Doctor en Ciencias con mención en Biología Molecular, Celular y Neurociencias / Copper is an essential micronutrient for life, it is required by a wide range of species, from bacteria to yeast, plant and humans. Copper essentiality is based in the capacity of the metal to be an intermediary in the transfer of electrons; thus, redox active enzymes that participate in physiological process like cellular respiration, iron transport and metabolism, and neurotransmitter synthesis utilize it. On the other hand, as a consequence of its redox properties, copper is potentially toxic to membranes, DNA and proteins through a Fenton´s type reaction. To prevent excess or deficit, living organisms have developed mechanisms that regulate copper in plasma and tissue stores, through specialized tissues such as intestinal mucosa and hepatic tissue. A number of molecules at a cellular level regulate the uptake, efflux, storage and utilization of the metal. The evidence indicates that copper handling is tightly regulated, thus, under normal conditions it is almost impossible to find a free copper ion inside the cell. Metallothioneins (MTs) are proteins involved in the regulation of intracellular copper metabolism. MTs are found in all eukaryots as well as some prokaryots; the structure is highly conserved across species. Physical-chemical properties allow MTs to coordinate the binding of multiple atoms of copper with a high affinity, and at the same time since these are kinetically labile they can be transferred to other molecules. Copper induces MT expression, thus intracellular MT content is related to an increase in cell resistance to copper toxicity. These properties suggest that MTs have an important role in cellular copper metabolism, storage and/or delivery of copper ions to specific cupro-enzymes. Since the role of MT has not been fully characterized, the goal of this doctoral thesis was to evaluate MT function in copper metabolism of cells maintained in sub, iso- and supra- physiological concentrations of copper. The results of this thesis indicate that in the absence of MT, cultured cell grown in low and normal concentration of copper have a decreased capacity to store copper; moreover they are more sensitive to an increment in intracellular copper, decreasing their viability. The increment in intracellular copper relative to wild cells is not explained by an increase in copper uptake, suggesting a difference in the efflux rate. The analysis of efflux of newly incorporated copper showed that in absence of MT, the retention of this copper is slightly lower; this may explain in part, the lower copper content observed in these cells. Finally, I have demonstrated that in the absence of MTs, the capacity of copper to induce gene expression of MT, SOD1 and Ccs1 its chaperone is lost. This observation could partially explain the increased vulnerability of MT null cells to lower intracellular copper concentrations. I propose as conclusions of this thesis that the presence of MT is important to maintain an appropriate regulation of intracellular copper homeostasis in cells grown at physiological copper concentrations and especially in response to extracellular copper excess. This response is dependent on the capacity of MT to store copper under physiological conditions and in response to excess, sequester intracellular copper in a safe form.

Metalotioneínas (MTs) são proteínas de baixa massa molecular, que tem como principal função a regulação dos níveis de metais nos organismos. A caracterização das MTs da cianobactéria Synechococcus PCC 7942 por eletroforese capilar foi feita em comparação com os padrões comerciais de MTs de rim de cavalo e de fígado de coelho. As MTs de mamíferos apresentam diferentes arranjos moleculares, classificadas em isoformas. Na aplicação da eletroforese capilar como metodologia analítica para a otimização da separação das isoformas existentes, foram investigados a influência da composição da solução eletrolítica, variações da voltagem, comprimento do capilar e diâmetro interno do capilar. Os perfis eletroforéticos das misturas das MTs purificadas a partir de rim de cavalo e fígado de coelho comparados com a de cianobactéria mostraram uma diferenciação no tempo de migração. Para a separação foram testados eletrólitos tais como fosfato, borato e TRIS-HCl, sendo que os melhores resultados foram obtidos com o tampão TRIS-HCl (70 mM, pH 8,2) com adição de 5% de metanol. A separação eletroforética foi testada em capilares de sílica fundida de 75 e 25 m d.i., comprimento de 40, 50 e 60 cm. As soluções das amostras em volume de 327 nL foram introduzidas por injeção hidrodinâmica. As diferenças de potencial testadas foram de 10, 15, 20 e 25 kV. As melhores condições de separação foram atingidas empregado TRIS-HCl com 5% metanol como solução eletrolítica, em capilar de 60 cm e diferença de potencial de 20 kV o que estabilizou a corrente de separação em 42 \'mü\'A. Os resultados mostraram que a eletroforese capilar mostrou-se eficiente para separação das MTs de mamifero e da Synechococcus devido às diferenças de carga e tamanho das moléculas / Metallothioneins (MTs) are low molecular weight proteins, which main functions are the regulation of metals levels in the body and detoxification. The capillary electrophoresis (CE) characterization of MT from Synechococcus cyanobacteria was attained by comparison with commercial standards of horse kidney and rabbit liver MTs. The influence of electrolyte, such as phosphate, borate and TRIS-HCl buffers on the separation performance were tested. Also, parameters such as voltage potential, capillary length and capillary inner diameter were investigated to attain optimized separation of mammal and Synechococcus MTs. The electrophoretic profiles of MTs revealed four abundant metallothionein isoforms for the horse kidney sample, one for rabbit liver MTII and two for cyanobacteria Synechococcus. The separation by CE of horse and cyanobacteria MTs mixtures differentiated two sets of signals, the first with four peaks corresponding to the horse sample and the last to Synechococcus. The mixture of rabbit liver MT and cyanobacteria MTs presented a first peak for rabbit MTII and a second for cyanobacteria. Tests were performed trying phosphate, borate and TRIS-HCl buffers, however the best results were attained with TRIS-HCl buffer (70 mM, pH 8.2) with addition of 5% methanol. Different capillary lengths of 40, 50 and 60 cm and two internal diameters of 75 and 25m were tested. Also, voltages of 10, 15, 20 and 25 kV were studied. The best experimental conditions were attained using a 60 cm long capillary, TRIS-HCl plus 5% methanol as electrolyte, the application of 20 kV which allowed maintaining a separation current of 42 \'mü\'A. Results demonstrated that capillary electrophoresis was efficient for separation of MTs of mammals from that of Synechoccocus due their differences on size to charge

Metalotioneínas (MTs) são proteínas de baixa massa molecular, que tem como principal função a regulação dos níveis de metais nos organismos. A caracterização das MTs da cianobactéria Synechococcus PCC 7942 por eletroforese capilar foi feita em comparação com os padrões comerciais de MTs de rim de cavalo e de fígado de coelho. As MTs de mamíferos apresentam diferentes arranjos moleculares, classificadas em isoformas. Na aplicação da eletroforese capilar como metodologia analítica para a otimização da separação das isoformas existentes, foram investigados a influência da composição da solução eletrolítica, variações da voltagem, comprimento do capilar e diâmetro interno do capilar. Os perfis eletroforéticos das misturas das MTs purificadas a partir de rim de cavalo e fígado de coelho comparados com a de cianobactéria mostraram uma diferenciação no tempo de migração. Para a separação foram testados eletrólitos tais como fosfato, borato e TRIS-HCl, sendo que os melhores resultados foram obtidos com o tampão TRIS-HCl (70 mM, pH 8,2) com adição de 5% de metanol. A separação eletroforética foi testada em capilares de sílica fundida de 75 e 25 m d.i., comprimento de 40, 50 e 60 cm. As soluções das amostras em volume de 327 nL foram introduzidas por injeção hidrodinâmica. As diferenças de potencial testadas foram de 10, 15, 20 e 25 kV. As melhores condições de separação foram atingidas empregado TRIS-HCl com 5% metanol como solução eletrolítica, em capilar de 60 cm e diferença de potencial de 20 kV o que estabilizou a corrente de separação em 42 \'mü\'A. Os resultados mostraram que a eletroforese capilar mostrou-se eficiente para separação das MTs de mamifero e da Synechococcus devido às diferenças de carga e tamanho das moléculas / Metallothioneins (MTs) are low molecular weight proteins, which main functions are the regulation of metals levels in the body and detoxification. The capillary electrophoresis (CE) characterization of MT from Synechococcus cyanobacteria was attained by comparison with commercial standards of horse kidney and rabbit liver MTs. The influence of electrolyte, such as phosphate, borate and TRIS-HCl buffers on the separation performance were tested. Also, parameters such as voltage potential, capillary length and capillary inner diameter were investigated to attain optimized separation of mammal and Synechococcus MTs. The electrophoretic profiles of MTs revealed four abundant metallothionein isoforms for the horse kidney sample, one for rabbit liver MTII and two for cyanobacteria Synechococcus. The separation by CE of horse and cyanobacteria MTs mixtures differentiated two sets of signals, the first with four peaks corresponding to the horse sample and the last to Synechococcus. The mixture of rabbit liver MT and cyanobacteria MTs presented a first peak for rabbit MTII and a second for cyanobacteria. Tests were performed trying phosphate, borate and TRIS-HCl buffers, however the best results were attained with TRIS-HCl buffer (70 mM, pH 8.2) with addition of 5% methanol. Different capillary lengths of 40, 50 and 60 cm and two internal diameters of 75 and 25m were tested. Also, voltages of 10, 15, 20 and 25 kV were studied. The best experimental conditions were attained using a 60 cm long capillary, TRIS-HCl plus 5% methanol as electrolyte, the application of 20 kV which allowed maintaining a separation current of 42 \'mü\'A. Results demonstrated that capillary electrophoresis was efficient for separation of MTs of mammals from that of Synechoccocus due their differences on size to charge

Este trabalho apresenta a pesquisa de interação de organismos aquáticos com metais, especificamente cobre e cádmio assim como da combinação deles. Para tanto, descreve-se um protocolo baseado em ensaios de toxicidade com tilápias Oreochromis niloticus, desenvolvido com a finalidade de estabelecer a concentração letal 50 (CL50) 96h. Como recurso adicional, focando a translocação de metais, foram utilizadas soluções enriquecidas isotopicamente de 65Cu (99,7%) e 111Cd (95,5%), as quais foram aplicadas através de injeções intraperitoneais. As concentrações dos metais nos tecidos e nas frações citosólicas do fígado, brânquias e músculo foram determinadas a partir dos extratos preparados em solução tampão tris-HCl 50 mmolL-1, agentes redutores e antiproteolíticos, na proporção 3:1 (m/v). Adicionalmente, foram determinados os teores de proteínas totais seguidos da etapa de isolamento das metalotioneínas. As concentrações letais (CL50) 96h calculadas pelo método Trimmed Spearman-Karber (95% de confiança), foram iguais a 20,13, 3,53 e 1,36 mg L-1 para cádmio, cobre e cobre+cádmio respectivamente. Estes valores indicam uma significativa diferença na sensibilidade dos organismos aos diferentes tratamentos. Observou-se uma redução na bioconcentração dos metais em função da concentração do metal e do tecido analisado, esta é maior para o Cu do que para o Cd e menor para o musculo em relação a brânquia e ao fígado. Os teores de proteínas totais nos tecidos foram determinados e os valores encontrados estiveram entre 3,25 mg/mL para fígados e 11,83 mg/mL para músculo. A presença de MTs nos diferentes tecidos e respectivos tratamentos, foi pesquisada empregando-se eletroforese capilar e separação de proteínas utilizando a eletroforese em gel de poliacrilamida. Por ambas as técnicas eletroforéticas foi possível identificar as metalotioneínas. Contudo, as análises dos extratos dos tecidos por espectrometria de massas, MALDI-TOF/TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization) e ESI-MS (electrospray tandem mass spectrometry ) não mostraram-se adequadas para identificação de metalotioneínas / This paper discuss the interactions of Cd, Cu and it mixture upon aquatic organisms. To reach for these goals lethal 50 (LC50) acute toxicity 96h assays were carried out. In order to assess for the metals translocation in fish, isotopically enriched solutions of 65Cu (99,7%) and 111Cd (95,5%), were used, through an intra-peritoneal injections. Metals concentrations in tissue and in the citossolic fractions of liver, and muscular tissue were analysed in the 50 mmol-1 tris-HCl buffer solutions, reducing and un-proteolitic (3:1) solutions. In addition the total protein content were determinate, followed by the metalothyonein isolation. Lethal concentrations were calculated by the Spearman-Karber method at 95% confidence interval, as 20.13, 3.53 and 1.36 mgL-1 for Cd, Cu and Cd+Cu respectively, which denote differences in organisms sensitivity according to the treatment. Metal bio-concentration was reduced depending on the analyte concentration and kind of tissue, being higher to Cu than to Cd. Total protein concentration varied from 3.35 mg L-1 for liver to 11.83 mg L-1 in the muscular tissue. The occurrence of MTs in tissues and in all treatments were investigated by using both, capillary electrophoresis and gel of polyacrilamide. In all situations the occurrence and identification of Mts were verified, but even with MALDI-TOF/TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization) and ESI-MS (electronspray tandem mass spectrometry), or actual instrumental facilities no satisfactory results were obtained, being not possible the identification of MTs in the analysed samples

Este trabalho apresenta a pesquisa de interação de organismos aquáticos com metais, especificamente cobre e cádmio assim como da combinação deles. Para tanto, descreve-se um protocolo baseado em ensaios de toxicidade com tilápias Oreochromis niloticus, desenvolvido com a finalidade de estabelecer a concentração letal 50 (CL50) 96h. Como recurso adicional, focando a translocação de metais, foram utilizadas soluções enriquecidas isotopicamente de 65Cu (99,7%) e 111Cd (95,5%), as quais foram aplicadas através de injeções intraperitoneais. As concentrações dos metais nos tecidos e nas frações citosólicas do fígado, brânquias e músculo foram determinadas a partir dos extratos preparados em solução tampão tris-HCl 50 mmolL-1, agentes redutores e antiproteolíticos, na proporção 3:1 (m/v). Adicionalmente, foram determinados os teores de proteínas totais seguidos da etapa de isolamento das metalotioneínas. As concentrações letais (CL50) 96h calculadas pelo método Trimmed Spearman-Karber (95% de confiança), foram iguais a 20,13, 3,53 e 1,36 mg L-1 para cádmio, cobre e cobre+cádmio respectivamente. Estes valores indicam uma significativa diferença na sensibilidade dos organismos aos diferentes tratamentos. Observou-se uma redução na bioconcentração dos metais em função da concentração do metal e do tecido analisado, esta é maior para o Cu do que para o Cd e menor para o musculo em relação a brânquia e ao fígado. Os teores de proteínas totais nos tecidos foram determinados e os valores encontrados estiveram entre 3,25 mg/mL para fígados e 11,83 mg/mL para músculo. A presença de MTs nos diferentes tecidos e respectivos tratamentos, foi pesquisada empregando-se eletroforese capilar e separação de proteínas utilizando a eletroforese em gel de poliacrilamida. Por ambas as técnicas eletroforéticas foi possível identificar as metalotioneínas. Contudo, as análises dos extratos dos tecidos por espectrometria de massas, MALDI-TOF/TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization) e ESI-MS (electrospray tandem mass spectrometry ) não mostraram-se adequadas para identificação de metalotioneínas / This paper discuss the interactions of Cd, Cu and it mixture upon aquatic organisms. To reach for these goals lethal 50 (LC50) acute toxicity 96h assays were carried out. In order to assess for the metals translocation in fish, isotopically enriched solutions of 65Cu (99,7%) and 111Cd (95,5%), were used, through an intra-peritoneal injections. Metals concentrations in tissue and in the citossolic fractions of liver, and muscular tissue were analysed in the 50 mmol-1 tris-HCl buffer solutions, reducing and un-proteolitic (3:1) solutions. In addition the total protein content were determinate, followed by the metalothyonein isolation. Lethal concentrations were calculated by the Spearman-Karber method at 95% confidence interval, as 20.13, 3.53 and 1.36 mgL-1 for Cd, Cu and Cd+Cu respectively, which denote differences in organisms sensitivity according to the treatment. Metal bio-concentration was reduced depending on the analyte concentration and kind of tissue, being higher to Cu than to Cd. Total protein concentration varied from 3.35 mg L-1 for liver to 11.83 mg L-1 in the muscular tissue. The occurrence of MTs in tissues and in all treatments were investigated by using both, capillary electrophoresis and gel of polyacrilamide. In all situations the occurrence and identification of Mts were verified, but even with MALDI-TOF/TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization) and ESI-MS (electronspray tandem mass spectrometry), or actual instrumental facilities no satisfactory results were obtained, being not possible the identification of MTs in the analysed samples

O carcinoma epidermoide bucal (CEB) é uma malignidade epitelial que causa grande mortalidade. As metalotioneínas (MTs) são proteínas envolvidas na homeostasia de metais e eventos oxidativos. Estudos de expressão proteica a apontaram como marcadora de prognóstico e comportamento metastático para o CEB. A análise da expressão gênica das mesmas tem auxiliado no entendimento deste papel para outros tumores, mas ainda não foi estudada no CEB. O objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil de expressão gênica das MTs no CEB e em fragmentos de mucosa oral (MOC), além de sua relação com dados clínicopatológicos, comportamento metastático e prognóstico. Para tal, foram utilizadas amostras armazenadas a -80º C no Banco Nacional de Tumores do Instituto Nacional de Câncer, constando de 35 casos de CEB de língua e/ou assoalho bucal e 35 MOC. Todos os fragmentos foram submetidos ao qRT-PCR com uso de TaqMan® para os genes: MT1A, MT1B, MT1E, MT1F, MT1G, MT1H, MT1X, MT2A, MT3 e MT4. A expressão dos genes MT1B e MT1H foi raramente detectada. Houve queda significativa de expressão dos genes MT1A, MT1X, MT3 e MT4 e aumento significativo de expressão de MT1F no CEB com relação à MOC. Casos de baixa expressão de MT1G tiveram pior prognóstico. A alta expressão de MT1X indicou casos não metastáticos e a alta expressão de MT3 indicou casos metastáticos. Em suma, foi demonstrado pela primeira vez o perfil gênico das MTs no CEB, indicando que a mesma pode fornecer informações sobre o prognóstico e comportamento metastático do CEB. / The oral squamous cell carcinoma (OSCC) is a malignancy that causes high mortality. Metallothioneins (MTs) are proteins involved in metal homeostasis and antioxidant events. Studies regarding its protein expression indicated its potential as marker of prognosis and metastatic behavior, also for OSCC. The analysis of its specific gene expression can clarify its importance in these aspects and no study has been done for OSCC. The aim of this work was to evaluate the profile of gene expression of MTs in OSCC and samples of non-neoplastic oral mucosa (OM), evaluating its relationship with clinic-pathologic characteristic, metastatic behavior and prognosis for OSCC. For this, tissue samples archived at -80º C at the National Bank of Tumors of the Brazilian National Institute of Cancer were collected, in a total of 35 cases of OSCC and 35 fragments of OM. All tissues were submitted to qRTPCR with TaqMan® for the genes: MT1A, MT1B, MT1E, MT1F, MT1G, MT1H, MT1X, MT2A, MT3 e MT4, besides the constitutive gene GAPDH. Expressions of MT1B and MT1H were rarely detected. There was significant loss of expression for MT1A, MT1X, MT3 and MT4 and gain of expression for MT1F comparing OSCC with OM. Cases with down-regulation of MT1G had the worst prognosis. Up-regulation of MT1X indicated non-metastatic cases whereas up-regulation of MT3 indicated metastatic ones. In conclusion, this study shows for the first time the profile of gene expression of MTs on OSCC indicating distinctive patterns of regulation for each, and giving associations with prognosis and metastatic behavior of cases.

O carcinoma epidermoide bucal (CEB) é uma malignidade epitelial que causa grande mortalidade. As metalotioneínas (MTs) são proteínas envolvidas na homeostasia de metais e eventos oxidativos. Estudos de expressão proteica a apontaram como marcadora de prognóstico e comportamento metastático para o CEB. A análise da expressão gênica das mesmas tem auxiliado no entendimento deste papel para outros tumores, mas ainda não foi estudada no CEB. O objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil de expressão gênica das MTs no CEB e em fragmentos de mucosa oral (MOC), além de sua relação com dados clínicopatológicos, comportamento metastático e prognóstico. Para tal, foram utilizadas amostras armazenadas a -80º C no Banco Nacional de Tumores do Instituto Nacional de Câncer, constando de 35 casos de CEB de língua e/ou assoalho bucal e 35 MOC. Todos os fragmentos foram submetidos ao qRT-PCR com uso de TaqMan® para os genes: MT1A, MT1B, MT1E, MT1F, MT1G, MT1H, MT1X, MT2A, MT3 e MT4. A expressão dos genes MT1B e MT1H foi raramente detectada. Houve queda significativa de expressão dos genes MT1A, MT1X, MT3 e MT4 e aumento significativo de expressão de MT1F no CEB com relação à MOC. Casos de baixa expressão de MT1G tiveram pior prognóstico. A alta expressão de MT1X indicou casos não metastáticos e a alta expressão de MT3 indicou casos metastáticos. Em suma, foi demonstrado pela primeira vez o perfil gênico das MTs no CEB, indicando que a mesma pode fornecer informações sobre o prognóstico e comportamento metastático do CEB. / The oral squamous cell carcinoma (OSCC) is a malignancy that causes high mortality. Metallothioneins (MTs) are proteins involved in metal homeostasis and antioxidant events. Studies regarding its protein expression indicated its potential as marker of prognosis and metastatic behavior, also for OSCC. The analysis of its specific gene expression can clarify its importance in these aspects and no study has been done for OSCC. The aim of this work was to evaluate the profile of gene expression of MTs in OSCC and samples of non-neoplastic oral mucosa (OM), evaluating its relationship with clinic-pathologic characteristic, metastatic behavior and prognosis for OSCC. For this, tissue samples archived at -80º C at the National Bank of Tumors of the Brazilian National Institute of Cancer were collected, in a total of 35 cases of OSCC and 35 fragments of OM. All tissues were submitted to qRTPCR with TaqMan® for the genes: MT1A, MT1B, MT1E, MT1F, MT1G, MT1H, MT1X, MT2A, MT3 e MT4, besides the constitutive gene GAPDH. Expressions of MT1B and MT1H were rarely detected. There was significant loss of expression for MT1A, MT1X, MT3 and MT4 and gain of expression for MT1F comparing OSCC with OM. Cases with down-regulation of MT1G had the worst prognosis. Up-regulation of MT1X indicated non-metastatic cases whereas up-regulation of MT3 indicated metastatic ones. In conclusion, this study shows for the first time the profile of gene expression of MTs on OSCC indicating distinctive patterns of regulation for each, and giving associations with prognosis and metastatic behavior of cases.

Las líneas de investigación de la presente tesis se encuentran enmarcadas en dos aspectos de la respuesta de los sistemas biológicos ante la presencia de metales. Los sujetos de investigación son tanto (1) elementos individuales (las proteínas denominadas Metalotioneínas), como (2) redes de respuesta global (Metalómica), y su relación e imbricación con el metabolismo celular (Metabolómica). Las metalotioneínas (MT), aunque ubicuas, son probablemente de origen polifilético, de modo que habrían aparecido numerosas “familias de homología” a lo largo de la evolución. El análisis computacional de los miembros de la familia de metalotioneínas en los genomas de Drosophila (5 formas parálogas), en doce especies (12 conjuntos de ortólogos) condujo a la identificación de 60 secuencias de isogenes/proteínas con secuencias de DNA/proteína altamente conservadas. La conservación en el número de isogenes del sistema MT en Drosophila sugiere que la multiplicidad de estos genes es debida a un evento evolutivo anterior a la especiación de este género. A pesar de exhibir una gran plasticidad, la región cromosómica donde se localizan los componentes del sistema de MT en Drosophila, preserva su localización en el elemento Müller E en las doce especies. La arquitectura de los genes, formados por dos exones y un intrón, también se conserva en el conjunto de ortólogos/parálogos. La reorganización identificada en la región cromosómica donde se localizan las isoformas de MT en Drosophila es debida principalmente a eventos de inversión de DNA que implican orientaciones diferentes de los cinco genes. El análisis de las propiedades de coordinación de metales de la isoforma MtnE la clasifican como una Cu-tioneína de carácter intermedio o no extremo, ya que a pesar de formar complejos homometálicos con el Cu, la capacidad de unión de cobre es menor que la observada para el resto de las isoformas. MtnE muestra la capacidad coordinante menos específica, en comparación con el resto de isoformas, lo que sugiere una función fisiológica relacionada con condiciones en las que se necesite un péptido con amplio espectro de coordinación de metales, por ejemplo condiciones de toxicidad mixta por varios metales, o elevado nivel de toxicidad de Cu en los que apoyaría la acción del resto de isoformas. Además se identificaron dos secuencias (BfMT1 y BfMT2) como potenciales MT en el genoma de Branchiostoma floridae, organismo procordado ubicado en la base evolutiva de los vertebrados. Las secuencias de ORFs, sus regiones reguladoras, y correspondientes productos proteicos, mostraron características que los reafirman como potenciales MT. Los genes BfMT1 y BfMT2 fueron identificados in vivo mediante RT-PCR sobre RNA total de organismos de Branchiostoma lanceolatum. Ambos genes se inducen in vivo en B. lanceolatum en condiciones de exceso de metales (Cd o Cu), mostrando BfMT1 un patrón correspondiente a un gen de expresión basal o constitutiva, mientras que la expresión de BfMT2 se corresponde con la de un gen inducible. El tratamiento de organismos vivos con distintas concentraciones de Cd demostró que en condiciones de exceso de este metal, se produce además una disrupción en la homoestasis del zinc. En cuanto a los elementos de respuesta global, desarrollamos el estudio genómico y transcriptómico de las redes de respuesta de S. cerevisiae como organismo modelo ante dosis excesivas de Zn que alteran sus equilibrios homeostáticos. Resultados previos de nuestro grupo mostraron una interrelación entre las vías metabólicas de respuesta a estrés de Zn y aquellas de distintos metales. Análisis de varios mutantes tolerantes a zinc nos permitió identificar una imbricación relevante entre procesos metabólicos vitales como la respiración, la respuesta a estrés oxidativo, la estabilidad del DNA mitocondrial y la tolerancia a zinc mediante redes de respuesta y señalización global que implican interconexiones de proceso / This thesis is framed in two aspects of the of biological systems responses to metals. The subjects of research are: (1) individual elements (proteins called Metalothioneins), and (2) networks of global response (Metallomics), and their relationship and overlap with cellular metabolism (metabolomics). Computational analysis of the members of the family of MTs in the genomes of Drosophila (5 forms parálogas), twelve species (12 sets of orthologous) led to the identification of 60 isogenes/proteins with highly conserved sequences and architecture of DNA/protein sequences. All the components of the MT system are located in the Müller E element in the twelve species. The MtnE isoform is classified as a not extreme Cu-thionein, despite forming homometallic complexes with the Cu. MtnE shows the less specific coordinating capacity compared with the rest of isoforms, suggesting a physiological function related to the need for a peptide with a broad spectrum of coordination of metals. We also identified two sequences (BfMT1 and BfMT2) as potential MTs in the genome of Branchiostoma floridae. ORFs sequences, their regulatory regions, and corresponding protein products, showed characteristics which confirm them as potential MT. The BfMT1 and BfMT2 genes were identified in vivo using RT-PCR on total RNA from Branchiostoma lanceolatum. Both genes are induced in vivo in B. lanceolatum in excess of metals (Cd or Cu) conditions, showing BfMT1 a pattern corresponding to a basal or constitutive expression gene, while the expression of BfMT2 corresponds with an inducible gene. The treatment of living organisms with different concentrations of Cd showed that under conditions of excess of this metal, there is also a disruption in zinc homoestasis. With respect to the elements of global response, we studied the metabolic responses of S. cerevisiae to high zinc. Previous results of our group showed an interconnection of zinc related metabolic pathways and those related to other metals. Analysis of several mutants tolerant to high zinc allowed us to identify a significant overlap between metabolic life processes such as respiration, oxidative stress response, stability of mitochondrial DNA and tolerance to high zinc through networks of response and global signalling involving interconnected processes.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In this study, acute effects of mercury on mouse blood, kidneys and liver were evaluated. Mice received a single dose of mercuric chloride (HgCl2 - 4.6 mg/kg, subcutaneously) for three consecutive days. We investigated the possible beneficial effects of antioxidant therapy (N-acetylcysteine (NAC) and diphenyl diselenide (PhSe)2) comparing to sodium salt of 2,3-dimercapto-1-propanesulfonic acid (DMPS), an effective chelating agent on mercury exposure in mice. We also verified if metallothionein (MT) induction would be involved in a possible mechanism of protection against mercury poisoning and if different therapies would modify MT levels and other toxicological parameters. The results demonstrated that animals treated with mercuric chloride presented a reduction in the body weight gain and therapies did not were effective in reverting this damage. HgCl2 exposure inhibited δ-aminolevulinic dehydratase (δ-ALA-D) activity in liver and only DMPS treatment prevented the inhibitory effect. Animals treated with mercury presented an increase in renal NPSH and therapies did not modify these levels. Urea concentration was increased after mercury exposure. NAC plus (PhSe)2 was partially effective in protecting against this effect of mercury . DMPS and (PhSe)2 were effective in restoring the increment in urea concentration caused by mercury. Thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS), ascorbic acid levels, aspartate (AST) and alanine (ALT) aminotransferases were not modified after mercury exposure. Moreover, mercury poisoning caused an increase in hepatic and renal MT levels and antioxidant therapies did not modify this parameter. Our data pointed out the lack of the therapeutic effect of antioxidants tested. / Neste trabalho foram avaliados os efeitos da intoxicação aguda induzida por cloreto de mercúrio (HgCl2) em sangue, rim e fígado de camundongos. Os animais receberam uma única dose de HgCl2 (4,6 mg/Kg de peso), via sub-cutânea, por três dias consecutivos. Investigou-se o possível efeito protetor da terapia com antioxidantes (N-acetilcisteína-NAC e disseleneto de difenila-(PhSe)2) comparando ao ácido 2,3-dimercapto-1-propanosulfônico (DMPS), um agente quelante efetivo contra intoxicações por mercúrio. Além disto, foi verificado se a indução de metalotioneínas (MT) poderia estar envolvida em um possível mecanismo de proteção contra a intoxicação pelo mercúrio e se as diferentes terapias poderiam modificar os níveis de MT e outros parâmetros toxicológicos. Os resultados demonstraram que os animais tratados com cloreto de mercúrio apresentaram uma redução no ganho de peso corporal e as terapias não foram efetivas em reverter este dano. A exposição ao HgCl2 causou inibição na atividade da enzima δ-aminolevulinato desidratase (δ-ALA-D) em fígado de camundongos e somente a terapia com DMPS foi efetiva em reverter esta inibição. Os animais tratados com mercúrio apresentaram um aumento nos níveis de NPSH renal e as terapias não modificaram estes níveis. A concentração de uréia foi aumentada nos animais expostos ao cloreto de mercúrio. A terapia com NAC + (PhSe)2 foi parcialmente efetiva em proteger contra este efeito do mercúrio. Já as terapias com DMPS e (PhSe)2 foram efetivas em proteger contra o aumento nos níveis de uréia induzido pelo mercúrio. As substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), os níveis de ácido ascórbico e as transaminases (aspartato-AST e alanina-ALT) não foram alteradas após a exposição ao HgCl2. Além disso, os resultados demonstraram que a exposição ao mercúrio causou um aumento nos níveis de metalotioneínas hepático e renal e as terapias com antioxidantes não modificaram este parâmetro. Nossos dados apontam para a falta de efeito terapêutico dos antioxidantes testados.

Zinc, cadmium, and mercury are divalent metals and constitute same group of the periodic table. While zinc is an essential metal, the others are toxic metals. The most important common feature among these metals is the ability to induce the synthesis of metallothioneins (MT), which occurs in two vital organs involved in detoxification, the liver and kidney. The main role of MT is the detoxification of heavy metals and the regulation of homeostasis of essential trace metals, such as copper and zinc. There are several studies about mercury toxicity and the role of MT in adult animals. However, the sensitivity of developing animals to various compounds differs from that observed in adults and may to related to different posnatal phases of the development. The aim of this investigation was to verify the effects of CdCl2 and ZnCl2 pretreatments on the deleterious effects of HgCl2 in young rats and to investigate whether MT were involved in this protection mechanism. When pups were three days old, they received five consecutive injections (s.c.) of saline, CdCl2 (3.7 mg/kg/day) or ZnCl2 (27.0 mg/kg/day). On the five subsequent days, the animals were injected daily with one dose (s.c.) of saline or HgCl2 (5.0 mg/kg). Pups were sacrificed 24 h after the last dose and samples were collected (blood, liver and kidneys). The body and renal weights, hepatic and renal porphobilinogen synthase (PBG-synthase) activity, alanine aminotransferase activity, creatinine, urea, glycemia, and the retention of heavy metal in tissues were significantly altered by HgCl2. Prior exposure to CdCl2 prevented the effect of mercury on renal PBG-synthase, but did not alter mercury levels in the tissues. In general, the effects of mercury were prevented or lessened by zinc, except that the zinc pre-treatment increased the retention of mercury in the kidneys and did not modify the increase of renal weight induced by mercury. MT contents were increased by treatments with mercury and zinc and the greatest increase was induced by latter. The metal distribution in subcellular fractions showed that in both the insoluble fraction (IF) and heat treated cytosolic fraction (HTC), the contents were modified by the treatments. Although the HTC fraction is rich in MT, higher zinc and mercury contents were verified in the IF from all tissues analyzed. The relationships between MT and HTC metals showed that in the hepatic and renal tissues whenever there is an increase of metal levels there is increase of MT content. The reduction of hepatic and blood mercury levels and the increase of this metal in the kidneys induced by zinc suggests that the heavy metal contained in the liver is carried to the kidneys through the blood. This process also would transport MT from the liver to the kidneys. Moreover, it is important to emphasize that in cells in proliferation, which occur during rapid growth, there are nuclear and mitochondrial MT. Therefore, the high content of mercury found in the IF, enriched fraction in nucleus and mitochondria, would be bound to MT, as well. Considering that the zinc pretreatment induced an increase of renal MT of around 80% and the group treated with zinc and mercury presented a content of mercury in this protein that was 25% higher than for the group treated only with mercury, these results suggest that MT are, at least in part, responsible for the reduction of the toxicity of mercury seen in the various parameters analyzed in this work. / O zinco, o cádmio e o mercúrio são metais divalentes pertencentes ao mesmo grupo da tabela periódica. O primeiro é um metal essencial e os demais são metais tóxicos. A característica comum mais notável entre eles é a capacidade de induzir à síntese de metalotioneínas (MT), que ocorre em dois órgãos vitais envolvidos na destoxificação, fígado e rins. A principal função das MT é a destoxificação de metais pesados e a regulação da homeostase de metais essenciais, como cobre e zinco. Há muitos estudos sobre a toxicidade do mercúrio e sobre o papel das MT em animais adultos. Entretanto, a sensibilidade de animais em desenvolvimento a vários compostos difere daquela observada em adultos e pode estar relacionada a diferentes intervalos pós-natais de desenvolvimento. O objetivo desta investigação foi verificar os efeitos dos pré-tratamentos com CdCl2 e ZnCl2 sobre os efeitos deletérios do HgCl2 em ratos jovens e investigar se as MT estão envolvidas neste mecanismo de proteção. Ratos de três dias de idade foram injetados com uma dose diária (s.c.), nos cinco dias consecutivos, de salina, CdCl2 (3,7 mg/kg) ou ZnCl2 (27,0 mg/kg). Nos cinco dias subseqüentes os animais foram injetados com uma dose diária (s.c.) de salina ou HgCl2 (5,0 mg/kg). Os animais foram sacrificados 24 h após a última dose e as amostras foram coletadas (sangue, figado e rins). Os pesos corporal e renal, a atividade da porfobilinogênio sintase (PBG-sintase) hepática e renal, a atividade da alanina aminotransferase, a creatinina, a uréia, a glicemia e a retenção do metal tóxico pelos tecidos foram significativamente alterados pelo HgCl2. A exposição prévia ao CdCl2 preveniu o efeito do mercúrio sobre a PBG-sintase renal, mas não alterou os níveis de mercúrio nos tecidos. Em geral, os efeitos do mercúrio foram prevenidos ou atenuados pelo zinco, exceto que o pré-tratamento com zinco aumentou o acúmulo de metal pesado nos rins e não modificou o aumento do peso renal induzidos pelo mercúrio. O conteúdo de MT foi aumentado pelos tratamentos com mercúrio e zinco e a sua maior elevação foi induzida pelo zinco. A distribuição de metal nas frações subcelulares mostrou que em ambas, fração insolúvel (FI) e fração citosólica tratada a quente (CTQ), os conteúdos foram modificados pelos tratamentos. Embora a fração CTQ seja rica em MT, os maiores conteúdos de zinco e mercúrio foram verificados na FI de todos os tecidos analisados. As relações entre MT e metais na fração CTQ revelaram que nos tecidos hepático e renal sempre que há um aumento nos teores de metal, há um aumento no conteúdo de MT. A redução dos níveis de mercúrio hepático e sangüíneo e o aumento do conteúdo desse metal nos rins induzidos pelo zinco sugerem que o metal pesado contido no fígado é transportado para os rins pelo sangue. Esse processo também pode estar carreando MT do fígado para os rins. Além disso, é importante salientar que em células em proliferação, o que ocorre durante o crescimento acelerado, há MT nos núcleos e nas mitocôndrias. Desse modo, o alto conteúdo de mercúrio encontrado na FI, fração rica em núcleos e mitocôndrias, também estaria associado às MT. Considerando que o pré-tratamento com zinco induziu a um aumento de 80% no conteúdo de MT renal e o grupo tratado com zinco e mercúrio apresentou um conteúdo 25% maior de metal tóxico nessa proteína do que aquele verificado no grupo que foi tratado somente com mercúrio, esses resultados sugerem que as MT são, pelo menos em parte, responsáveis pela redução da toxicidade do mercúrio verificada em vários parâmetros analisados nesse trabalho.