Metagenômica é a técnica que permite analisar os genomas de microorganismos que habitam determinados nichos do ambiente sem a necessidade de isolar e cultivar cada um separadamente. Ao conjunto de microorganismos que habita um determinado nicho se dá o nome de microbi- oma. Análises do perfil da diversidade taxonômica e funcional de comunidades microbianas em microbiomas são comuns em estudos de metagenômica. No entanto, atualmente as plata- formas de uso geral (como MG-RAST e IMG/M) tendem a separar as análises baseadas em reads (sequências não montadas) das baseadas em contigs (sequências montadas), isto dificulta as análises destes dados. Motivado por esta separação, desenvolvemos uma plataforma web, batizada de CARAVELA, que facilita a conexão entre os resultados de análises de diversidade taxonômica e funcional baseadas em reads e contigs respectivamente. Uma das principais fun- ções da plataforma CARAVELA é associar a identificação taxonômica de cada read com o contig que este read faz parte e, anotações funcionais do contig, quando existirem. Essa função deve permitir a rápida identificação de contigs potencialmente quiméricos bem como contigs taxonomicamente bem resolvidos. Também é possvel fazer buscas, tais como: listar todos os contigs que tenham um ou mais reads classificados como Pseudoxanthomonas suwonensis em sua composição e ainda, é possvel navegar nos contigs de maneira similar a navegadores de metagenomas tradicionais. Podem ser utilizados como arquivos de entrada a sada de outros programas, desde que o formato atenda certos padrões. A plataforma CARAVELA foi desenvol- vida com Java, HTML, CSS, Javascript e Mysql, e com o fim de testar a ferramenta, utilizamos o conjunto de dados metagnômicos obtidos a partir da operação de compostagem do Parque Zoológico de São Paulo. / The taxonomic diversity analysis (read-based) and functional analysis (contig / gene-based) from metagenomic studies usually generate information that is complementary. However, the tools that produce gene annotations (eg IMG / M) and taxonomic assignments (eg MyTaxa) do not allow easy integration of these results. Motivated by this split, we are develop a web platform called Caravela to facilitate the integration, search and visualization of information provided by read-based analyzes and contig / gene-based analyzes. The tool is able to display the list of contigs and for each contig, it displays annotated genes, reads participating in its composition and rate associated with each read (when such association exists). Such a capability enable manual / automated curation of assembly as well as taxonomic assignments (detection of possible mis-assignments). The platform able to accept output files from a variety of tools, as long as the file formats follow certain standards. The tests was performed on a dataset of metagenomic reads obtained from the composting operation of the São Paulo Zoological Park. The tool was implemented using Java technology, HTML, CSS and Javascript. Information was stored in a MySQL database.

Este trabalho teve como objetivo caracterizar a diversidade bacteriana presente em uma área de mineração. Os resultados mostraram que o filo mais abundante das bactérias classificadas foi o proteobacteria e 66% deste filo pertencem a classe betaproteobacteria. A diversidade de bactérias encontradas no solo de fora da mina mostrou-se diferente daquele encontrado dentro da mina, mostrando que a ação da mineração poderia ter modificado a comunidade microbiana nativa do local. Na tentativa de elucidar o mecanismo de resistência ao cobre presente nos isolados, foram escolhidas 2 cepas resistentes a altas concentrações de cobre: Acinetobacter sp. e Enterobacter sp. Os resultados de proteômica mostraram que as duas cepas possuem mecanismos diferentes de resistência. Acinetobacter teve a expressão de duas proteínas CopA e CopB em diferentes condições de cultivos (200 ppm de cobre 6h de cultivo; 24h e 72h de cultivo em 450 ppm de cobre). Com esses resultados foi possível elucidar que esta cepa tem o mesmo mecanismo de resistência encontrado em Enterococcus hirae, onde a proteína CopA tem como função o influxo de cobre e a proteína CopB o efluxo do excesso de cobre intracelular. Já a bactéria Enterobacter teve expressão apenas de proteínas de membranas e nenhuma proteína propriamente conhecida como de resistência à cobre. Este resultado foi corroborado por técnica de PCR, no qual não houve expressão para esse gene. Possivelmente as proteínas de membrana externa estão responsáveis pela homeostase do cobre realizada por esta cepa. / This work aimed to characterize the bacterial diversity present in a mining area. Results showed the most abundant phylum of the classified bacteria are proteobacteria and 66% of this phylum are class betaproteobacteria. The diversity of bacteria found in the soil outside the mine differed from those found within the mine, showing that the mining action may have modified the local microbial community. In an attempt to elucidate the mechanism of resistance to copper present in the isolates, two strains resistant to high concentrations of copper were chosen: Acinetobacter sp. and Enterobacter sp. Proteomics results showed these two strains have different mechanisms of resistance. Acinetobacter had the expression of two CopA and CopB proteins under different cultivation conditions (200 ppm of copper 6h of culture and 24h and also in 450 ppm of copper and 72h of culture). With these results it was possible to elucidate, this strain has the same mechanism of resistance found in Enterococcus hirae, which the CopA protein functions as the copper influx and the CopB protein the efflux of excess intracellular copper. On the other hand, Enterobacter bacterium had only membrane proteins, and no proteins known as copper resistance. This result was corroborated with PCR, where there was no expression for this gene. Possibly the outer membrane proteins are responsible for the copper homeostasis performed by this strain.

O sequenciamento de alto desempenho, pela redução dos custos nos últimos anos, vem sendo cada vez mais utilizado para prospectar e identificar vírus. Estes métodos são extremamente mais sensíveis que outros métodos moleculares, e capazes de sequenciar genomas virais sem conhecimento prévio, clonagem ou isolamento. Neste estudo, utilizamos o sequenciamento de alto desempenho para conhecer, e caracterizar genomas completos de arbovírus isolados nas Américas, incluindo a prospecção de vírus em amostras de pequenos mamíferos do estado de São Paulo, Brasil. Assim, sequenciamos e caracterizamos 44 Bunyavirales, 35 no gênero Orthobunyavirus, família Peribunyaviridae, oito no gênero Phlebovirus, família Phenuiviridae, e um orthonairovírus, família Nairoviridae. Entre os Bunyavirales identificamos uma provável nova estratégia de codificação da proteína não estrutural do segmento pequeno, e ainda identificados sete vírus que são reassortants naturais. Caracterizamos o genoma completo do vesiculovírus Piry, determinando sua relação filogenética com arbovírus pertencentes ao gênero Vesiculovirus, família Rhabdoviridae. Prospectamos novos vírus, os quais incluímos em três famílias, Parvoviridae, Anelloviridae e Hepeviridae. Na família Parvoviridae, identificamos 20 chapparvovírus endógenos e exógenos, oriundos de grande diversidade de hospedeiros vertebrados e invertebrados, e que representam uma nova subfamília, a Chapparvovirinae. Também, descrevemos onze novas espécies de Anelloviridae em roedores silvestres e marsupiais, fornecendo importantes informações sobre a diversidade, a taxonomia, e ainda ampliamos a gama de hospedeiros de anellovírus conhecidos. Por fim, identificamos e caracterizamos uma nova espécie de Orthohepevirus de roedores Sigmodontinae, nomeada \"Orthohepevirus E\". Acreditamos que estamos a fornecer relevantes informações sobre genômica, epidemiologia molecular, evolução e taxonomia de 45 arbovírus americanos, bem como sobre 13 novas espécies virais encontradas em pequenos mamíferos. Tais informações deverão dar subsídios para múltiplos futuros estudos visando compreender a importância destes novos vírus e a desenvolver métodos diagnósticos. / In last years, high-throughput sequencing (HTS) has been cost-effective and increasingly used for prospection and identification of viruses. These methods are extremely more sensitive than other molecular methods and are capable of sequencing viral genomes without prior knowledge, cloning or isolation. In this study, we used HTS approach to identify and characterize complete genomes of arbovirus isolated in the Americas, as well as viral prospection in samples of small mammals from São Paulo State, Brazil. Thus, we sequenced and characterized 44 viruses from Bunyavirales order, including 35 in Orthobunyavirus genus, family Peribunyaviridae, eight in Phlebovirus genus, family Phenuiviridae, and one in Orthonairovirus genus, family Nairoviridae. Among the Bunyavirales we identified a novel putative strategy for encoding the non-structural protein of the small segment, as well as we identified seven viruses that are natural reassortants. Also, we characterized the complete genome of the Piry vesiculovirus, determining its phylogenetic relationship with arboviruses belonging to the Vesiculovirus genus, family Rhabdoviridae. On the other hand, we have prospected novel viruses, which included in three families, Parvoviridae, Anelloviridae, and Hepeviridae. In the Parvoviridae family, we identified 20 endogenous and exogenous chapparvoviruses from a broad diversity of vertebrate and invertebrate hosts, representing a new subfamily, the Chapparvovirinae. Also, we have described eleven new species of Anelloviridae in wild rodents and marsupials, providing important information on diversity, taxonomy and even broadening the range of known anelloviruses hosts. Finally, we identified and characterized a novel species of orthohepevirus in Sigmodontinae rodent, named \"Orthohepevirus E\". We believe that we are providing relevant relevant on genomics, molecular epidemiology, evolution and taxonomy of 45 American arboviruses, as well as on 13 new viral species found in small mammals. Thus, these informations should provide support for multiple future studies to understand the importance of these new viruses, as well as to develop diagnostic methods.

O Alquilbenzeno Linear Sulfonado (LAS) é um surfactante aniônico de degradação complexa. Via ensaio cinético em batelada ajustou-se modelo de inibição por excesso de substrato na remoção de LAS e matéria orgânica de água residuária de lavanderia comercial (ARLC) em co-digestão com esgoto doméstico (ED). A adição de 50 mg L-1 de etanol (EOH) resultou em maiores valores para velocidade específica de utilização do substrato (robs) e concentração mais elevada de LAS que fornece o maior robs (18,98 mg LAS L-1 e 2,39 mg LAS L-1 na presença e ausência de etanol, respectivamente). Areia com 1,0 mm de diâmetro foi escolhida como material suporte). Objetivou-se otimizar a remoção do surfactante de ARLC + ED (1:3 volume; &#8764; 20 mg LAS L -1) em RLF em escala aumentada (19,8L) através de: (i) adição de etanol em diferentes dosagens; (ii) variação da velocidade ascensional (vasc) aplicada ao leito; e (iii) aumento do tempo de detenção hidráulica (TDH). Desta forma, para TDH de 18 h foram realizadas as seguintes fases operacionais: (I) ARLC + ED + 1,3 velocidade mínima de fluidificação (vmf); (II) ARLC + ED + 50 mg EOH L -1 + 1,3 vmf; (III) ARLC + ED+200 mg EOH L-1 + 1,3 vmf; (IV) ARLC + ED +200 mg L-1 + 1,0 vmf; (V) ARLC + ED + 200 mg L-1 + 0,7 vmf; (VI) ARLC + ED + 100 mg L-1 + 1,0 vmf; e para TDH de 30 h: (VII) ARLC + ED + 1,0 vmf. Não se observou diferença significativa na eficiência de remoção de DQO e LAS (&#8764; 50%; p < 0,5) nas fases I à IV. O decréscimo da vasc (0,7 vmf) resultou em 29% de eficiência de remoção de LAS (V) e o aumento do TDH em 86% de eficiência de remoção de LAS (VII). Nas fases VI e VII observou-se maior remoção de DQO (&#8805; 70%). As menores vasc e 200 mg EOH L-1 favoreceram acúmulo de ácidos no sistema (IV e V). No efluente do RLF foram identificados 17 compostos recalcitrantes. Para vasc = 0,7 vmf, foi observada maior diversidade de compostos recalcitrantes, em sua maioria, ftalatos. Caracterização taxonômica e funcional dos microrganismos para as fases III, IV e V (variação da vasc) e VII (maior eficiência de remoção de LAS e DQO) foi realizada por metagenômica. Foram identificados microrganismos dos domínios Archaea e Bacteria, sendo que a diminuição da vasc resultou em maior abundância relativa de arqueias metanogênicas, como Methanosarcina e genes relacionados a F420 reducing hydrogenase que é transportadora central de elétrons na metanogênese. Diversidade de gêneros foram identificados do domínio Bacteria (Geobacter, Thauera, Pseudomonas, Chryseobacterium, Sulfuricurvum e Sulfurospirillum, etc.) e genes codificadores de enzimas que atuam nas diferentes etapas de degradação do LAS: (a) adição de fumarato (fumarate redutase); (b) beta-oxidação (3-hidroxiacil-CoA desidrogenase); (c) clivagem do anel benzênico (benzoyl-CoA reductase); (d) dessulfonação (Adenylyl-sulfate reductase). Na amostra da fase VII, foram identificados genes relacionados à etapa de dessulfonação com maior abundância relativa, se comparada às demais fases. Para maior vasc observou-se maior abundância relativa de genes relacionados à fosforilação oxidativa com Chryseobacterium como principal representante. / The linear alkylbenzene sulfonate (LAS) is in the laundry detergent composition and it presents complex degradation. Through kinetics assays in batch tests, an inhibition kinetic model by subtrate excess was adjusted to the data in the removal of LAS and organic matter from laundry wastewater (LW) in co-digestion with domestic sewage (DS). The addition of 50 mg L-1 of ethanol (EOH) to the influent resulted in higher values for the specific substrate rate (robs) as well as higher LAS concentration that provided the maximum LAS utilization rate by the biomass (Sbm) (18.98 mg LAS L-1 and 2. 39 mg LAS L-1 in the presence and absence of ethanol, respectively). Sand with 1.0 mm of diameter was chosen as supporting material for the fluidized bed reactor (FBR). The purpose of the present study was to optimize the removal of surfactant in LW + DS (1: 3 volume; &#8764; 20 mg LAS L-1) by using an upscale FBR (19.8 L) through: (i) adding ethanol in different dosages; (ii) varying the upflow velocity (vup) applied to bed; and (iii) increasing the hydraulic retention time (HRT). Thus, for 18h of HRT, the following stages were performed: (I) LW + DS + 1,3 fluidization minimum velocity (vfm); (II) LW + DS + 50 mg EOH L-1 + 1.3 vfm; (III) LW + DS + 200 mg EOH L-1 + 1.3 vfm; (IV) LW + DS + 200 mg L-1 + 1.0 vfm; (V) LW + DS + 200 mg L-1 + 0.7 vfm; (VI) LW + DW + 100 mg L-1 + 1.0 vfm; and for 30 h of HRT: (VII) LW + DS + 1.0 vfm. There was no significant difference in the efficiency of COD and LAS removal (&#8764; 50%, p < 0.5) in stages I to IV. The vup decrease (0.7 vfm) resulted in LAS removal efficiency of 29% (V) and the HRT increase resulted in LAS removal efficiency of 86% (VII). In stages VI and VII, COD removal &#8805; 70% was observed. Lower vup as well as ethanol dosage of 200 mg L-1 favored system acidification (IV and V). In the FBR effluent, 17 recalcitrant compounds were identified. For vup = 0.7 vfm, large diversity of recalcitrant compounds, mostly phthalates, was observed. A taxonomic and functional characterization of the microorganisms was performed by metagenomics analysis in stages III, IV and V (vup variation) and VII (higher efficiency of LAS and COD removal). Microorganisms of Archaea and Bacteria domains were identified, and the decrease of vup resulted in a higher relative abundance of methanogenic archaea, mainly Methanosarcina. Genes related to F420, which are the central electron carrier in the methanogenesis, were identified. Genera diversity was classified in Bacteria domain (Geobacter, Thauera, Pseudomonas, Pseudomonas, Chryseobacterium, Sulfuricurvum and Sulfurospirillum, etc.). Enzyme-encoding genes that act on different stages of LAS degradation were found: (a) addition of fumarate (fumarate reductase); (b) beta-oxidation (3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase); (c) benzene ring cleavage (benzoyl-CoA reductase) and (d) desulfonation (Adenylyl-sulfate reductase). In stage VII sample, genes related to the desulfonation step were identified with higher relative abundance, when compared to the other stages. For a higher vup, a higher relative abundance of genes related to oxidative phosphorylationwas observed and the genus main representative in that category was Chryseobacterium.

A água doce no Brasil, assim como o seu consumo é extremamente importante para as diversas atividades criadas pelo ser humano. Por esta razão o consumo deste bem é muito grande e consequentemente, provocando o seu impacto. Os mananciais são normalmente usados para abastecimento doméstico, comercial, industrial e outros fins. Os estudos na área de ecologia de micro-organismos em águas (mananciais e esgoto) vêm sendo realizados com mais intensidade nos últimos anos. Nas últimas décadas foi introduzido o conceito de virioplâncton com base na abundância e diversidade de partículas virais presentes no ambiente aquático. O virioplâncton influencia muitos processos ecológicos e biogeoquímicos, como ciclagem de nutriente, taxa de sedimentação de partículas, diversidade e distribuição de espécies de algas e bactérias, controle de florações de fitoplâncton e transferência genética horizontal. Os estudos nesta área da Virologia molecular ainda estão muito restritos no país, bem como muito pouco se conhece sobre a diversidade viral na água no Brasil. / Freshwater in Brazil, as well as its consumption is extremely important for the various activities created by human being. For this reason the consumption of this good is very great and consequently, causing its impact. The sources are usually used for domestic, commercial, industrial and other purposes. Studies on the ecology of microorganisms in waters (freshwater and sewage) have been carried out more intensively in recent years. In recent decades the concept of virioplankton has been introduced based on the abundance and diversity of viral particles present in the aquatic environment. Virioplankton influences many ecological and biogeochemical processes, such as nutrient cycling, particle sedimentation rate, diversity and distribution of algal and bacterial species, control of phytoplankton blooms and horizontal gene transfer. Studies in this area of molecular Virology are still very restricted in the country, and very little is known about viral diversity in water in Brazil.

The human microbiome - defined as the microbial communities that live in and on our bodies - is emerging as a key factor in human diseases. The expanding research field that investigates the role of the microbiome on human cancer development, termed oncobiome, has led to important discoveries such as the role of Fusobacterium nucleatum in colorectal cancer carcinogenesis and tumor progression. Motivated by these discoveries, this thesis studied the oncobiome from different perspectives, investigating whether alterations to microbial profiles were associated with disease status or an adverse response to treatment. We used both biopsy tissue samples and 16S rRNA amplicon sequencing (N = 36), as well as privately and publicly available fecal whole metagenomes (N = 764) to investigate microbiome-colorectal cancer (CRC) associations. We observed significant increases in species richness in CRC, regardless of sample type or methodology, which was partially due to expansions of species typically from the oral cavity, as well as an overabundance of specific taxa such as Bacteroides fragilis, Fusobacterium, Desulfovibrio and Bilophila in CRC. Functional potential analysis of CRC metagenomes revealed that the choline trimethylamine-lyase (cutC) gene was over-abundant in CRC, with the strength of association dependent on four identified sequence variants, pointing at a novel potential mechanism of CRC carcinogenesis. Predictive microbiome signatures trained on the combination of multiple datasets showed very high and consistent performances on distinct cohorts (average AUC 0.83, minimum 0.81). To investigate the microbiomes role in response to treatment, we profiled microbial communities of gastric wash samples in gastric cancer patients (N = 36) before and after neoadjuvant chemotherapy through 16S rRNA amplicon sequencing. Gastric wash microbial communities presented remarkably high inter-individual variation, with significant decreases in richness and phylogenetic diversity after treatment and associations with pH, pathological response and sample collection. The most abundant genera found in patients before or after chemotherapy treatment included Streptococcus, Prevotella, Rothia and Veillonella. Despite limitations inherent to differing experimental choices, this thesis provides microbiome signatures that can be the basis for clinical prognostic tests and hypothesis-driven mechanistic studies, as well as supporting the role of the human oral microbiome in whole-body diseases. / O microbioma humano - definido como as comunidades microbianas que vivem sobre e dentro do corpo humano - está se tornando um fator cada vez mais importante em doenças humanas. O campo de estudo que investiga o papel do microbioma no desenvolvimento do câncer humano, denominado oncobioma, está crescendo e já levou a importantes descobertas como o papel da espécie Fusobacterium nucleatum na carcinogênese e progressão tumoral de tumores colorretais. Motivado por estas descobertas, esta tese de doutorado analisou o oncobioma por diferentes perspectivas, investigando se alterações nos perfis microbianos estavam associados à presença da doença ou a uma resposta adversa ao tratamento. Usamos tanto amostras de tecidos de biópsias e o sequenciamento do gene 16S rRNA (N = 36), quanto metagenomas fecais públicos e privados (N = 764), para investigar associações entre o microbioma e o câncer colorretal (CCR). Observamos um aumento significativo da riqueza microbiana no CCR, independentemente do tipo da amostra ou metodologia, que era em parte, devido ao aumento de espécies tipicamente presentes na cavidade oral. Observamos também um aumento da abundância de táxons específicos no CCR, que incluíam Bacteroides fragilis, Fusobacterium, Desulfovibrio e Bilophila. Analisando o potencial funcional dos metagenomas, encontramos um aumento significativo da enzima liase colina trimetilamina (cutC) no CCR, cuja associação era dependente de 4 variantes de sequência, demonstrando ser um possível novo mecanismo de carcinogênese no CCR. Assinaturas preditivas do microbioma treinadas na combinação dos estudos demonstraram ser altamente preditivas e consistentes nos diferentes estudos (média de AUC 0.83, mínimo de 0.81). Para investigar o possível papel do microbioma na resposta ao tratamento, analisamos os perfis microbianos do suco gástrico de pacientes com câncer gástrico (N = 36) antes e depois do tratamento quimioterápico neoadjuvante. As comunidades microbianas apresentaram uma variabilidade inter-individual notavelmente grande, com diminuições significativas na riqueza e diversidade filogenética pós tratamento, além de estarem associadas principalmente ao pH, mas também à resposta patológica e ao tempo da coleta. Os gêneros mais abundantes encontrados nos pacientes antes ou depois da quimioterapia incluíam Streptococcus, Prevotella, Rothia e Veillonella. Apesar das limitações inerentes às escolhas experimentais, esta tese proporciona assinaturas do microbioma que podem servir de base para testes clínicos prognósticos e estudos mecanísticos, além de dar mais suporte ao papel do microbioma oral em doenças humanas.

The human microbiome - defined as the microbial communities that live in and on our bodies - is emerging as a key factor in human diseases. The expanding research field that investigates the role of the microbiome on human cancer development, termed oncobiome, has led to important discoveries such as the role of Fusobacterium nucleatum in colorectal cancer carcinogenesis and tumor progression. Motivated by these discoveries, this thesis studied the oncobiome from different perspectives, investigating whether alterations to microbial profiles were associated with disease status or an adverse response to treatment. We used both biopsy tissue samples and 16S rRNA amplicon sequencing (N = 36), as well as privately and publicly available fecal whole metagenomes (N = 764) to investigate microbiome-colorectal cancer (CRC) associations. We observed significant increases in species richness in CRC, regardless of sample type or methodology, which was partially due to expansions of species typically from the oral cavity, as well as an overabundance of specific taxa such as Bacteroides fragilis, Fusobacterium, Desulfovibrio and Bilophila in CRC. Functional potential analysis of CRC metagenomes revealed that the choline trimethylamine-lyase (cutC) gene was over-abundant in CRC, with the strength of association dependent on four identified sequence variants, pointing at a novel potential mechanism of CRC carcinogenesis. Predictive microbiome signatures trained on the combination of multiple datasets showed very high and consistent performances on distinct cohorts (average AUC 0.83, minimum 0.81). To investigate the microbiomes role in response to treatment, we profiled microbial communities of gastric wash samples in gastric cancer patients (N = 36) before and after neoadjuvant chemotherapy through 16S rRNA amplicon sequencing. Gastric wash microbial communities presented remarkably high inter-individual variation, with significant decreases in richness and phylogenetic diversity after treatment and associations with pH, pathological response and sample collection. The most abundant genera found in patients before or after chemotherapy treatment included Streptococcus, Prevotella, Rothia and Veillonella. Despite limitations inherent to differing experimental choices, this thesis provides microbiome signatures that can be the basis for clinical prognostic tests and hypothesis-driven mechanistic studies, as well as supporting the role of the human oral microbiome in whole-body diseases. / O microbioma humano - definido como as comunidades microbianas que vivem sobre e dentro do corpo humano - está se tornando um fator cada vez mais importante em doenças humanas. O campo de estudo que investiga o papel do microbioma no desenvolvimento do câncer humano, denominado oncobioma, está crescendo e já levou a importantes descobertas como o papel da espécie Fusobacterium nucleatum na carcinogênese e progressão tumoral de tumores colorretais. Motivado por estas descobertas, esta tese de doutorado analisou o oncobioma por diferentes perspectivas, investigando se alterações nos perfis microbianos estavam associados à presença da doença ou a uma resposta adversa ao tratamento. Usamos tanto amostras de tecidos de biópsias e o sequenciamento do gene 16S rRNA (N = 36), quanto metagenomas fecais públicos e privados (N = 764), para investigar associações entre o microbioma e o câncer colorretal (CCR). Observamos um aumento significativo da riqueza microbiana no CCR, independentemente do tipo da amostra ou metodologia, que era em parte, devido ao aumento de espécies tipicamente presentes na cavidade oral. Observamos também um aumento da abundância de táxons específicos no CCR, que incluíam Bacteroides fragilis, Fusobacterium, Desulfovibrio e Bilophila. Analisando o potencial funcional dos metagenomas, encontramos um aumento significativo da enzima liase colina trimetilamina (cutC) no CCR, cuja associação era dependente de 4 variantes de sequência, demonstrando ser um possível novo mecanismo de carcinogênese no CCR. Assinaturas preditivas do microbioma treinadas na combinação dos estudos demonstraram ser altamente preditivas e consistentes nos diferentes estudos (média de AUC 0.83, mínimo de 0.81). Para investigar o possível papel do microbioma na resposta ao tratamento, analisamos os perfis microbianos do suco gástrico de pacientes com câncer gástrico (N = 36) antes e depois do tratamento quimioterápico neoadjuvante. As comunidades microbianas apresentaram uma variabilidade inter-individual notavelmente grande, com diminuições significativas na riqueza e diversidade filogenética pós tratamento, além de estarem associadas principalmente ao pH, mas também à resposta patológica e ao tempo da coleta. Os gêneros mais abundantes encontrados nos pacientes antes ou depois da quimioterapia incluíam Streptococcus, Prevotella, Rothia e Veillonella. Apesar das limitações inerentes às escolhas experimentais, esta tese proporciona assinaturas do microbioma que podem servir de base para testes clínicos prognósticos e estudos mecanísticos, além de dar mais suporte ao papel do microbioma oral em doenças humanas.

In the last years, microbial ecologists have dramatically increased their efforts to elucidate the \"black box\" of patterns and processes that modulate the diversity and functionality of soil microorganisms, examining their genetic diversity (e.g. through metagenomic) and measuring their functional characteristics. The aim of this thesis was to evaluate the interaction of the ecological processes of dispersion, diversification, selection and genetic drift on (1) the soil microbial communities, after conversion of forest to grassland or no-till cropping in long-term and (2) on the microbial communities in the rhizosphere of soybean in long-term no-till system. The cultivation of grassland in long-term led to a homogenizing selection of microbial communities, reducing beta-diversity, with consequent changes in the soil functions related to stress. No-till long-term led to minor changes of diversity, maintaining the functions found in the forest. The soybean plant has shown homogenizing power selection, and this increased with time. However, the functions selected in the rhizosphere were maintained, indicating functional resilience. / Nos últimos anos, ecologistas microbianos aumentaram drasticamente seus esforços para elucidar a \"caixa preta\" dos padrões e processos que modulam a diversidade e funcionalidade dos microrganismos do solo, examinando sua diversidade genética (e.g. através de metagenômica) e medindo suas características funcionais. O objetivo dessa tese foi avaliar a interação dos processos ecológicos de dispersão, diversificação, seleção e deriva gênica, sobre (1) as comunidades microbianas do solo, após a conversão da floresta em pastagem ou plantio direto, em longo período e (2) sobre as comunidades microbianas da rizosfera de soja, em sistema de plantio direto, em longo período. O cultivo de pastagens em longo período levou a uma seleção homogeneizante das comunidades microbianas, reduzindo a beta-diversidade, com conseguinte alteração em funções no solo relacionadas ao estresse. O plantio direto em longo período levou a uma menor alteração da diversidade, com manutenção das funções encontradas na floresta. A planta de soja demonstrou poder de seleção homogeneizante, e este aumentou com o tempo. Contudo, as funções selecionadas na rizosfera foram mantidas, indicando resiliência funcional.

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:12:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carolinie.pdf: 1105289 bytes, checksum: fb4a9af7cf4012e7784dfbcf92246455 (MD5) Previous issue date: 2010-03-09 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / In the Amazon agricultural soils are found in soil called Anthropogenic Dark Earths (ADE), a soil rich in organic matter and minerals. The biodiversity is a source of very high value of non-cultivable microorganisms that can be isolated through construction of metagenomic libraries, using vectors of large fragments, with the goal of finding new biocatalytic enzymes. Enzymes widely used in the industrial market are amylase and protease, are applied in industry: chemical, pharmaceutical, textile, detergent and food industries. Amylases degrade starch into smaller units of saccharides, as proteases catalyze the hydrolysis of peptide bonds. The aim of this study was to isolate and partially characterize enzymes amylase and protease of clones isolated from a selection of functional metagenomic library of TPI in the Amazon region. In this study were isolated 1.344 clones, only 4 producing halo of starch hydrolysis and 3 proteolytic clones belonging to metagenomic library constructed with total DNA extracted from microorganisms present in soil samples of the TPI, were partially characterized the enzymes produced by 4 clones amilolytic and 1 proteolytic clone. After isolation, the clones were inoculated in culture medium Luria Bertani (LB) at 37ºC under agitation of 150 rpm and subjected to assays at pHs of 3 to 10 and temperatures ranging from 25 to 100ºC for up to 90 of incubation. Amylases had its highest production in 24 h (4.3 U/mL) and its activity was optimal at neutral pH to slightly alkaline, the clone P1C4 showed the highest production at 70°C (6.93 U/mL), since the clones P5C4 and P6C12 reported higher thermostability at 80°C, these results indicate that the gene for alpha-amylase to be cloned encoding a thermostable enzyme, such as the enzyme produced by Bacillus liqueniformis. Since the clone P3A3 produced 26.3 U/mL protease in 10 hours of production, its activity was optimal at neutral pH, and its optimum temperature at 30ºC (56.0 U/mL) and its thermostability was demonstrated in 50°C (22,0 U/mL). These features contribute to the implementation of these enzymes in industrial sectors as in food production, chemical industry and production of detergents. The enzymes isolated in this study demonstrated new features and performance when compared to enzymes described today, which proves the efficiency of the construction of metagenomic libraries for isolation of new bioproducts. / Na floresta Amazônica são encontrados solos agricultáveis denominado de solo de Terra Preta de Índio (TPI), um solo rico em matéria orgânica e em minerais. A biodiversidade da Amazônia constitui uma fonte de valor altíssimo de micro-organismos não-cultiváveis que podem ser isolados através das construções das bibliotecas metagenômicas, utilizando vetores de grandes fragmentos, com o objetivo de encontrar novas enzimas biocatalíticas. As enzimas de maior aplicação no mercado industrial são as amilases e proteases, aplicadas nas indústrias: química, farmacêutica, têxtil, de detergentes e alimentícia. As amilases são capazes de degradar o amido em unidades de sacarídeos menores, já as proteases catalisam a hidrólise de ligações peptídicas. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar parcialmente enzimas amilolíticas e proteolíticas de clones isolados a partir de uma seleção funcional da biblioteca metagenômica de TPI da região Amazônica construída com DNA total extraído dos micro-organismos presentes nas amostras de solos de TPI, inseridos no vetor fosmidial (pCC1Fos ) e clonado na célula hospedeira Escherichia coli (EPI300). De 1.344 clones pertencente a biblioteca metagenômica, apenas 4 clones foram produtores de halo de hidrólise de amido e 3 clones foram proteolíticos, além disso, todas as enzimas produzidas pelos 4 clones amilolíticos e 1 clone proteolítico foram caracterizadas parcialmente. Após o isolamento, os clones foram inoculados em meio de cultura Luria Bertani (LB) a 37oC, sob agitação de 150 rpm e submetidos aos ensaios enzimáticos nos pHs de 3 a 10 e temperatura variando de 25 a 100ºC por até 90 minutos de incubação. As amilases tiveram sua maior produção em 24 horas (4,3 U/mL) e sua atividade ótima foi em pH neutro a levemente alcalino, o clone P1C4 demonstrou a maior produção a 70ºC (6,93 U/mL), já os clones P5C4 e P6C12 demonstraram a maior termoestabilidade a 80°C, tais resultados indicam que o gene de alfa-amilase clonado deve ser codificador de uma enzima termoestável, como por exemplo, a enzima produzida por Bacillus liqueniformis. Já o clone P3A3 produziu 26,3 U/mL de proteases em 10 horas de produção, sua atividade ótima foi em pH neutro, sendo sua temperatura ótima em 30ºC (56,0 U/mL) e sua termoestabilidade foi demonstrada em 50ºC (22,0 U/mL). Estas características contribuem para a aplicação destas enzimas em setores industriais como na produção de alimentos, indústria química e produção de detergentes. As enzimas isoladas neste trabalho demonstraram características e atuações novas quando comparadas a enzimas descritas atualmente, a qual comprova a eficiência da construção de bibliotecas metagenômicas para o isolamento de novos bioprodutos.

As doenças associadas ao circovírus suíno (DACS) causam impacto econômico negativo nos sistemas de criação de suínos no mundo todo. As perdas incluem tratamento da doença, mortalidade, bem como diminuição no desempenho dos animais. Uma das manifestações mais relevantes das DACS é a síndrome multissistêmica do definhamento dos suínos (SMDS). O principal agente patogênico na causa da SMDS é o circovírus suíno tipo 2 (PCV2), no entanto, estudos observacionais e experimentais demonstraram que outros agentes estão envolvidos na patogênese e manifestação dos sinais clínicos. O sequenciamento de alto desempenho aliado a metagenômica são ferramentas que tornam possível a identificação da microbiota total de uma determinada amostra, independentemente de cultivo dos microrganismos. Visando contribuir para o conhecimento dos possíveis vírus envolvidos na SMDS, o presente trabalho realizou o sequenciamento genético de alto desempenho de soros de suínos e posterior análise do metagenoma resultante. Foram utilizadas amostras de soro coletadas em 2008, de 16 suínos com sinais clínicos da SMDS, entre 80 e 100 dias de idade, em uma granja no interior do Rio Grande do Sul. Os dados revelaram sequências virais de PCV2, parvovírus suíno tipo 1 a 6 (PPV1-6), torque teno vírus de suínos (TTSuV) tipo 1b, k2a e k2b e vírus de DNA circular de fita simples codificador de proteína associada a replicação (CRESS). A ocorrência de PCV2, PPV1-5 e TTSuV já foi descrita em suínos com SMDS, portanto este estudo reforça resultados anteriores. O PPV6 foi recentemente descrito na China, Europa e Estados Unidos, e os estudos não relacionaram o vírus com nenhuma doença específica de suínos. Os CRESS já foram identificados em todos os continentes, em vários tipos de amostras, incluindo fezes de suínos, mas sem nenhuma conexão com doenças de animais. Portanto, este é o primeiro relato de PPV6 e CRESS em suínos apresentando sinais de SMDS. Porém estudos posteriores são necessários para poder atribuir relação entre PPV6 e CRESS no desenvolvimento da SMDS. / Porcine circovirus associated disease (PCVAD) is one of the causes of negative economic impact on pig farming systems described worldwide. Losses include expenditures with treatment, increased mortality rates, and decreased productivity. One of the most relevant manifestations of PCVAD is the post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). The main pathogen present in PMWS is porcine circovirus type 2 (PCV2). However, observational and experimental studies have shown that other agents may be involved in the pathogenesis and clinical manifestation. High-throughput sequencing combined with metagenomics analyses make it possible to identify the total microbiota in a given sample, regardless of microorganism culture. In order to contribute to the knowledge of the viruses involved in PMWS, the present study carried out the high-throughput sequencing of swine sera and subsequent analysis of the resulting metagenome. Sixteen serum samples collected in 2008 on a farm in Rio Grande do Sul, from 80 and 100 days old pigs with clinical signs of PMWS, were examined. Data revealed viral sequences of PCV2, porcine parvovirus type 1 through 6 (PPV1-6), torque teno sus virus (TTSuV) types 1b, k2a and k2b and circular replication-associated protein (Rep) encoding single-stranded (CRESS) DNA viruses. The occurrences of PCV2, PPV1-5 and TTSuV have already been described in pigs with PMWS, so this study reinforces previous results. PPV6 was recently described in China, Europe and the United States, and the studies did not correlate the virus to any specific disease. CRESS DNA viruses have been identified on all continents in various types of samples, including swine feces, but without any connection to animal diseases. The present study is the first report of PPV6 and CRESS in pigs presenting PMWS signals. However, further studies are necessary to be able to attribute the relationship between PPV6 and CRESS in the development of SMDS.