Orientadores: Maria Julia Marques, Elaine Minatel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T06:25:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Machado_RafaelVentura_M.pdf: 800859 bytes, checksum: 1bb3eb2604bb7183c771d752b2478081 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Neste trabalho foi verificado se o cromoglicato de sódio protege os músculos distróficos de camundongos mdx da necrose. Camundongos mdx (n=8) com 14 dias de vida pós-natal, antes do início dos ciclos de degeneração e regeneração, foram tratados com cromoglicato de sódio (50mg/Kg/dia; intraperitoneal) por 16 dias. Camundongos mdx (n=8) com a mesma idade foram utilizados como grupo controle, recebendo salina pela mesma via e período. A necrose muscular foi quantificada através do marcador azul de Evans (AE), que penetra na fibra muscular somente quando há lesão do sarcolema. Secções do terço médio dos músculos esternomatóideo e tibial anterior foram obtidas para análise em HE e AE. Foram avaliados o número de fibras musculares positivas ao AE, de fibras musculares com núcleo periférico e de fibras com núcleo central. Foram quantificadas as áreas com infiltrado inflamatório exuberante com células no estágio inicial de regeneração muscular (Área Infl/Reg) e áreas com infiltrado inflamatório escasso com células em estágio avançado de regeneração. O cromoglicato de sódio promoveu diminuição significativa da mionecrose (p<0,05; teste t de Student) em ambos músculos e aumento da porcentagem de fibras com núcleo periférico. No músculo tibial anterior, a diminuição da mionecrose foi de 26% e o aumento de fibras com núcleo periférico, 30%. A área de Infl/Reg aumentou em ambos os músculos (p<0,05; teste t de Student). Os resultados mostram que o cromoglicato de sódio, ministrado antes do início dos ciclos de degeneração/regeneração, protege os músculos distróficos da mionecrose e interfere nos estágios iniciais da regeneração / Abstract: In the present study, we verified whether disodium cromoglycate (cromolyn), an anti-allergic drug, could protect dystrophic mdx muscIe fibers ITom degeneration. Treated mdx mice (n=8; 14 days of age) received daily intraperitoneal iDJections of cromolyn at a dose of 50mglkg body weight in saline, during 15 days. Cromolyn treatment started before the cycIes of muscIe degeneration-regeneration had started. Control non-treated mice (n=8 mdx) were injected with na equivalent amount of saline. For visualization of muscle fiber damage, treated (n=5) and non­ treated mdx (n=5) mice were injected with Evans blue dye (EBD), a marker of sarcolemmal lesion. Cryostat cross-sections of t.he stemomastoid (STN) and tibialis anterior (TA) muscles were stained with HE. The whole cross-sectional area of the muscIes was divided into a regenerated area, a.Tl area of inflammatory celI infiltration/regeneration a.Tld an area of regeneration. The number of regenerated muscle fibers (central nucIeated fibers), fibers with peripheral c.ell nuclei and degenerated fibers (positive to EBD) was counted in the regenerated area. The areas of inflammatory cell infiltrationlregeneration and of regeneration were expressed as a percentage of the total transverse graft area. Cromolyn lead to a significant decrease in myonecrosis and in t.he percentage of central nucleated fibers (p<O.O5; Student's t test). The number of fibers with peripheral nuclei increased in about 30% in t.he TA muscle. The area of inflammation-regeneration increased (p<O.O5; Student's t test) in the cromolyn treated group. These results show that cromolyn treatment before the cycles of muscle fiber degeneration­ regeneration started protects dystrophic muscIe fiber ITom myonecrosis and promotes the earlier stages ofmuscle fiber regeneration / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Humberto Santo Neto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T22:18:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oggiam_DaniellaSilva_M.pdf: 1790150 bytes, checksum: f55f529364fdf6fa2bae8c646e2b2d8b (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma miopatia progressiva causada por uma doença autossômica recessiva ligada ao sexo, que acomete crianças do sexo masculino, e evolui para incapacidade motora na puberdade até causar óbito ao redor da segunda década de vida. É causada por uma alteração no gene codificador da proteína distrofina, que mantém a integridade do sarcolema da fibra muscular. O camundongo mdx é utilizado como modelo experimental da DMD para investigações do tecido muscular esquelético e cardíaco, por apresentar muitas semelhanças com humano portador da doença. Na DMD os pacientes iam á óbito por falência respiratória, desde a evolução do tratamento com técnicas de ventilação mecânica artificial, as disfunções cardíacas tornaram-se importantes, visto que a partir disto, a maioria dos óbitos começaram a ser em função da falência cardíaca, que resulta de um processo seguido de: necrose, inflamação, fibrose evoluindo para cardiomiopatia grave. Várias estratégicas farmacológicas tem sido utilizadas para melhora da função cardíaca tanto no portador de DMD como no camundongo mdx. Um dos medicamentos utilizados é o deflazacorte, um glucocorticóide de ação anti-inflamatória, administrado por toda vida do portador de DMD. Embora os efeitos do deflazacorte sobre a função cardíaca no humano e no camundongo mdx têm sido extensivamente estudados, pouco se sabe sobre os efeitos histopatológicos no tecido cardíaco. Neste trabalho foi avaliado o efeito da administração a longo prazo de deflazacorte na progressão da fibrose miocárdica intersticial em camundongos mdx de 6 meses de idade. Os animais foram tratados diariamente com deflazacorte durante 15 meses, após foram sacrificados, o coração foi removido e congelado em nitrogênio líquido para posterior análise histológica e morfológica do tecido. O coração do grupo de camundongos mdx tratados com deflazacorte foi comparado com camundongos mdx não tratados. As áreas de fibrose miocárdica diminuíram significativamente 40% em relação ao grupo não tratado. Concluiu-se que o tratamento à longo prazo com deflazacorte é eficiente para diminuir a progressão da fibrose cardíaca. Sendo assim, como a cardiomiopatia está diretamente relacionada à disfunções celulares que acarreta a necrose dos cardiomiócitos, é de interesse investigar o acúmulo de lipofuscina, um biomarcador do envelhecimento, nos corações de camundongos mdx. Neste trabalho também foi observado o acúmulo de lipofuscina em animais controle C57BL10 e mdx de 14 dias a 23 meses de idade sem serem submetidos a qualquer tratamento. Os animais foram sacrificados, o coração removido e congelado em nitrogênio líquido para posterior análise da fluorescência dos grânulos de lipofuscina. Após contagem dos grânulos observou-se que aumentam com a idade, e dos 4 para os 6 meses ocorreu um acréscimo no acúmulo de lipofuscina. Considerando-se que o acúmulo de lipofuscina relaciona-se a disfunção celular é possível que isto contribua para lesão de cardiomiócitos em corações desprovidos de distrofina / Abstract: The Duchenne Muscle Dystrophy is a progressive myopathy caused by recessive autossomic disease connected to the gender, which attacks male kids, and involves to motor disability in the property, leading to death around the second decade of life. It is caused by an alteration in the codifier gene of the protein dystropin, which maintains the integrity of the muscle fiber sarcolemma. The mdx mouse is used as an experimental model of DMD to investigate the skeletal and cardiac muscle fiber, because it presents a lot of similarities with the human carrier of the disease. In the DMD, the patients used to die due to respiratory failure. Since there was a treatment evolution with artificial mechanical ventilation techniques, the cardiac dysfunctions became important considering that from this moment on, most of the deaths started occurring because of a cardiac failure, resulting of a process followed by necrosis, inflammation, fibrosis involving to a serious cardiomyopathy. Several pharmacological strategies have been used to improve the cardiac function both in the DMD carrier and in the mdx one of the medications utilized is the deflazacort, a glucocorticóide of anti-inflammatory action, administrated during the whole life of the DMD carrier. Although the deflazacort effects upon the cardiac function in the human being and in the mouse mdx have been extensively studied just a little is know about the histopathological effects on the cardiac tissue. In this paper, the effect of the long term administration of deflazacort daily for 15 months, after they were sacrificed, had their hearts removed and frozen in liquid nitrogen for histological and morphological tissue further analysis. The heart of the mdx mice group treated with deflazacort was compared to the heart of the untreated mdx mice group. The myocardial fibrosis areas diminished significantly in comparison to the untreated group, in 40%. It was concluded that the long term treatment with deflazacort is effective to diminish the cardiac fibrosis progression the cardiomyopathy which cause the myocites cardiac necrosis, and therefore it is interesting to investigate the lipofuscin is a pigment related to the age, it is considered an aging biomarker. In this paper, the accumulation of lipofuscin in control animals C57BL10 and mdx with ages between 14 days and 21 months without any treatment was observed that they increase with the age, and from the 4 to the 6 months there was a raise in the lipofuscin accumulation. It was so, concluded, that the myocites cardiac functioning can be harmed even before the age of 8 months, and the accumulation of lipofuscin can mean a degeneration process which is more intensive in mdx / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Maria Julia Marques / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T07:04:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Albuquerque_TerezaCristinaPessoade_M.pdf: 1316775 bytes, checksum: 93039fe90ce98e8b3c47f1e5074f823b (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Em fibras musculares distróficas de camundongos mdx e na distrofia muscular de Duchenne (DMD), a deficiência da distrofina provoca lesão do sarcolema e degeneração muscular. Esta deficiência está associada a alterações na estabilidade do sarcolema e aumento dos níveis intracelulares de cálcio, que podem provocar mionecrose. O mecanismo exato que provoca a lesão da membrana e a mionecrose são desconhecidos. Uma das hipóteses é que a resposta inflamatória endógena pode aumentar a lesão do sarcolema devido à ausência da distrofina. O processo inflamatório está associado com a regeneração muscular e com o reparo tecidual. Antiinflamatórios não-esteróides (AINE) podem reduzir a inflamação que ocorre como conseqüência de lesão muscular através da inibição das ciclo-oxigenases, provocando redução da síntese de prostaglandinas. Estudos anteriores mostraram que houve atraso da regeneração muscular após a utilização de AINE. Neste estudo, foi verificado se os AINE naproxeno e nimesulida reduzem a mionecrose no camundongo mdx, um dos modelos experimentais da DMD. Camundongos mdx (n= 48) com 21 dias de idade receberam injeções intraperitoneais de naproxeno (10 mg/kg de peso corporal) ou de nimesulida (25 mg/kg de peso corporal) durante 15 ou 30 dias consecutivos. Camundongos mdx não tratados receberam injeção intraperitoneal de solução salina. Para a observação e contagem de fibras em degeneração, três animais de cada grupo receberam injeção intraperitoneal de azul de Evans (AE), marcador que indica alterações de permeabilidade do sarcolema. Secções transversais dos músculos esternomastóide (STN) e tibial anterior (TA) foram coradas com hematoxilina-eosina. A secção total transversa foi dividida em área de infiltrado inflamatório, com fibras em estágios iniciais de regeneração (áreas INFL/REG), e áreas com fibras em estágio avançado de regeneração (áreas REG). Estas áreas foram expressas como porcentagens da área seccional transversa total. O número de fibras regeneradas (fibras com núcleo central), fibras com núcleo periférico e fibras em degeneração (positivas ao corante AE) foram quantificadas. O naproxeno mostrou-se mais efetivo que a nimesulida na diminuição da mionecrose, influenciando de maneira diferenciada os ciclos de degeneração/regeneração de músculos distróficos, principalmente quando utilizado nos estágios iniciais destes ciclos. Concluímos que a utilização de inibidores da produção de prostaglandinas não prejudica a regeneração muscular de camundongos mdx, podendo ser uma alternativa para o tratamento de miopatias, especialmente se associada a outros fármacos de ação mais direta na proteção à mionecrose / Abstract: In dystrophin-deficient fibers of mdx mice and in Duchenne muscular dystrophy (DMD), the lack of dystrophin leads to sarcolemma breakdown and muscle degeneration. The lack of dystrophin is associated with changes in membrane stability and increased levels of calcium in the muscle fiber, which leads to myonecrosis. The exact mechanism determining the sarcolemmal lesion and myonecrosis is unknown. One hypothesis is that the endogenous inflammatory response exacerbates the muscle fiber membrane damage due to the lack of dystrophin. Inflammation has also been associated to muscle regeneration and repair. Non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAID) can reduce inflammation following injury by inhibiting cyclooxygenase and leading to a reduction in prostaglandin synthesis. Previous experimental studies have indicated delayed muscle regeneration after NSAID. In this work, we verified the effects of the cyclooxygenase inhibitors, naproxen and nimesulide, on the extent of myofiber necrosis in the mdx mice model of DMD. Mdx mice (n=48) at 21 days after birth received daily intraperitoneal injections of naproxen (10 mg/kg body weight) or nimesulide (25 mg/kg body weight) for 15 or 30 days. Untreated mdx mice were injected with saline. To measure muscle fiber damage, some mice were injected with Evans blue dye (EBD; n=3), a marker of sarcolemmal lesion. Cryostat cross-sections of the sternomastoid (STN) and tibialis anterior (TA) muscles were stained with hematoxylin and eosin. The whole cross-sectional area of the muscles was divided into areas of inflammatory infiltrate with early regenerating fibers (INFL/REG areas) and areas with late regenerated fibers (REG areas). These areas were expressed as a percentage of the total cross-section area. The number of regenerated fibers (central nucleated fibers), fibers with peripheral cell nuclei and degenerated fibers (positive to EBD) was counted. Naproxen was more effective than nimesulide in decreasing myonecrosis. We concluded that the use of prostaglandin inhibitors does not impair muscle regeneration in the mdx mice. They could be useful therapeutic alternatives in the treatment of DMD, but should be accompanied by other strategies directed against muscle degeneration / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

O plexo mioentérico é uma vasta rede de nervos e gânglios localizado entre as camadas longitudinal e circular da túnica muscular externa de todo o trato gastrintestinal (TGI). A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma miopatia ligada ao cromossomo X causada pela ausência da distrofina que, além dos evidentes efeitos degenerativos no músculo esquelético, causa severas alterações do TGI. No entanto as causas dessas alterações não são claras. Pesquisadores demonstraram que a distrofina é expressa nas fibras musculares lisas e também nos neurônios do plexo mioentérico, todavia não existe um consenso sobre o papel desta nessas estruturas. Desta forma pretende-se estudar os componentes do plexo mioentérico do intestino delgado de camundongos mdx (o modelo animal da DMD) nas idades de 4 e 10 semanas e de seus respectivos controles, camundongos C57BL/10. Os animais de ambos os grupos tiveram o intestino delgado retirado e seccionado em segmentos oral, médio e aboral para posterior avaliação através das técnicas histoquímicas de evidenciação neuronal: NADH-d, NADPH-d e AChE. Além disso, a musculatura lisa e os neurônios do plexo mioentérico foram analisados por MET. A análise quantitativa mostrou que o grupo MDX4 apresentou uma área total do intestino delgado significativamente maior que o C4 (p<0,05). Para as técnicas da NADH-d e NADPH-d foi observado um gradiente crescente de densidade numérica neuronal, no sentido oral-aboral, para todos os grupos estudados. O grupo MDX4 apresentou uma densidade neuronal significativamente menor que o C4 (p<0,05), todavia MDX10 e C10 foram iguais. Além disso, a densidade neuronal dos grupos de 10 semanas foi significativamente menor que dos de 4 semanas para ambas as técnicas (p<0,05). Em relação à estimativa do número total de neurônios, MDX10 e C10 apresentaram uma significativa redução de neurônios NADH-d positivos, quando comparada à dos grupos MDX4 e C4 (p<0,05), porém, para os neurônios NADPH-d positivos, a estimativa dos grupos de 10 semanas foi estatisticamente superior que à dos de 4 semanas (p<0,05). O grupo MDX4 apresentou uma área do perfil de neurônios nitrérgicos significativamente maior que o C4 (p<0,05). Na técnica da NADH-d, não foi detectada diferença significativa relativa à esse aspecto. Comparativamente ao grupo C4, os neurônios do grupo MDX4 não apresentaram intensa reatividade a AChE, mas foram iguais em 10 semanas. Referente à ultra-estrutura dos neurônios, esta apresentou-se preservada em todos os grupos, no entanto as fibras musculares lisas do grupo MDX apresentaram alterações morfológicas. / The myenteric plexus is an extensive network of nerve strands and ganglia located between the outer longitudinal and inner circular muscle layers of the external muscle coat of the gastrointestinal tract (GI). Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a X-linked degenerative muscular myopathy caused by the absence of dystrophin which, apart from the obvious degenerative effects in skeletal muscle, causes severe alterations of gastrointestinal (GI) tract. However the causes of these changes remain unclear. Researchers have shown that dystrophin is expressed in both smooth muscle fibers and myenteric plexus neurons, however there is no consensus on the role of it in these structures. Thus, we intend to study the components of the myenteric plexus of the small intestine of mdx mice (an animal model for DMD) at the ages of 4 and 10 weeks and their respective controls, C57BL/10 mice. The animals of both groups had the small intestine removed and sectioned into oral, middle and aboral segments for further evaluation by histochemical techniques of neuronal evidencing: NADH-d, NADPH-d and AChE. In addition, smooth muscle and myenteric plexus neurons were analyzed by TEM. The quantitative analysis showed that the MDX4 group had a significantly higher small intestine total area than the C4 (p <0.05). For the techniques of NADH-d and NADPH-d was observed an increasing gradient of neuronal numerical density, in the oral-aboral direction, for all groups. The MDX4 group showed a significantly lower neuronal density than C4 (p<0.05), however MDX10 and C10 were the same. In addition, the neuronal density of 10 weeks groups was significantly lower than those of 4 weeks for both techniques (p <0.05). Considering the total estimative number of neurons, MDX10 and C10 showed a significant reduction of NADH-d positive neurons, compared to groups MDX4 and C4 (p <0.05), but for the NADPH-d positive neurons, the estimative of 10 weeks groups was statistically higher than that of 4 weeks (p <0.05). The MDX4 group showed an nitrergic neurons profile area significantly higher than the C4 (p <0.05). In the technique of the NADH-d, no significant difference was detected on this aspect. Compared to the C4 group, neurons of MDX4 group did not show intense AChE reactivity, but they were equal in 10 weeks. Concerning the neurons ultrastructure, it was preserved in all groups, however the smooth muscle fibers of MDX group showed morphological changes.

Orientador: Maria Julia Marques / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T10:29:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_CandidaLuizaTonizzade_D.pdf: 7808064 bytes, checksum: e7eb0b2d08d94a0d2baad550d0683e29 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A distrofia muscular de Duchenne é caracterizada pela falta de distrofina, proteína estrutural do sarcolema que promove a sua estabilização. Em ausência de distrofina, ocorre aumento da permeabilidade ao cálcio e conseqüente mionecrose. No camundongo distrófico mdx, os músculos extra-oculares (EOM) não apresentam mionecrose, sendo protegidos da falta de distrofina. Este fato os torna importantes para a maior compreensão dos mecanismos da patogênese da distrofia muscular. No presente trabalho verificamos se alterações nos níveis das proteínas calsequestrina e SERCA1, reguladoras do cálcio, e ?-distroglicana (?-DG), pertencente ao complexo distrofina-glicoproteínas, podem se relacionar a proteção contra a mionecrose dos EOM de animais distróficos. Utilizamos as técnicas de immunoblotting e imunofluorescência e observamos que os EOM de animais distróficos apresentaram aumento significativo no conteúdo das proteínas calsequestrina e SERCA1, bem como aumento significativo da ?-distroglicana. Músculos distróficos não protegidos (tibial, gastrocnêmio, sóleo, esternomastóide e diafragma) apresentaram diminuição no conteúdo destas proteínas em relação aos controles. Não foram observadas alterações na localização da utrofina, decorrente da falta da distrofina. Sugerimos que o aumento da ?-DG nos EOM de animais distróficos possa auxiliar na integridade do sarcolema e, conseqüentemente, na proteção das fibras musculares. Já o aumento das proteínas ligadas ao Ca2+ nos EOM mdx poderia ajudar na rápida remoção do excesso de cálcio, resultando na manutenção da sua homeostase e proteção à mionecrose. Os resultados obtidos nos demais músculos distróficos confirmam que distúrbios no tamponamento do cálcio podem estar envolvidos na distrofia muscular. / Abstract: Duchenne muscular dystrophy is one of the most common hereditary diseases. Abnormal calcium ion handling renders dystrophic muscle fibers more susceptible to necrosis. In the mdx mice, extraocular muscles (EOM) are protected and do not undergo myonecrosis. We investigated whether this protection is related to an increased expression of calcium-binding proteins, which may protect against the elevated calcium levels seen in dystrophic fibers. The expression of SERCA1 and calsequestrin was examined in EOM and in non-spared limb, diaphragm and sternomastoid muscles of control and mdx mice using immunofluorescence and immunoblotting. Dystrophic EOM presented a significant increase in the proteins studied, and a significant increase in ?-dystroglycan expression. These proteins were reduced in the non-spared mdx muscles. The were no changes in utrophin distribution. The increase of Ca2+-handling proteins in dystrophic EOM may permit a better maintenance of calcium homeostasis, with the consequent absence of myonecrosis. The results further support the concept that abnormal Ca2+-handling is involved in dystrophinopaties. / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Maria Julia Marques / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T07:55:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Matsumura_CintiaYuri_D.pdf: 2096053 bytes, checksum: 36802787c48fa671b02e82fdc5d9de40 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Na Distrofia Muscular de Duchene (DMD) e em seu modelo experimental, camundongos mdx, a ausência ou disfunção da proteína distrofina leva a degeneração muscular. Acredita-se que a patogênese da DMD esteja relacionada à fragilidade do sarcolema, ao estresse mecânico e ao maior influxo de íons cálcio na fibra muscular resultante do funcionamento anormal de canais iônicos, como os canais de cálcio ativados por estiramento. O conhecimento das proteínas envolvidas na degeneração/regeneração muscular e na proteção a mionecrose da fibra muscular distrófica é essencial para a caracterização das distrofias musculares, bem como para o estabelecimento de métodos diagnósticos e de tratamentos preventivos ou terapêuticos. No presente trabalho estudamos os mecanismos de proteção a degeneração muscular, sendo dois os objetivos. No primeiro, identificamos proteínas envolvidas na proteção a mionecrose e nos processos de degeneração/regeneração muscular através do estudo proteômico dos músculos afetados ou não pela distrofia muscular em camundongos mdx e em animais controle. No segundo, verificamos a participação dos canais de cálcio ativados por estiramento na degeneração da fibra muscular através do seu bloqueio pela estreptomicina nos diferentes músculos distróficos de mdx. Adicionalmente, verificamos os potenciais efeitos secundários da estreptomicina na estabilidade do sarcolema e no tamponamento e sinalização de cálcio. Quanto ao estudo proteômico, nossos resultados sugerem que a diferença constitutiva dentre músculos afetados e não afetados pela degeneração são fundamentais para proteção a mionecrose, permitindo a manutenção da homeostase de cálcio e melhor resposta ao estresse mecânico e oxidativo. As proteínas galectina-1, anexina A1 e proteína 1 de interação com Reticulon-4 são possíveis biomarcadores para a distrofia muscular, uma vez que participam de diferentes processos celulares. Quanto a terapia farmacológica verificamos que os músculos distróficos mais afetados, como o diafragma, possuem maior quantidade de canais de cálcio ativados por estiramento e a estreptomicina atenuou a degeneração dos músculos distróficos. Diferente do efeito secundário de outros bloqueadores de canais de cálcio, a estreptomicina não alterou as proteínas do complexo distrofina-glicoproteína (beta-distroglicana e alfa-sintrofina), bem como as relacionadas ao cálcio (calsequestrina e calmodulina). Nossos resultados abrem novas perspectivas para o desenvolvimento de terapias farmacológicas relacionadas a proteínas envolvidas na degeneração muscular e na proteção a mionecrose, assim como para o desenvolvimento de métodos diagnóstico e de acompanhamento das distrofinopatias pelos marcadores moleculares / Abstract: In Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) and in the mdx mice model of DMD, the lack of dystrophin leads to muscle degeneration. The pathogenesis of DMD is related to sarcolemmal fragility, mechanical stress and increased influx of calcium in muscle fibers, due to dysfunction of ion channels, such as the stretch-activated calcium channels. The knowledge of the proteins related to muscle degeneration/regeneration and to the protection against myonecrosis is essential to better characterize the muscular dystrophy and to establish new diagnostic tools, in addition to new preventive or therapeutic treatments. In the present study, we addressed new mechanisms of muscle protection by focusing on two main objectives. First, to identify proteins related to the protection agaisnt myonecrosis and to muscle degeneration/regeneration by performing a comparative proteomic study of spared and affected muscles of mdx and control mice. Second, to verify the involvement of stretch-activated calcium channels in dystrophic muscle degeneration by performing a drug therapy with a stretch-activated calcium channels blocker, streptomycin, in muscles that are differently affected by the lack of dystrophin, in the exercised-mdx mice. Furthermore, we were interested to see whether the stretch-activated calcium channels blocker would have additional effects on sarcolemal stability and on calcium buffering and signaling, as previously reported for other calcium channels blockers. The proteomic study suggests that constitutive differences among spared and affected dystrophic muscles are essential for muscle protection agaisnt myonecrosis, allowing a better calcium homeostasis and response to oxidative and mechanical stress. Galectin-1, annexin A1 and the protein interacting with Reticulon-4 are potencial biomarkers for muscular dystrophy, due to their involvement in different cellular processes. The drug therapy study shows that stretch-activated calcium channels participates in dystrophic muscle degeneration, showing higher levels in the mostly affected muscle, the diaphragm. Streptomycin protects the dystrophic muscles against myonecrosis, but has no further effects on other mechanisms of dystrophic muscle protection, i.e., did not improve the dystrophin-glycoprotein complex (assayed by beta-dystroglycan and alpha-syntrofin levels), nor calcium binding protein (assayed by calsequestrin and calmodulin levels). Overall, the present study opens new perspectives for the development of drug therapies to dystrophinopathies by suggesting potential new molecular markers of dystrophy (proteomic study) and by suggesting new mechanistic views to explain the differences in the response of dystrophic muscles to the lack of dystrophin (drug therapy) / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Maria Julia Marques, Selma Maria Michelin Matheus / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T06:49:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DeCarvalho_SamaraCamacari_M.pdf: 1740331 bytes, checksum: ad4bf7c2d274ea63e20314141eeb1e83 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma miopatia progressiva causada pela ausência da proteína distrofina e necrose muscular progressiva. No camundongo mdx, modelo da DMD, a resposta inflamatória é exacerbada e populações distintas de macrófagos, M1 e M2, influenciam a degeneração e regeneração muscular, respectivamente, regulando a progressão da doença. Anti-inflamatórios esteróides são utilizados para a terapia farmacológica da DMD. Contudo, os efeitos colaterais decorrentes do seu uso contínuo estimulam o desenvolvimento de novas terapias farmacológicas para esta doença. No presente trabalho, verificamos os efeitos do ácido eicosapentaenóico (EPA) sobre os macrófagos M1 e M2 nos músculos bíceps braquial (BB), diafragma (DIA) e quadríceps femoral (QDR) do camundongo mdx. Camundongos mdx (14 dias de vida pós-natal) receberam 300mg/Kg de EPA diluído em óleo mineral, via gavagem, diariamente, por 16 dias. Camundongos mdx não tratados e camundongos C57BL/10 não tratados receberam óleo mineral via gavagem, pelo mesmo período. Verificamos que o EPA diminuiu a mionecrose (redução da CK no plasma) e aumentou o número de fibras com núcleo periférico, principalmente no BB e DIA. Em todos os músculos estudados, o tratamento com EPA diminuiu significativamente a área total de inflamação. Nos músculos BB e DIA, o tratamento com EPA aumentou a área de macrófagos M2. No QDR, observou-se predominância de regeneração muscular após o EPA, evidenciada por extensas áreas contendo fibras com núcleo central, em diferentes estágios de regeneração. Estes resultados sugerem que o EPA altera o balanço entre os macrófagos M1 e M2, promovendo diminuição de macrófagos M1, citotóxicos, o que pode contribuir para a proteção contra a mionecrose dos músculos distróficos / Abstract: Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a progressive myopathy characterized by the absence of dystrophin and progressive muscle necrosis. In the mdx mice model of DMD, the inflammatory response is exacerbated and distinct macrophage populations, M1 and M2, influence muscle degeneration and regeneration, respectively, regulating the progression of the disease. Antiinflammatory steroids are the choice pharmacological therapy for DMD. However, their side effects stimulate the development of new drug therapies for this disease. In the present study, we observed the effects of eicosapentaenoic acid (EPA) on M1 and M2 macrophages in the biceps brachii (BB), diaphragm (DIA) and quadriceps (QDR) muscles of the mdx mice. Mdx mice (14 days old) received 300mg/kg of EPA diluted in mineral oil by gavage, daily, for 16 days. Untreated mdx and C57BL/10 mice received mineral oil by gavage for the same period. We observed that EPA decreased myonecrosis (reduced plasma CK) and increased the number of fibers with peripheral nuclei, mainly in the BB and DIA. In all muscles, treatment with EPA significantly decreased the total area of inflammation. In DIA and BB muscles, treatment with EPA increased the area of M2 macrophage. In the QDR, there was a predominance of muscle regeneration after EPA, with extensive areas containing fibers with central nuclei at different stages of regeneration. These results suggest that EPA affects the balance of M1 and M2 macrophages in dystrophic muscles, with a trend towards a decrease in the cytotoxic M1 phenotype, which may contribute to the protection against myonecrosis in the dystrophic muscles / Mestrado / Anatomia / Mestra em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Maria Julia Marques / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T09:08:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Apolinario_LeticiaMontanholi_M.pdf: 1840325 bytes, checksum: aac9928181ab48946d6ed91bfa3a9c50 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma doença recessiva ligada ao cromossomo X. Os glicocorticoides são amplamente utilizados para o tratamento da DMD, entretanto os efeitos colaterais decorrente de seu uso contínuo motivam a busca por novas terapias farmacológicas. Ácidos graxos poli-insaturados têm sido empregados para o tratamento de várias doenças, exercendo seus efeitos através de mecanismos pouco conhecidos... O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked recessive disease that leads to myonecrosis and cardiorespiratory failure. Glucocorticoids are so far the choice treatment for DMD. However their side effects due to continuous use motivate the search for new therapies¿ The complete Abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Anatomia / Mestra em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Humberto Santo Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T21:05:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferretti_Renato_D.pdf: 15919724 bytes, checksum: 2e3e4ba8b562aaaaf3dde85b2e810561 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Os músculos intrínsecos da laringe (MIL) são protegidos da mionecrose em camundongos mdx, modelo da distrofia muscular de Duchenne (DMD). A DMD caracteriza-se pela mionecrose, causada pela ausência da proteína distrofina (DIS). A DIS se une a um complexo glicoproteínas (CDG), que auxilia na estabilidade da fibra e interage com proteínas reguladoras do Ca2+. O sarcolema instável dado pela ausência da DIS, diminuição de proteínas do CDG, desregulação de canais de Ca2+ e leva ao influxo de Ca2+ exacerbado, associado à diminuição da homeostase do Ca2+ intracelular e capacidade do estresse oxidativa, resulta na mionecrose. A utrofina (Utrn), semelhante à proteína DIS, se conecta às proteínas do CDG, parece ter papel na agregação dos receptores de acetilcolina (AChRs) nas junções neuromusculares (JNM) e auxiliaria na proteção da mionecrose. Neste trabalho examinamos os níveis das proteínas do CDG (beta-distroglicana [b-DG], beta-sarcoglicana [b-SG] e alfa-sintrofina [a-SIN]), da Utrn, de canais de estoque do Ca2+ (SOCE; proteínas Orai e STIM1) e proteína relacionada ao estresse oxidativo na mitocôndria (PGC-1a) em MIL distróficos. Além disso, analisamos o padrão de distribuição da Utrn e AChRs nas JNM de MIL distróficos. A análise da b-DG, b-SG, a- SIN e da Utrn pela técnica de imunohistoquímica e western blotting, mostrou que nos MIL distróficos os níveis da b-DG e da Utrn são normais em MIL adultos comparados com controle. Com envelhecimento, os níveis de proteínas do CDG e Utrn são alterados em MIL distróficos e parece não estar relacionado a proteção da mionecrose. Com emprego de técnicas moleculares e bioquímicas para análise de canais de estoque do Ca2+ (Orai e STIM1) e proteína do estress oxidativo na mitocôndria (PGC-1a), foram observados níveis aumentados de STIM1, com similar aumento da proteína calmodulina (CaM), bem como aumento da expressão do PGC-1a em MIL distróficos. Músculos acometidos distróficos apresentaram diminuição na expressão destas proteínas. Utilizando imunohistoquimica e microscopia confocal, foi observado que o padrão de distribuição da Utrn e dos AChRs não se altera nas JNM de MIL mdx. Em fibras regeneradas tanto o padrão de distribuição da Utrn quanto dos AChRs mostraram-se alterados. Pode-se concluir que os MIL de camundongos mdx apresentam manutenção dos níveis normais de proteínas do CDG e da Utrn, bem como o aumento de STIM1, CaM e PGC-1a, poderiam auxiliar, pelo menos em parte, à proteção da mionecrose / Abstract: The intrinsic laryngeal muscles (ILM) are protected from myonecrosis in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy (DMD). The DMD is characterized by myonecrosis, resulting from the absence of dystrophin protein. Dystrophin links the cytoskeleton to a complex of glycoprotein, the dystrophin-glycoprotein complex (DGC), which interacts with Ca2+-dependent channels for signaling and stability of the muscle membrane. In the absence of dystrophin, the sarcolemma becomes instable due to a decrease in the DGC level, deregulation of Ca2+-dependent channels, which increase Ca2+ influx, decreased Ca2+-handling and oxidative stress capacity, that result in muscle fiber necrosis. Utrophin (Utrn), similarly to the dystrophin, conects to DGC proteins, assembles the acethylcoline receptors (AChRs) at the neuromuscular junctions (NMJ) and may play a role in dystrophic muscle sparing. In this study, we examined the levels of DGC proteins (beta-dystroglycan [b-DG], beta-sarcoglycana [b-SG], alpha-syntrophin [a-SIN]), Utrn, store-operated Ca2+ channels (SOCE; STIM1 and Orai1 proteins), and mitochondrial oxidative protein (PGC-1a) in dystrophic ILM. We also examined the distribution of Utrn and AChRs in the dystrophic ILM NMJ. Immunohistochemistry and western blotting analyses of b-DG, b-SG and a-SIN, and the Utrn showed normal levels in adult dystrophic ILM compared with adult control. In aged mice, a dramatic decrease in DGC levels was observed in all dystrophic muscles compared with control. There are age-related alterations in DGC in the ILM of mdx mice, regardless of their protection against the lack of dystrophin. Using biochemical and molecular techniques to analyze SOCE proteins and mitochondrial oxidative protein (PGC-1a), we observed increased levels of STIM1, associated with increased level of calmodulin (CaM), and increased level of PGC-1a in dystrophic ILM. Dystrophic affected muscles have decreased levels of those proteins. Using molecular and biochemical methods we observed that Utrn and AChRs are fragmented only in affected muscle fibers and remaining unchanged in dystrophic MIL. We conclude that in adult dystrophic MIL the rescue of the DGC, increased levels of STIM1, CaM and PGC-1a, may be associated, at least in part, with their protection against myonecrosis / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador : Maria Julia Marques / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T23:03:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mendes_ZarifTorresRehder_M.pdf: 784934 bytes, checksum: dac9ec18f5f84c47d0194a64020fd1d8 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: No presente trabalho estudamos o padrão de distribuição dos receptores de acetilcolina (AChRs) e terminais nervosos em animais C57BL/10, após longo período de regeneração muscular. A degeneração-regeneração muscular foi induzida pelo anestésico local cloridrato de lidocaína no músculo esternomastóideo. Após 90 e 150 dias, os músculos foram retirados e os AChRs e terminais nervosos marcados com rodamina-a-bungarotoxina e anti-neurofilamento, respectivamente e observados através de microscopia de fluorescência confocal. Em todas as junções superficiais da fibra regenerada observada (n=416 junções) os receptores estavam distribuídos em ilhas e a fibra muscular apresentava núcleo central, caracterizando sua regeneração. Os terminais possuíam finas arborizações com dilatações em suas extremidades, situadas no centro das ilhas dos receptores. O padrão de distribuição da acetilcolinesterase foi semelhante ao observado para os AChRs. Nas fibras musculares regeneradas e desnervadas (n=900 junções) os AChRs não estavam distribuídos em ilhas. Esses resultados mostram que os receptores colinérgicos, após longo tempo de regeneração muscular, mantêm o padrão de distribuição em ilhas e o terminal nervoso parece determinar este padrão, provavelmente em consequência de brotamentos intraterminais que ocorrem em presença de regeneração muscular / Abstract: Mdx mice have deficiency of dystrophin and cycles of muscle fiber regeneration. Changes in the distribution of acetylcholine receptors have been reported at the neuromuscular junction of mdx and may be a consequence of muscle fiber regeneration. At the present, we verified whether the distribution of receptors is still altered in long-term regenerated muscle fibers from C57Bl/10 mice. The left sternomastoid muscle of adult mice was injected with 60 µl of lidocaine hydrochloride to induce degeneration-regeneration. Some animals had the STN denervated at the time of lidocaine injection. After 90 and 150 days, receptors were labeled with rhodamine-a-bungarotoxin for confocal observation. For both periods studied, receptors were distributed into clusters. In denervated-regenerated fibers, receptors were distributed as branches, similar to normal denervated muscles. This suggests that nerve-dependent mechanisms are involved in the changes in receptor distribution seen in regenerated muscle fibers, after lidocaine treatment and a similar phenomenon might explain the changes in receptor distribution seen in dystrophic muscle fibers / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural