Orientador: Alexandre Lima de Andrade / Resumo: Avaliaram-se os sinais clínicos oculares da ceratoplastia lamelar, utilizando-se a membrana de biocelulose (MB) embebida em ciprofloxacina em duas espessuras, no tratamento de úlceras de córneas profundas e/ou perfuradas, em cães e gatos, com ceratite ulcerativa com sequestro de córnea. A celulose possui aplicações importantes na engenharia de tecidos, como a reparação e cicatrização de feridas. Os principais exemplos são as aplicações que incluem engenharia de vasos sanguíneos, tecido neural, osso, cartilagem, fígado e tecido adiposo, reconstrução da uretra e dura-máter, reparação de tecido conjuntivo e defeitos cardíacos congênitos, construção de barreiras protetoras e aplicações oftalmológicas, principalmente construção de contato lentes. Os animais foram divididos igualmente em dois grupos, onde um (G-HE) recebeu a membrana hidratada espessa e outro recebeu (G-HD) hidratada delgada. Previamente ao emprego da MB, as mesmas foram recortadas em discos de 3-4mm e adaptadas ao leito das úlceras, utilizando-se sutura não perfurante total, em pontos simples isolados. Instituiram-se, por terapia pós-operatória, colírios à base de ciprofloxacina, diclofenaco sódico, atropina, lubrificante ocular e colar do tipo elizabetano. As causas das úlceras foram, também, tratadas. Avaliaram-se os sinais clínicos oculares no pós-operatório aos 3, 7, 15, 30 e 60 dias. A MB e os pontos de suturas foram removidos ao trigésimo dia. Sinais clínicos como blefarospasmo, presença de secreção ocular, ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Clinical ocular signs of lamellar keratoplasty were evaluated using a two-thickness ciprofloxacin-embedded biocellulose membrane (MB) in the treatment of deep and / or perforated corneal ulcers in dogs and cats with sequestered ulcerative keratitis. of cornea. Cellulose has important applications in tissue engineering, such as wound repair and healing. Top examples are applications that include blood vessel engineering, neural tissue, bone, cartilage, liver and adipose tissue, urethral and dura mater reconstruction, connective tissue repair and congenital heart defects, protective barrier construction and ophthalmic applications, mainly construction of contact lenses. The animals were divided equally into two groups, where one (G-HE) received the thick hydrated membrane and the other received thin hydrated (G-HD). Prior to the use of MB, they were cut in 3-4mm discs and adapted to the ulcer bed, using total nonperforating suture, in isolated single stitches. Postoperative therapy was followed by eye drops based on ciprofloxacin, diclofenac sodium, atropine, eye lubricant and Elizabethan collar. The causes of ulcers were also treated. Postoperative ocular clinical signs were evaluated at 3, 7, 15, 30 and 60 days. MB and suture stitches were removed on day 30. Clinical signs such as blepharospasm, presence of ocular discharge, conjunctival hyperemia, and corneal vascularization were present in both groups until the 15th postoperative day, gradually decreasing over time. No sign... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: João Ruggiero Neto / Banca: Margarete Teresa Gottardo de Almeida / Banca: Mara Corrêa Lelles Nogueira / Banca: Fátima Pereira de Souza / Banca: Fernando Alves de Melo / Resumo: Peptídeos antimicrobianos (PAMs) são componentes do sistema imune inato, que estão presentes na maioria dos organismos vivos cujo interesse é crescente devido à sua potente atividade antimicrobiana contra uma vasta gama de microrganismos, juntamente com a sua baixa toxicidade, em geral, para as células de mamíferos. Esse trabalho teve a finalidade de desenvolver um peptídeo antimicrobiano curto com as mesmas características estruturais do peptídeo Polybia-MP1 (IDWKKLLDAALQIL-NH2) extraído da vespa Polybia paulista que conferem ação antimicrobiana e seletividade, tais como: o posicionamento relativo dos resíduos de aminoácidos carregados, um resíduo ácido na posição N-terminal, a hidrofilicidade e a ampla face polar. Foi idealizado e sintetizado um peptídeo denominado L1A (IDGLKAIWKKVADLLKNT-NH2) e dois análogos com modificações na região do Nterminal; um acetilado (Ac-L1A) e outro com o ácido orto-aminobenzóico (Abz), uma sonda fluorescente extrínseca, ligado covalentemente ao N-terminal, esse peptídeo teve o triptofano substituído por um resíduo de valina (Abz-L1A-W8V). Analisou-se a fluorescência estática e dinâmica do triptofano e do Abz, que apresentaram significante deslocamento quando os peptídeos são adsorvidos em vesículas lipídicas; a supressão da fluorescência por acrilamida mostrou que os fluoróforos em vesículas aniônicas estão menos expostos ao solvente do que em vesículas zwitterionicas. A atividade lítica em vesículas a partir das curvas de doseresposta também reforça que os três peptídeos são mais eficientes em vesículas aniônicas, além disso, que os análogos foram mais eficientes. Estas observações foram compatíveis com o maior teor helicoidal (observado em dinâmica molecular e dicroísmo circular) seus fluoróforos se enterram mais profundamente em vesícula aniônica. Dados de MD e CD demonstraram uma relação entre a estabilidade da hélice e a ausência de carga ... / Abstract: Antimicrobial peptides (AMPs) are components of the innate immune system, which are present in the majority of the living organisms and whose interest is growing due to their potent antimicrobial activity against a broad range of microorganisms, coupled with their usually low toxicity to mammalian cells. In an effort to develop short antimicrobial peptides with the same structural characteristics that imparted selectivity to Polybia-MP1 (IDWKKLLDAALQIL-NH2): the relative positioning of acid and basic residues, an acid residue at the N-terminus, hydrophilicity and the broad polar face. MP1 is a potent antimicrobial, antitumoral and non-hemolytic peptide. We generated a peptide named L1A (IDGLKAIWKKVADLLKNT-NH2) and two analogs with N-terminus modifications; one acetylated (Ac-L1A) and other was extrinsic fluorescent labeled with ortho-aminobenzoic acid (Abz) in which the tryptophan was substituted by valine (Abz-L1A-W8V). We analyzed static and time-resolved fluorescence of tryptophan and ortho-aminobenzoic acid were used and showed significant blue shift when peptides are adsorbed in lipid vesicles and the fluorescence quenching by acrylamide showed that fluorophores in anionic vesicles, are less exposed to the solvent than in neutral vesicles. The lytic activity in vesicles showed from dose-response curves that the three peptides were more efficient in anionic vesicles moreover that the analogs were more efficient. These observations were compatible with the higher helical content (observed in Molecular Dynamics and Circular Dichroism) and deeper burying of the fluorophores in anionic vesicle. MD and CD data demonstrated a relationship between the stability of the helix and the absence of load on the N-terminal. L1A and Ac-L1A presented potent antimicrobial selective against Gram negative bacteria without being hemolyitic while Abz -L1A -W8V was mildly hemolytic / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-09-30Bitstream added on 2014-06-13T20:41:21Z : No. of bitstreams: 1 000735574.pdf: 3666043 bytes, checksum: 92271843c48882539c1edd0ed156eddf (MD5) / Na busca de material biológico alternativo para a realização de implantes, objetivou-se com o presente estudo avaliar comparativamente a implantação do peritônio da paca conservado em glicerina a 98%, uma nova opção de biomaterial e a tela de polipropileno, consagrada prótese sintética na parede abdominal de ratos Wistar. Foram utilizados 60 ratos, machos, da linhagem Wistar pesando entre 150 e 200 gramas organizados nos seguintes grupos experimentais: grupo controle (GI), grupo peritônio conservado em glicerina a 98% (GII) e grupo tela de polipropileno (GIII), cada um com 20 animais. O grupo GII recebeu o enxerto de peritônio da paca conservado em glicerina 98%, o grupo GIII recebeu o enxerto da tela de polipropileno e o grupo GI não recebeu a membrana. Cinco ratos de cada grupo foram submetidos à eutanásia em quatro momentos distintos: sete, 15, 30 e 60 dias de pós-operatórios para avaliações macroscópicas e microscópicas da interface implante-tecido nativo. Em 100% dos animais do grupo GII e GIII houve boa cicatrização da membrana. Na análise histológica, nos animais que receberam o peritônio da paca preservado em glicerina a 98% ficou demonstrada reação inflamatória aguda (M7 e M15), que gradativamente foi desaparecendo e a membrana foi sendo substituída por tecido conjuntivo fibroso (M30 e M60). Nos animais do GIII que receberam a tela de polipropileno verificou-se infiltrado inflamatório com predominância de mononucleares (M7, M15, M30 e M60), que gradativamente foi desaparecendo e a membrana foi sendo substituída por tecido conjuntivo fibroso (M30 e M60). Pode-se concluir que o peritônio da paca conservado em glicerina e a tela de polipropileno, promoveram reforço abdominal satisfatório no reparo de defeito produzido na parede abdominal de ratos / In search of alternative biological material to perform implants, this study aimed to compare the implantation of paca peritoneum preserved in glycerin 98% a new option of biomaterial and polypropylene mesh , consecrated synthetic prosthesis in the abdominal wall of wistar rats. A total of 60 male rats of wistar strain weighting between 150 and 200 grams housed into three diferent experimental groups: control group (GI), peritoneum preserved in glycerin 98% (GII) and polypropylene mesh group, with 20 animals each one. The group GII received the paca peritoneum graft preserved in glycerin 98%, the group GIII received the polypropylene mesh and the group GI did not receive any membrane. Five rats from each group were euthanized at four different times: seven, 15, 30 and 60 days postsurgery to macroscopic and microscopic evaluations in graft-native tissue interface. 100% of the animals of the GII and GIII had good healing of the membrane. On histological examination, the animals that had received the paca peritoneum graft preserved in glycerin 98% , showed inflammatory infiltrates (M7 and M15), wich gradually disappeared and the membrane was replaced by connective tissue (M30 e M60). The animals that received the polypropylene mesh had inflammatory infiltrates with predominance of mononucleares (M7, M15, M30 and M60), wich gradually disappeared and the membrane was being replaced by connective tissue (M30 e M60). It was concluded that the paca peritoneum conserved in glycerin 98% and the polypropylene mesh promote strengthening abdominal quite satisfying in repair induced defect in the abdominal wall of rats

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-09-19Bitstream added on 2015-04-09T12:48:12Z : No. of bitstreams: 1 000809190_20160919.pdf: 563233 bytes, checksum: 7e88ada7742983c9e70b9e7afa9e4627 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-09-19T11:17:03Z: 000809190_20160919.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-19T11:17:39Z : No. of bitstreams: 1 000809190.pdf: 1213447 bytes, checksum: 4f2181a0a93fd547e190acd7930623fe (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Peptídeos antimicrobianos (PAMs) são componentes do sistema imune inato, que estão presentes na maioria dos organismos vivos cujo interesse é crescente devido à sua potente atividade antimicrobiana contra uma vasta gama de microrganismos, juntamente com a sua baixa toxicidade, em geral, para as células de mamíferos. Esse trabalho teve a finalidade de desenvolver um peptídeo antimicrobiano curto com as mesmas características estruturais do peptídeo Polybia-MP1 (IDWKKLLDAALQIL-NH2) extraído da vespa Polybia paulista que conferem ação antimicrobiana e seletividade, tais como: o posicionamento relativo dos resíduos de aminoácidos carregados, um resíduo ácido na posição N-terminal, a hidrofilicidade e a ampla face polar. Foi idealizado e sintetizado um peptídeo denominado L1A (IDGLKAIWKKVADLLKNT-NH2) e dois análogos com modificações na região do Nterminal; um acetilado (Ac-L1A) e outro com o ácido orto-aminobenzóico (Abz), uma sonda fluorescente extrínseca, ligado covalentemente ao N-terminal, esse peptídeo teve o triptofano substituído por um resíduo de valina (Abz-L1A-W8V). Analisou-se a fluorescência estática e dinâmica do triptofano e do Abz, que apresentaram significante deslocamento quando os peptídeos são adsorvidos em vesículas lipídicas; a supressão da fluorescência por acrilamida mostrou que os fluoróforos em vesículas aniônicas estão menos expostos ao solvente do que em vesículas zwitterionicas. A atividade lítica em vesículas a partir das curvas de doseresposta também reforça que os três peptídeos são mais eficientes em vesículas aniônicas, além disso, que os análogos foram mais eficientes. Estas observações foram compatíveis com o maior teor helicoidal (observado em dinâmica molecular e dicroísmo circular) seus fluoróforos se enterram mais profundamente em vesícula aniônica. Dados de MD e CD demonstraram uma relação entre a estabilidade da hélice e a ausência de carga ... / Antimicrobial peptides (AMPs) are components of the innate immune system, which are present in the majority of the living organisms and whose interest is growing due to their potent antimicrobial activity against a broad range of microorganisms, coupled with their usually low toxicity to mammalian cells. In an effort to develop short antimicrobial peptides with the same structural characteristics that imparted selectivity to Polybia-MP1 (IDWKKLLDAALQIL-NH2): the relative positioning of acid and basic residues, an acid residue at the N-terminus, hydrophilicity and the broad polar face. MP1 is a potent antimicrobial, antitumoral and non-hemolytic peptide. We generated a peptide named L1A (IDGLKAIWKKVADLLKNT-NH2) and two analogs with N-terminus modifications; one acetylated (Ac-L1A) and other was extrinsic fluorescent labeled with ortho-aminobenzoic acid (Abz) in which the tryptophan was substituted by valine (Abz-L1A-W8V). We analyzed static and time-resolved fluorescence of tryptophan and ortho-aminobenzoic acid were used and showed significant blue shift when peptides are adsorbed in lipid vesicles and the fluorescence quenching by acrylamide showed that fluorophores in anionic vesicles, are less exposed to the solvent than in neutral vesicles. The lytic activity in vesicles showed from dose-response curves that the three peptides were more efficient in anionic vesicles moreover that the analogs were more efficient. These observations were compatible with the higher helical content (observed in Molecular Dynamics and Circular Dichroism) and deeper burying of the fluorophores in anionic vesicle. MD and CD data demonstrated a relationship between the stability of the helix and the absence of load on the N-terminal. L1A and Ac-L1A presented potent antimicrobial selective against Gram negative bacteria without being hemolyitic while Abz -L1A -W8V was mildly hemolytic

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:33:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-11-28. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:47:56Z : No. of bitstreams: 1 000816123.pdf: 2998420 bytes, checksum: 77b23050109378484ebbbc9798801d55 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Nesta tese de doutorado foram apresentadas duas vertentes de trabalho. A primeira trouxe os resultados referentes à fabricação de filmes finos (nanômetros de espessura) de fosfolipídios utilizando as técnicas Layer-by-layer (dipping e spray) e Langmuir-Blodgett (LB). Os objetivos foram: i) otimizar o crescimento dos filmes finos contendo diferentes arquiteturas moleculares; ii) explorar a eficiência destas diferentes arquiteturas moleculares na detecção de derivados xantênicos em soluções diluídas; iii) investigar a influência de filmes contendo fosfolipídios com matrizes para a imobilização de enzimas na construção de biossensores. Na segunda vertente do trabalho foi abordado o estudo de interação entre o derivado xantênico eritrosina e sistemas miméticos de membrana biológica baseados em filmes de Langmuir e vesículas unilameares gigantes (GUV). Arquiteturas moleculares significativamente distintas foram obtidas dependendo da técnica empregada no crescimento dos filmes (LB, dipping-e spray-LbL). Essas diferentes arquiteturas moleculares mostraram-se fundamentais para a resposta dos sensores e, consequentemente, sobre as discriminações das soluções. Além disso, matrizes formadas por filmes de fosfolipídios demonstraram-se superiores para a imobilização de enzimas na construção de biossensores, possivelmente por apresentar um ambiente biologicamente compatível para a adsorção de biomoléculas. Em termos de interação, o derivado xantênico eritrosina apresentou interações com a membrana lipídica, principalmente quando formada por fosfolipídios insaturados. De particular relevância, os efeitos da oxidação lipídica em GUV, gerados pela foto-ativação do xantênico, foram relacionados a interações entre os oxigênios singletos e as insaturações das cadeias dos fosfolipídios / In this we have present two patheays of work. The first one brought the results of the phospholipid immobilization as thin films (nanometer thickness) by using the Layer-by-Layer (dipping and spray) and Langmuir-Blodgett (LB) techniques. The main goals were to: i) optimize the thin film growth toward different molecular architectures; ii) explore the efficiency of these different molecular architectures to detect xanthenes derivatives in diluted water solutions; iii) investigate the influence of phospholipids matrices for the immobilization of enzymes in the design of biosensors. In the second pathway, we have addressed the interaction study between the xanthene erythrosine and Langmuir films and giant unilamellar vesicles (GUV) as mimetic systems of biological membrane. Significantly different molecular architectures were obtained depending on the technique used in the growth of the films (LB, dipping-and-spray-LbL). These different molecular architectures have shown to be essential for the response of the sensing units and, therefore, to the discrimination of the solutions. In addition, matrices composed by phospholipid films were proved be superior for the immobilization of enzymes in the design of biosensors, possibly due to a more biologically friendly environment to adsorb biomolecules. Interactions were observed between the the xanthene erythorosine and the lipid membrane, especially when composed by unsaturated phospholipids. The effects of lipid oxidation in GUV, generated by the xanthene photo-activation, were assigned to the interaction between singlet oxygen and unsaturations of phospholipid chains

Made available in DSpace on 2015-07-13T12:10:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-08-01. Added 1 bitstream(s) on 2015-07-13T12:25:41Z : No. of bitstreams: 1 000837513.pdf: 748713 bytes, checksum: f6c3f2e57d1d839e2a01a84e58c8b82b (MD5) / Sistemas de liberação de fármacos tornaram-se importantes no campo da farmacologia e da biomedicina, uma vez que podem reduzir a dose terapêutica através da liberação local e evitar possíveis efeitos da droga durante sua passagem pelo organismo. Biomembranas de látex natural extraído da Hevea brasiliensis têm mostrado interessantes resultados na área da biomedicina por apresentarem proteínas que estimulam a angiogênese, acelerararem processos de cicatrização, constituirem próteses e pelo bom desempenho como matriz para liberação de fármacos, extratos vegetais, nanopartículas e proteínas. Este trabalho apresenta a elaboração e a utilização de um novo sistema, dito dinâmico, onde a liberação se dá sob fluido circulante e utilizando biomembranas de látex natural como carreador da liberação. A fim de complementar as propriedades cicatrizantes do látex, foi escolhido o cetoprofeno como modelo de fármaco, devido à sua ação antiinflamatória, analgésica e antipirética, de uso veterinário e humano. As biomembranas foram produzidas misturando látex natural com uma solução de cetoprofeno pelo método de deposição, e secas à temperatura ambiente. Um novo sistema dinâmico para liberação de fármacos com fluxo circulante foi implementado, onde foram comparados resultados de liberações estáticas (sem fluxo) e dinâmicas, em mesmas condições, a fim de se obter a influência do fluxo na liberação. As biomembranas foram caracterizadas por Microscopia Eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) e teste mecânico de tração. Os resultados de MEV mostram a existência de fármaco superficial nas membranas e os resultados de FTIR mostram que não há interação entre o biomaterial e o fármaco, porém o cetoprofeno torna a biomembra mais frágil com a redução do modulo de Young, da porcentagem de alongamento... / Drug delivery systems have become important in the field of pharmacology and biomedicine, as they may reduce the therapeutic dose through the local release, avoiding possible effects during its passage through the body. Biomembranes made of natural latex extracted from Hevea brasiliensis has shown interesting results in biomedicine, by presenting proteins that stimulate angiogenesis, wound healing, constitute prostheses and good performance as a matrix for release of drugs, plant extracts, nanoparticles and proteins. This paper presents the development and use of a new system, said dynamic, where the release occurs from circulating fluid and using natural latex biomembranes as carrier for the releases. In order to supplement its healing properties, ketoprofenwas chosen as model drug because of its anti-inflammatory, analgesic and antipyretic properties, in the veterinary and human use. Biomembranes were produced by mixing natural rubber latex with a ketoprofen solution by the casting, and dried at room temperature. A new dynamic system for drug delivery with circulating flow was implemented and the static (no flow) and dynamic releases were compared in order to obtain the influence of the flow in the release. The biomembranes were characterized by scanning electron microscopy (SEM), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and mechanical testing. The SEM results showed the existence of the drug in the surface membranes. The FTIR results showed that there is no interaction between the drug and biomaterial, although the incorporation of ketoprofen makes the biomembranes more fragile by reducing the Young's modulus, elongation at break and tensile strength, indicating that the drug is only interleaved in the matrix polymer. These results indicate differences between static and dynamic release, since the dynamic released 30% more drug than static. Mathematical modeling showed that the initial release...

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:24:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-01-10. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:48:10Z : No. of bitstreams: 1 000845702_20180120.pdf: 420550 bytes, checksum: c8157ced2528f61f2d07a208c18d603f (MD5) Bitstreams deleted on 2018-01-29T11:44:58Z: 000845702_20180120.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2018-01-29T11:45:45Z : No. of bitstreams: 1 000845702.pdf: 26123214 bytes, checksum: f7fe9f4bcbb4d061d089a48d81ecacc7 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Peptídeos bioativos são de grande interesse como substitutos de antibióticos e quimioterápicos convencionais já que, alguns deles apresentam atividades antimicrobiana, antifúngica e/ou anticâncer. Eles são predominantemente catiônicos e sua atividade tem se mostrado ser modulada por interações eletrostáticas, contribuições hidrofóbicas e por características elásticas da membrana, o seu alvo. O peptídeo mastoparano Polybia MP1 (MP1) possui dois resíduos ácidos (D2 e D8) e três resíduos básicos (K4, K5 and K11), que somados ao C terminal amidado conferem a ele uma carga elétrica líquida relativamente baixa, Q= +2. Nesta tese, foi analisada a importância da sequência de aminoácidos do MP1, da sua carga elétrica líquida e da sua hidrofobicidade média na interação com distintas membranas modelo, já que a presença de resíduos ácidos é rara dentre os peptídeos bioativos e além disto, o MP1 apresenta elevadas atividades antimicrobiana e anticâncer sem ser hemolítico. Para entender a sua especificidade e o seu mecanismo de ação em células bacterianas e de câncer, a atividade e a afinidade do MP1 foi acessada através de espectroscopia de fluorescência e de dicroísmo circular, medidas de potencial eletrocinético e de espalhamento de luz dinâmico e microscopia confocal. Estas técnicas permitiram a observação da estruturação do peptídeo, da sua partição da água para a interface de membranas modelo, da sua atividade lítica e da agregação dos lipossomos devido a sua adição. Assim, foi possível estimar as contribuições energéticas envolvidas no sistema além das dimensões dos danos causados pelo MP1 na superfície da membrana. MP1 mostrou que sua baixa carga elétrica líquida e a presença de dois resíduos ácidos na sua sequência de aminoácidos apresentam um papel importante em modular a sua estruturação e a sua atividade em uma ampla gama de composições lipídicas. Isso é atribuído... / Bioactive peptides are of high interest as substitutes of conventional drugs since some of them present antimicrobial, antifungal and/or anticancer action. They are predominantly cationic and it has been shown that their activity is modulated by electrostatic interactions, hydrophobic contributions and the elastic features of the membranes their target. The mastoparan peptide Polybia MP1 (MP1) possesses two acidic residues (D2 and D8) and three basic ones (K4, K5 and K11), which together with the amidation of the C-terminal confers to it a relatively low net charge Q=+2. In this thesis, we analyzed the importance of the MP1 amino acid sequence, charge and hidrophobicity to the interaction with distinct model membranes, since the presence of acidic residues is a rare characteristic among the bioactive peptides and, beyond this, MP1 presents high antimicrobial and anticancer activities without being hemolytic. In search of understand its specificity and mechanism of action for bacteria and cancer cells, the activity and affinity of MP1 was assessed through circular dichroism and fluorescence spectroscopy, electrophoretic and dynamic light scattering measurements, and confocal microscopy. These techniques allowed the observation of the peptide structuration, the peptide partitioning from water to the model membranes interface, the peptide lytic activity, and the liposome aggregation due to peptide addition. From this, it was possible estimate the energetic contributions involved in the system, besides the dimension of the damages caused by MP1 on the membranes surface. MP1 showed that its low net charge and the presence of two acidic residues play an important role in modulating its structuration and activity in a wide range of lipid compositions, by equilibrating electrostatic and non-electrostatic contributions giving basis to understand its action as bioactive...

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:24:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-16. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:47:13Z : No. of bitstreams: 1 000846885.pdf: 505151 bytes, checksum: ad11474b84c8cf10e34014ace8c2c242 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Peptdeos antimicrobianos possuem em geral cadeias curtas, carga líquida positiva devido ao excesso dos res duos b asicos e são ricos em amino acidos hidrof obicos. Possuem um grande potencial farmacológico, com atividade antimicrobiana modulada por interações eletrost aticas e hidrof obicas. Neste trabalho utilizou-se o pept deo sintético L1A (IDGLKAIWKKV ADLLKNT NH2), que devido aos res duos de acido asp artico e lisinas constituintes de sua cadeia, possui carga liquida +3, em pH neutro. Foram analisadas as insuficiências do pH e da carga de ves culas aniônicas na adsorçãao do pept deo. Este estudo utilizou medidas de potencial eletrocin etico de ves culas e experimentos de titulação monitorados por dicro smo circular (CD). A adsorção do L1A a LUVs de POPC e misturas POPC/POPG em diferentes proporções de POPG, foi medida nos pHs 4, 7 e 10. Os espectros de dicro smo circular dos peptídeos, na presença de vesícula, apresentaram caracter sticas de estruturas helicoidais, enquanto apresentaram estruturas desordenadas em tampão. As frações de hélices obtidas são maiores quando o pept deo adsorve em ves culas com maiores quantidades de POPG, indicando forte contribuição eletrost atica. As constantes aparentes de adsorção dos pept deos as membranas modelo foram calculadas atrav es da elipticidade de CD normalizada em 222 nm, obtidas por titulações de pept deo com ves culas. A a - nidade do pept deo a ves culas aniônicas e signi cativamente maior do que a ves culas zwitteriônicas, o que refor ca a import ancia das interçõeoes eletrost aticas no processo de adsorção do pept deo na bicamada. O efeito conjunto de carga das ves culas e de pH resultaram em signi cativa regulação de carga do pept deo resultando em valores de carga efetiva alta em pH 4,0 devido a protonação dos res duos de asp artico. Em pH 10,0 a pequena carga efetiva calculada deve-se as desprotona ações do N-terminal e das lisinas... / Antimicrobial peptides have in general short chains, positive net charge due to the excess of basic residues and are rich in hydrophobic amino acids. They have pharmacological potential as antimicrobial agents and their activity is modulated by electrostatic and hydrophobic interactions. In this work, we used the synthetic peptide L1A (IDGLKAIWKKV ADLLKNT NH2) that due to its acid and basic residues have an net charge +3, at neutral pH. The e ects of the pH and of the charges of anionic vesicles on the adsorption of L1A were analized. This study used measurement of electrokinetic potential of vesicles and titration experiments monitored by circular dichroism spectroscopy (CD). Adsorption of L1A to POPC and POPC/POPG LUVs in di erent POPG contents were assessed in the pH 4.0, 7.0 and 10.0. Circular dichroism spectra of the peptides in the presence of vesicles showed to features of helical structures; while random coil structures were observed at bu er for all the used pHs. The helical content was evaluated and showed to increase when the peptide adsorbs into vesicles with increasing amounts of POPG, indicating that there is a strong electrostatic contribution. Partition coe cients were calculated through the normalized CD ellipticities at 222 nm and showed that the a nity of the peptide for anionic model membranes is e ectively higher than those found for zwitterionic ones. It reinforces the importance of the electrostatic contribution to the process of peptide-lipid interaction. The coupled e ect of the vesicle charge and pH lead to signi cant charge regulation of the peptide resulting in high values of e ective charge at pH 4.0 due to the deprotonation of aspartic acid residues. At pH 10.0 the estimated e ective charge is small as a consequence of the deprotonation of both N-terminus and the lysines. The electrostatic and interfatial free energies seems to be additive only at pH 4.0, especially for the bilayers with higher content...

Made available in DSpace on 2014-08-27T14:36:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-16Bitstream added on 2014-08-27T15:57:03Z : No. of bitstreams: 1 000780416.pdf: 1903514 bytes, checksum: 03a551a777f464409ad2b066766feffa (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Este trabalho desenvolve uma investigação teórica sobre o gradiente de pH em uma região delimitada por duas membranas que se ionizam em equilíbrio com uma solução eletrolítica. O objetivo foi de aplicar esta teoria para o espaço intermembranar da mitocôndria, investigando uma possível relação entre a ionização dos fosfolipídeos que constituem estas membranas e o controle de pH . O modelo utiliza a aproximação de campo médio, resolvendo-se a equação de Poisson-Boltzmann para um sistema composto por dois planos infinitos, fixos e separados por uma distância L. A densidade superficial de carga em cada plano é função da ionização dos grupos que o compõem e, portanto, dependente do equilíbrio químico com a solução circundante. Dois sistemas foram considerados, o primeiro com a solução contendo apenas os contraíons provenientes da ionização e o segundo contendo, uma solução eletrolítica, além dos contraíons. Foram analisados o potencial eletrostático médio e o pH em função da distância, variando-se a concentração de sal e a área disponível por molécula ionizável. O comportamento resultante mostra que a ionização contribui para manter o valor do pH estável nas vizinhanças da membrana. Assim, o gradiente de pH no espaço intermembranar da mitocôndria pode estar associado à ionização das moléculas que a compõem / This work develops a theoretical model to investigate the pH gradient in a region bounded by two phospholipid bilayers that ionize in equilibrium with an electrolytic solution. The objective was to apply this theoretical model to the mitochondrial intermembrane space by investigating a possible relationship between the ionization of the phospholipids of the membrane and the pH control. The theoretical model was based on a mean field approximation. The Poisson – Boltzmann equation was solved for a system composed by two infinite planes separated by a distance L. The surface charge density in each plane is a function of the ionization of their ionizing groups and therefore dependent on the chemical equilibrium with the surrounding solution. Two systems were considered, the first takes into account only the counterions from the ionization. The second takes into account also the presence of an electrolyte besides the counterions. For these two systems the mean electrostatic potential and the pH were analyzed as a function of the distance from the charged planes for different values of both the added salt concentration and the cross section of the ionizable groups. The results obtained evidence that the ionization contributes to maintain the pH value stable near the membranes. These results suggest that the pH gradient in the mitochondrial intermembrane space is likely to be associated to the ionization of the phospholipid molecules

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseRSL.pdf: 1529127 bytes, checksum: d548f8e67f0f40c6a182f89594e5db50 (MD5) Previous issue date: 2004-09-15 / Universidade Federal de Minas Gerais / ACL myotoxin (ACLMT) is a Lys49 phospholipase A2-like protein isolated from the venom of the snake Agkistrodon contortrix laticinctus. The aim of this work was to study the effect of ACLMT on water transport in the toad urinary bladder. Water flow through the membrane was measured gravimetrically in bag preparations of the bladder. ACLMT increased the baseline water flow and partially inhibited the water permeability stimulated by arginine-vasopressin (AVP), cyclic AMP, 8-chlorophenylthio-cAMP and forskolin. The effect of ACLMT on baseline water flow was prevented by lanthanum, nifedipine, and trifluoperazine. These results suggest that the effect of ACLMT on baseline water flow could be mediated either by an increase in intracellular calcium or by the activation of the calcium-calmodulin. Colchicine reduced the effect of ACLMT on baseline water permeability. Carbachol has been shown to enhance baseline water flow while inhibiting AVP-stimulated water flow by increase in intracellular calcium. The effects of ACLMT and carbachol on baseline and AVP-stimulated water flow were not additive, suggesting that both agents alter the water transport by a similar mechanism. Lanthanum reduced the inhibitory effect of ACLMT on AVP-stimulated water permeability, suggesting the participation of intracellular calcium in this effect. Indomethacin reduced the effect of ACLMT on forskolinstimulated water flow, suggesting a role for prostaglandin in the effect of ACLMT on AVP-stimulated water permeability. However, the inhibitory effect of ACLMT on AVP-stimulated water flow was enhanced in the presence of trifluoperazine. Similarly, the inhibitory effect of ACLMT on AVP and cAMP-stimulated water flow was enhanced in the presence of colchicine. Therefore, the results of present study suggest that the effects of ACLMT on water permeability could be mediated either by an increase in intracellular calcium or by the activation of the calciumcalmodulin, and also suggests a role additional for prostaglandin in effect of ACLMT on AVP-stimulated water transport. In addition, the effect of ACLMT on water transport seems be dependent of integrity of microtubules. / ACL miotoxina (ACLMT) é uma fosfolipase A2 miotóxica com um resíduo de lisina na posição 49, isolada do veneno da serpente Agkistrodon contortrix laticinctus. O objetivo do presente trabalho foi estudar o efeito da ACLMT sobre o transporte de água em bexiga de sapo. O fluxo de água através da membrana foi mensurado gravimetricamente por meio da técnica de Bentley (1958), em preparações com a bexiga em forma de lobos. A ACLMT aumentou o fluxo basal de água e diminuiu parcialmente o fluxo de água estimulado pela vasopressina, AMP cíclico, 8-clorofeniltiomonofosfato de adenosina cíclico e forscolina. O efeito da ACLMT sobre o fluxo basal de água foi reduzido na presença de lanthanum, nifedipina e trifluoperazina, sugerindo um papel para o cálcio citossólico e para o complexo cálcio-calmodulina nesse efeito. A colchicina também diminuiu o efeito da ACLMT sobre o fluxo basal de água, sugerindo que a ação da ACLMT é dependente da integridade dos microtúbulos. O lantânio reduziu o efeito inibitório da ACLMT sobre a ação hidrosmótica da vasopressina, sugerindo um papel para o cálcio citossólico nesse efeito. O carbacol é capaz de aumentar o fluxo basal de água e diminuir o fluxo de água estimulado pela vasopressina por meio de um aumento da concentração do cálcio intracelular. Os efeitos da ACLMT e do carbacol sobre o transporte de água não foram aditivos, sugerindo que esses agentes alteram a permeabilidade da membrana por um mecanismo similar. A indometacina reduziu o efeito da ACLMT sobre o fluxo de água estimulado pela forscolina, sugerindo um papel adicional para as prostaglandinas no efeito da ACLMT sobre a ação da vasopressina. Por outro lado, o efeito inibitório da ACLMT sobre a ação hidrosmótica da vasopressina foi potencializado na presença de trifluoperazina. Similarmente, o efeito inibitório da ACLMT sobre a ação hidrosmótica da vasopressina e do AMP cíclico foi potencializado na presença da colchicina. Nossos resultados sugerem que o efeito da ACLMT sobre o transporte de água pode ser mediado pelo aumento no cálcio intracelular e pela ativação do complexo cálcio-calmodulina, sugerindo também um papel adicional para as prostaglandinas no efeito da ACLMT sobre a ação hidrosmótica da vasopressina. Além disso, o efeito da ACLMT sobre o transporte de água parece ser dependente da integridade dos microtúbulos.