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Pathologische Mechanismen der Sensomotorik in verschiedenen Mausmodellen für spinale MuskelatrophieBüttner, Jannik Maximilian 21 February 2024 (has links)
Die Spinalen Muskelatrophie (SMA) ist eine neurodegenerative Krankheit, die durch einen Mangel an Survival Motor Neuron (SMN) Protein verursacht wird. Die vorliegende Dissertation vergleicht drei SMA-Mausmodelle, um festzustellen, ob sich die Pathologien und die zeitliche Abfolge gleichen. Das SMN-Delta7-Modell zeigt umfassende Defekte im motorischen System, einschließlich der Degeneration von Motoneuronen, sowie der Denervierung von spinalen exzitatorischen Synapsen und neuromuskulären Endplatten. Im Gegensatz dazu weist das Taiwanese Modell milde Motoneuron-Pathologien, aber einen frühen Verlust zentraler Synapsen auf. Beim intermediären Smn2B/- Modell treten starke Pathologien in zentralen exzitatorischen Synapsen und Neuromuskulären Endplatten auf, gefolgt von einem späten Absterben der Motoneurone, das p53-abhängig ist. Diese Ereignisse korrelieren mit einer SMN-abhängigen Störung der Splicing-Regulation bestimmter mRNAs. Die Studie liefert eine Wissensgrundlage für zukünftige Untersuchungen und identifiziert die zentrale exzitatorische Synaptopathie als Schlüsselmerkmal der motorischen Pathologie bei SMA.:Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis .................................................................................................. III
Abkürzungsverzeichnis.................................................................................................IV
1 Bibliographische Zusammenfassung............................................................... 1
2 Einführung ......................................................................................................... 2
2.1 Der sensomotorische Schaltkreis im Rückenmark .................................... 2
2.2 Grundlagen der spinalen Muskelatrophie (SMA)....................................... 6
2.3 Mechanismen der Motoneurondegeneration in SMA ................................ 9
2.4 Die Rolle peripherer und zentraler Synapsen in SMA…………………….11
3 Ziele der Arbeit................................................................................................. 16
4 Publikationsmanuskript .................................................................................. 17
5 Zusammenfassung .......................................................................................... 45
6 Literaturverzeichnis………………………………………………………………….50
7 Anlagen ............................................................................................................ 55
7.1 Supplemental Material ............................................................................. 55
7.2 Erklärung über den wissenschaftlichen Beitrag des Promovenden zur
Publikation................................................................................................ 66
7.3 Selbstständigkeitserklärung ..................................................................... 67
7.4 Lebenslauf................................................................................................ 68
7.5 Publikationen............................................................................................ 70
7.6 Danksagung ............................................................................................. 71
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Charakterisierung von Mausmutanten als Modellsysteme für hereditäre ZapfendystropienStieger, Susann 23 November 2011 (has links) (PDF)
Die Zapfenphotorezeptoren (ZPR) sind verantwortlich für das Scharf- und Farbensehen. Ein totaler Funktionsverlust der ZPR, welcher beim Menschen zur Achromatopsie führt, hat eine Degeneration der ZPR zur Folge. Die pathologischen Vorgänge, die zur Degeneration der ZPR führen sind noch nicht restlos entschlüsselt worden. Zur Analyse der ZPR-Degeneration werden Tiermodelle genutzt, wobei bisher nur wenige Tiermodelle vorhanden sind. Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung und Charakterisierung von Mausmodellen, die Mutationen in funktionell bedeutsamen Genen der ZPR tragen. Hierbei handelt es sich entweder um ein weiteres potentielles Kandidatengen für ZPR-Dystrophien, das SLC24A2 Gen, oder um das PDE6C Gen, welches als ursächlich für Achromatopsie identifiziert wurde.
Die Tiere der verschiedenen Mauslinien wurden anhand ihrer Ohrkennung genotypisiert und für die verschiedenen molekularbiologischen Verfahren euthanasiert. Von den Augen wurde entweder das gesamte Auge, das eye cup, oder die Netzhaut weiterverarbeitet. Es wurde eine Methode zur Anrei¬cherung der ZPR mit fluorescence activated cell sorting (FACS) erarbeitet. Des Weiteren kamen Techniken auf der DNA-, RNA- und Protein- Ebene (PCR, RT-PCR, Klonieren, Western blot) sowie histologische und immunhistologische Techniken zur Anwendung. Die Tiere wurden in vivo mithilfe von bildgebenden Verfahren (Scanning Laser Ophthalmology (SLO)) untersucht und funktionell durch die Elektroretinographie (ERG) charakterisiert.
Für diese Studie wurde die Cone-GFP (die grünes fluoreszierendes Protein in den ZPR produziert) Mauslinie zur Entwicklung der ZPR-Anreicherung eingesetzt und analysiert. Die slc24a2ENU-Maus¬mutante wurde extern hergestellt, wobei durch eine ENU-induzierte Mutagenese eine Punktmutation im slc24a2-Gen, welches für den NCKX2 Austauscher kodiert, an Position 1722 (c.1722g>t) gene¬riert wurde. Als weiteres Mausmodell wird die spontan aufgetretene Mausmutante cpfl1 (cone photo¬receptor function loss 1) untersucht, die zwei unterschiedliche Mutationen im pde6c-Gen besitzt. Durch Kreuzen dieser Mauslinien untereinander und mit der Trα -/- Mauslinie (knock-out Mutation der Stäbchen Transducin α-Untereinheit) wurden die Doppelmutanten Linien slc24a2ENUxCone-GFP, slc24a2ENUxTrα-/- und cpfl1xCone-GFP hergestellt und untersucht.
Bei Cone-GFP Mäusen konnten ZPR mittels FACS angereichert und gezielt untersucht werden. In der angereicherten ZPR-Population wurde bei RT-PCR Analysen zum einen nur eine Spleißvariante des NCKX2-Austauschers detektiert, während bei RT-PCR Analysen von ganzen Augen mehrere Spleißvarianten des NCKX2-Austauschers gefunden wurden. Zum Zweiten wurden weitere Mitglie¬der der NCKX-Familie in der angereicherten ZPR-Population (NCKX-1, 4) detektiert.
Bei der slc24a2ENU-Mausmutante konnte die Mutation im slc24a2-Gen sowohl auf DNA- als auch auf RNA- Ebene nachgewiesen werden, jedoch nicht auf Proteinebene. Sowohl bei morphologischen (SLO und Histologie) als auch funktionellen (ERG) Untersuchungen wurden keine Unterschiede zwischen Wildtyp und Mutante in der Retina erkannt. Mithilfe der SLO wurde bei allen Tieren eine verlängerte Persistenz der arteria hyaloidea beobachtet. Das ERG war bei der slc24a2xTrα-/- Dop¬pelmutanten gegenüber der reinen Trα-/- ohne Veränderung. Bei den slc24a2ENUxCone GFP Mäusen und den reinen Cone-GFP Mäusen konnte im Alter von einem Jahr keine Amplitude mehr im ERG gemessen werden. Bei der SLO (bei beiden Doppelmutanten) wurden bei einigen Mäusen autofluo¬reszierende Punkte, so genannte „AF-dots“ beobachtet. Eine Ursache hierfür konnte nicht erbracht werden. Vergleichende genomische DNA-Untersuchungen von Intron 4 des pde6c Gens zwischen der cpfl1-Maus und dem Wildtyp C57Bl/6 zeigten bei der cpfl1-Maus eine im Vorfeld bereits auf RNA-Ebene beschriebene 116bp Insertion als Anteil einer 1522bp großen genomischen Insertion ist. Zusätzlich wurde eine 1bp Deletion im Exon 7 des pde6c Gens bei der cpfl1-Maus detektiert (c.1042delT). Beide Mutationen bedingen eine Verschiebung des Leserasters (frame shift), das wiederum zu einem verfrühten Stopcodon führt (p.E289fsX297 und p.L348fsX362). Vergleichende RT-PCR Untersu¬chungen der pde6c Transkripte zwischen der cpfl1-Maus mit ihrem Parentalstamm BALB/c erbrach¬ten, dass beide die 116bp Insertion tragen. Bei der ERG Untersuchung der cpfl1-Maus (im Alter von drei und sechs Wochen) konnte keine ZPR-Antwort registriert werden. Bei einer vergleichenden SLO-Verlaufsstudie (3., 4., 6. und 8. Lebenswoche) zwischen der Cone-GFP und der Doppelmutanten cpfl1xCone-GFP Maus zeigte sich, dass die Anzahl der ZPR zu Beginn der Studie gleich sind, im weiteren Verlauf bei der Doppelmutante immer stärker abnehmen und mit 8 Wochen nur noch im ventralen Bereich vorhanden sind. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Cone-GFP Maus ein potentiell sehr wichtiges Mausmodell werden kann, um weiterführende Grund-lagenforschung an ZPR zu ermöglichen. Zum einen können ZPR durch FACS angereichert werden und zum anderen ist eine eindeutige und einfache Darstellung der ZPR in vivo durch die SLO-Technik möglich. Jedoch ist es wichtig, den Untersuchungszeitpunkt innerhalb der ersten 2 Monate anzusetzen, da die ZPR der Cone-GFP Maus danach fortschreitend degenerieren. Aufgrund der RT-PCR Untersuchung der NCKX-Familie in der angereicherten ZPR-Population der Cone-GFP Maus konnten weitere Mitglieder der NCKX Austauscher Familie in den ZPR identifiziert werden, wodurch die Aussage, dass der NCKX2-Austauscher die einzige Möglichkeit darstellt, um Ca2+-Ionen aus dem Außensegment der ZPR zu schleusen, relativiert werden muss. Die Slc24a2ENU-Mausmutante zeigt keinen offensichtlichen degenerativen retinalen Phänotyp. Die einzige Besonderheit stellt die sporadisch auftretende persistierende Arteria hyaloidea dar. Der bei einigen doppelmutanten Tieren auftretende retinale Phänotyp, der „AF-dots“-Phänotyp, ist möglich¬erweise auf den Stammhintergrund (C3H) zurückzuführen. Weitere Untersuchungen sind zur Klärung dieser Frage notwendig. Die cpfl1-Maus ist das erste Modell für Achromatopsie, bei dem die Pathologie durch Mutationen im pde6c-Gen ausgelöst wird. Das cpfl1-Allel besitzt zwei unterschiedliche Mutationen, die beide zu einem verfrühten Abbruch der Proteinsynthese führen. Durch RNA-Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die cpfl1-Maus sich nur in der 1 bp Deletion von dem Parentalstamm BALB/c unterscheidet. Jedoch scheinen beide Mutationen einen Anteil an der Herausbildung des Phänotyps der cpfl1-Maus zu haben. Im Rahmen der vergleichenden Verlaufsstudie mit Doppelmutanten cpfl1xCone-GFP wurde als pathologischer Vorgang eine Degeneration und keine Aplasie der ZPR nachgewiesen, da im Alter von 3 Wochen noch eine normale Anzahl an ZPR vorhanden ist.
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The role of Cyclin and CBS Domain Divalent Metal Cation Transport Mediator 2 (CNNM2) in the transepithelial magnesium transportSeker, Murat 18 January 2022 (has links)
Magnesium ist eines der am häufigsten vorkommenden Elemente auf der Erde. Es ist sowohl für niedere als auch für höhere Organismen lebensnotwendig und für die neuronale Übertragung, die kardiale Erregungsleitung und Funktion zahlreicher Enzyme erforderlich. In höheren Organismen wird der Großteil von Mg2+ in der Niere filtriert und reabsorbiert. Störungen in diesem Prozess führen zu verschiedenen genetischen Erkrankungen beim Menschen. CNNM2 (Cyclin und CBS Domain Divalent Metal Cation Transport Mediator 2) wurde als magnesiumresponsives Gen identifiziert, seine genaue Rolle ist jedoch noch unklar. In dieser Arbeit wurden verschiedene Zell- und In-vivo-Modelle verwendet, um die Rolle von CNNM2 zu verstehen. Ich fand heraus, dass CNNM2 hauptsächlich auf der apikalen Oberfläche polarisierter MDCK-Zellen exprimiert wird, was durch Oberflächenbiotinylierungs- und Immunfluoreszenz-Experimente unterstützt wurde. Darüber hinaus wurde ARL15 durch Massenspektrometrie als neuer Interaktionspartner von CNNM2 identifiziert. Ich fand heraus, dass ARL15 die CNNM2-Oberflächenexpression erhhöhte und dessen Monomerisierung bevorteilte. Bei Mäusen führte die Deletion von Cnnm2 zu Fehlbildungen des Gehirns, verringerten Mg2+ -Spiegeln im Serum und perinatalen Letalität. Um die Rolle von CNNM2 in vivo weiter aufzuklären, wurde ein Mausmodell mit gezielter Deletion von Cnnm2 in der Niere unter Verwendung der Ksp-Cadherin-Cre-Linie erstellt, was zu einer teilweisen Verringerung der CNNM2-Spiegel führte. Insgesamt konnte diese Studie unter Verwendung von gentechnisch veränderten Mausmodellen und In-vitro Modellsystemen zum Verständnis der CNNM2-Funktion beitragen. / Magnesium is one of the most abundant elements found on earth. It is vital to both lower and higher organisms and required for neuronal transmission, cardiac conduction, and enzyme function. In higher organisms, the majority of Mg2+ is filtered in the kidney. Disturbances in this process result in various human diseases. CNNM2 (Cyclin and CBS Domain Divalent Metal Cation Transport Mediator 2) was identified as a Mg2+ responsive gene, but its exact role is still uncertain. In this thesis, various cell and in vivo models were utilized to understand the role of CNNM2. I found that CNNM2 is expressed mostly on the apical surface of the polarized MDCK cells which was supported by cell surface biotinylation and immunofluorescence experiments. Furthermore, ARL15 was identified as a novel interaction partner of CNNM2 by mass spectrometry. I found that ARL15 increased CNNM2 surface expression and monomerization. Moreover, deletion of Cnnm2 in mice resulted in brain malformations, reduced serum Mg2+ levels and prenatal death. To further elucidate the role of CNNM2 in vivo, a mouse model with targeted deletion of Cnnm2 in the kidney was generated by using Ksp cadherin-cre line which resulted in a partial reduction in the CNNM2 levels. Overall, this study contributed to the understanding of CNNM2 function by combining genetically engineered mouse models and in vitro models.
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Rolle des NF-kappaB Signalweges in zellulärer Seneszenz und Therapie-EffektivitätJing, Hua 23 September 2013 (has links)
Zelluläre Seneszenz beschreibt einen terminalen Zellzyklus-Arrest. Nach zellulärem Stress u. a. durch aktivierte Onkogene oder DNA-schädigende Chemotherapie wird Seneszenz induziert und kann so zur Tumorsuppression bzw. zum Behandlungserfolg beitragen. Vor kurzem wurde gezeigt, dass der Transkriptionsfaktor NF-kappaB – welcher bisher vor allem durch seine onkogenen Funktionen mit Krebs in Verbindung gebracht wurde - bei der Seneszenz-assoziierten Zytokinausschüttung mitwirkt und den seneszenzten Phänotyp möglicherweise sogar verstärkt, wodurch NF-kappaB potentiell eine tumorsuppressive Rolle zukäme. Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung des NF-kappaB-Signalweges in Seneszenz und Therapie. In der vorliegenden Arbeit zeige ich die deutliche Aktivierung von NF-kappaB nach Therapie-induzierter Seneszenz (therapy-induced senescence, TIS) und erhöhte Expression NF-kappaB-regulierter Zytokine. TIS ist vor allem in vivo mit starker Aktivität des NF-kappaB-Signalweges assoziiert und von selbiger abhängig. Primäre Eµ-myc-transgene Mauslymphome wurden nach ihrer endogenen NF-kappaB-Aktivität klassifiziert bzw. mit inhibierenden und aktivierenden NF-kappaB-Konstrukten modifiziert, welche auch in diffusen großzelligen B-Zell Lymphomen (diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL) als natürlich vorkommende Mutationen gefunden wurden. Über einen neuartigen „Cross-Species“-Vergleich wurden Bcl2-hochexprimierende Keimzentrums-B-Zell-DLBCL (germinal center B-cell type, GCB) als klinisch relevante Gruppe identifiziert, welche nach NF-kappaB-Hyperaktivierung signifikant besser auf Therapie ansprach. Diese Ergebnisse zeigen eine kontextspezifische, d. h. von „onkogenen Netzwerken“ abhängige Rolle des NF-kappaB Signalweges unter Chemotherapie. Diese Information könnte für künftige klinische Studien bedeutsam sein, da sie Bedingungen aufzeigt, unter denen NF-kappaB als Vermittler einer erwünschten Therapie-induzierten Seneszenzantwort eher nicht inhibiert werden sollte. / Cellular senescence is a terminal cell-cycle arrest program that is executed in response to cellular stresses, such as activated oncogenes or DNA-damaging anti-cancer chemotherapy, where it serves as a tumor-suppressive mechanism or contributes to treatment outcome, respectively. Recently, transcription factor NF-kappaB which has long been linked to cancer development primarily through its oncogenic functions, has been postulated to participate in a senescence-associated and possibly senescence-reinforcing cytokine response, thereby suggesting a tumor-restraining role for NF-kappaB. The aim of my PhD project was to understand the role of the NF-kappaB pathway in senescence and cancer treatment outcome. In this thesis, I show markedly elevated NF-kappaB activity upon therapy-induced senescence (TIS), associated with strong upregulation of NF-kappaB-controlled cytokines. TIS is associated with and depends on hyper-activated NF-kappaB signaling. By characterization and genetic engineering of primary mouse lymphomas according to distinct NF-kappaB-related oncogenic networks reminiscent of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) subtypes, Bcl2-overexpressing germinal center B-cell-like (GCB) DLBCL were identified as a clinically relevant subgroup with significantly superior outcome when NF-kappaB is hyperactive. These results demonstrate the context-dependent role of NF-kappaB signaling in cancer therapy and unveil oncogenic scenarios in which NF-kappaB hyperactivity unexpectedly accounts for superior long-term outcome to therapy. This finding has significant ramifications for future clinical trials that aim at inhibiting NF-kappaB activity based on the assumption of its detrimental impact on treatment outcome.
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Charakterisierung von Mausmutanten als Modellsysteme für hereditäre ZapfendystropienStieger, Susann 27 September 2011 (has links)
Die Zapfenphotorezeptoren (ZPR) sind verantwortlich für das Scharf- und Farbensehen. Ein totaler Funktionsverlust der ZPR, welcher beim Menschen zur Achromatopsie führt, hat eine Degeneration der ZPR zur Folge. Die pathologischen Vorgänge, die zur Degeneration der ZPR führen sind noch nicht restlos entschlüsselt worden. Zur Analyse der ZPR-Degeneration werden Tiermodelle genutzt, wobei bisher nur wenige Tiermodelle vorhanden sind. Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung und Charakterisierung von Mausmodellen, die Mutationen in funktionell bedeutsamen Genen der ZPR tragen. Hierbei handelt es sich entweder um ein weiteres potentielles Kandidatengen für ZPR-Dystrophien, das SLC24A2 Gen, oder um das PDE6C Gen, welches als ursächlich für Achromatopsie identifiziert wurde.
Die Tiere der verschiedenen Mauslinien wurden anhand ihrer Ohrkennung genotypisiert und für die verschiedenen molekularbiologischen Verfahren euthanasiert. Von den Augen wurde entweder das gesamte Auge, das eye cup, oder die Netzhaut weiterverarbeitet. Es wurde eine Methode zur Anrei¬cherung der ZPR mit fluorescence activated cell sorting (FACS) erarbeitet. Des Weiteren kamen Techniken auf der DNA-, RNA- und Protein- Ebene (PCR, RT-PCR, Klonieren, Western blot) sowie histologische und immunhistologische Techniken zur Anwendung. Die Tiere wurden in vivo mithilfe von bildgebenden Verfahren (Scanning Laser Ophthalmology (SLO)) untersucht und funktionell durch die Elektroretinographie (ERG) charakterisiert.
Für diese Studie wurde die Cone-GFP (die grünes fluoreszierendes Protein in den ZPR produziert) Mauslinie zur Entwicklung der ZPR-Anreicherung eingesetzt und analysiert. Die slc24a2ENU-Maus¬mutante wurde extern hergestellt, wobei durch eine ENU-induzierte Mutagenese eine Punktmutation im slc24a2-Gen, welches für den NCKX2 Austauscher kodiert, an Position 1722 (c.1722g>t) gene¬riert wurde. Als weiteres Mausmodell wird die spontan aufgetretene Mausmutante cpfl1 (cone photo¬receptor function loss 1) untersucht, die zwei unterschiedliche Mutationen im pde6c-Gen besitzt. Durch Kreuzen dieser Mauslinien untereinander und mit der Trα -/- Mauslinie (knock-out Mutation der Stäbchen Transducin α-Untereinheit) wurden die Doppelmutanten Linien slc24a2ENUxCone-GFP, slc24a2ENUxTrα-/- und cpfl1xCone-GFP hergestellt und untersucht.
Bei Cone-GFP Mäusen konnten ZPR mittels FACS angereichert und gezielt untersucht werden. In der angereicherten ZPR-Population wurde bei RT-PCR Analysen zum einen nur eine Spleißvariante des NCKX2-Austauschers detektiert, während bei RT-PCR Analysen von ganzen Augen mehrere Spleißvarianten des NCKX2-Austauschers gefunden wurden. Zum Zweiten wurden weitere Mitglie¬der der NCKX-Familie in der angereicherten ZPR-Population (NCKX-1, 4) detektiert.
Bei der slc24a2ENU-Mausmutante konnte die Mutation im slc24a2-Gen sowohl auf DNA- als auch auf RNA- Ebene nachgewiesen werden, jedoch nicht auf Proteinebene. Sowohl bei morphologischen (SLO und Histologie) als auch funktionellen (ERG) Untersuchungen wurden keine Unterschiede zwischen Wildtyp und Mutante in der Retina erkannt. Mithilfe der SLO wurde bei allen Tieren eine verlängerte Persistenz der arteria hyaloidea beobachtet. Das ERG war bei der slc24a2xTrα-/- Dop¬pelmutanten gegenüber der reinen Trα-/- ohne Veränderung. Bei den slc24a2ENUxCone GFP Mäusen und den reinen Cone-GFP Mäusen konnte im Alter von einem Jahr keine Amplitude mehr im ERG gemessen werden. Bei der SLO (bei beiden Doppelmutanten) wurden bei einigen Mäusen autofluo¬reszierende Punkte, so genannte „AF-dots“ beobachtet. Eine Ursache hierfür konnte nicht erbracht werden. Vergleichende genomische DNA-Untersuchungen von Intron 4 des pde6c Gens zwischen der cpfl1-Maus und dem Wildtyp C57Bl/6 zeigten bei der cpfl1-Maus eine im Vorfeld bereits auf RNA-Ebene beschriebene 116bp Insertion als Anteil einer 1522bp großen genomischen Insertion ist. Zusätzlich wurde eine 1bp Deletion im Exon 7 des pde6c Gens bei der cpfl1-Maus detektiert (c.1042delT). Beide Mutationen bedingen eine Verschiebung des Leserasters (frame shift), das wiederum zu einem verfrühten Stopcodon führt (p.E289fsX297 und p.L348fsX362). Vergleichende RT-PCR Untersu¬chungen der pde6c Transkripte zwischen der cpfl1-Maus mit ihrem Parentalstamm BALB/c erbrach¬ten, dass beide die 116bp Insertion tragen. Bei der ERG Untersuchung der cpfl1-Maus (im Alter von drei und sechs Wochen) konnte keine ZPR-Antwort registriert werden. Bei einer vergleichenden SLO-Verlaufsstudie (3., 4., 6. und 8. Lebenswoche) zwischen der Cone-GFP und der Doppelmutanten cpfl1xCone-GFP Maus zeigte sich, dass die Anzahl der ZPR zu Beginn der Studie gleich sind, im weiteren Verlauf bei der Doppelmutante immer stärker abnehmen und mit 8 Wochen nur noch im ventralen Bereich vorhanden sind. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Cone-GFP Maus ein potentiell sehr wichtiges Mausmodell werden kann, um weiterführende Grund-lagenforschung an ZPR zu ermöglichen. Zum einen können ZPR durch FACS angereichert werden und zum anderen ist eine eindeutige und einfache Darstellung der ZPR in vivo durch die SLO-Technik möglich. Jedoch ist es wichtig, den Untersuchungszeitpunkt innerhalb der ersten 2 Monate anzusetzen, da die ZPR der Cone-GFP Maus danach fortschreitend degenerieren. Aufgrund der RT-PCR Untersuchung der NCKX-Familie in der angereicherten ZPR-Population der Cone-GFP Maus konnten weitere Mitglieder der NCKX Austauscher Familie in den ZPR identifiziert werden, wodurch die Aussage, dass der NCKX2-Austauscher die einzige Möglichkeit darstellt, um Ca2+-Ionen aus dem Außensegment der ZPR zu schleusen, relativiert werden muss. Die Slc24a2ENU-Mausmutante zeigt keinen offensichtlichen degenerativen retinalen Phänotyp. Die einzige Besonderheit stellt die sporadisch auftretende persistierende Arteria hyaloidea dar. Der bei einigen doppelmutanten Tieren auftretende retinale Phänotyp, der „AF-dots“-Phänotyp, ist möglich¬erweise auf den Stammhintergrund (C3H) zurückzuführen. Weitere Untersuchungen sind zur Klärung dieser Frage notwendig. Die cpfl1-Maus ist das erste Modell für Achromatopsie, bei dem die Pathologie durch Mutationen im pde6c-Gen ausgelöst wird. Das cpfl1-Allel besitzt zwei unterschiedliche Mutationen, die beide zu einem verfrühten Abbruch der Proteinsynthese führen. Durch RNA-Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die cpfl1-Maus sich nur in der 1 bp Deletion von dem Parentalstamm BALB/c unterscheidet. Jedoch scheinen beide Mutationen einen Anteil an der Herausbildung des Phänotyps der cpfl1-Maus zu haben. Im Rahmen der vergleichenden Verlaufsstudie mit Doppelmutanten cpfl1xCone-GFP wurde als pathologischer Vorgang eine Degeneration und keine Aplasie der ZPR nachgewiesen, da im Alter von 3 Wochen noch eine normale Anzahl an ZPR vorhanden ist.
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Studying normal and cancer stem cells in the kidney using 3D organoids and genetic mouse modelsMyszczyszyn, Adam 17 August 2021 (has links)
Organoide aus adulten Mäusen sind vielversprechende Modelle für die Nierenforschung. Ihre Charakterisierung wurde jedoch nicht auf ein zufriedenstellendes Niveau gebracht. Hier habe ich ein langfristiges 3D-Maus-Organoid (Tubuloid)-Modell etabliert und charakterisiert, das die Erneuerung und die Reparatur sowie die Architektur und die Funktionalität der adulten tubulären Epithelien rekapituliert. In der Zukunft wird das Modell detaillierte Untersuchungen der Trajektorien selbsterneuernder Zellen sowohl zur teilweisen Wiederherstellung der Niere als auch zur malignen Transformation der Niere ermöglichen.
Das klarzellige Nierenzellkarzinom (ccRCC) ist der häufigste und aggressivste Nierenkrebs. Die Inaktivierung des Tumorsuppressorgens Von Hippel-Lindau (VHL) ist der Haupttreiber des ccRCCs. Zuvor hatten wir die Hochregulation der Wnt- und Notch-Signalübertragung in den CXCR4+MET+CD44+-Krebsstammzellen (CSC) aus primären humanen ccRCC-Tumoren identifiziert. Das Blockieren von Wnt und Notch in von Patienten stammenden Xenotransplantaten, Organoiden und nicht-anhaftenden Sphären unter Verwendung von niedermolekularen Inhibitoren beeinträchtigte die Selbsterneuerung der CSC und das Tumorwachstum. Um CSC-gesteuertes humanes ccRCC in genetischen Mausmodellen nachzuahmen, begann ich mit der Erzeugung von zwei Doppelmausmutanten; β-Catenin-GOF; Notch-GOF und Vhl-LOF; β-Catenin-GOF. Sowohl die β-Catenin-GOF; Notch-GOF Mausmutante als auch die Vhl-LOF; β-Catenin-GOF Mausmutante entwickelten innerhalb einiger Monate schwere Krankheitssymptome. Überraschenderweise beobachtete ich weder Tumore oder Tumorvorläuferläsionen noch höhere Zellproliferationsraten in den mutierten Nieren. Weitere Analysen ergaben, dass die Mausmutanten Merkmale chronischer Nierenerkrankung (CKD) aufwiesen. / Adult mouse organoids are promising models for kidney research. However, their characterization has not been pushed forward to a satisfying level. Here, I have generated and characterized a long-term 3D mouse organoid (tubuloid) model, which recapitulates renewal and repair, and the architecture and functionality of the adult tubular epithelia. In the future, the model will allow detailed investigations of trajectories of self-renewing cells towards both the partial recreation and malignant transformation of the kidney.
Clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common and aggressive kidney cancer. Inactivation of the Von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene is the major driver of ccRCC. Earlier, we identified the upregulation of Wnt and Notch signaling in CXCR4+MET+CD44+ cancer stem cells (CSCs) from primary human ccRCCs. Blocking Wnt and Notch in patient-derived xenografts, organoids and non-adherent spheres using small-molecule inhibitors impaired self-renewal of CSCs and tumor growth. To mimic CSC-governed human ccRCC in genetic mouse models, I started from the generation of two double mouse mutants; β-catenin-GOF; Notch-GOF and Vhl-LOF; β-catenin-GOF. Surprizingly, I observed neither tumors or tumor precursor lesions nor higher cell proliferation rates in the mutant kidneys. Further analyses revealed that the mutant mice displayed features of chronic kidney disease (CKD). Thus, β-catenin-GOF; Notch-GOF and Vhl-LOF; β-catenin-GOF mouse mutants did not develop kidney tumors under the given experimental conditions.
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Cell type-dependent differential activation of ERK by oncogenic KRAS or BRAF in the mouse intestinal epitheliumBrandt, Raphael 10 March 2023 (has links)
Kolorektale Karzinome (CRC) zeigen eine heterogene Ätiologie. Die Progression prämaligner Vorläufer zu CRC unterscheidet (U) sich in Morphologie, molekularen Veränderungen und Interaktion mit der Tumorumgebung. CRC weisen oft onkogene Mutationen in KRAS und BRAF auf. Diese steigern die MAPK Signalwegaktivität (Mpa). Obwohl sie im selben Signalweg wirken, sind KRAS und BRAF auf die CRC-Entitäten U verteilt. Dabei ist KRAS häufiger im sogenannten konventionellen und BRAF im serratierten Weg zu CRC mutiert. In dieser Studie nutzte ich murine intestinale Organoide (iO), die induzierbare (Ind) KRAS oder BRAF Onkogene exprimieren. Große U zwischen KRAS und BRAF zeigten sich sowohl in Signaltransduktion (ST) als auch im Phänotyp. Phosphoprotein-, ERK-Reporter-, scRNA-Seq und EM-Analysen ergaben eine starke Mpa durch BRAF, die zu hoher Expression von MAPK-Zielgenen und Verlust der epithelialen Integrität führte. iO nach KRAS-Ind blieben intakt, korrelierend mit moderater, zelltypspezifischer (ZS) Mpa in sekretorischen und undifferenzierten Zellen. Die meisten Enterozyten waren Mpa-negativ. ERK-Reporter zeigten: Das ZS Muster der Mpa ist nicht nur gegenüber KRAS, sondern auch dem Entzug von Wachstumsfaktoren stabil. Dies spricht für eine intrinsische, robuste Regulierung der Mpa. BRAF-Ind Mpa setzte die ZS Regulierung der MAPK außer Kraft und schädigte das Gewebe, im Einklang mit einer oberen Grenze tolerabler Mpa. Die ZS Mpa wurde in CRC-Zelllinien bestätigt, deren Mpa durch KRAS aber nicht BRAF U ausfiel. Ferner, nutzte ich iO mit bCatenin+KRAS-Ind, um den konventionellen Weg zu CRC zu modellieren. Die Kombination führte zu synergistischen Effekten, die sich in EGFR-unabhängigem Wachstum und der
Aufhebung der ZS Mpa-Blockade äußerten, die durch eine Verschiebung der Differenzierung zu mehr Progenitorzellen bewirkt wurde. Zusammenfassend konnte ich U in der Mpa durch KRAS oder BRAF im Darmepithel feststellen, was dazu beiträgt, deren Rollen in der CRC-Genese zu bestimmen. / Colorectal cancer (CRC) is a disease with heterogeneous etiology. Premalignant lesions
follow distinct routes of progression to carcinoma reflected by differences in morphology,
molecular alterations and the tumor environment. Mutant KRAS and BRAF are frequent,
leading to MAPK pathway activation (Mpa), which is relevant for CRC therapy. Despite
acting in the same pathway, mutant KRAS and BRAF segregate to different entities, as KRAS
is more frequent in the conventional- and BRAF being specific for the serrated route to
CRC. I used murine intestinal organoids (iO) expressing inducible oncogenic KRAS or BRAF
to study the impact of oncogenes in primary cells. I found marked differences in signal
transduction and phenotype. Phospho-protein, ERK-reporter, scRNA-seq and EM data showed
strong Mpa upon BRAF induction followed by ERK-target gene expression leading to tissue
disruption. In contrast, KRAS left the tissue intact resulting in less and cell
type-dependent Mpa limited to secretory cells, a subset of late-stage enterocytes and
undifferentiated crypt cells. Most enterocytes were irresponsive to KRAS. The pattern of
Mpa was robust towards KRAS or growth factor depletion arguing in favor of intrinsic,
resilient MAPK regulation. In iO, BRAF-induced Mpa could break this cell type-specific
regulation, indicating an upper limit of tolerable Mpa. I validated these findings in CRC
cell lines that differed in Mpa in response to oncogenic KRAS but not BRAF. Finally, I
used iO expressing an inducible form of stabilized bCatenin in combination with KRAS to
mimic events frequently found in the conventional pathway to CRC. Expression of KRAS and
bCatenin synergized in driving EGFR independent growth and breaking the villus-specific
block of Mpa by altering differentiation towards progenitor cell types. In summary, this
study emphasizes differences between Mpa induced by oncogenic KRAS or BRAF which helps
clarifying their nature in different etiological routes to CRC genesis.
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