetores pcambia 1300 e pcambia 2300 que contêm os genes higromicina (hpt) e canamicina (nptll), respectivamente. Discos foliares, assim como segmentos entrenodais e hipocotiledonares que induzem calos, foram usados nos experimentos de biobaiística. A expressão do gene uida foi avaliada para testar os parâmetros de bombardeamento, pressão de gás Hélio (psi) e a distância da tela de retenção até o tecido alvo (cm). A resposta organogênica dos discos foliares não diferiu quando placas de petrí, tubos ou frascos foram usados, embora os tubos (2,4 x 8,5 cm, 30 mi) mostraram uma resposta ligeiramente melhor. O meio MS (Murashige & Skoog, Physiologia Plantarum, 15, 1962) solidificado com agar (0,6%) e suplementado com 0,5 mg/L BA e 5% de água de coco (w/v) provou ser eficiente na indução de organgênese. Brotos foram obtidos após 30 dias. Segmentos entrenodais e hipocotiledonares produziram 300 estruturas semelhantes a gemas por explante. Microscopia de varredura e análises histológicas demonstraram ser estruturas foliares, as quais evoluíram em brotos após 50 dias em Y2 MS. Higromicina a 5 mg/L provou ser um agente seletivo apropdado, inibindo organogênese em 60% dos explantes. Canamicina a 50 mg/L foi também efetiva. Calos morfogênicos de até 10 dias e discos foliares de 3 dias de cultivo mostraram elevados níveis de expressão transiente sob 80016,5 ou 100019,5 (psi de gás Héliolcm de distância de võo dos microprojéteis). Foram realizados experimentos de co-transformação com pB[426 (8,7 kb) que contém o gene npdi e pFFatacina (5,25 kb), como também utilizando-se um único vetor (pcatacina 1300), Freqüência de transformação estável de 0,85% foi obtida. A integração do transgene foi confirmada por PCR para o gene atacina A. Este é o primeiro trabalho que relata a transferência de um gene de interesse para plantas de maracujá amarelo por biobalística. / Brazil is the leading producer of the yellow passion fruit. However, the productivity is fairly low, about 10,000 t per hectare. Fruit yields vary with cultivars, climatic conditions, management and other factors, namely bacterial and virus díseases. Genetic transformation methodologies are modern alternatives to obtain plant resistance. The insectderived protein, attacin A acts as bacterícide, and it has been used to confer resistance to plant species. The objectives of the present study were (i) to obtain in vitro shoot regeneration, (ii) to test the efficiency of certain selective agents during the organogenesis process, (iií) to construct the cassette containing the attacin A gene, and (iv) to determine the physical and biological conditions for genetic transformation of passion fruit plants by using the biolistic approach. Regarding the ín vítro studies, three culture recipients were evaluated as well as different concentrations of benzylaminopurine (BA) and coconut water that suppiemented the basal medium. Phytagei and agar were aiso tested as solidifying agents. Cultures were evaluated with respect to leaf dises morphogenic responses. The attacín A gene was sequenced, and cioned to receive the CAMV 35S promoter with a duplicated enhancer sequence, and the 35S terminator. This vector was denoted pFFatacina. The cassette was cioned in pcambia 1300 and pcambia 2300 vectors that contain the hygromícin (hpt) and kanamycin (nptil) genes, respectively. Leaf discs, as well as internodal segments and hypocotyl-derived sections chosen to índuce calii, were used in the biolistic experiments. The uida gene expression was evaluated for testing bombardment parameters, namely the helium pressure (psi) and the distance from the stopping screen to the target tissue (cm). The organogenic response of the leaf discs did not differ when petri dishes, tubes or culture vesseis were used although the tubes (2,4 x 8,5 cm, 30 ml capacity) showed to be slightly better. The agar (0.6%)-solidifíed MS (Murashige & Skoog, Physíología Plantarum, 15, 1962) medium suppiemented with 0.5 mg/L BA and 5% (wlv) coconut water proved to be efficient to induce organogenesis. Shoots were obtained after 30 days. Internada[ and hypocotyl-derived segments produced 300 bud-like structures per explant. Scanning microscopy and histologícal anaiyses provided evidences that they were leaf structures, which last 50 days in 1/2 MS to evolve into shoots. Hygromicin at 5 mg/L proved to be proper as selective agent, inhibiting organogenesis in 60% of the explants. Kanamycin at 50 mg/L was also effective. Morphogenic calli up to 10 days old and 3 d-leaf discs showed high levels of transient uida gene expression under 80016.5 or 1000/9.5 helium pressureldistance from the stopping screen to the target tissue. Cotransformation experiments with pBI426 (8.7 kb) that contain the nptil gene and pFFatacina (5.25 kb) were carried on as well singre vector transformation tríals (pcatacina 1300). Stable transformation frequency of 0.85% was obtained. Transgene integration was confirmei by PCR for the attacin A gene. This is the first report on agronomicaily useful-gene transfer to yeilow passion fruit plants by biolistics.

O avanço da cultura do maracujazeiro no país impulsionado pela agroindústria de suco e a crescente demanda de fruta fresca, acarretou o surgimento de problemas, principalmente de ordem fitossanitária, doenças causadas por fungos, bactérias e vírus. A espécie Passiflora cincinnata Mast. por apresentar resistência à doença da parte aérea causada pela ba ctéria Xanthomonas campestris f. sp. passiflorae e, potencial para a comercialização constitui um genótipo de interesse em programas de melhoramento. Visto que a cultura de tecidos tem sido ferramenta importante nesses programas, o presente projeto visa o estudo aspectos anatômicos e fisiológicos da organogênese in vitro dessa espécie. Os explantes utilizados: segmentos radiculares, discos foliares e a própria plântula, obtidos da germinação de sementes in vitro, foram inoculados em meio contendo diferentes concentrações de 6-BA (6-benziladenina) e acrescido de 5% de água de coco, a fim de estabelecer os protocolos de regeneração de plantas in vitro. A concentração de 0,5 mg.L -1 de 6-BA foi a mais adequada para os três explantes, porém, o tempo e a via (direta/indireta) de formação da gema diferiu para cada tipo de explante. Os eventos histológicos que levaram a formação de um novo órgão, via meristemóides (centros meristemáticos) foram descritos. Nos discos foliares a origem foi indireta, com formação de calo a partir das células subepidérmicas das camadas de parênquima clorofiliano. Nos segmentos de raiz e nas raízes das plântulas, a organogênese direta apresentou duas origens, a partir do periciclo, nas raízes com início da estrutura secundária, e a partir do câmbio vascular, nas raízes com estrutura secundária já estabelecida. Também nos segmentos de raiz observou-se a via indireta, esta a partir da proliferação do periciclo. / The progress of passionfruit culture in the country stimulated by the juice agroindustry and due to an increased demand of fresh fruit have brought phytosanitary problems, such as, diseases caused by fungis, bacterium and virus. The Passiflora cincinnata Mast. a resistant specie to Xanthomonas campestris f. sp. Passiflora bacterium shows a potential for commercialization creating an interest genotype in breedings programs. Whereas the tissue culture has been an important instrument for those programs, object of this program is to study the anatomical and physiologycal aspects of organogenesis "in vitro" of this specie. The explants used were: root segments, leaf discs and the seedlings obtained from germination of seeds "in vitro". They were placed in different solutions of 6-BA (benzyladenine) and with 5% of coconut water, in order to establish protocol for plant regeneration "in vitro". The concentration of 0,5 mg.L- 1 of 6-BA was the most adequate for all three explants, but the time and nourishement source (direct/indirect) to the shoots formation differed to each kind of explants. The histological events had lead the formation of a new organ, by meristemoids (meristematic centers) were described. In the leaf discs the indirect origin, was observed in which callus were formatted by the layer of chlorophyll parenchyma subepidermis cells. In the root segments and in the root plantets, the direct organogenesis showed two origins (source), from the pericycle, on the roots that starts at the secondary structure and from vascular cambium, on the roots that had already been established secondary structure. Also the root segments was seen by the indirect way, which callus were formatted by the pericycle proliferation.

As sementes de maracujá-amarelo perdem rapidamente o poder germinativo quando são arbitrariamente armazenadas; assim, buscando embasamento para a definição de alternativas tecnológicas voltadas à desaceleração da deterioração durante o armazenamento, o objetivo da pesquisa foi o de estudar, através de variações no teor de água das sementes e na temperatura do ambiente, o comportamento fisiológico de sementes de maracujazeiro. A experimentação, realizada entre julho de 2002 e agosto de 2003 no Laboratório de Análise de Sementes localizado na Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz/ USP, foi conduzida com sementes de maracujá-amarelo (Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Deg.) produzidas em Mogi Mirim/ SP a partir de polinização aleatória entre plantas da Série IAC 270. Após a retirada da mucilagem das sementes, foi determinado o grau de umidade inicial do lote e, paralelamente, obtida a amostra representante do tratamento com o maior teor de água estudado (31%); as sementes remanescentes foram submetidas à secagem, em estufa com circulação de ar a 30°C ± 3°C, para a obtenção dos demais tratamentos referentes aos teores de água desejados (27%, 21%, 17%, 11% e 7%). Posteriormente, os tratamentos, correspondentes aos diferentes graus de umidade, foram armazenados em câmaras com temperaturas controladas de 10°C, 15°C e 20°C. Antes do armazenamento, e após 35, 70, 105, 140, 175, 210, 245, 280, 315 e 350 dias, as sementes foram submetidas às avaliações da qualidade. De acordo com os resultados obtidos, a combinação do grau de umidade de 7% com a temperatura de 10°C supera as demais no favorecimento à manutenção do potencial fisiológico das sementes de Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Deg. / Yellow passion fruit seeds quickly lose the germination capacity when erratically stored; thus, seeding grounds to define technological alternatives to delay deterioration during storage, the goal of this research was to study the physiological behavior of passion fruit (Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Deg.) seeds through varied seed water content and environmental temperature. The experiment was conducted at the Seed Analysis Laboratory of the Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz - USP, from July 2002 through August 2003, with yellow passion fruit seeds produced in Mogi Mirim/ SP, through random pollination among IAC 270 Series plants. Following seed mucilage removal, the initial moisture degree of the lot was determined and the representative sample of the treatment with the highest water content studied (31%) was obtained concurrently; the remaining seeds were dried in na air-circulating oven at 30°C ± 3°C to achieve other treatments regarding the intended water contents (27%, 21%, 17%, 11% and 7%). Further, the treatments - corresponding to different moisture levels - were stored in controlled-temperature chambers at 10°C, 15°C and 20°C. Previous to storage and 35, 70, 105, 140, 175, 210, 245, 280, 315 and 350 days later, the seeds were submited to quality assays. The results indicate that the combination between 7% moisture degree and 10°C temperature overcomes the remaining ones towards favoring the maintenance of the physiological potential of Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Deg. seeds.

Passiflora (Passifloraceae) é um grande gênero de espécies vegetais encontradas, principalmente, na flora tropical. Algumas passifloras são cultivadas como plantas ornamentais, frutíferas ou exploradas pelas suas propriedades medicinais. A principal espécie comercial brasileira, o maracujá-azedo (Passiflora edulis f. flavicarpa, 2n = 18), ocupa 95% da área plantada. Os frutos são consumidos in natura ou processados pela indústria de suco. Estudos genéticos e cromossômicos têm sido gerados para esta espécie. Entretanto, devido ao pequeno tamanho e a similaridade morfológica dos seus cromossomos, as medições do cariótipo convencional do maracujá-azedo têm levado a resultados inconsistentes, sendo necessário o desenvolvimento de marcadores cromossomos-específicos. Estes marcadores são produzidos a partir da identificação de sequências de cópia-única em clones de bibliotecas de BACs (Bacterial Artificial Chromosome), que são utilizadas como sondas em ensaios de FISH (Hibridização in situ Fluorescente). Neste trabalho, foi construída uma biblioteca genômica de maracujá-azedo em BACs contendo 82.944 clones, com tamanho médio dos insertos de 108 kb, e provendo uma cobertura de seis vezes o genoma. A biblioteca apresentou baixa contaminação com cpDNA e mtDNA (~0,04% e 0%, respectivamente), e foi possível o isolamento de oito clones contendo genes putativos de P. edulis f. flavicarpa. Estes clones foram marcados e utilizados como sondas em ensaios de FISH. Destas sondas, quatro apresentaram sinal único de hibridização, e foram mapeadas nos cromossomos 1 (gene ERS), 3 (gene ACCO) e 4 (genes G3PD e CYCD1). As demais sondas (genes LOX, NDID e MIPS) apresentaram sinais de hibridização subteloméricos ou pericentroméricos, indicando a presença de DNA repetitivo nos clones; a sonda contendo o gene EMB não revelou sinal fluorescente. Com base em análises de FISH, definiu-se, no presente trabalho, um novo cariótipo para o maracujá-azedo, com marcadores específicos para os cromossomos 1, 3 e 4, localizando, também, sítios de DNAr 45S nos cromossomos 7 e 8, e um sítio de DNAr 5S no cromossomo 5. A exploração da biblioteca de BAC, bem como o mapa físico aqui estabelecido, representa importantes avanços para guiar pesquisas futuras sobre o gênero Passiflora. / Passiflora (Passifloraceae) is a large genus of plant species essentially found in the tropical flora. Some passiflora are grown as ornamentals, cultivated for their edible fruits, or exploited due to their medicinal properties. The main Brazilian commercial species, the yellow passion fruit (Passiflora edulis f. flavicarpa, 2n = 18) occupies 95% of all planted orchards. The fruits are eaten fresh or used for industrial juice production. Genetic and chromosomal studies have been carried out on the species. However, due to the small size and morphological similarity of their chromosomes, the conventional measures of the karyotype have produced some inconsistent results, being imperative the development of chromosome-specific markers. These markers are produced by identifying BAC (Bacterial Artificial Chromosome) library clones that harbor single copy sequences, which are used as probes in FISH (Fluorescent in situ Hybridization) assays. In the present work, a yellow passion fruit genomic BAC library of 82.944 clones was constructed, with average insert sizes of 108 kb, and covering six times the genome equivalent. The library has shown a low level of cpDNA and mtDNA contamination (~0.04% and 0%, respectively), and it was possible the isolation of eight clones harboring putative genes of P. edulis f. flavicarpa. These clones were labeled and used as probes in FISH assays. Of these probes, four have shown single hybridization signals, and they were mapped on chromosome 1 (ERS gene), 3 (ACCO gene), and 4 (G3PD and CYCD1 genes). The other probes (LOX, NDID and MIPS gene) revealed subtelomeric or pericentromeric signals, suggesting the presence of repetitive DNA sequences in the clones; the probe harboring the EMB gene did not reveal any hybridization signal. Based on FISH analyses, a new karyotype for the passion fruit was established in the present work, with specific markers in chromosomes 1, 3 and 4; we also mapped 45S rDNA sites in chromosomes 7 and 8, and one 5S rDNA site in chromosome 5. The exploitation of the BAC library, as well as the physical map here established, represents novel and essential advances to guide future researches on the Passilfora genus.