Orientador: Jackson Antônio Marcondes de Souza / Banca: Alessandro de Mello Varani / Banca: Maria de Lourdes Teixeira de Moraes Polizeli / Resumo: Indústrias e governos buscam pela obtenção de biocombustível celulósico, entretanto a desconstrução do arranjo lignocelulósico para obtenção de açúcares livres de forma eficiente e economicamente viável ainda é um grande desafio. Avanços conquistados através da metagenômica ressaltam sua aplicação como alternativa para compreender e desvendar o grande potencial metabólico presente nos ambientes a fim de superar tais desafios. Contudo, ainda são poucos os trabalhos voltados à cana-de-açúcar. O solo trata-se da maior fonte microbiana de todo o planeta, sendo essa biodiversidade ainda desconhecida, esta comunidade microbiana fornece um ponto de partida para a exploração de novas enzimas responsáveis para a degradação de biomassa vegetal. Este trabalho buscou acessar o panorama do perfil taxonômico e funcional do metagenoma da comunidade microbiana presente em solo sob cultivo de cana-de-açúcar contendo palhada sobre o mesmo, possuindo como foco enzimas envolvidas na hidrólise de materiais lignocelulóscicos. Os dados encontrados demonstraram uma variedade de famílias enzimáticas envolvidas na degradação do complexo lignocelulósico. Verificou-se a presença de 27 famílias de Glycoside Hydrolases (GH), 21 famílias de Carbohydrate-Binding Module (CBM), 11 famílias de Carbohydrate Esterases (CE) e 4 famílias de Auxiliary Activities (AA). Os filos mais abundantes neste ambiente foram Proteobacteria e Actinobacteria, possuindo o último reconhecida importância industrial dadas suas enzim... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Industries and governments seek for obtaining cellulosic biofuel, but the deconstruction of lignocellulosic arrangement to obtain free sugars efficiently and economically viable is still a big challenge. Advances made by metagenomics emphasize their application as an alternative to understand and unravel the great metabolic potential present in the environment in order to overcome such challenges. However, there are few studies related to sugarcane. The soil is the largest source of microbial whole planet, and its biodiversity still unknown, this microbial community provides a starting point for the exploration of new enzymes responsible for the degradation of plant biomass. This study aimed to access the overview of taxonomic and functional profile of the metagenome of soil under sugarcane cultivation containing straw on it, having focused on enzymes involved in the hydrolysis of lignocellulosic materials. The soil metagenome under sugarcane cultivation showed a variety of enzyme families involved in the degradation of the lignocellulosic complex. The presence of 27 Glycoside Hydrolases (GH) families, 21 Carbohydrate-Binding Module (CBM) families, 11 Carbohydrate Esterases (CE) families and 4 Auxiliary Activities (AA) families has been verified. Proteobacteria and Actinobacteria were the abundest phyla in this environment, which the last has recognized industrial importance given their enzymes with resistence to changes in pH and temperature. Such microbial community showed ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2017-02-16T18:12:51Z No. of bitstreams: 1 PDF - Bruna Regina dos Santos Silva.pdf: 4083927 bytes, checksum: f31770fedd1b2c616664828556da3d87 (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2017-03-07T16:47:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Bruna Regina dos Santos Silva.pdf: 4083927 bytes, checksum: f31770fedd1b2c616664828556da3d87 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-07T16:47:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Bruna Regina dos Santos Silva.pdf: 4083927 bytes, checksum: f31770fedd1b2c616664828556da3d87 (MD5) Previous issue date: 2017-02-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Red rice is practically unknown by most Brazilians, but in Paraíba as in other Northeastern states, it is highly cultivated and has great socioeconomic importance, cultivated mainly by small farmers. In agricultural activity, large quantities of cellulolytic materials are generated. This material is degraded by cellulolytic microorganisms, which hydrolyze and metabolise cellulose efficiently. There is a great commitment to the development of renewable alternatives to fossil fuels and one of these alternatives is second generation ethanol production, using enzymatic hydrolysis in vegetable biomass derivatives and subsequent fermentation. Microorganisms exhibit immense genetic diversity and play a variety of roles in maintaining ecosystems. One of these functions is the production of extracellular enzymes, which help in the degradation of organic matter. Cellulase is an enzyme that hydrolyzes cellulose by breaking the β-1,4 linkage. In the search for new non- cultured microorganisms, metagenomics appears as a tool that isolates DNA from environmental sources to identify enzymes with biotechnological potential. In this work, a gene encoding an endoglucanase was cloned from red rice culture residues using the metagenomic strategy. The amino acid identity between this gene and its nearest published congeners is less than 70%. The gene found has potential for use in the production of ethanol from cellulosic biomass (second generation ethanol). / O arroz vermelho é praticamente desconhecido pela maioria dos brasileiros, mas na Paraíba assim como em outros estados do Nordeste, é bastante cultivado por pequenos agricultores, apresentando uma grande importância socioeconômica. Na atividade agrícola, grandes quantidades de materiais celulolíticos são gerados. Esse material é degradado por microrganismos celulolíticos, que hidrolisam e metabolizam a celulose de forma eficiente. Existe um grande empenho para o desenvolvimento de alternativas renováveis aos combustíveis fósseis e uma dessas alternativas é a produção etanol de segunda geração, utilizando a hidrólise enzimática em derivados de biomassa vegetal e sua posterior fermentação. Os microrganismos apresentam uma imensa diversidade genética e desempenham vária funções na manutenção de ecossistemas. Uma dessas funções é a produção de enzimas extracelulares, que ajudam na degradação da matéria orgânica. A celulase é uma enzima que hidrolisa a celulose por meio da quebra da ligação β-1,4. Na busca por novos microrganismos não-cultivados, a metagenômica surge como uma ferramenta que isola o DNA a partir de fontes ambientais para identificar enzimas com potencial biotecnológico. Neste trabalho, um gene que codifica uma endoglucanase foi clonado a partir de resíduos de cultura do arroz vermelho utilizando a estratégia metagenômica. A identidade de aminoácidos entre este gene e os seus congêneres mais próximos publicado é inferior a 70%. O gene encontrado possui potencial para uso na produção de etanol a partir de biomassa celulósica (segunda etanol geração).

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-11-28T14:07:58Z No. of bitstreams: 1 Michelle Barros Pantoja.pdf: 1641953 bytes, checksum: 3ccb5972f0e3ceb3779eebd3c7ee502f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-28T14:07:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Michelle Barros Pantoja.pdf: 1641953 bytes, checksum: 3ccb5972f0e3ceb3779eebd3c7ee502f (MD5) Previous issue date: 2015-02-26 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The peanut (Arachis hypogaea) is an oleaginous plant belonging to the Fabaceae family, native to South America. Its kernels are widely used as a food source and the production of oil. The main producing countries are China, India and the United States, which occupy the 1st, 2nd and 3rd places, respectively, in the ranking of world production. Brazil occupies the 17th position, in which the State of São Paulo stands out with 95% of total production of the country. The peanut is infected by several virus species, which limit the development of the crop in different parts of the world. The objective of this study was to detect the presence of virus in peanut plants in 10 counties of the State of São Paulo. Thirty-five samples (s) from 18 fields (f) were analyzed from Santa Adélia (3f/6s), Lusitânia (1f/1s), Jaboticabal (3f/6s), Itápolis e Pindorama (1f/2s, each), Tupã (4f/8s), Rancharia e Marília (1f/2s, each), Guaimbê (2f/4s) and Guarantã (1f/2s). The maintenance of the virus isolates was done in peanut plants graft inoculated. The isolates were submitted to biological, serological e molecular analyses. For host range study, Lactuca sativa, Capisicum annuum, C. annuum var. 679, C. annuum var. Ikeda, Chenopodium amaranticolor, C. quinoa, Datura stramonium, Gomphrena globosa, Nicotiniana tabacum, N. benthamiana, N. rustica, N. glutinosa, Physalis floridana and Solanum sculentum were mechanically inoculated and the symptoms analyzed. Based on Dot-ELISA results, the presence of the tospoviruses Groundnut ringspot virus (GRSV) (16s), Tomato chlorotic spot virus (TCSV) (6s) and do Tomato spotted wilt virus (TSWV) (3s) was detected. The comparison of the sequence obtained in the RT-PCR test with those deposited in the GenBank, revealed the occurrence of the GRSV. Furthermore, the metagenomic analysis showed the presence of the GRSV, as well as, the potyvirus Peanut motlle virus (PeMoV), both with complete genome. / O amendoim (Arachis hypogaeae L.) é uma oleaginosa pertencente à família Fabaceae, originária da América do Sul. Seus grãos são muito utilizados como fonte de alimento e na produção de óleo. Os principais países produtores são China, Índia e Estados Unidos, que ocupam o 1°, 2° e 3º lugar, respectivamente. O Brasil situa-se na 17ª posição, tendo o Estado de São Paulo contribuído com 95% da produção total do país. O amendoim é hospedeiro de um grande número de espécies de vírus, que limitam o desenvolvimento da cultura em diferentes partes do mundo. O objetivo deste trabalho foi detectar a presença de vírus em plantas de amendoim oriundas de 10 municípios paulistas, sendo analisadas amostras (am) de campos (cam) de Santa Adélia (3cam/6am), Lusitânia (1cam/1am), Jaboticabal (3cam/6am), Itápolis e Pindorama (1cam/2am, cada), Tupã (4cam/8am), Rancharia e Marília (1cam/2am, cada), Guaimbê (2cam/4am) e Guarantã (1cam/2am). Plantas de amendoim foram usadas para manutenção dos isolados virais, empregando-se transmissão sucessivas por meio de enxertias. Os isolados foram submetidos a análises biológicas em gama de hospedeiros, sorológicas pelo método Dot-ELISA e moleculares por RT-PCR e metagenômica. Os hospedeiros indicadores testado foram: Lactuca sativa, Capisicum annuum, C. annuum var. 679, C. annuum var. Ikeda, Chenopodium amaranticolor, C. quinoa, Datura stramonium, Gomphrena globosa, Nicotiniana tabacum, N. benthamiana, N. rustica, N. glutinosa, Physalis floridana e Solanum sculentum. Com base nos resultados do teste Dot-ELISA foi detectada a presença dos tospovírus Groundnut ringspot virus (GRSV) (16am), Tomato chlorotic spot virus (TCSV) (6am) e do Tomato spotted wilt virus (TSWV) (3am). Ao ser comparado os resultados obtidos no sequenciamento (Macrogen) do fragmento obtido no teste RT-PCR, com as sequências disponíveis no GenBank, ficou comprovada ocorrência do GRSV. Por outro lado, a análise metagenômica confirmou a presença do GRSV e detectou o potyvírus Peanut motlle virus PeMoV), ambos com genoma completo.

Orientadores: Valéria Maia de Oliveira, Suzan Pantaroto de Vasconcellos / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T10:57:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dellagnezze_BrunaMartins_M.pdf: 2605800 bytes, checksum: 9f658e8eb7ad92524b8042afa7233e71 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Bioemulsificantes ou biossurfactantes são compostos sintetizados por micro-organismos que aumentam a biodisponibilidade de hidrocarbonetos, promovendo a estabilização de substâncias com diferentes polaridades, como por exemplo, emulsões água-óleo existentes nos reservatórios de petróleo. As amostras utilizadas neste trabalho foram coletadas na Bacia Potiguar (RN), e empregadas como inóculo para a realização de enriquecimentos anaeróbios e aeróbios da microbiota do petróleo. A amostra de óleo selecionada (GMR 75) foi obtida a partir de um poço com nível de biodegradação moderado. Após o período de incubação dos enriquecimentos, foi realizada a extração de DNA dos mesmos e a construção das bibliotecas de fosmídios, utilizando-se kit de clonagem comercial. A avaliação da produção de emulsificantes pelos clones fosmidias provenientes das bibliotecas metagenômicas foi realizada através de dois tipos de ensaios de triagem, um teste baseado em atividade biológica e outro em similaridade de sequência. O teste funcional, denominado "colapso da gota", apresenta caráter qualitativo e foi utilizado para a triagem preliminar de 2.880 clones, gerando 2.104 resultados positivos. Para o teste baseado em seqüência, os clones que se mostraram positivos no teste funcional foram avaliados através de reações de PCR utilizando primers homólogos a regiões conservadas de genes para a síntese de biossurfactantes. Entretanto, nenhum sinal positivo de amplificação foi observado com os primers utilizados. Ensaios de tensiometria, utilizando meio mineral e hexadecano como única fonte de carbono e energia, foram realizados para a confirmação da produção dos emulsificantes pelos clones. Nove clones capazes de reduzir a tensão interfacial de 45 mN\m para 30 mN/m foram selecionados e submetidos aos ensaios de emulsificação utilizando petróleo, óleo diesel e hexadecano. Os resultados demonstraram a formação de emulsão, principalmente em óleo diesel, sugerindo poder emulsificante sobre este composto. As análises colorimétricas dos biossurfactantes produzidos pelos nove clones revelaram proporções similares de carboidratos, proteínas e ácidos urônicos, não permitindo resultados conclusivos sobre a composição destes compostos. / Abstract: Bioemulsifiers or biosurfactants are compounds produced by microorganisms which enhance the bioavailability of hydrophobic substances promoting the stabilization of substances with different polarities, like oil-in-water emulsion occurring in petroleum reservoirs. The samples used in this work were collected in the Potiguar Basin (RN, Brazil), and employed as inoculum for aerobic and anaerobic enrichments of the petroleum microbiota. The selected oil sample (GMR 75) was obtained from a reservoir presenting a moderate biodegradation level. After the incubation period of the microbial enrichments, total DNA was extracted and used for the assembly of the metagenomic libraries by using a comercial kit. The evaluation of the potential for emulsifier production by the fosmid clones derived from the metagenomic libraries was performed by means of two screening assays, one based on biological activity and another based on sequence similarity. The functional assay, named "drop collapse", has a qualitative character and was used for the preliminary screening of 2,880 clones, yielding 2,104 positive results. For the sequence-based assay, clones shown to be positive in the functional assay were evaluated through PCR reactions using primers homologous to conserved regions of genes for biosurfactant synthesis. However, no positive amplification signal was observed with the primers used. Tensitometric assays, using mineral medium and hexadecane as sole carbon and energy source, were performed to confirm the production of the biosurfactants by the clones. Nine clones able to reduce the interfacial tension from 45 mN\m to 30 mN/m were selected and subsequently submitted to emulsification assays using petroleum, diesel oil and hexadecane. Results demonstrated the formation of an emulsion, mainly in diesel oil, suggesting the emulsifier power of the biosurfactants over this substance. Colorimetric analyses of the biosurfactants produced by the clones revealed similar proportion of carbohydrates, proteins and uronic acids, not allowing conclusive characterization of their composition. / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Submitted by isabel silva (isabel_manaus@yahoo.com.br) on 2017-06-22T15:28:22Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) CLONAGEM E CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA DE UMA LIPASE ISOLADA DE UMA BIBLIOTECA METAGENÔMICA DE TERRA PRETA DE ÍNDIO_Edson J1.pdf: 508907 bytes, checksum: 6b77566991052362063c90de82c2af97 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-06-23T13:18:22Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) CLONAGEM E CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA DE UMA LIPASE ISOLADA DE UMA BIBLIOTECA METAGENÔMICA DE TERRA PRETA DE ÍNDIO_Edson J1.pdf: 508907 bytes, checksum: 6b77566991052362063c90de82c2af97 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-06-23T13:18:48Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) CLONAGEM E CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA DE UMA LIPASE ISOLADA DE UMA BIBLIOTECA METAGENÔMICA DE TERRA PRETA DE ÍNDIO_Edson J1.pdf: 508907 bytes, checksum: 6b77566991052362063c90de82c2af97 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-23T13:18:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) CLONAGEM E CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA DE UMA LIPASE ISOLADA DE UMA BIBLIOTECA METAGENÔMICA DE TERRA PRETA DE ÍNDIO_Edson J1.pdf: 508907 bytes, checksum: 6b77566991052362063c90de82c2af97 (MD5) Previous issue date: 2017-04-05 / CAPES / The advancement of molecular technologies in the scientific field has enabled the development of various forms of access to the genetic material of organisms in order to locate, map, isolate, characterize and decode the target genes of a particular individual or a set of individuals coexisting in a specific environment. Metagenomic studies are very promising in several areas of biotechnology, such as the discovery of new molecules of industrial biotechnological interest, the investigation of new antibiotics and drugs, the bioremediation of environments impacted with toxic metals and the prospection of various enzymes. The objective of this work was characterize enzymatically a previously screened lipase enzyme from Metagenomic Library of Terra Preta de Índio. Lipase gene sequence was isolated from the metagenomic library and expressed in Pichia pastoris under control of PGK promoter. Recombinant lipase was characterized by hydrolysis activity of lipid substrates and synthesis ability in organic solvent. In silico analyzes infer the identification of extracellular lipase belonging to the lipase family, superfamily -hydrolase and lipase activity molecular function. Enzyme was efficiently produced in P. pastoris and recombinant lipase showed activity of 374.59 U/mL hydrolyzing p-nitrophenyl palmitate, Vmax (ap.) 143,4 U/mL.min-1, Km (ap.) 1,4 mM and Kcat (ap.) 103,7 S-1. Enzyme had maximum activity at pH 8.0, temperature 90 ºC and remained stable at high temperatures. Synthesis ability was evaluated by the formation of ethyl laurate by esterification reaction of lauric acid with ethanol, yielding 70% conversion in 45 minutes. Recombinant protein is characterized as an alkaline, thermotolerant, activated by calcium, EDTA e detergents. / O avanço das tecnologias moleculares no campo científico, possibilitou o desenvolvimento de diversas formas de acesso ao material genético dos organismos, de forma a ser possível localizar, mapear, isolar, caracterizar e decodificar os genes alvo de um indivíduo particular ou de um conjunto de indivíduos coexistentes em um ambiente específico. Estudos metagenômicos são bastante promissores em diversas áreas da biotecnologia, como nas descobertas de novas moléculas de interesse biotecnológico industrial, na investigação de novos antibióticos e fármacos, na biorremediação de ambientes impactados com metais tóxicos e na prospecção de enzimas diversas. O objetivo deste trabalho foi caracterizar enzimaticamente uma enzima lipase previamente rastreada de uma Biblioteca Metagenômica de Terra Preta de Índio. A sequência correspondente ao gene de lipase foi isolada da biblioteca metagenômica, clonada e expressada em Pichia pastoris sob controle do promotor PGK. A lipase recombinante foi caracterizada pela atividade de hidrólise de substratos lipídicos e capacidade de síntese em solvente orgânico. Análises in silico da sequência proteica inferem a identificação de uma lipase extracelular pertencente à / - hidrolase e com função molecular para atividade lipásica. A enzima foi produzida eficientemente em P. pastoris e a lipase recombinante apresentou atividade de 374,59 U/mL hidrolisando p-nitrofenil palmitato, Vmax(ap.) 143,4 U/mL.min-1, Km(ap.) 1,4 mM e Kcat(ap.) 103,7 S-1. A enzima possuiu atividade máxima em pH 8,0, temperatura 90 ºC e se manteve estável em altas temperaturas. A capacidade de síntese foi avaliada pela formação de laurato de etila pela reação de esterificação do ácido láurico com etanol apresentando rendimento de 70% em 45 minutos de reação. A proteína recombinante se caracteriza como uma enzima alcalina, termotolerante, ativada por cálcio, EDTA e detergentes.

Polihidroxialcanoatos (PHA) são poliésteres acumulados por diversas bactérias a partir de fontes renováveis e são termoplásticos, biodegradáveis e biocompatíveis. A variabilidade da composição monomérica de PHA determina suas propriedades mecânicas e permite seu uso em diversas aplicações. A PHA sintase é a enzima responsável pela polimerização do PHA. O objetivo deste trabalho foi à busca por genes codificadores desta enzima, construção e avaliação de recombinantes portando tais genes. Inicialmente buscaram-se novos genes de PHA sintase a partir de clones de uma biblioteca metagenômica previamente detectados por PCR como positivos para algum tipo de PHA sintase. Posteriormente buscou-se PHA sintases de classe III e construiram-se recombinantes de Pseudomonas sp e B. sacchari pela introdução de genes de C. vinosum (phaECCv). Nas duas recombinantes, os genes inseridos foram capazes de aumentar a fração de 3HHx em relação a linhagem selvagem, quando se utilizou glicose e hexanoato como fontes de carbono. / Polyhydroxyalkanoates (PHA) are polyesters accumulated from renewable sources by several bacteria and are thermoplastic, biodegradable and biocompatible. The variability of the PHA monomer composition determines its mechanical properties and allows their use in many applications. PHA synthase is the enzyme responsible for the polymerization of PHA. The objective was to search for genes encoding this enzyme, construction and the assessment of recombinant bacteria carrying such genes. Initially a screening of PHA synthase genes was made from a metagenomic library clones previously identified as positive by PCR for any type of PHA synthase. Later a search for class III PHA synthases was made as a construction of a recombinant Pseudomonas sp and B. sacchari by introducing genes of C. vinosum (phaECCv). In the two recombinant strains, the genes inserted were able to increase the fraction of 3HHx compared to the wild strain when glucose and hexanoate was used as carbon sources.

A construção de bibliotecas metagenômicas tornou possível o acesso ao potencial biotecnológico de micro-organismos não cultiváveis. O solo é um habitat pouco explorado, com elevada diversidade bacteriana que possuem genes codificadores de enzimas de interesse industrial, chamadas de biocatalisadores naturais. Dentre estas, destacam-se as enzimas lipolíticas, lipases e esterases, por promoverem a hidrólise de matérias-primas de alto valor agregado e com muitas aplicações biotecnológica. Devido a necessidade, existe uma constante busca para isolar novos genes com diferentes especificações. Neste trabalho, o gene lip4, isolado de biblioteca metagenômica de solo, foi superexpresso, purificado e identificado como membro da família V das lipases bacterianas. Tem atividade ótima hidrolisando triacilglicerol de cadeia média em pH alcalino sem presença de íons. A estrutura cristalográfica obtida identificou o dobramento conservado das α/β hidrolases e a tríade catalítica, Ser94-Asp217-His245, além da presença do domínio CAP, comum nas esterases. / Metagenomic libraries construction make possible the access to the biotechnological potential of not cultivated microorganisms. Soil environment has a big bacterial diversity with genes encoding industrial interest enzymes, named natural biocatalysts. Among these, lipolytic enzymes, that includes lipases and estarases, are able to catalyse different biochemistry reaction and promoting raw material hydrolysis with added values. In this overview, a search for new genes with different specifications, allowed isolation by functional screening in tributyrin agar, a gene lip4 from a soil metagenomic library. These gene was overexpressed, purified and identified as a member to family V of bacterial lipases. Presents better activity in alkaline pH with medium chain triacyglycerol without ions. Three dimensional structure of Lip4 identified a conserved α/β hydrolase backbone and the catalytic triad Ser94-Asp217-His245, besides the presence of CAP domain, common structure in esterase.

Considerando a dieta como um fator modulador do microbioma ruminal, neste trabalho objetivou-se investigar o impacto do bagaço da cana-de-açúcar sobre a composição e funcionalidade das espécies microbianas residentes no rúmen de carneiros (Ovis aries). Foram utilizados seis animais machos fistulados de O. aries, dos quais três foram alimentados com uma dieta composta por 70% de volumoso e 30% de concentrado (tratamento controle) e outros três animais alimentados com uma dieta similar a anterior, mas com 14% do volumoso substituído por bagaço de cana-de-açúcar (tratamento bagaço). O conteúdo ruminal (líquido e fibra) foram amostrados quinzenalmente durante 60 dias. A partir dessas amostras foram acessadas a estrutura e a composição da comunidade microbiana pela extração de DNA total e amplificação das regiões V3 e V6-V7 do gene 16S rRNA bacteriano e a região intergênica fúngica (ITS2). Além disso, foram feitas análises metagenômicas e metatranscriptômicas de comunidade microbianas enriquecidas em fibra ruminal para identificar enzimas lignocelulolíticas expressas. As frações líquida e fibrosa do conteúdo ruminal de O. aries revelaram uma comunidade bacteriana dominada principalmente por Bacteroidetes e Firmicutes ao longo de todo período experimental. Dois gêneros, Prevotella e Ruminococcus representaram 20% e 4% da comunidade bacteriana ruminal, respectivamente. Para a comunidade fúngica o filo Neocallimastigomycota representou 91% das sequências e os principais gêneros deste filo foram Piromyces, Neocallimastix, Orpinomyces, Anaeromyces, Caecomyces e Cyllamyces aderidos a fibra ruminal. O gênero Caecomyces, foi significativamente mais abundante na fibra ruminal de animais que se alimentaram de bagaço de cana-de açúcar. Além disso, foi observado um aumento significativo na frequência de enzimas como, por exemplo, 1,4-α-glucano, α-galactosidase, endo 1,4-β-xilanase, β- xilosidase, xilose isomerase, celobiose fosforilase e α-N-arabinofuranosidase no tratamento com bagaço de cana-de-açúcar. Considerando que a recuperação de enzimas a partir de comunidades microbianas naturalmente selecionadas para a degradação de biomassa é uma estratégia promissora para superar a atual ineficiência da ação enzimática na produção industrial de biocombustíveis, os resultados deste trabalho representam a possibilidade de aumentar a capacidade de recuperação ou descoberta de enzimas a partir de ruminantes, ou ainda, a possibilidade de manipular a estrutura do microbioma do rúmen para usá-lo como fonte de inóculo enriquecido em processos industriais de degradação de biomassa. / Considering the diet as a modulator of ruminal microbiome, this work aimed to investigate the impact of sugarcane bagasse on the composition and function of microbial species residents in the sheep (Ovis aries) rumen. Six cannulated male animals were used in the experiment, where three individuals were fed on a diet consisting of 70% forage and 30% concentrate (control treatment), and three were fed on a similar diet, but with sugarcane bagasse replacing 14% of the forage portion (bagasse treatment). The ruminal content (i.e., liquid and fiber) were sampled every two weeks during 60 days. From these samples, the structure and composition of the microbial community were assessed by total DNA extraction and amplification of V3 and V6-V7 regions of 16S rRNA gene from bacteria and the fungal intergenic region (ITS2). Furthermore, metagenomics and metatranscriptomics approaches were used to evaluate the enrichment of specific members of the microbial community in the ruminal fiber and genes related to lignocellulolytic enzymes. The liquid and fiber fractions of the O. aries rumen revealed a microbial community dominated mainly by Firmicutes and Bacteroidetes throughout the experimental period. The genera Prevotella and Ruminococcus accounted for 20% and 4% of the bacterial community of rumen, respectively. In the fungal community, the phylum Neocallimastigomycota accounted for 91% of sequences and its main genera adhered on the ruminal fiber were Piromyces, Neocallimastix, Orpinomyces, Anaeromyces, Caecomyces and Cyllamyces. The genus Caecomyces was significantly more abundant in the ruminal fiber in animals fed on sugarcane bagasse. Furthermore, there was a significant increase in the frequency of enzymes, such as α-1,4-glucan, α-galactosidase, endo- 1,4-β-xylanase, β-xylosidase, xylose isomerase, cellobiose phosphorylase and α- Narabinofuranosidase in the bagasse treatment. Considering that the recovery of enzymes from ecosystems naturally evolved for degradation of biomass is a promising strategy to overcome the current inefficient enzymatic action in industrial production of biofuels, the results of this study bring great possibilities to increase the discovery and or recovery of enzymes from ruminants, as well as the possibility of the ruminal microbiome structure manipulation to be used as source of an enriched inoculum for biomass degradation in industrial processes.

Orientadores: Valéria Maia Merzel, Itamar Soares de Melo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T12:19:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Domingos_DanielaFerreira_D.pdf: 4459680 bytes, checksum: c21b44008997f453425f3732e5729029 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O manguezal é um ambiente rico em diversidade microbiana, entretanto existem poucos estudos sobre esse tema no Brasil, tornando imperativo o conhecimento e a exploração de novos micro-organismos e seus metabólitos neste ecossistema. A prospecção da diversidade microbiana em ambientes pouco explorados, como os manguezais, potencializa as chances de sucesso na busca por novas moléculas bioativas, contribuindo para o desenvolvimento econômico e ambiental mais sustentável. Entretanto, sabemos que embora as técnicas de cultivo tenham sido aprimoradas e tenham permitido a recuperação in vitro de um número crescente de micro-organismos ainda não cultivados, nosso conhecimento sobre sua ecologia permanece insuficiente para cultivar a maioria deles. Neste contexto, as bibliotecas metagenômicas surgem como uma ferramenta poderosa para acessar de maneira mais abrangente a diversidade microbiana total em um dado ambiente, permitindo a análise e exploração de genes funcionais de membros da microbiota, principalmente de micro-organismos não-cultivados, e a descoberta de novos compostos bioativos. O objetivo geral desse trabalho foi a prospecção de biossurfactantes a partir de microbiota de manguezal utilizando uma abordagem polifásica. Para a abordagem independente-de-cultivo, foi construída uma biblioteca metagenômica de alto peso molecular a partir de sedimento de manguezal contaminado com petróleo. Os clones obtidos foram submetidos à triagem funcional e molecular para compostos com atividade biossurfactante. Três clones potencialmente produtores foram selecionados e submetidos ao sequenciamento fosmidial para a caracterização gênica dos insertos. Embora os clones apresentassem uma redução na tensão superficial, não foram identificados genes que pudessem estar envolvidos na síntese de algum biossurfactante. Os resultados obtidos revelaram que o uso da metagenômica funcional para a exploração metabólica de uma comunidade microbiana pode oferecer grandes limitações quando se trata de prospecção de biossurfactantes, cujos operons são muitas vezes maiores que 30-40 kb e podem conter elementos de regulação esparsos no genoma da bactéria selvagem. Na abordagem dependente-de-cultivo, foram selecionadas duas linhagens produtoras de biossurfactantes, Bacillus safensis CCMA-560 e Gordonia sp. CCMA-559, isoladas e testadas em estudo prévio. Através de planejamento experimental do tipo Plackett-Burman e Delineamento Composto Central Rotacional foi otimizada a produção do biossurfactante por essas linhagens. A pumolicidina produzida pelo B. safensis CCMA-560 foi caracterizada quimicamente, bem como a via metabólica responsável por sua produção. Este foi o primeiro trabalho a reportar a análise fisiológica, genética e química da produção de biossurfactante por representantes da espécie B. safensis / Abstract: Mangrove is an environment rich in microbial diversity, but little has been reported about it in Brazil, making the knowledge and exploitation of new microorganisms in mangroves an imperative issue. The prospection of microbial diversity in underexplored environments, such as mangroves, increses possibility of success in looking for new bioactive molecules, contributing to a more sustentable economy and environment. Although the cultivation techniques have been improved, allowing an increased number of yet uncultivated microorganisms to be able recuperated in vitro, our knowledge about their ecology is still insufficient to cultivate the majority of them. Therefore, the metagenomic library have emerged as a powerful tool to more widely access the overall microbial diversity in an environment, enabling the functional analyses of genes and the discovery of new bioactive compounds, mainly uncultured-microorganisms. The aim of the current work was the prospection of biosurfactant from mangrove microbiota through a polifasica approach. For the independent-cultivation approach, a metagenomic library of high molecular weight was constructed from mangrove sediment contaminated with oil. The clones were subjected to functional and molecular screening to identify biosurfactant activity. Three clones with the potential to procuce biosurfactant were selected, and the fosmid sequencing for genetic chatacterization of the insert was carried out. Although the clones showed the ability to reduce the surface tension, genes that may involved in biosurfactant synthesis were not identified. The results showed that using the functional metagenomic to explore metabolic pathways of microbial communities can have great limitation when in the prospection of biosurctants when the operon are larger then 30-40 kb and the genome of wild bacteria contains sparse regulation elements. For the dependent-cultivation approach, two strains that produce biosurfactant were selected: Bacillus safensis CCMA-560 and Gordonia sp. CCMA-559. They were isolated and tested in previous study. The biosurfactant production was opmized through the Placktt-Burman design and the Central Composite Design. The pumilacidin produced by B. safensis CCMA-560 was chemically characterized, and the metabolic pathway that is responsible for its production was genetically characterized. This work was the first report the physiologic, genetic, and chemical analysis on the biosurfactant production by the B. safensis strain / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Cubatão, o maior pólo industrial da américa latina também já foi uma das cidades mais poluídas do mundo. Os 30 anos de intensa atividade industrial vêm pressionando o meio ambiente com substâncias tóxicas e afetando gravemente a saúde da população. Dentre as substâncias contaminantes mais importantes da região estão os derivados de petróleo como o benzeno, tolueno, etilbenzeno e xilenos. Conhecidos como BTEX, eles são produzidos e utilizados em larga escala e a contaminação ocorre frequentemente através de vazamentos. Nos solos, devido à sua solubilidade em água, essas substâncias podem se espalhar por longas distâncias a partir do ponto afetado contaminando locais distantes. Já foi comprovada a capacidade de micro-organismos de sobreviver e até utilizar BTEX como fonte de carbono. Os micro-organismos adaptados catabolizam os contaminantes transformando-os em substâncias menos tóxicas e até mesmo eliminando-os do ambiente, capacidade de grande interesse econômico e ambiental. Nessa linha, nossa proposta visa o estudo das comunidades microbianas de solos afetados e não afetados por BTEX. Para isso foi utilizada a metagenômica como abordagem de estudo identificando-se diferenças qualitativas e quantitativas nas estruturas microbianas de três diferentes locais do município de Cubatão, sendo um deles afetado diretamente por BTEX. Pelo método utilizado e aqui desenvolvido, foi possível identificar um panorama metabólico geral identificando-se genes relevantes e o potencial de degradação de hidrocarbonetos aromáticos de micro-organismos conhecidos e desconhecidos, revelando melhor o potencial metabólico dos solos identificados. Os resultados apresentados podem contribuir para um melhor entendimento da dinâmica in situ de uma comunidade microbiana afetada por BTEX assim como melhorar o conhecimento sobre a comunidade microbiana de um local altamente impactado como Cubatão. / Cubatão is the largest industrial site in Latin America and was in the past one of the most polluted cities in the world. 30 years of intense industrial activity has pushed environmental limits with toxic substances and has severely affected the inhabitants\' health. Among the contaminants found in the region, the petroleum derivatives benzene, toluene, ethylbenzene and xylenes are the most important. Known collectively as BTEX, they are produced and used at a large scale and contamination frequently occurs. Because it is highly soluble in water, when in soil BTEX can spread long distances from the original contamination site, thus affecting large areas. Some microorganisms are known to live in contaminated environments and use contaminants such as BTEX as a unique carbon source for energy production. They catabolize contaminants into less dangerous products or even eliminate them from environment, a feature which has great commercial and environmental interest. We therefore compared the microbial communities in soils which were affected and un-affected by BTEX contamination. To this end, we used a metagenomics approach and developed a comparison method to identify microorganisms and degradation potential of soils studied. We found qualitative and quantitative differences in microbial structures from three different sites in Cubatão County, one of which is contaminated with BTEX. We constructed a metabolic overview identifying important genes, degradation potential and microorganisms related to BTEX degradation. The results presented here could contribute to understanding the in situ dynamics of a BTEX affected microbial community as well as improving our knowledge of the microbial community of Cubatão, a highly environmentally impacted place.