Aufgrund ihres sehr hohen Metastasierungsrisikos weisen Patienten mit klarzelligem Nierenzellkarzinom (kzNZK) eine sehr hohe Sterblichkeit auf. Mit den zurzeit zur Verfügung stehenden klinischen Parametern kann der Krankheitsverlauf der Patienten nach der operativen Entfernung des Primärtumors nur unzureichend vorhergesagt werden. Um das Nachsorge- und Therapieregime der Patienten zu optimieren, muss die Vorhersagegenauigkeit der bestehenden Prognosemodelle durch molekulare Marker erhöht werden. Um geeignete Gene für eine Abschätzung von Metastasierungsrisiko und krankheitsfreiem Überleben (DFS) zu identifizieren, wurden genomweite Expressionsanalysen sowohl an Lungenmetastasen (n = 24) als auch an Primärtumoren (n = 24) des kzNZK vorgenommen. Durch Vergleich von Metastasensubgruppen, die sich nach unterschiedlich langen DFS entwickelt hatten bzw. Primärtumoren, die nach unterschiedlich langen DFS Metastasen bedingten, wurden tumorintrinsische DFS-assoziierte Expressionsmuster identifiziert. Weiterhin wurden Gene identifiziert, deren Expression sich zwischen Primärtumoren unterschied, die im Krankheitsverlauf manifeste Metastasen bedingten und solchen, die dies nicht taten. Die differenzielle Expression funktionell interessanter, teilweise auch in anderen publizierten Microarraystudien an kzNZK bestätigter Gene wurde im Folgenden mittels quantitativer Polymerasekettenreaktion (qPCR) validiert. Anschließend wurde die Assoziation ausgewählter Gene mit klinischen Parametern und dem Überleben der Patienten untersucht. Ein von klinischen Parametern unabhängiger Einfluss auf den Krankheitsverlauf der Patienten wurde dabei für EDNRB und PECAM1 auf Expressionsebene (qPCR; n = 86) sowie für TSPAN7 auf Proteinebene (Immunhistochemie an „Tissue Microarrays“; n = 106) belegt. EDNRB und PECAM1 waren signifikant höher exprimiert in Primärtumoren mit günstigen klinischen Parametern (TNMI/II, G1/2, V0, N0/M0). TSPAN7 war vorwiegend in den Gefäßen der primären kzNZK nachweisbar; eine signifikant höhere Zahl TSPAN7-positiver Gefäße war ebenfalls in Tumoren mit günstigen klinischen Parametern zu verzeichnen (pT1/2, TNMI/II, N0). Überlebensanalysen zeigten ein signifikant längeres DFS für Patienten mit einer hohen im Vergleich zu solchen mit einer geringen EDNRB-Expression und für Patienten, die in beiden untersuchten Gewebestanzen der „Tissue Microarrays“ TSPAN7-positive Gefäße aufwiesen im Vergleich zu Patienten mit nur einer oder keiner TSPAN7-gefäßpositiven Stanze. Für Patienten mit einer hohen im Vergleich zu solchen mit einer geringen EDNRB- bzw. PECAM1-Expression oder mit zwei im Vergleich zu keiner oder einer TSPAN7-gefäßpositiven Gewebestanze war zudem ein signifikant längeres tumorspezifisches Überleben (TSS) zu verzeichnen. Mit Hilfe multivariater Cox-Regressionsanalysen wurde eine unabhängige günstige prognostische Relevanz für EDNRB auf das DFS sowie für EDNRB, PECAM1 und TSPAN7 auf das TSS nachgewiesen. Somit sind diese molekularen Faktoren geeignet, um die Genauigkeit der bestehenden und ausschließlich auf klinischen Parametern basierenden Prognosemodelle zu erhöhen. Für eine Abschätzung von DFS und Metastasierungsrisiko erscheint dabei insbesondere EDNRB geeignet. / Patients with clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) have an extremely poor prognosis due to their high risk of metastases. Currently used clinico-patological parameters are insufficient for reliable prediction of metastatic risk and disease free survival (DFS) after surgical resection of the primary tumor. Molecular markers are strongly needed to improve outcome prediction, and thus to optimize the follow up and treatment schedule for patients with ccRCC. To identify genes which are suitable for the prediction of metastatic risk and DFS, genome-wide expression analyses were performed on pulmonary metastases (n = 24) and primary tumors (n = 24) obtained from patients with ccRCC. Tumor-intrinsic DFS-associated expression patterns were observed by comparing subgroups of metastases, which had developed within different DFS as well as primary tumors, which had caused metastases after different DFS. Furthermore, genes differentially expressed in primary tumors, which caused macroscopic metastases and tumors, which did not were identified. The differential expression of genes with a potential function in metastatic spread, which has in part been identified in independent published microarray studies as well, were validated by quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Moreover, an independent prognostic impact on the survival of ccRCC patients was observed for the EDNRB und the PECAM1 gene expression (qPCR; n = 86) as well as for the TSPAN7 protein level (immunohistochemistry on tissue microarrays; n = 106). Primary tumors of patients with favourable clinico-pathological parameters (TNMI/II, G1/2, V0, N0/M0) showed a significantly higher EDNRB und PECAM1 gene expression than those with unfavorable parameters. TSPAN7 was predominantly detected in blood vessels of ccRCC tissues. In patients with favourable clinico-pathological parameters (pT1/2, TNMI/II, N0) a significantly higher number of TSPAN7-positive vessels was observed. Using survival analyses, a significantly longer DFS was observed for patients with a high compared to those with a low EDNRB expression as well as for patients with TSPAN7-positive vessels in both cores compared to no or one of the both cores investigated on tissue microarrays. A significantly longer TSS was observed for patients with a high EDNRB or PECAM1 expression as well as for patients with TSPAN7-positive vessles in both tissue cores investigated. Furthermore, EDNRB was an independent prognostic factor for the DFS of the patients; EDNRB, PECAM and TSPAN7 had an independent prognostic impact on the TSS. Therefore, these molecular markers are suitable to improve the accuracy of outcome prediction based on clinico-pathological parameters in ccRCC. For the prediction of DFS and metastatic risk EDNRB is particularly interesting.

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Made available in DSpace on 2014-12-17T15:32:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AndreaFS_tese.pdf: 610478 bytes, checksum: 22934e3fba7a401686d3b0057e0e7f35 (MD5) Previous issue date: 2007-07-11 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / The expression of bone morphogenetic proteins (BMPs) is altered in a variety of human canceres. The BMP-2/4 and BMPR-IA were recently shown to be overexpressed in high-risk premalignant and malignant lesions of oral epithelium. The present study analysed the expression of BMP-2/4 and BMPR-IA in Oral Squamous Cell Carcinoma (OSCC) such as their implications in disease prognostic using munohistochemistry. Ten cases of Oral Fibroepithelial Hiperplasia were selected as a control group. The experimental group included 16 cases of OSCC without metastases and 7 cases of OSCC metastatic. The presence or absence of nodal metastases was used as parameter to evaluated the disease prognostic. The results demonstrated weak immunoreactivity for BMP-2/4 and BMPR-IA in every case of the control group. In the cases of OSCC with metastases an overexpression of BMP-2/4 (71,4%) was observed while the BMPR-IA showed weak expression (85,7%). In the cases of OSCC without metastases BMP-2/4 (62,5%) and BMPR-IA showed strong immunostaining standing out an overexpression of the receptor in all the specimens. Observed statistical significance for correlation between the oral cancer prognostic and the staining intensity of the BMP-2/4 (p=0,002). There wasn t statistical significance for association between the staining intensity of the BMPR-IA and the disease prognostic (p<0,001). In conclusion, this findings suggest that the overexpression of BMP-2/4 associated with the loss of expression of the BMPR-IA in OSCC metastatic has prognostic relevance, as the loss of sensitivity to BMPs can be an indicative of metastases development in OSCC / A express?o das prote?nas morfogen?ticas ?sseas (BMPs) est? alterada em v?rios c?nceres humanos. A BMP-2/4 e o BMPR-IA foram recentemente encontrados superexpressos em les?es malignas e pr?-malignas de alto risco em epit?lio oral. Este estudo analisou a express?o da BMP-2/4 e seu receptor BMPR-IA em 23 esp?cimes de Carcinoma Epiderm?ide Oral (CEO), utilizando a imuno-histoqu?mica. O grupo controle constou de 10 casos de Hiperplasia Fibro-epitelial da mucosa oral. O grupo experimental foi constitu?do por 16 casos de CEO n?o metast?tico e 7 casos de CEO metast?tico. Utilizou-se o par?metro presen?a ou aus?ncia de met?stase nodal para avaliar o progn?stico da doen?a. Os resultados demonstraram imunorreatividade fraca para a BMP-2/4 e o BMPR-IA em todos os esp?cimes do grupo controle. No grupo experimental com met?stase, a BMP-2/4 exibiu forte expressividade (71,4%), enquanto que o BMPR-IA mostrou fraca express?o (85,7%). No grupo experimental sem met?stase, evidenciou-se forte express?o para a BMP-2/4 (62,5%) e para o BMPR-IA (100%). Encontrou-se signific?ncia estat?stica para a associa??o entre o progn?stico do CEO e a intensidade de marca??o da BMP-2/4 (p=0,002). Para o BMPR-IA n?o houve signific?ncia estat?stica ? sua associa??o com o progn?stico da doen?a (p<0,001), em fun??o do tamanho da amostra. Portanto, os resultados sugerem que a fraca expressividade do BMPR-IA associada ? forte express?o da BMP-2/4, no grupo experimental com met?stase, tem relev?ncia progn?stica, j? que a perda de sensibilidade ?s BMPs, atrav?s da perda de express?o de seus receptores pode ser indicativo de desenvolvimento de met?stase em CEO

Résumé:IntroductionLa chirurgie reste le seul traitement à visée curative pour les patients porteurs d’un cancer colorectal (CCR) primitif ou métastatique. L’établissement précis de l’extension de la maladie, au niveau de la tumeur primitive, des ganglions loco-régionaux et des métastases à distance représente un élément essentiel pour la prise en charge thérapeutique. Les ganglions locorégionaux et la technique du ganglion sentinellePour les patients présentant un CCR non métastatique, l’analyse pathologique des ganglions (pN) conditionne la décision d’administrer ou non une chimiothérapie adjuvante. Les patients présentant un envahissement ganglionnaire (pN+) recevront un traitement adjuvant, celui-ci n’étant le plus souvent pas indiqué chez les patients sans envahissement ganglionnaire (pN0). Près de 20 à 30% des patients classés pN0 vont cependant développer des récidives tumorales. Parmi ces patients, il est probable qu’une partie ait été sous-classée au moment du diagnostic. La technique du ganglion sentinelle (GS) permet d’identifier les ganglions les plus susceptibles d’être envahis et de réaliser des analyses anatomopathologiques plus approfondies sur un nombre plus limité d’échantillon. Cette technique est recommandée dans le cancer du sein et dans le mélanome, mais son rôle reste discuté dans le CCR. Le premier volet de cette thèse concerne les résultats d’études cliniques que nous avons menées pour évaluer le rôle de la technique du GS au bleu patenté (BP) et de l’imagerie en fluorescence (IF) au vert d’indocyanine ou indocyanine green (ICG) dans le staging ganglionnaire des patients présentant un CCR. Les principaux objectifs de ces travaux étaient d’évaluer la faisabilité de ces techniques et leur apport dans le staging des patients présentant un CCR.Notre première étude sur la technique du GS au BP, représentant la plus grande cohorte monocentrique européenne, a permis de démontrer la faisabilité de la technique. En outre, cette approche a modifié le geste chirurgical dans 12% des cas (technique in vivo) et a permis de reclasser 10% des patients initialement classés pN0 en pN+ par la réalisation de coupes sériées spécifiquement réalisées sur les ganglions démontrés comme GS. Dans une seconde étude sur la technique du GS comparant l’IF-ICG à la technique au BP, nous avons montré que ces 2 techniques étaient complémentaires, permettant d’augmenter la sensibilité globale pour la détection des métastases ganglionnaires. De plus, l’IF-ICG apparaît comme plus sensible chez les patients présentant une surcharge pondérale. En termes de sensibilité, la recherche du GS par IF est supérieure à la technique BP, ces résultats restant cependant limités, notamment en raison d’un taux élevé de faux négatifs (FN) pour les tumeurs localement avancées (pT3-4). Les métastases ganglionnaires et la carcinose péritonéaleDans le CCR, les patients métastatiques, présentant une carcinose péritonéale (CP) et/ou un envahissement ganglionnaire, ont un pronostic sombre. La chirurgie d’exérèse de la CP associée à une chimiothérapie hyperthermique intrapéritonéale (CHIP) et la réalisation de curages ganglionnaires chez les patients porteurs d’une maladie oligométastatique permettent toutefois d’obtenir des survies prolongées et parfois des guérisons, avec des résultats similaires à ceux observés chez les patients opérés pour métastases hépatiques isolées. Pour la CP, l’étendue de la maladie et la radicalité de la résection sont les principaux facteurs pronostiques de survie. La sensibilité des examens d’imagerie conventionnelle et métabolique reste cependant faible pour déterminer l’extension de la maladie péritonéale. L’évaluation de l’étendue de la CP et son exérèse sont donc essentiellement fondées sur la palpation et l’exploration visuelle réalisée durant l’intervention chirurgicale, représentant un facteur limitant pour la radicalité de la chirurgie. De façon similaire, chez les patients présentant une maladie métastatique ganglionnaire limitée, la détection peropératoire est souvent difficile, nécessitant la réalisation de curages étendus de principe, afin de s’assurer de l’exérèse des ganglions pathologiques.L’utilisation de l’IF après injection iv intra-opératoire d’ICG a été rapportée comme une technique permettant la détection de tissu tumoral tant visible que non visible (infraclinique), pouvant potentiellement aider le chirurgien et guider les gestes de résection. Aucune étude n’avait particulièrement analysé le rôle de l’IF-ICG dans la détection de CP et de métastases ganglionnaires de CCR. Le second volet de cette thèse concerne l’évaluation de l’apport de l’IF après injection iv d’ICG pour la détection de la CP et des métastases ganglionnaires dans le CCR. L’objectif primaire était de vérifier si les métastases péritonéales (MP) et ganglionnaires visibles par le chirurgien étaient effectivement détectées par l’IF-ICG peropératoire. En parallèle, nous avons évalué si l’IF-ICG permettait de détecter une maladie infraclinique, non détectée par le chirurgien dans les conditions habituelles. La première étude de cette seconde partie a permis de montrer que les MP étaient visualisées comme hyperfluorescentes à l’IF-ICG pour autant qu’elles ne soient pas d’origine mucineuse. De plus, l’IF-ICG a permis de détecter des MP non visualisées en lumière visible, permettant d’adapter le geste chirurgical et d’augmenter la radicalité de la résection dans près de 38% des cas. Dans une seconde étude, nous avons rapporté que la technique d’IF utilisée in vivo et ex vivo après injection iv d’ICG permettait d’identifier des ganglions métastatiques, détectés ou non par les imageries conventionnelles et métaboliques préopératoires. Les résultats de cette étude constituant une preuve de concept ont été ensuite confirmés dans une étude rétrospective réalisée sur l’analyse ex vivo des ganglions de patients ayant reçu une injection iv d’ICG. Dans ce travail, nous avons montré que les ganglions envahis étaient plus fluorescents que les ganglions non envahis. Toutefois, cette preuve de concept doit encore être confirmée et évaluée plus largement dans une étude prospective. Ces 2 travaux montrent donc le bénéfice potentiel de l’utilisation de l’IF après injection iv d’ICG à 2 niveaux, pour guider la chirurgie en améliorant la détection peropératoire des sites métastatiques infracliniques et pour guider l’analyse histologique, en identifiant des ganglions fluorescents sur la pièce de résection, permettant une étude anatomopathologique plus ciblée et plus approfondie. Conclusions et perspectivesNos travaux sur la recherche du GS dans le CCR par la technique au BP et à l’IF-ICG ont montré que ces techniques étaient faisables mais que leurs sensibilités restaient limitées, en particulier chez les patients porteurs de tumeurs localement avancées. Dans la CP d’origine colorectale, nous avons montré que l’IF-ICG permettait d’améliorer la stadification de la CP des patients opérés de métastases péritonéales non mucineuses, de révéler des lésions non visibles dans les conditions standards et d’améliorer la radicalité de la chirurgie. Pour la détection de ganglions métastatiques, nous avons montré que l’IF-ICG permettait, in vivo, de détecter des ganglions infracliniques durant l’intervention et ex vivo, de guider l’analyse anatomopathologique de la pièce de résection. Enfin, nous pensons que ces observations pourraient nous permettre d’élaborer un nouveau concept de GS systémique par opposition au GS classique correspondant aux ganglions de drainage anatomique de la tumeur. Nous proposons que les capacités particulières de rétention de l’ICG dans les tissus cancéreux après injection par voie systémique pourraient permettre d’identifier des sites ganglionnaires métastatiques en dehors des sites de drainage révélés par les injections de marqueurs au sein ou en périphérie de la tumeur elle-même. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons élaboré un nouveau protocole d’une étude clinique prospective dans laquelle la détection du GS systémique après injection iv d’ICG sera comparée aux résultats obtenus suite à l’injection péritumorale de BP. Les ganglions révélés par ces 2 techniques seront recherchés ex vivo sur la pièce de résection et analysés en anatomopathologie. Outre la démonstration de métastases ganglionnaires extra-anatomiques, nous pensons que cette approche systémique pourrait permettre de réduire le taux de FN observé suite à une injection péritumorale, notamment pour les tumeurs localement avancées, celles-ci pouvant perturber le drainage lymphatique selon les voies anatomiques. Summary:This thesis reports several clinical research works on the role of indocyanine green (ICG) fluorescence imaging (FI) for the detection of colorectal tumoral tissue. We first evaluate and compare the role of ICG-FI in the detection of sentinel lymph node (SLN) in colorectal cancer (CRC) in view to upstage patients. We have reported that both techniques (blue dye and ICG-FI) are similar in term of sensitivity with a high rate of false negative results. Therefore, we think that new approaches for SLN detection should be developped in CRC. Secondarily, we evaluate the role of ICG-FI after IV ICG injection for the detection of peritoneal carcinomatosis (PC) from CRC origin. We have reported that ICG-FI is able to detect non-mucinous PM with a sensitivity of 86%. Moreover, ICG-FI was able to guide surgery modifying the surgical procedure in 38% of patients. Thirdly, we investigate the role of ICG-FI for the detection lymph node (LN) metastases. We have reported that ICG-FI performed after IV ICG injection is able to detect LN metastases both in vivo and ex vivo. These findings have been confirmed in a retrospective study. Fiinally, we propose a new protocol to evaluate a new approach for SLN detection. In comparison with the standard technique using peritumoral injection, we propose a new approach using systemic (intravenous) ICG injection. We have called this approach the 'systemic' SLN detetion. This approach will be compared with the standard one using peritumoral blue dye injection. Sensitivity, specificity of both technique will be compared. In conclusion, the results of these preliminary clinical studies using ICG-FI for tumoral staging and treatment are encouraging and further larger studies should be performed. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Au cours des dernières années, une nouvelle classe de composés anticancéreux à base de ruthénium, appelés RDCs (Ruthenium-Derived Compounds), a été développé pour dépasser les limitations des agents chimiothérapiques contenants du platine. Contrairement à ces derniers, l’activité anticancéreuse des RDCs est en partie indépendante de l'interaction avec l'ADN. L’objectif principal de ma thèse a été ainsi de comprendre les mécanismes moléculaires quiinter viennent dans l’action anticancéreuse et antimétastatique des RDCs au-delà du dommage à l’ADN.J’ai démontré que le RDC11, contrairement au cisplatine, affecte les voies de signalisation de HIF-1 et mTOR, deux voies qui jouent un rôle clé dans le métabolisme cellulaire et qui sont souvent altérées dans les cellules cancéreuses.En parallèle, j’ai effectué un analyse structure/activité pour sélectionner des nouveaux RDCs ayant meilleures propriétés chimiques et pharmacologiques que le RDC11. Cette étude a permis d’identifier deux nouveaux RDCs qui réduisent la croissance tumorale in vivo avec un dosage beaucoup plus faible que le RDC11 et qui induisent la mort des cellules cancéreuses par une surproduction d'espèces réactives de l'oxygène et par l'activation de la caspase8. En conclusion, mes travaux ont conduit à l’identification de nouveaux mécanismes à la base de l’activité anticancéreuse du RDC11 qui pourraient expliquer certaines différences entre le mode d’action du RDC11 et du cisplatine. De plus, ils ont permis de sélectionner deux nouveaux RDCs plus efficaces que le RDC11. Ces résultat sont un impact important pour le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses ou antimétastatiques. / In recent years, a new class of anticancer ruthenium-based drugs, called RDCs (Ruthenium-Derived Compounds), has been developed to overcome the limitations of classic platinum chemotherapeutics. Unlike the latter, the anticancer activity of RDCs is in part independent of DNA interaction. Therefore, the main objective of my thesis work was to elucidate the molecular mechanisms involved in RDCs anticancer and antimetastatic activity beyond DNA damage. I demonstrated that RDC11, unlike cisplatin, affects the HIF-1 and mTOR signaling pathways, two pathways that play a key role in cellular metabolism and that are frequently altered in cancer cells. In parallel, I performed a structure/activity analysis to select new RDCs endowed with better chemical and pharmacological properties than RDC11. This study allowed to identify two novel RDCs that reduce tumor growth in vivo at much lower doses than RDC11 and that induce cancer cell death by an overproduction of reactive oxygen species and activation of caspase 8. In conclusion, my work led to the identification of new mechanisms underlying the anticancer activity of RDC11 that could explain some of the differences between the mode of action of RDC11 and cisplatin. In addition, it allowed to select two novel RDCs which are more effective than RDC11. These results have a significant impact on the development of new anticancer or antimetastatic therapies.

Dans notre travail de thèse, nous nous sommes attachés à répondre à cette question : peut-t-on améliorer la résécabilité tumorale dans le métastases hépatiques et péritonéales du cancer colorectal? Pour cela nous nous sommes appuyés sur deux éléments : la fluorescence du vert d’indocyanine et sa détection par la caméra NIR. Dans un premier temps, après une mise au point en laboratoire, nous avons appliqué cette technique aux résections hépatiques. Nous avons montré que cette technique a un double intérêt : la détection des lésions tumorales et l’amélioration de la marge de résection oncologique. La question encore ouverte est le pourcentage de cellules cancéreuses ou précancéreuses présentent dans cette couronne fluorescente. Dans un deuxième temps nous avons appliqué cette technique dans la carcinose péritonéale. Il s’agit d’une première étude de faisabilité car nous n’avons retrouvé aucune publication sur ce sujet. Nous avons pu montrer des similitudes avec l’étude sur le foie. La fluorescence de l’ICG permet de détecter des tumeurs du péritoine difficilement visibles à l’œil nu grâce à l’intensité et à la qualité de la fluorescence même. Les perspectives sont centrées sur deux axes: l’agent fluorescent, le vert d’indocyanine, et les caméras NIR / In our work of PhD, we endeavored to answer this question: do we can improve tumor resectability in the liver and peritoneal metastases of colorectal cancer? For this, we relied on two elements: the fluorescence of indocyanine green and its detection by NIR camera. Initially, after formal laboratory development, we applied this technique to liver resections. We have shown that this technique has two advantages: the detection of tumor lesions and improving the margin of oncologic resection. The still open question is the percentage of cancerous or precancerous cells present in the fluorescent ring. Secondly, we applied this technique in peritoneal carcinomatosis. This is a first feasibility study because we did not find any publications on this topic. We could show similarities with the study on the liver. The fluorescence from ICG can detect tumors of the peritoneum hardly visible to the naked eye through the intensity and quality of the fluorescence. The outlook is focused on two areas: the fluorescent agent, indocyanine green, and NIR cameras

Les tumeurs pulmonaires, qu’elles soient primaires (principalement représentées par le cancer du poumon non-à-petites cellules) ou secondaires (métastases), causent la mort de plusieurs centaines de milliers de personnes par an à travers le monde. Malgré les modalités de traitements existantes, un plateau thérapeutique a été atteint avec un taux de survie à 5 ans de maximum 15%. Actuellement, il est connu que le cancer du poumon non-à-petites cellules ainsi que les métastases sont intrinsèquement résistants à l’apoptose.<p>Pour apporter des réponses aux principales problématiques rencontrées avec l’administration systémique de la chimiothérapie conventionnelle qui est principalement constituée d’agents pro-apoptotiques, nous avons développé des formulations à base d’agents antinéoplasiques aux propriétés anticancéreuses non pro-apoptotiques qui sont destinées à être administrées de manière localisée par la voie inhalée. Il faut savoir que l’inhalation est la voie d’administration préférentielle des principales affections respiratoires telles que l’asthme, la bronchopneumonie chronique obstructive et la mucoviscidose. <p>La première partie de ce travail a consisté à produire et à évaluer des formulations à base de témozolomide destinées à être administrées chez la souris porteuse de pseudo-métastases pulmonaires (issues d’un mélanome expérimental, le modèle B16F10), soit via la voie intraveineuse (iv) conventionnelle soit via la voie inhalée à l’aide d’un dispositif endotrachéal approprié. La suspension pour inhalation a été produite à l’aide de technique de réduction de taille et a été stabilisée à l’aide de phospholipides compatibles avec la voie pulmonaire. L’activité anticancéreuse in vitro a été vérifiée pour le témozolomide formulé sous forme de suspension pour inhalation et de solution intraveineuse par rapport à du témozolomide non formulé sur des lignées de cellules cancéreuses de cancer humain NSCLC A549, de glioblastome humain T98G et de mélanome murin B16F10. Cette dernière lignée a été utilisée pour générer les pseudo-métastases pulmonaires chez la souris en injectant les cellules de mélanomes dans la voie systémique via la veine caudale. La reproductibilité de la dose et de l’aérosol générés à partir de la suspension pour inhalation à l’aide du dispositif d’administration endotrachéal et la déposition des gouttelettes dans les poumons de la souris ont pu être respectivement évaluées avec précision par une méthode de quantification du témozolomide qui a été validée par nos soins, par des techniques de diffraction laser et par des techniques de microscopie à fluorescence et d’analyse d’images histologiques. Enfin, l’activité antitumorale in vivo et la tolérance des traitements conventionnels ou localisés ont été vérifiées chez la souris porteuse de ces pseudo-métastases pulmonaires B16F10. Les résultats ont montré que le dispositif endotrachéal utilisé permettait de produire des doses et des aérosols reproductibles et de déposer les gouttelettes d’aérosol profondément dans les poumons des souris. De plus, lors de l’étude in vivo, les traitements administrés étaient bien tolérés et la dose de témozolomide administré sous forme de suspension pour inhalation à l’aide du dispositif endotrachéal avait permis d’obtenir une efficacité antitumorale similaire à une dose similaire de témozolomide administrée par la voie iv conventionnelle. De plus, 11% (3/27) de souris « long-survivantes » avaient été observées avec le groupe traité par inhalation trois fois par semaine pendant trois semaines consécutives et les poumons de ces long-survivants avaient présenté une éradication quasi complète des tumeurs pulmonaires. Ce phénomène n’avait pas été observé dans les groupes de souris traitées de manière conventionnelle.<p>Ensuite, la seconde partie de notre travail a consisté en l’élaboration du témozolomide sous forme de poudres sèches pour inhalation destinées à être délivrées à l’aide d’un dispositif à poudre sèche à usage humain. Pour ce faire, nous avons développé les poudres sèches pour inhalation à l’aide de techniques de réduction de taille pour microniser la poudre de départ et d’atomisation pour évaporer le solvant et élaborer un enrobage autour des particules micronisées. La nature de l’enrobage était soit hydrophile soit lipophile. Ensuite les caractéristiques physicochimiques telles que les propriétés thermiques, les propriétés cristallines, la distribution de taille particulaire et la morphologie des formulations de poudre sèche pour inhalation ont été évalués à l’aide de techniques appropriées telles que la calorimétrie différentielle à balayage, la diffraction des rayons X sur poudre, la diffraction de la lumière laser et la microscopie électronique à balayage. Les profils de déposition pulmonaire et de dissolution ont été respectivement déterminés in vitro à l’aide de l’essai de la pharmacopée européenne utilisant l’impacteur à cascade multi-étages et d’un test de dissolution adapté aux formes pulmonaires. Les quatre formulations élaborées présentaient des caractéristiques physicochimiques intéressantes pour la stabilité à long-terme de la substance active et des formulations. De plus, deux formulations de poudre sèche pour inhalation (les formulations F1 et F2) présentaient des propriétés aérodynamiques tout à fait attrayantes avec une fraction minimale de poudre déposée au niveau du tractus respiratoire supérieure et une fraction maximale de poudre déposée au niveau du tractus respiratoire inférieur où se localisent les tumeurs pulmonaires. De plus, l’ensemble des formulations ont montré que la fraction sélectionnée des particules fines des poudres sèches pour inhalation libérait 75% du témozolomide dans le liquide simulant le fluide pulmonaire endéans les dix premières minutes du test de dissolution in vitro adapté aux formes pulmonaires. <p>Enfin, nous avons comparé l’efficacité et la tolérance in vivo d’une de nos formulations de poudre sèche de témozolomide pour inhalation administrée soit sous forme de suspension, soit sous forme de poudre sèche, à l’aide du dispositif endotrachéal approprié chez la souris porteuse de pseudo-métastases pulmonaires. L’uniformité de la dose délivrée par les différents dispositifs a été évaluée à l’aide d’une technique quantitative validée. Les résultats de cette étude ont montré qu’en administrant une formulation de poudre sèche sous forme d’un mélange de poudres plutôt que sous forme d’une suspension liquide, les doses en témozolomide à administrer pour obtenir une efficacité comparable était au moins deux fois moins élevées. Cependant, le dispositif endotrachéal pour les formulations de poudre présentait plus de variabilité au niveau de la dose délivrée que le dispositif endotrachéal pour les formulations liquides ce qui induit une variabilité dans les doses délivrées. Pour clôturer ce travail, nous avons appliqué certaines techniques que nous avons développées pour le témozolomide à une nouvelle molécule de synthèse, le trivanillate polyphénolique 13c, qui montre des propriétés anticancéreuses intéressantes dans le cadre des tumeurs pulmonaires. En effet, une méthode quantitative a été développée et a été validée. Une étude de pré-formulation et des essais de formulation pour produire une suspension, des complexes d’inclusion et des microparticules lipidiques ont été entrepris avec de relativement bons résultats pour les complexes d’inclusion élaborés avec des gamma cyclodextrines qui permettaient d’augmenter la solubilité dans l’eau de la molécule de 13c d’un facteur d’au moins 1,5×106. De plus, les particules de 13c montraient la particularité de se solubiliser dans un mélange dichlorométhane/éthanol (1 :1 v/v) ce qui nous a permis d’élaborer des microparticules lipidiques pour lesquelles les propriétés de mouillage devront être améliorées dans l’avenir./<p>Primary lung tumors, mainly represented by non-small-cell lung cancers (cancers NSCLC), or secondary lung tumors (metastasis) cause the death of hundred thousand human beings worldwide. Despite the therapeutic modalities used, the five-year survival rate reaches only 15%. Nowadays, it is known that cancers NSCLC and metastasis are intrinsically resistant to apoptosis.<p>To overcome the main problems occurring with the systemic delivery of conventional chemotherapy which are mainly constituted of non-specific and non selective pro-apoptotic agents, we have developed some formulations based on non pro-apoptotic antineoplasic drugs which are designed to be delivered by a localized administration, the inhalation. Indeed, inhalation is the preferential route to treat the main pulmonary affections such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease or cystic fibrosis.<p>The first part of this work consisted to produce and evaluate temozolomide-based formulations designed to be delivered to mice bearing pulmonary pseudo-metastases (using a experimental melanoma, the B16F10 model), either by the conventional intravenous (iv) route or by inhalation using an endotracheal device appropriate to mice. The suspension for inhalation was produced by means of a high pressure homogenizing technique using phospholipids compatible with the lungs to stabilize the suspension. The in vitro anticancer activity was evaluated for both temozolomide-based formulations in comparison with non-formulated temzolomide on three cancer cell lines, a human NSCLC cancer cells (A549), a human glioblastoma cancer cells (T98G) as positive control and a murine melanoma cancer cells (B16F10). The latter was used to generate lung tumors in mice by injecting the melanoma cells by iv. Reproducibility of delivered dose and generated aerosol by the endotracheal device from the suspension for inhalation and the deposition of droplets in the mouse lungs were precisely evaluated by means of a validated HPLC determination method, a laser diffraction technique and fluorescent microscopy and histological image analysis, respectively. Then, the tolerance and the antitumor efficacy of iv or inhaled temozolomide-based treatments were evaluated on mice bearing pulmonary pseudo-metastases B16F10. The results showed that endotracheal device produced reproducible doses and aerosols and that the aerosol droplets were deposited deeply in the mouse lungs. Moreover, the temozolomide-based treatments were well tolerated in terms of weight evolution and the inhaled based-temozolomide treatments were able to get the same antitumor efficacy in terms of median survival rate as the conventional iv based-temozolomide treatments delivered at a same frequency. Moreover with the group treated by inhalation three times a week during three consecutive weeks, 11% (3/27) mice survived with an almost complete eradication of lung tumors which was not observed with the groups treated by conventional route.<p>Then, the second part of our work consisted to produce temozolomide-based dry powders for inhalation able to be delivered with a dry powder inhaler for human use. We developed the dry powders for inhalation using a high-pressure homogenizing technique to micronize temozolomide particles and then spray-drying technique to coat temozolomide microparticles. The coating was either hydrophilic or lipophilic. Then, the physicochemical characteristics such as thermal or crystalline properties, the particle size distribution and the particle morphology were evaluated for the four dry powders for inhalation by means of differential scanning calorimetry, x-ray powder diffraction, laser light scattering and scanning electron microscopy, respectively. The in vitro pulmonary deposition and dissolution were respectively determined by European pharmacopeia assay for the aerodynamic assessment of fine particles using a multi-stage liquid impinger and by dissolution test optimized for inhaler products. The four formulations produced presented physicochemical properties promoting long-term stability of temozolomide and formulations.Moreover, two of them (dry powder without coating or with a thin lipid coating) showed attractive aerodynamic properties with a minimal fraction of powder deposited in the oropharyngeal and tracheal zones and maximal fraction deposited in the lungs (almost 50% of the nominal dose) where the lung tumors are localized. Moreover, fine particle fraction of all formulations showed a fast release and dissolution of temozolomide with more than 75% of temozolmide dissolved within 10 minutes in the simulated lung fluid during the in vitro dissolution test optimized for dry powders for inhalation.<p>Then, we compared the in vivo antitumor efficacy and tolerance of one of dry powders for inhalation on mice bearing pulmonary pseudo-metastases B16F10. The dry powder for inhalation was administered either by dispersing it as a extemporaneous suspension able to be delivered by the endotracheal device for liquid forms or by mixing it with a spray-dried diluent able to be delivered by the endotracheal device for dry powders. The uniformity of delivered dose by the different endotracheal device was evaluated by a validated quantitative method. The results showed that the delivery of the powder mixture presented the same antitumor efficacy as the extemporaneous suspension but for a half dose of temozolomide. However, the endotracheal device for dry powders presented a higher variability of delivered dose than the endotracheal device for liquid forms.<p>Finally, we apply the pulmonary application on a polyphenol developed in the Faculty of Pharmacy, the molecule 13c, that showed very interesting in vitro anticancer properties against lung tumors. So, a quantitative method was developed and was validated. A preformulation studie was performed and formulation developements are on-going.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Lors du diagnostic de cancer colorectal, près d’un quart des patients ont des métastases hépatiques dites synchrones. Lorsque la tumeur primitive est asymptomatique, la stratégie chirurgicale (chirurgie première de la tumeur primitive versus chirurgie première des métastases hépatiques) reste débattue. Les recommandations actuelles ne reposent que sur des accords d’experts qui elles-mêmes sont basées sur des études cliniques rétrospectives. L’étude du microenvironnement tumoral a pris ces dernières années une place majeure dans la recherche sur le cancer. Elle a permis de changer de paradigme avec une nouvelle conception du processus métastatique : une tumeur primitive peut agir sur le microenvironnement du futur site métastatique pour créer une "niche pré-métastatique". Cette niche pré-métastatique permettrait secondairement la croissance des cellules tumorales via une angiogénèse tumorale et la formation de métastases. Par une triple approche à la fois fondamentale, translationnelle et clinique, nous avons obtenu des données qui suggèrent qu’une chirurgie première de la tumeur colique ou rectale permet de moduler l’angiogénèse au sein du microenvironnement hépatique. Cette stratégie chirurgicale permettrait également d’améliorer le pronostic oncologique des malades et l’efficacité des anti-angiogéniques. / At the time of the diagnosis of colorectal cancer, nearly 25% of patients have synchronous liver metastases. When this tumor is asymptomatic, the question of surgical strategy (primary tumor first versus liver-first strategy) remains debated. Current recommendations are based on agreements of experts which are by themselves based on retrospective clinical studies. The study of the tumor microenvironment has taken in recent years a major place in the field of cancer research. It leads to new paradigm with a new conception of the metastatic process. It may be possible that the microenvironment of the metastatic sites can be modulated by the primary tumor to promote the formation of the pre-“metastatic niche”. This leads to promote the growth of cancer cells and increase the metastatic potential of primary tumor. By a multidisciplinary research including fundamental, translational and clinical approaches, we have shown that primary tumor first strategy could modulate tumor angiogenesis and liver metastatic process. It is associated with improved survival of patients and efficacy of the anti-angiogenic therapy.

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In breast cancer therapeutic decisions are based on the expression of estrogen (ER), progesterone (PR), the human epidermal growth factor 2 (HER2) receptors and the proliferation marker Ki67. However, only little is known concerning heterogeneity between the primary tumor and axillary lymph node metastases (LNM) in the primary site. We retrospectively analyzed receptor profiles of 215 early breast cancer patients with axillary synchronous LNM. Of our cohort, 69% were therapy naive and did not receive neoadjuvant treatment. Using immunohistochemistry, receptor status and Ki67 were compared between core needle biopsy of the tumor (t-CNB) and axillary LNM obtained during surgery. The discordance rates between t-CNB and axillary LNM were 12% for HER2, 6% for ER and 20% for PR. Receptor discordance appears to already occur at the primary site. Receptor losses might play a role concerning overtreatment concomitant with adverse drug effects, while receptor gains might be an option for additional targeted or endocrine therapy. Hence, not only receptor profiles of the tumor tissue but also of the synchronous axillary LNM should be considered in the choice of treatment.