Microbial rhodopsins are widespread bacteriorhodopsin-like proteins found in many prokaryotes and lower eukaryotic groups. They serve as photosensors, light-driven ion pumps, and light-gated channels. The main goal of this thesis was to spectroscopically characterize a new subgroup of fungal rhodopsins (so-called auxiliary group) and a new type of rhodopsin found in flavobacteria. Towards the first goal, products of two known rhodopsin genes from the fungal wheat pathogen, Phaeosphaeria nodorum, were investigated. The two yeast-expressed Phaeosphaeria rhodopsins were spectroscopically characterized by Raman, time-resolved visible and Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and shown many similarities: absorption spectra, conformation of the retinal chromophore, fast photocycling, and carboxylic acid protonation changes. It is likely that both Phaeosphaeria rhodopsins are proton-pumping, at least in vitro. We suggest that auxiliary rhodopsins have separated from their ancestors fairly recently and have acquired the ability to interact with as yet unidentified transducers, performing a photosensory function without changing their spectral properties and basic photochemistry. In the second project, we studied a flavobacterial rhodopsin with highly unusual sequence, which was functionally expressed in E.coli by our collaborators and produced light-induced pH changes in the spheroplast suspensions, suggesting an inward H+ transport. Using time-resolved visible spectroscopy, we revealed that its photochemical reaction cycle was fast and strongly dependent on cations. Analysis of the sequence alignments, combined with visible and FTIR spectroscopic studies of the wild-type and mutant flavobacterial rhodopsin, provided the clues for the mechanism of binding metal ions and origin of the observed light-induced pH changes. Finally, isotope labeling protocol, previously used for soluble secreted proteins, was successfully implemented and optimized to produce homogeneous samples of eukaryotic rhodopsin from Leptosphaeria in methylotrophic yeast. Isotope-labeling extent and functionality were verified by FTIR spectroscopy, and obtained samples gave high-resolution ssNMR spectra suitable for structural studies. This protocol for overexpression of isotope-labeled multi-spanning eukaryotic membrane proteins in Pichia pastoris can be adopted for challenging mammalian targets, which often resist characterization by other structural methods. / Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC)

Cellular lipid membranes can – and often do – support a transmembrane electric field, serving as biological capacitors that maintain a voltage difference between their two sides. It isn't hard to see why these voltage gradients matter; the electrical spiking of neurons gives rise to our thoughts and actions, and the voltage dynamics of cardiomyocytes keep our hearts beating. Studies of bioelectricity have historically relied on electrode-based techniques to perturb and measure membrane potential, but these techniques have inherent limitations. I present new optogenetic methods of studying membrane potential that will broaden the scope of electrophysiological investigations by complementing traditional approaches. I introduce the microbial rhodopsin Archaerhodopsin-3 (Arch), a transmembrane protein from Halorubrum sodomense. The fluorescence of Arch is a function of membrane potential, allowing it to serve as an optical voltage reporter. We use time-dependent pump-probe spectroscopy to interrogate the light- and voltage- dependent conformational dynamics of this protein, to elucidate the mechanism of voltage-dependent fluorescence in Arch. I then present two new methods for imaging voltage using engineered variants of Arch. Both techniques take advantage of the unique photophysical properties of Arch(D95X) mutants. The first method, Flash Memory, records a photochemical imprint of the activity state -- firing or not firing -- of a neuron at a user-selected moment in time. The Flash Memory technique decouples the recording of neural activity from its readout, and can potentially allow us to take large-scale snapshots of voltage (e.g. maps of activity in a whole mouse brain). The second method allows for the quantitative optical measurement of membrane potential. This technique overcomes the problems that typically hinder intensity-based measurements by encoding a measurement of voltage in the time domain. Finally, I present a method to visualize cellular responses to changes in membrane potential. I engineer mutants of Channelrhodopsin-2 (ChR2), a light-gated cation channel from Chlamydomonas reinhardtii that is used for optical control of neural activity, and use these optogenetic actuators in conjunction with GFP-based sensors to study the activity-dependent behavior of cultured neurons.

Rhodopsin-Guanylylzyklasen (RhGC) sind einzigartige Photorezeptoren, die kürzlich in Pilzen der Abteilung Blastocladiomycota entdeckt wurden [1]. RhGCs gehören zu den Enzym-Rhodopsinen und die Licht-sensitive mikrobielle Rhodopsin Domäne ist kovalent mit einer Typ III Guanylylzyklase verbunden. Guanylylzyklasen bilden den sekundären Botenstoff cGMP, der zusammen mit cAMP eine Vielzahl biologischer Prozesse reguliert [2–12]. In der vorliegenden Arbeit wurden die fünf neu-entdeckten RhGCs mithilfe unterschiedlicher biochemischer und biophysikalischer Methoden charakterisiert. Elektrophysiologische Messungen erbrachten einen indirekten Nachweis für eine Grünlicht-aktivierte cGMP Synthese bei den RhGCs aus Blastocladiella emersonii (Be) und Catenaria anguillulae (Ca). Die Licht-aktivierte Guanylylzyklasen Funktion dieser RhGCs konnte durch ELISA Experimente und nach Aufreinigung der Photorezeptoren bestätigt werden. Belichtung führte zu einer 100-fachen oder 200-fachen Erhöhung von cGMP mit einem vmax von 1.8 oder 11.6 µmol/min/mg(Protein) bei BeRhGC oder CaRhGC. Im Dunkeln verblieb bei beiden Photorezeptoren die cGMP-Konzentration auf dem Niveau von Kontrollzellen. Durch eine enzymkinetische Analyse der isolierten Guanylylzyklase Domänen (Be/CaGC) konnte die konstitutive Aktivität der enzymatischen Einheit gezeigt werden, die im Vergleich zu den Volllängen Photorezeptoren 3-6x reduziert war. Weiterhin wurden die Photozyklen der isolierten Rhodopsin Domänen mithilfe spektroskopischer Methoden untersucht und Photointermediate identifiziert, die typisch für mikrobielle Rhodopsine sind. Die M-Intermediate zerfielen langsam mit τ ~ 100 ms bei BeRh und τ ~ 500 ms bei CaRh. Um die kinetischen und spektroskopischen Parameter der Photorezeptoren zu verändern, wurden die Be/Ca Rhodopsin Domänen mutiert. Zusätzlich wurde die Substratspezifität der RhGCs geändert und eine Doppelmutation (E497K/C566D) in der katalytischen Domäne erzeugte Rhodopsin-Adenylylzyklasen (RhACs). Die Licht-induzierte cAMP Synthese der RhACs wurde in Xenopus Oocyten getestet und im Vergleich zu BeRhAC zeigte CaRhAC eine erhöhte Licht-zu-Dunkel-Aktivität (6x) einhergehend mit einer verringerten Dunkelaktivität (5.5x). Um weitere Einblicke in die kürzlich entdeckten RhGCs zu erhalten, wurden die isolierten Zyklase Domänen, Be/CaGC und CaAC, in Gegenwart von NTP Analoga kristallisiert. Neben hochauflösenden monomeren GC Strukturen ohne Ligand wurde eine 2.25 Å Struktur der mutierten Zyklase, CaAC, mit dem ATP Analogon ATPαS gelöst. Die CaAC Struktur zeigt ein antiparalleles Arrangement der Dimer-Untereinheiten und die Bindung der Nukleotidbase durch die zuvor mutierten Reste. Aufgrund der Ähnlichkeit zu anderen Typ III Zyklasen kann auf einen klassischen Reaktionsablauf bei RhGCs rückgeschlossen werden. Abschließend wurde die Anwendbarkeit von Ca/BeRhGC sowie CaRhAC in hippokampalen Rattenneuronen und CHO Zellen getestet. Diese Experimente zeigen, dass sowohl RhGCs als auch YFP-CaRhAC als optogenetische Werkzeuge eingesetzt werden können, um die Zellbotenstoffe cGMP bzw. cAMP präzise mit Licht zu regulieren. / Rhodopsin-guanylyl cyclases (RhGC) are unique photoreceptors recently discovered in Blastocladiomycota fungi [1]. In RhGCs the light-sensitive microbial rhodopsin domain is covalently linked to a type III guanylyl cyclase. Guanylyl cyclases form the second messenger cGMP, which together with cAMP regulates a variety of biological processes [2–12]. Due to their architecture, RhGCs are classified as microbial enzyme rhodopsins. In the present work, the five newly discovered RhGCs were characterized using different biochemical and biophysical methods. Electrophysiological measurements provided indirect evidence for green light-activated cGMP synthesis of the RhGCs from Blastocladiella emersonii (Be) and Catenaria anguillulae (Ca). The light-activated guanylyl cyclase function could be confirmed by ELISA experiments and after purification of these photoreceptors. Green illumination led to a 100-fold or 200-fold increase in cGMP with a vmax of 1.8 or 11.6 µmol/min/mg(protein) for BeRhGC or CaRhGC. In the dark the cGMP concentration remained at the level of control cells for both photoreceptors. A kinetic analysis of the isolated guanylyl cyclase domains (Be/CaGC) revealed the constitutive activity of the enzymatic domain, which was 3-6x reduced compared to the full-length photoreceptors. A spectroscopic characterization of the Be/Ca rhodopsin domains allowed the identification of photocycle intermediates, which are typical for microbial rhodopsins. The M-intermediates decayed slowly with a τ ~ 100 ms for BeRh and τ ~ 500 ms for CaRh. The Be/Ca rhodopsin domains were mutated to change the kinetic and spectroscopic parameters of the photoreceptors. In addition, the substrate specificity of the RhGCs was switched to ATP by a double mutation (E497K/C566D) in the catalytic domain. The light-induced cAMP synthesis of the generated rhodopsin-adenylyl cyclases (Be/CaRhACs) was shown in Xenopus oocytes and after purification of the proteins. Compared to BeRhAC, CaRhAC showed an increased light-to-dark activity (6x) and a decreased activity in darkness (5.5x). To get further insight into the recently discovered RhGCs, the isolated cyclase domains, Be/CaGC and CaAC, were crystallized in the presence of NTP analogues. High-resolution monomeric GC structures without a bound ligand were produced. Additionally, a 2.25 Å structure of the mutated cyclase, CaAC, with the ATP analogue ATPαS was solved. The CaAC structure shows an antiparallel arrangement of the dimer subunits and the nucleotide base is bound by the previously mutated residues. Due to the similarity to other type III cyclases, a classical reaction sequence for RhGCs can be deduced. Finally, the applicability of Ca/BeRhGC and CaRhAC was tested in hippocampal rat neurons and CHO cells. These application-oriented approaches show that both RhGCs and YFP-CaRhAC can be used as optogenetic tools to precisely control cGMP and cAMP with light.

Kanalrhodpsine (ChRs) sind lichtaktivierbare Kationenkanäle, welche als primäre Fotorezeptoren in Grünalgen dienen. In der Optogenetik werden ChRs verwendet um neuronale Membranen zu depolarisieren und mit Licht Aktionspotentiale auszulösen. Das mit blauem Licht aktivierte Chlamydomonas Kanalrhodopsin 2 (C2) und effiziente Mutanten wie C2 H134R stellen die am häufigsten genutzten depolarisierenden, optogenetischen Werkzeuge dar. Komplementär zu ChRs werden Protonen- und Chloridpumpen aus Archaebakterien zur neuronalen Inhibierung durch lichtinduzierte Hyperpolarisation verwendet. In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir die ChR-Chimäre C1V1, ein grünlichtaktiviertes ChR, das sich durch hervorragende Membranlokalisierung und hohe Fotoströme in HEK-Zellen auszeichnet. C1V1 und C1V1-Mutanten mit feinabgestimmten spektralen und kinetischen Eigenschaften ermöglichen die neuronale Aktivierung mit Wellenlängen bis 620 nm sowie die unabhängige Aktivierung zweier Zellpopulationen in Kombination mit C2. Um die strukturelle Basis von Kanalöffnung und Ionentransport in ChRs zu verstehen, wurden gezielt Mutationen in C2 und C1V1 eingeführt. Die Fotoströme der entsprechenden Mutanten wurden auf Kationenselektivität und kinetische Veränderungen untersucht. Während Aminosäuren, die den Kanal an der zytosolischen Seite begrenzen, die Kationenfreisetzung und Einwärtsgleichrichtung der ChRs bestimmen, spielen zentral im Kanal gelegende Aminosäuren ein entscheidende Rolle für Kationenselektivität und -kompetition. Ein enzymkinetisches Modell ermöglichte außerdem die Zerlegung der Fotoströme in Beiträge der verschiedenen, konkurrierenden Kationen. Im letzten Teil der Arbeit wurde pHoenix, ein optogenetisches Werkzeug zur Ansäuerung synaptischer Vesikel, entwickelt. In Neuronen des Hippocampus wurde pHoenix verwendet, um die treibenden Kräfte für die vesikuläre Neurotransmitteraufnahme sowie den Zusammenhang zwischen Vesikelfüllstand und Freisetzungswahrscheinlichkeit zu analysieren. / Channelrhodopsins (ChRs) are light-activated cation channels functioning as primary photoreceptors in green algae. In the emerging field of optogenetics, ChRs are used to depolarize neuronal membranes, thus allowing for light-induced action-potential firing. The blue light-activated Chlamydomonas channelrhodopsin 2 (C2) and high-efficiency mutants such as C2 H134R represent the most commonly used depolarizing optogenetic tools. Complementary to ChRs, green to yellow light-activated proton and chloride pumps originating from archea enable neuronal inhibition by membrane hyperpolarization. In the present work, we developed the chimeric ChR C1V1, a green-light activated ChR with excellent membrane targeting and high photocurrents in HEK cells. Action spectrum and kinetic properties of C1V1 were further fine-tuned by site-directed mutagenesis. The ensemble of C1V1 variants allows for neuronal activation with wavelengths up to 620 nm and can be used in two-color optogenetic experiments in combination with C2 derivatives. In order to understand the structural motifs involved in channel gating and ion transport, conserved residues in C2 and C1V1 were mutated and photocurrents of the respective mutants were analyzed for kinetic characteristics and cation selectivity. In these experiments, residues of the inner gate region were shown to alter cytosolic cation release and inward rectification, whereas central gate residues determine cation competition and selectivity, as well as the equilibrium between the two open channel conformations. Moreover, an enzyme-kinetic model was used to quantitatively dissect ChR photocurrents into the contribution of different competing cations. Finally, we designed pHoenix, an optogenetic tool enabling green-light induced acidification of synaptic vesicles. In hippocampal neurons, pHoenix was used to study both the energetics of vesicular neurotransmitter uptake and the impact of the vesicular contents on synaptic vesicle release.

Mikrobielle Rhodopsine sind lichtsensitive Proteine, die von Mikroorganismen exprimiert werden um Licht wahrzunehmen oder dessen Energie zu nutzen. Ionen-transportierende mikrobielle Rhodopsine begründeten das Feld der Optogenetik. Hier erlauben sie transmembrane Ionenflüsse lichtsensitiv zu machen und neuronale Aktivität mit Licht zu steuern. Eine zielführende Nutzung beruht auf ihrer molekularen Charakterisierung, um sie dem Experiment anzupassen und es sinnvoll zu entwerfen. Teil I der Arbeit beschäftigt sich mit dem rotverschobenen Kanalrhodopsin ReaChR. Obwohl es mit breitem, nicht gaussförmigen Aktionsspektrum mit maximalen Strömen um 600 nm publiziert wurde, zeigte das Blitzlichtspektrum hier maximale Aktivität bei 535 nm ohne Besonderheiten. Mit steigender Intensität und längeren Pulsen verbreiterte sich das Spektrum; sehr ähnlich zum publizierten Spektrum. Dieses einzigartige Verhalten wird durch sekundäre Photochemie erklärt, welche zu einem komplexen Photozyklus mit lichtinduzierten Übergangen führt. Mutationen an Schlüsselpositionen wurden genutzt, um ReaChR über die publizierten Daten hinaus zu charakterisieren und neue Eigenschaften zu generieren. In Teil II wurde die auswärtsgerichtete Natriumpumpe KR2 elektrophysiologisch charakterisiert, was zuvor von schlechter Membranständigkeit in Säugetierzellen verhindert wurde. Ein verbessertes KR2 mit höherer Membranständigkeit und 60-fach größeren Photoströmen erlaubte Selektivitätsmessungen, welche zeigten, dass der Strom von Natriumionen getragen wird, wohingegen nichts auf Protonentransport hindeutete. Bei ausreichender Substratkonzentration war der Strom anders als bei Chlorid- oder Protonenpumpen von der Membranspannung unabhängig. Die Expression in Mausneuronen ermöglichte die reversible Unterdrückung von Aktionspotentialen mit Licht, wobei der Ausstrom von Kationen einen komplementären Weg zur neuronale Aktivitätsunterdrückung bietet, wenn etablierte Werkzeuge schlecht oder nicht funktionieren. / Microbial rhodopsins are photosensitive proteins utilized by fungi, algae, and prokaryotes to sense light or harness its' energy. Ion transporting microbial rhodopsins initiated the field of optogenetics, where they are applied to render transmembrane ion fluxes light sensitive and control neuronal activity with light. Part I of the thesis focused on the electrophysiological characterization of the red-shifted channelrhodopsin ReaChR. Although published with a broad, non-Gaussian shaped action spectrum peaking around 600 nm, the flash action spectra of ReaChR recorded here had a maximum at 535 nm without peculiarities. Increasing intensities and prolonging illumination broadened the spectrum, which finally peaked around 600 nm. This unique behavior stems from pronounced secondary photochemistry leading to a complex photocycle with various light-induced transitions especially under constant illumination. Mutations at key positions like the central gate, DC-pair or counter ions were employed to characterize the properties of ReaChR beyond published data and engineer new features. In part II an electrophysiological characterization of the outward Na+ pump KR2 was pursued, which was hindered by poor membrane targeting in mammalian cells before. Engineering of eKR2 improved membrane targeting and lead to 60-fold larger photocurrents than in the wild type. Selectivity measurements revealed that the stationary photocurrent is primarily carried by sodium with no evidence for proton transport. At sufficient substrate concentration stationary photocurrents were independent of the membrane voltage distinguishing eKR2 from proton and chloride pumps. Finally, eKR2 reliably and reversibly inhibited action potential firing already at 0.5 mW/mm2 green illumination in cultured hippocampal mouse neurons. Inhibiting action potential firing through cation extrusion poses a complementary way of neuronal silencing in contexts where established tools are unfavorable or even impossible to use.