O osteossarcoma é um tumor ósseo maligno, de maior ocorrência em cães, possui rápido crescimento e alto potencial metastático. Assim, o cão é um modelo útil para o estudo da doença em humanos, tendo em vista as semelhanças clínicas e histopatológicas que ocorrem em ambas às espécies. Atualmente, os estudos a respeito de células-tronco são promissores considerando seu alto potencial terapêutico. Entretanto, ainda prevalecem muitas dúvidas referentes ao tratamento de tumores utilizando a terapia celular. Este tema é pouco conhecido e estudado, por isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a interação entre células-tronco obtidas da polpa dentária canina com as células derivadas osteossarcoma canino. Foram realizados cocultivos celulares das células derivadas de polpa dentária canina, osteossarcoma canino e derivadas de osso normal canino. Analisou-se os aspectos morfológicos das células cocultivadas e controle, assim como a atividade proliferativa, a morte celular, o potencial elétrico mitocondrial e a expressão gênica. A partir dos resultados obtidos, concluiu-se que a interação entre a célula-tronco da polpa dentária canina imatura e as células de osteosarcoma canino não apresentam alterações morfológicas. Entretanto, as células-tronco derivadas da polpa dentária canina e de osso fetal canino sadio parecem servir de suporte para o crescimento tumoral. Além disso, a cocultura celular, em todos os grupos testados, promove alterações na expressão gênica e proteica. / Osteosarcoma is a malignant bone tumor most frequent in dogs. It has fast growth and high metastatic potential. Thus, the dog is an useful model for the study of human disease, due to the clinical and histological similarities found in both species. Currently, studies about stem cells are promising considering its high therapeutic potential. However, many doubts still exist regarding the treatment of tumors using cell therapy. This theme is little known and studied. Therefore, the aim of this study was to evaluate the interaction between stem cells obtained from canine immature dental pulpstem cells with osteosarcoma cells derived from dogs. Cellular coculture were performed using cells derived from canine dental pulp, canine osteosarcoma and canine normal bone. The morphological aspects of cocultured cells and control were analyzed, as well as proliferative activity, cell death, the mitochondrial membrane electric potential and gene expression. In summary, it was concluded that the interaction between stem cells from canine immature dental pulp and canine osteosarcoma cells did not show morphological changes. However, stem cells derived from canine dental pulp and healthy canine fetal bone serve to support tumor growth. Furthermore, the cell coculture in all groups tested, causes changes in gene and protein expression.

Metástases em ovário geralmente se apresentam como o primeiro sinal de doença, com o tumor primário não sendo imediatamente reconhecido. A diferenciação mucinosa é o fenótipo mais comum entre essas metástases. Em algumas situações, quando essa apresentação está associada a carcinomas metastáticos capazes de simular tumores ovarianos primários, essa configuração pode levar até mesmo patologistas experientes a diagnosticar incorretamente um depósito secundário como uma neoplasia primária. A maioria dos casos problemáticos pode ser resolvida correlacionando-se os dados clínicos, as características macroscópicas, os critérios de histologia e o perfil imuno-histoquímico, mas sempre haverá alguns casos com características sobrepostas. Levando-se em conta que a invasão linfovascular conspícua é uma das características que favorecem metástase, nós hipotetizamos que diferentes padrões de microdensidade vascular intratumoral poderiam nos ajudar na definição da origem primária ou secundária do tumor. Um total de 124 casos de tumores mucinosos de ovário foram selecionados, apresentando histologia \"borderline\" e maligna. Eles foram separados em dois grupos (primários ou metastáticos), classificados de acordo com as informações clínicas disponíveis, características macroscópicas e microscópicas, e perfil imuno-histoquímico realizado em amostras de tumores em microarranjo de tecido (TMA). A densidade vascular linfática (DVL) foi analisada quantificando-se espaços vasculares intratumorais identificados pela podoplanina, um marcador endotelial linfático. De acordo com os nossos resultados a DVL foi maior nas neoplasias primárias do que nas secundárias, mas, após análise multivariada, os melhores preditores de um tumor ser secundário foram tamanho de 10,0 cm ou menos (OR 9,4; IC 95% 1,2-69,2), bilateralidade (OR 51,5; IC 95% 7,1-370,2) e negatividade para CK7 (OR 64,8; IC 95% 9,4- 447). De acordo com o conhecimento atual, a disseminação metastática não é um evento aleatório, mas um processo de várias etapas complexas e sequenciais, altamente organizado e tecido específico. É importante aprofundar a relação entre as células tumorais e seu microambiente porque as características moleculares envolvidas podem ser uma possível fonte de novos marcadores que podem permitir uma categorização mais precisa dos tumores mucinosos nos ovários / Ovarian metastases commonly present as the first sign of the disease, with the primary tumor not being immediately recognized. Mucinous differentiation is the most common phenotype among those metastases. In particular situations, when compounded by the known metastatic carcinomas capable of simulate primary tumors, this setting can lead even experienced pathologists to diagnose incorrectly a secondary deposit as a primary neoplasm. Correlating clinical data, macroscopic features, histology criteria and immunohistochemistry profile, can solve the majority of those problematic cases, but there will always be some cases in a gray zone with superimposed characteristics. Since conspicuous lymphovascular invasion is one of the characteristics favoring metastases, we hypothesized if different patterns of intratumoral vascular microdensity can help us in defining the tumor origin. A total of 124 cases of mucinous tumors in ovary were selected, presenting borderline and malignant histology. They were separated in two groups (primary and metastatic) classified according to the available clinical data, gross and microscopic features, and immunohistochemistry profile performed in tumor samples in tissue microarrays (TMA). The lymphatic vascular density (LVD) was analyzed using podoplanin, a lymphatic endothelial marker. According to our results LVD was greater in primary than in secondary neoplasms, but after multivariate analysis, the best predictors of a secondary deposit tumor were size 10,0 cm or less (OR 9.4; CI 95% 1.2- 69.2), bilaterality (OR 51.5; CI 95% 7.1-370.2) and CK7 negativity (OR 64.8; CI 95% 9.4-447). According to actual knowledge metastatic dissemination is not a random event, but a complex and sequential multistep process, highly organized and tissue-specific. It is important to go deeper into the relation between tumor cells and their microenvironment because its molecular features may be a possible source of new markers that could allow a more precise categorization of mucinous tumors in the ovaries

Submitted by Fabíola Silva (fabiola.silva@famerp.br) on 2016-09-29T20:17:35Z No. of bitstreams: 1 josehenriquemferreira_dissert.pdf: 1670640 bytes, checksum: 3707d57cc4f4e98d8edb6594786c1b7e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-29T20:17:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 josehenriquemferreira_dissert.pdf: 1670640 bytes, checksum: 3707d57cc4f4e98d8edb6594786c1b7e (MD5) Previous issue date: 2014-10-20 / Introduction: Mammary neoplasms are the most common type of tumor in dogs. Some proteins play an important role in tumor progression, thus are candidate prognosis markers. During tumor growth, the transcription factor induced by hypoxia (HIF-1α) activates the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), promoting angiogenesis. Interleukin-8 (IL-8) is a pro-inflammatory and pro-angiogenic cytokine and has been associated with tumor progression. Objectives: To evaluate the prognostic value of HIF-1α, VEGF and IL-8 proteins in tumor tissue in dogs with mammary tumors, correlating them with clinicopathological parameters, clinical outcome and survival. Material and Methods: The concentrations of HIF-1α, VEGF and IL-8 proteins were evaluated by ELISA (Enzyme-linked immunosorbent) in macerated tumor of 25 bitches with mammary tumors and control samples and compared statistically. Results: The levels of HIF-1α, VEGF and IL-8 were higher in dogs over the age of 10 years and that had died (p <0.05). Moreover, HIF-1α concentrations were elevated in the tumors of dogs who developed metastases (p = 0.04), while VEGF levels were highest in tumors with clinical stages III and IV (p = 0.03) and IL-8 tumors in tumor with development greater than six months (p = 0.03). Still, high levels of HIF-1α, VEGF and IL-8 were also related to shorter overall survival (p <0.05). Conclusions: High levels of HIF-1α, VEGF and IL-8 are associated with features of poor prognosis, suggesting that the assessment of these proteins in tumor macerated has important prognostic value. / Introdução: As neoplasias mamárias são o tipo mais comum de tumor na espécie canina. Algumas proteínas exercem importante papel na progressão tumoral e portanto, são candidatos marcadores de prognóstico. Durante o crescimento tumoral, o fator de transcrição induzido por hipóxia (HIF-1α) ativa a expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), promovendo a angiogênese. A interleucina-8 (IL-8) é uma citocina pró-inflamatória e pró-angiogênica e tem sido associada à progressão tumoral. Objetivos: Avaliar o valor prognóstico das proteínas HIF-1α, VEGF e IL-8 no tecido tumoral em cadelas com neoplasia mamária, relacionando-os com os parâmetros clínico-patológicos, evolução clínica e sobrevida. Material e Métodos: As concentrações das proteínas HIF-1α, VEGF e IL-8 foram avaliadas pelo método de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent Assay) no macerado tumoral de 25 cadelas com neoplasia mamária e amostras controle e comparadas estatisticamente. Resultados: Os níveis de HIF-1α, VEGF e IL-8 foram maiores em cadelas com idade superior a 10 anos e que vieram a óbito (p < 0,05). Além disso, concentrações de HIF-1α foram elevadas nos tumores de cadelas que desenvolveram metástase (p = 0,04), enquanto os níveis de VEGF foram maiores em tumores com estadiamento clínico III e IV (p = 0,03), e de IL-8 em tumores com evolução tumoral maior que seis meses (p = 0,03). Ainda, níveis elevados de HIF-1α, VEGF e IL-8 também foram relacionados com menor tempo de sobrevida global (p < 0,05). Conclusões: Altas concentrações de HIF-1α, VEGF e IL-8 estão associadas com características de pior prognóstico, sugerindo que a avaliação dessas proteínas no macerado tumoral possui importante valor prognóstico.

Introdução: Os cânceres de mama subtipos Luminal A e B (HER2 negativo) podem apresentar prognóstico variável, a depender do índice de proliferação, avaliado pelo Ki67. As células malignas e as células estromais adjacentes (fibroblastos e células de resposta imune ) podem interagir tanto pelo contato célula a célula como por fatores secretados por elas, ambas influenciando no comportamento tumoral. Já foi demonstrado que as células estromais podem aumentar a proliferação das células do câncer da mama. Objetivo: Nosso objetivo foi avaliar o perfil de expressão gênica de células do estroma em câncer de mama luminal A e luminal B e analisar se este se correlaciona com o prognóstico da doença. Pacientes e Métodos/ Resultados: Amostras de tumores de 11 pacientes na pós menopausa foram analisadas, todas elas HER2 negativas. A expressão de Ki67 foi <= 10 % em 5 pacientes (luminal A) e >= 30 % em outras 6 amostras(Luminal B ). Células estromais foram microdissecadas para a extração de RNA, que posteriormente foi hibridizado na plataforma de microarray Agilent G485 -1A GE 8x60K. Após a normalização, 50 % dos genes com a maior variância foram selecionados para análise por SAM duas classes desemparelhado (software TMEV ) e aceitando FDR 14.1%, 35 sequências foram identificadas como diferencialmente expressas, incluindo 16 genes conhecidos, entre as células estromais das amostras de Luminal A versos Luminal B, todos mais expressos nas amostras B. Dentre as funções biológicas enriquecidas em genes diferencialmente expressos encontram-se regulação positiva do sistema imune, incluindo genes como ZAP70 (proteína quinase 70kDa associada a cadeia zeta (TCR)), CD38 (molécula CD38); UBASH3A (ubiquitina associada e SH3 domínio que contém A); PLA2G7 (fosfolipase A2, grupo VII (fator acetil ativador de plaquetas no plasma)); NCR3 (citotoxicidade natural, provocando receptor 3). Nosso próximo passo foi avaliar se a expressão de alguns genes selecionados estava associada com prognóstico de tumores luminais. Para tal selecionamos amostras de outro grupo de 89 pacientes com seguimento de pelo menos 5 anos, cujos tumores eram ER(+), HER2(-), para análise de expressão proteica em Tissue microarray. Caracterizamos os fibroblastos destas amostras com 3 marcadores de fibroblastos: actina de músculo liso (AML), S100A4 e caveolina-1 (CAV1) e analisamos a marcação da proteína ZAP70. Correlacionamos a expressão proteica de todos os marcadores com as características anatomopatológicas da amostra. Observamos que fibroblastos de todas as amostras de tumor de mama expressam AML, S100A4 e CAV1, em diferentes proporções, entretanto não detectamos diferença entre os tumores luminais A e B. Também não obsevamos diferença de expressão de AML, S100A4 e CAV1 em relação a grau histológico, comprometimento linfonodal e estadiamento clínico. Nestas amostras não detectamos expressão proteica de ZAP70 em fibroblastos tumorais. Conclusão: Houve expressão diferencial de 16 genes relacionados a processos imunes, todos eles mais expressos em células estromais de tumores Luminal B em relação a luminal A / Introduction: Luminal breast cancer subtypes A and B (HER2 negative) may present a variable prognosis, depending on tumor proliferation index, evaluated by Ki67 expression. Malignant cells and adjacent stromal cells (fibroblasts and immune response cells) may interact by both cell contact and secreted factors and influence tumor behavior. It was shown that stromal cells may enhance breast cancer cells proliferation. Objective: Our aim was to evaluate stromal cells gene expression profile in luminal A and luminal B tumors and to evaluate whether selected transcripts expressed in stromal cells may be associated with prognosis in breast cancer. Material/ Methods and Results: Hormone receptor positive tumor samples from 11 post menopausal patients were analyzed, all of them Her2 negative. Ki67 expression <= 10% (luminal A) was observed in five and Ki67 >= 30% (luminal B) in six samples. Stromal cells were microdissected for RNA extraction, which was hybridized in Agilent G485-1A GE 8x60K microarray platform. After normalization, 50% of the genes with the highest variance were selected for further analysis by two class unpaired SAM (TMEV software) and accepting FDR 14,1%, 35 sequences, including 16 known genes, were found differentially expressed between stromal cells from luminal A vs luminal B breast cancer samples, all of them more expressed in luminal B. Among biological functions enriched in genes found differentially expressed were positive regulation of immune system process, including genes as: ZAP70 (zeta-chain (TCR) associated protein kinase 70kDa); CD38 (CD38 molecule); UBASH3A (ubiquitin associated and SH3 domain containing A); PLA2G7 (phospholipase A2, group VII (platelet-activating factor acetylhydrolase, plasma); NCR3 (natural cytotoxicity triggering receptor 3). Our next step was evaluate whether expression of selected genes was associated with prognosis in another group of patients. Tumor samples from 89 patients with at least 5 years of follow up, all of them estrogen receptor positive and HER2 negative, were selected. Tissue microarray was prepared with stromal tumor compartment from paraffin embedded tumor samples. Fibroblasts were characterized for the expression of 3 fibroblasts markers (alfa-SMA, alpha smooth muscel actin; S100A4 and CAV1, caveolin 1), and ZAP70. Correlation of expression of these markers with prognostic variables was determined. Expression of alfa-SMA, S100A4 and CAV1 was detected in fibroblasts from all tumor samples in different proportions, however no differential expression was observed between luminal A and B tumors. Neither difference was detected on the expression of these proteins in relation with histological grade, lymph node involvement and clinical stage. Conclusion: A differential expression of 16 genes involved in immune process was found, all of them more expressed in fibroblasts from luminal B as compared with luminal A tumors

Metástases em ovário geralmente se apresentam como o primeiro sinal de doença, com o tumor primário não sendo imediatamente reconhecido. A diferenciação mucinosa é o fenótipo mais comum entre essas metástases. Em algumas situações, quando essa apresentação está associada a carcinomas metastáticos capazes de simular tumores ovarianos primários, essa configuração pode levar até mesmo patologistas experientes a diagnosticar incorretamente um depósito secundário como uma neoplasia primária. A maioria dos casos problemáticos pode ser resolvida correlacionando-se os dados clínicos, as características macroscópicas, os critérios de histologia e o perfil imuno-histoquímico, mas sempre haverá alguns casos com características sobrepostas. Levando-se em conta que a invasão linfovascular conspícua é uma das características que favorecem metástase, nós hipotetizamos que diferentes padrões de microdensidade vascular intratumoral poderiam nos ajudar na definição da origem primária ou secundária do tumor. Um total de 124 casos de tumores mucinosos de ovário foram selecionados, apresentando histologia \"borderline\" e maligna. Eles foram separados em dois grupos (primários ou metastáticos), classificados de acordo com as informações clínicas disponíveis, características macroscópicas e microscópicas, e perfil imuno-histoquímico realizado em amostras de tumores em microarranjo de tecido (TMA). A densidade vascular linfática (DVL) foi analisada quantificando-se espaços vasculares intratumorais identificados pela podoplanina, um marcador endotelial linfático. De acordo com os nossos resultados a DVL foi maior nas neoplasias primárias do que nas secundárias, mas, após análise multivariada, os melhores preditores de um tumor ser secundário foram tamanho de 10,0 cm ou menos (OR 9,4; IC 95% 1,2-69,2), bilateralidade (OR 51,5; IC 95% 7,1-370,2) e negatividade para CK7 (OR 64,8; IC 95% 9,4- 447). De acordo com o conhecimento atual, a disseminação metastática não é um evento aleatório, mas um processo de várias etapas complexas e sequenciais, altamente organizado e tecido específico. É importante aprofundar a relação entre as células tumorais e seu microambiente porque as características moleculares envolvidas podem ser uma possível fonte de novos marcadores que podem permitir uma categorização mais precisa dos tumores mucinosos nos ovários / Ovarian metastases commonly present as the first sign of the disease, with the primary tumor not being immediately recognized. Mucinous differentiation is the most common phenotype among those metastases. In particular situations, when compounded by the known metastatic carcinomas capable of simulate primary tumors, this setting can lead even experienced pathologists to diagnose incorrectly a secondary deposit as a primary neoplasm. Correlating clinical data, macroscopic features, histology criteria and immunohistochemistry profile, can solve the majority of those problematic cases, but there will always be some cases in a gray zone with superimposed characteristics. Since conspicuous lymphovascular invasion is one of the characteristics favoring metastases, we hypothesized if different patterns of intratumoral vascular microdensity can help us in defining the tumor origin. A total of 124 cases of mucinous tumors in ovary were selected, presenting borderline and malignant histology. They were separated in two groups (primary and metastatic) classified according to the available clinical data, gross and microscopic features, and immunohistochemistry profile performed in tumor samples in tissue microarrays (TMA). The lymphatic vascular density (LVD) was analyzed using podoplanin, a lymphatic endothelial marker. According to our results LVD was greater in primary than in secondary neoplasms, but after multivariate analysis, the best predictors of a secondary deposit tumor were size 10,0 cm or less (OR 9.4; CI 95% 1.2- 69.2), bilaterality (OR 51.5; CI 95% 7.1-370.2) and CK7 negativity (OR 64.8; CI 95% 9.4-447). According to actual knowledge metastatic dissemination is not a random event, but a complex and sequential multistep process, highly organized and tissue-specific. It is important to go deeper into the relation between tumor cells and their microenvironment because its molecular features may be a possible source of new markers that could allow a more precise categorization of mucinous tumors in the ovaries

Introdução: Em câncer de mama, existem evidências de que o microambiente pode influenciar o desenvolvimento do tumor no sítio primário, bem como em metástases regionais e a distância. Neste contexto, fibroblastos são importantes células estromais que podem influenciar a proliferação e a migração de células do câncer e podem prover um nicho apropriado para o desenvolvimento tumoral. Objetivos:O principal objetivo deste trabalho é comparar células estromais obtidas do tumor primário (PT), metástase linfonodal (N+) e medula óssea (BM) de pacientes com câncer de mama, através do perfil de expressão gênica. Pacientes e Métodos: Foi analisada a expressão gênica de fibroblastos (cultura primária) de 11 pacientes com câncer de mama. O perfil de expressão foi determinado em PT (n=4), N+(n=3) e BM (n=4) através de uma plataforma de cDNA microarray customizada (contendo 4.800 sequencias imobilizadas, representando cerca de 4600 genes), e os genes diferencialmente expressos foram identificados pelo teste SAM multiclasse, seguido pelo teste SAM de duas classes (TMEV, FDR 0%). A análise funcional foi realizada pelo software DAVID v6.7. Validação técnica foi realizada em 6 amostras previamente analisadas no microarray e a validação biológica em fibroblastos obtidos de outros 16 pacientes utilizando-se de RT-qPCR. Resultados: O perfil de expressão gênica dos fibroblastos obtidos de diferentes sítios mostraram 267 genes diferencialmente expressos, os quais apropriadamente agruparam os fibroblastos de acordo com suas origens (PT vs. N+ vs. BM). Apesar das diferenças entre PT e N+ serem representadas por 20 genes, as diferenças entre PT vs. BM e N+ vs BM foram mais significantes (235 e 245 genes diferencialmente expressos respectivamente). Análise funcional dos genes diferencialmente expressos mostrou enriquecimento de funções relacionadas ao desenvolvimento e morfogênese.A seguir, a expressão de alguns genes selecionados foi analisada em uma série diferente de amostras (validação biológica). Desse modo observamos que NOTCH2 confirmou uma alta expressão em N+ (vs. PT), e ADCY2, HECTD1, HNMT, LOX, MACF1 e USP16 confirmaram alta expressão em BM (vs PT). Conclusão:Em pacientes com câncer de mama, células estromais obtidas de diferentes origens apresentam um perfil de expressão gênica diferencial, o qual pode influenciar o comportamento do tumor / may influence tumor development in the primary site of breast cancer, as well as in regional and distant metastatic sites. In this context, fibroblasts are important stromal cells which influence proliferation and migration of cancer cells and may also provide an appropriate niche to tumor development. Objectives: The main objective of this work is the comparison of stromal cells from the primary tumor (PT), lymph node metastasis (N+) and bone marrow (BM) obtained from breast cancer patients, through gene expression profile. Patients and Methods: The gene expression profile was analyzed in fibroblasts primary culture from 11 breast cancer patients. The expression profiles of PT cells (n=4), N+ cells (n=3) and BM cells (n=4) were determined through a customized cDNA microarray platform (containing 4800 immobilized sequences which represents 4600 genes approximately). The analysis were performed by SAM multiclass (TMEV; FDR 0%), followed by SAM two classes test (TMEV; FDR 0%). Functional analysis was performed using DAVID v6.7. Technical validation was performed in same 6 samples that were previously analyzed in microarray experiments and biological validation was performed in fibroblasts obtained from other group of 16patients by RT-qPCR Results: The expression profile of fibroblasts obtained from three sites revealed 267 differentially expressed genes, which appropriately clustered fibroblasts in three different branches, in accordance with their origin (PT vs. N+ vs. BM). Although the differences between PT and N+ were represented by 20 genes, differences between PT vs. BM and N+ vs. BM were more significant (235 and 245 differentially expressed genes respectively). Functional analysis revealed enrichment of functions related to development and morphogenesis. Afterwards, the expression of some selected genes were analyzed in a different batch of samples (biological validation).Thereby, NOTCH2 confirmed high expression in N+ (vs. PT), and ADCY2, HECTD1, HNMT, LOX, MACF1 and USP16 confirmed high expression in BM (vs. PT). Conclusion: In breast cancer patients, stromal cells obtained from different origins present a differential gene expression profile, which may influence tumor behavior

Orientadores: Jorg Kobarg, Jose Andres Yunes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T22:20:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Trindade_DanielMaragno_D.pdf: 7352494 bytes, checksum: 5b03d143205e747b05e3d4b6a8ed8e34 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Staniocalcinas (STCs) representam uma pequena família de hormônios glicoprotéicos, encontrados em todos os vertebrados e composta por STC1 e STC2, que foram inicialmente implicados na homeostase de cálcio e recentemente também foram implicados em vários outros processos. Stanniocalcina-1 (STC1), o primeiro membro encontrado, foi originalmente descoberto em peixes ósseos e posteriormente identificado em humanos onde parece ter um papel, embora ainda obscuro, na carcinogênese e angiogênese. Nos seres humanos STC1 pode ser encontrado em duas formas: um dímero ou um grupo de variantes de alto peso molecular coletivamente chamados bigSTC. Uma vez que ambas as células leucêmicas e os tumores sólidos dependem vascularização, a angiogênese é um passo fundamental na interação tumorhospedeiro e essencial para a progressão do câncer. Análises prévias de microarray resultaram na identificação de vários genes ativados em células endoteliais da medula óssea (BMEC) modulados pela presença de células leucêmicas. Apresentamos aqui STC1 como um marcador microambiente de medula óssea (BMM) durante leucemia linfoblástica aguda (LLA) pela validação dos dados prévios de microarray através de PCR em tempo real quantitativos. Em vista da falta de informações funcionais e estruturais sobre STC1 realizamos: (1) um screen no sistema de duplo híbrido em levedura, a fim de encontrar algumas das proteínas que interagem com a STC1 humana, e (2) uma caracterização estrutural inicial à baixa resolução desta proteína. Fomos capazes de construir um mapa interação proteína-proteína, obtido a partir dos 22 interactantes encontrados em screen de duplo híbrido em levedura. As proteínas encontradas apresentam-se em vários compartimentos celulares nos quais STC1 já foi demonstrada para estar presente, e essas novas informações podem ajudar a esclarecer como e qual o papel STC1 desempenha nesses locais. A fim de fornecer informação estrutural sobre STC1, realizamos análises bioquímicas e estruturais da proteína recombinante STC1 com 6xHis tag produzida em células de inseto utilizando o sistema baculovírus. A análise de dicroísmo circular confirmou a predição in silico do elevado conteúdo de alfa-helices. A análise por espectrometria de massas forneceu os dados experimentais que confirmaram o padrão conservado de pontes dissulfeto anteriormente descrito para STC1 de peixes. Finalmente, os dados de espalhamento de raios-X a baixo ângulo demonstraram que, STC1 adota uma estrutura dimérica, ligeiramente alongada em solução fornecendo deste modo os primeiros dados estruturais à baixa resolução desta família de proteínas. Além disso, foi possível obter proteína suficiente e de elevado grau de pureza para realizar ensaios cristalização que resultaram em cristais os quais difrataram a boa resolução. / Abstract: Staniocalcins (STCs) represent a small family of glycoprotein hormones found in all vertebrates composed by STC1 and STC2, which have been initially implicated in calcium homeostasis and also recently implicated in several other processes. Stanniocalcin-1 (STC1), the first member found, was originally discovered in bony fishes and later identified in humans were it seems to have a role, although still unclear, in carcinogenesis and angiogenesis. In humans STC1 can be found in two forms: a dimer or a group of higher molecular weigh variants collectively called bigSTC. Since both leukemic cells and solid tumors depend on vascularization, angiogenesis is a fundamental step in tumor-host interaction and essential to the cancer progression. Previous microarray analysis resulted in the identification of several activated genes in bone marrow (BM) endothelial cells (BMEC) modulated by presence of leukemic cells. Here we present STC1 as a BM microenvironment marker during acute lymphoblastic leukemia (ALL) by validating previous microarray data by quantitative RealTime-PCR. In view of the lack of functional and structural information on STC1 we performed (1) a yeast two hybrid screen in order to find some of the human STC1 interacting proteins and (2) a initial structural lowresolution characterization of this protein. We were able to construct a protein-protein interaction map, derived from the 22 interactants found in our yeast two-hybrid screen. The proteins found are located in several cellular compartments in which STC1 has already been shown to be present, and the new information might help to clarify how and which role it performs at these sites. As a means to provide structural information about STC1, we performed biochemical and structural analyses of recombinant STC1 6xHis tagged protein produced in insect cells by using the baculovirus system. Circular dichroism analysis confirmed the in silico predicted high alpha-helical content. By mass spectroscopy analysis we provided experimental data that confirmed the conserved disulfide pattern previously described for fish STC1. Finally Small Angle X-ray Scattering data demonstrated that STC1 adopts a dimeric, slightly elongated structure in solution, providing there by the first low resolution structural data of this family of proteins. Additionally, we could obtain enough protein of high purity to perform crystallization trials that resulted in crystals diffracting at good resolution. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Introdução: Os cânceres de mama subtipos Luminal A e B (HER2 negativo) podem apresentar prognóstico variável, a depender do índice de proliferação, avaliado pelo Ki67. As células malignas e as células estromais adjacentes (fibroblastos e células de resposta imune ) podem interagir tanto pelo contato célula a célula como por fatores secretados por elas, ambas influenciando no comportamento tumoral. Já foi demonstrado que as células estromais podem aumentar a proliferação das células do câncer da mama. Objetivo: Nosso objetivo foi avaliar o perfil de expressão gênica de células do estroma em câncer de mama luminal A e luminal B e analisar se este se correlaciona com o prognóstico da doença. Pacientes e Métodos/ Resultados: Amostras de tumores de 11 pacientes na pós menopausa foram analisadas, todas elas HER2 negativas. A expressão de Ki67 foi <= 10 % em 5 pacientes (luminal A) e >= 30 % em outras 6 amostras(Luminal B ). Células estromais foram microdissecadas para a extração de RNA, que posteriormente foi hibridizado na plataforma de microarray Agilent G485 -1A GE 8x60K. Após a normalização, 50 % dos genes com a maior variância foram selecionados para análise por SAM duas classes desemparelhado (software TMEV ) e aceitando FDR 14.1%, 35 sequências foram identificadas como diferencialmente expressas, incluindo 16 genes conhecidos, entre as células estromais das amostras de Luminal A versos Luminal B, todos mais expressos nas amostras B. Dentre as funções biológicas enriquecidas em genes diferencialmente expressos encontram-se regulação positiva do sistema imune, incluindo genes como ZAP70 (proteína quinase 70kDa associada a cadeia zeta (TCR)), CD38 (molécula CD38); UBASH3A (ubiquitina associada e SH3 domínio que contém A); PLA2G7 (fosfolipase A2, grupo VII (fator acetil ativador de plaquetas no plasma)); NCR3 (citotoxicidade natural, provocando receptor 3). Nosso próximo passo foi avaliar se a expressão de alguns genes selecionados estava associada com prognóstico de tumores luminais. Para tal selecionamos amostras de outro grupo de 89 pacientes com seguimento de pelo menos 5 anos, cujos tumores eram ER(+), HER2(-), para análise de expressão proteica em Tissue microarray. Caracterizamos os fibroblastos destas amostras com 3 marcadores de fibroblastos: actina de músculo liso (AML), S100A4 e caveolina-1 (CAV1) e analisamos a marcação da proteína ZAP70. Correlacionamos a expressão proteica de todos os marcadores com as características anatomopatológicas da amostra. Observamos que fibroblastos de todas as amostras de tumor de mama expressam AML, S100A4 e CAV1, em diferentes proporções, entretanto não detectamos diferença entre os tumores luminais A e B. Também não obsevamos diferença de expressão de AML, S100A4 e CAV1 em relação a grau histológico, comprometimento linfonodal e estadiamento clínico. Nestas amostras não detectamos expressão proteica de ZAP70 em fibroblastos tumorais. Conclusão: Houve expressão diferencial de 16 genes relacionados a processos imunes, todos eles mais expressos em células estromais de tumores Luminal B em relação a luminal A / Introduction: Luminal breast cancer subtypes A and B (HER2 negative) may present a variable prognosis, depending on tumor proliferation index, evaluated by Ki67 expression. Malignant cells and adjacent stromal cells (fibroblasts and immune response cells) may interact by both cell contact and secreted factors and influence tumor behavior. It was shown that stromal cells may enhance breast cancer cells proliferation. Objective: Our aim was to evaluate stromal cells gene expression profile in luminal A and luminal B tumors and to evaluate whether selected transcripts expressed in stromal cells may be associated with prognosis in breast cancer. Material/ Methods and Results: Hormone receptor positive tumor samples from 11 post menopausal patients were analyzed, all of them Her2 negative. Ki67 expression <= 10% (luminal A) was observed in five and Ki67 >= 30% (luminal B) in six samples. Stromal cells were microdissected for RNA extraction, which was hybridized in Agilent G485-1A GE 8x60K microarray platform. After normalization, 50% of the genes with the highest variance were selected for further analysis by two class unpaired SAM (TMEV software) and accepting FDR 14,1%, 35 sequences, including 16 known genes, were found differentially expressed between stromal cells from luminal A vs luminal B breast cancer samples, all of them more expressed in luminal B. Among biological functions enriched in genes found differentially expressed were positive regulation of immune system process, including genes as: ZAP70 (zeta-chain (TCR) associated protein kinase 70kDa); CD38 (CD38 molecule); UBASH3A (ubiquitin associated and SH3 domain containing A); PLA2G7 (phospholipase A2, group VII (platelet-activating factor acetylhydrolase, plasma); NCR3 (natural cytotoxicity triggering receptor 3). Our next step was evaluate whether expression of selected genes was associated with prognosis in another group of patients. Tumor samples from 89 patients with at least 5 years of follow up, all of them estrogen receptor positive and HER2 negative, were selected. Tissue microarray was prepared with stromal tumor compartment from paraffin embedded tumor samples. Fibroblasts were characterized for the expression of 3 fibroblasts markers (alfa-SMA, alpha smooth muscel actin; S100A4 and CAV1, caveolin 1), and ZAP70. Correlation of expression of these markers with prognostic variables was determined. Expression of alfa-SMA, S100A4 and CAV1 was detected in fibroblasts from all tumor samples in different proportions, however no differential expression was observed between luminal A and B tumors. Neither difference was detected on the expression of these proteins in relation with histological grade, lymph node involvement and clinical stage. Conclusion: A differential expression of 16 genes involved in immune process was found, all of them more expressed in fibroblasts from luminal B as compared with luminal A tumors

Introdução: Em câncer de mama, existem evidências de que o microambiente pode influenciar o desenvolvimento do tumor no sítio primário, bem como em metástases regionais e a distância. Neste contexto, fibroblastos são importantes células estromais que podem influenciar a proliferação e a migração de células do câncer e podem prover um nicho apropriado para o desenvolvimento tumoral. Objetivos:O principal objetivo deste trabalho é comparar células estromais obtidas do tumor primário (PT), metástase linfonodal (N+) e medula óssea (BM) de pacientes com câncer de mama, através do perfil de expressão gênica. Pacientes e Métodos: Foi analisada a expressão gênica de fibroblastos (cultura primária) de 11 pacientes com câncer de mama. O perfil de expressão foi determinado em PT (n=4), N+(n=3) e BM (n=4) através de uma plataforma de cDNA microarray customizada (contendo 4.800 sequencias imobilizadas, representando cerca de 4600 genes), e os genes diferencialmente expressos foram identificados pelo teste SAM multiclasse, seguido pelo teste SAM de duas classes (TMEV, FDR 0%). A análise funcional foi realizada pelo software DAVID v6.7. Validação técnica foi realizada em 6 amostras previamente analisadas no microarray e a validação biológica em fibroblastos obtidos de outros 16 pacientes utilizando-se de RT-qPCR. Resultados: O perfil de expressão gênica dos fibroblastos obtidos de diferentes sítios mostraram 267 genes diferencialmente expressos, os quais apropriadamente agruparam os fibroblastos de acordo com suas origens (PT vs. N+ vs. BM). Apesar das diferenças entre PT e N+ serem representadas por 20 genes, as diferenças entre PT vs. BM e N+ vs BM foram mais significantes (235 e 245 genes diferencialmente expressos respectivamente). Análise funcional dos genes diferencialmente expressos mostrou enriquecimento de funções relacionadas ao desenvolvimento e morfogênese.A seguir, a expressão de alguns genes selecionados foi analisada em uma série diferente de amostras (validação biológica). Desse modo observamos que NOTCH2 confirmou uma alta expressão em N+ (vs. PT), e ADCY2, HECTD1, HNMT, LOX, MACF1 e USP16 confirmaram alta expressão em BM (vs PT). Conclusão:Em pacientes com câncer de mama, células estromais obtidas de diferentes origens apresentam um perfil de expressão gênica diferencial, o qual pode influenciar o comportamento do tumor / may influence tumor development in the primary site of breast cancer, as well as in regional and distant metastatic sites. In this context, fibroblasts are important stromal cells which influence proliferation and migration of cancer cells and may also provide an appropriate niche to tumor development. Objectives: The main objective of this work is the comparison of stromal cells from the primary tumor (PT), lymph node metastasis (N+) and bone marrow (BM) obtained from breast cancer patients, through gene expression profile. Patients and Methods: The gene expression profile was analyzed in fibroblasts primary culture from 11 breast cancer patients. The expression profiles of PT cells (n=4), N+ cells (n=3) and BM cells (n=4) were determined through a customized cDNA microarray platform (containing 4800 immobilized sequences which represents 4600 genes approximately). The analysis were performed by SAM multiclass (TMEV; FDR 0%), followed by SAM two classes test (TMEV; FDR 0%). Functional analysis was performed using DAVID v6.7. Technical validation was performed in same 6 samples that were previously analyzed in microarray experiments and biological validation was performed in fibroblasts obtained from other group of 16patients by RT-qPCR Results: The expression profile of fibroblasts obtained from three sites revealed 267 differentially expressed genes, which appropriately clustered fibroblasts in three different branches, in accordance with their origin (PT vs. N+ vs. BM). Although the differences between PT and N+ were represented by 20 genes, differences between PT vs. BM and N+ vs. BM were more significant (235 and 245 differentially expressed genes respectively). Functional analysis revealed enrichment of functions related to development and morphogenesis. Afterwards, the expression of some selected genes were analyzed in a different batch of samples (biological validation).Thereby, NOTCH2 confirmed high expression in N+ (vs. PT), and ADCY2, HECTD1, HNMT, LOX, MACF1 and USP16 confirmed high expression in BM (vs. PT). Conclusion: In breast cancer patients, stromal cells obtained from different origins present a differential gene expression profile, which may influence tumor behavior