Les interférons (IFNs) de type I sont des cytokines qui jouent un rôle capital dans les défenses immunes, antivirales et antiprolifératives de l'organisme. En se liant à leur récepteur de surface, composé des deux sous-unités IFNAR1 et IFNAR2, ils induisent la cascade de signalisation JAK/STAT qui aboutit à leur effets biologiques. L'objectif de ma thèse était d'identifier des mécanismes de régulation de la signalisation des IFNs. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés à la palmitoylation du récepteur de l'IFN de type I, une modification lipidique souvent impliquée dans le trafic et la signalisation des protéines. Par marquage métabolique au palmitate tritié, nous avons montré qu'IFNAR1 et IFNAR2 sont palmitoylées. Le domaine cytoplasmique d'IFNAR1 contient deux cystéines, Cys463 et Cys502, qui sont des sites potentiels de palmitoylation. A l'aide de mutants sur chacune de ces cystéines, nous avons montré qu'IFNAR1 est palmitoylée uniquement sur sa cystéine la plus proche de la membrane plasmique, la Cys463. Un mutant non palmitoylé dans lequel cette cystéine a été remplacée par une alanine nous a permis de constater que la palmitoylation d'IFNAR1 n'est pas impliquée dans son trafic intracellulaire, dans son endocytose ni dans sa stabilité, mais qu'en revanche elle joue un rôle crucial dans l'activation de la voie de signalisation JAK/STAT. De façon concordante, la palmitoylation d'IFNAR1 est requise pour l'activation transcriptionnelle des gènes induits spécifiquement par l'IFN-a. Par contre, un défaut de palmitoylation n'influence nullement l'activité antiproliférative de l'IFN-a, en dépit du rôle de cette modification dans la signalisation.

L'infection des hépatocytes par les sporozoïtes constitue une première étape obligatoire du cycle de Plasmodium chez l'hôte vertébré. Les mécanismes impliqués dans l'invasion des hépatocytes restent mal caractérisés. Nous avons découvert que CD81, une protéine transmembranaire appartenant à la famille des tétraspanines, est nécessaire à l'infection des hépatocytes par les sporozoïtes de Plasmodium falciparum, de Plasmodium yoelii, et dans certains cas de Plasmodium berghei. L'expression de CD81 suffit à rendre les cellules hépatocytaires HepG2 sensibles à l'infection par les sporozoïtes de P. yoelii mais pas P. falciparum, suggérant l'intervention d'autres molécules pour ce parasite. Une caractéristique majeure des tétraspanines est leur capacité de s'associer entre elles et avec d'autres molécules de surface pour former des microdomaines membranaires distincts des radeaux lipidiques classiques (« rafts »). Nos résultats montrent que le cholestérol membranaire contribue non seulement à la localisation de CD81 dans les microdomaines enrichis en tétraspanines mais aussi à l'infection par les sporozoïtes de Plasmodium lorsqu'elle implique une voie dépendante de CD81. Nous n'avons pas pu mettre en évidence d'interaction directe entre CD81 et les sporozoïtes, ce qui suggère que CD81 pourrait ne pas jouer un rôle de récepteur pour le parasite mais intervenir de manière indirecte. EWI-F et EWI-2, deux protéines transmembranaires associées à CD81 dans les hépatocytes, ne sont pas directement impliquées dans l'infection par les sporozoïtes. Au contraire, EWI-F a un effet inhibiteur sur l'infection, peut-être lié à une réorganisation des microdomaines à tétraspanines ou à une compétition avec un autre partenaire de CD81. Une autre molécule associée à CD81 pourrait donc jouer un rôle essentiel dans l'infection par les sporozoïtes, éventuellement comme récepteur, mais sa nature reste à déterminer.

Le fer est essentiel à la croissance et au développement des plantes. Chez Arabidopsis thaliana, le transporteur IRT1 permet l’absorption du fer par les cellules épidermiques de la racine et est, par conséquent, un des acteurs majeurs de la nutrition en fer. IRT1 est cependant un transporteur peu spécifique qui transporte également des métaux non ferreux que sont le zinc (Zn), le manganèse (Mn) et le cobalt, qui constituent les substrats secondaires d’IRT1 et qui ont été récemment démontrés dans notre laboratoire comme régulant l’endocytose d’IRT1. Afin d’identifier des protéines potentiellement impliquées dans le trafic ou dans la régulation de l’activité d’IRT1, nous avons isolé des interactants de ce transporteur via des immunopurifications d’IRT1 combinées à des analyses de spectrométrie de masse. Cette approche nous a permis d’établir le premier intéractome d’IRT1. Parmi les protéines interagissant avec IRT1, nous avons isolé AHA2 et FRO2 qui participent toutes les deux au processus d’absorption du fer chez Arabidopsis, ainsi que la protéine à domaine SPFH appelée HIR2. HIR2 est localisée dans des microdomaines membranaires chez Arabidopsis mais sa fonction reste jusqu’à présent assez énigmatique. Cependant, chez les animaux, les protéines à domaine SPFH ont été proposées comme étant impliquées dans la formation des microdomaines membranaires; de plus certaines protéines à domaines SPFH appelées Flotillines interviennent dans des mécanismes d’endocytose chez les animaux et les plantes. Après avoir validé les interactions entre les protéines IRT1 et FRO2/AHA2/HIR2 par des approches complémentaires, nous avons analysé la dynamique intracellulaire de ces protéines par microscopie. Nos résultats suggèrent l’existence d’un complexe protéique regroupant les trois acteurs majeurs de l’homéostasie du fer chez Arabidopsis : IRT1, FRO2 et AHA2, dont la fonction pourrait être d’optimiser l’absorption du fer dans la racine. Contrairement à ce qui est observé pour IRT1, les protéines FRO2 et AHA2 ne sont pas massivement endocytées en réponse à un excès de métaux (Zn,Mn, Co) et ceci bien qu’elles puissent être présentes au sein d’un complexe contenant IRT1. Nous avons en outre montré que FRO2 et AHA2 étaient ubiquitinées, mais contrairement à IRT1, de façon indépendante de la concentration en métaux non ferreux. En utilisant des approches de génétique inverse, nous avons mis en évidence que HIR2 était impliquée dans le maintien de l’homéostasie du fer, les mutants hir2 étant extrêmement sensibles à la carence en fer. D’autre part nous avons montré que l’accumulation de la protéine IRT1 était dérégulée chez le mutant hir2 et ceci de façon post-transcriptionnelle. Nous cherchons actuellement à déterminer comment HIR2 régule la dynamique et/ou la stabilité d’IRT1 dans la cellule. HIR2 pourrait assurer le recrutement d’IRT1 et plus généralement du complexe d’acquisition du fer décrit ci-dessus dans des microdomaines membranaires spécifiques. D’autre part, nous avons également émis l’hypothèse que HIR2 pourrait être impliquée dans une voie d’endocytose d’IRT1 indépendante de la clathrine. / Iron is an essential nutrient for plant growth and development. In Arabidopsis thaliana, the transporter IRT1, which allows iron absorption through the epidermic cells of the root, is a major actor in iron nutrition. Despite of it, IRT1 also transports the non-iron metals zinc (Zn), manganese (Mn) and cobalt (Co). These metals are considered as the secondary substrates of IRT1, and therefore this transporter is considered as poorly specific. Our laboratory has recently uncover that these secondary substrates regulate IRT1 endocytosis. In order to uncover the different proteins that can be implicated in the traffic or in the regulation of IRT1 activity, we have proceeded to perform IRT1 immnopurifications, followed by mass spectrometry analyses. This approach has allowed us to produce a first interactome list of IRT1. Among the proteins that interact with IRT1, we have isolated AHA2 and FRO2, both well known in the process of iron acquisition in Arabidopsis, and also a SPFH domain containing protein known as HIR2. Although it is known that HIR2 is contained in membrane microdomains in Arabidopsis, its function is still to be determined. Nevertheless, in the animal kingdom, SPFH domain containing proteins have been proposed as implicated in the formation of membrane microdomains. This is specially the case of the specific SPFH domain containing proteins known as Flotillins, which have the ability to mediate endocytosis in animals as in plants. After validation of the interaction between IRT1 and FRO2/AHA2/HIR2 by different complementary approaches, we have microscopically analyzed the intracellular dynamics of these proteins. Our results suggest the existence of a protein complex that reunites the three major actors of iron homeostasis in Arabidopsis: IRT1, FRO2 and AHA2. We suspect that the main function of this complex is to optimize the process of iron absorption in the root. In spite of what is known for IRT1 and despite being part of a same complex, FRO2 and AHA2 are not massively endocytosed in response to a non-iron metal excess (Zn, Mn, Co). Furthermore, we have shown that FRO2 and AHA2 are ubiquitinated, although their ubiquitination is also independent of the concentration of the non-iron metals, unlike the ubiquitination of IRT1. Finally, using reverse genetic approaches, we have been able to show that HIR2 is implicated in the maintenance of the iron homeostasis. Indeed, hir2 mutants are extremely sensitive to lack of Fe, even though they present posttranslational deregulations that result in the an overaccumulation of the protein IRT1. We are currently trying to determine how HIR2 regulates the dynamics and/or the stability of IRT1 inside the cell. HIR2 could be assuring the recruiting of IRT1 (or the recruitment of the whole iron acquisition complex) into specific membrane microdomains. On the other hand, HIR2 could be implicated in a new pathway of internalization of IRT1, independent of clathrin.

La maturation épididymaire est un processus essentiel à l'acquisition du pouvoir fécondant et de la motilité des spermatozoïdes. Ce processus implique, entre autres, l'acquisition de nouvelles protéines dans des structures fonctionnelles spécifiques des spermatozoïdes. Chez le bovin, les protéines P25b et MlF sont acquises au cours du transit épididymaire à partir des vésicules membranaires nommées épididymosomes, sécrétées dans la lumière de l'épididyme. La P25b, impliquée dans la liaison à la zone pellucide, est une protéine GPIancrée localisée dans la région acrosomale de la membrane plasmique du spermatozoïde. MIF est une protéine associée aux fibres denses du flagelle et impliquée dans la motilité du spermatozoïde. Bien que la compartimentation spécifique de ces protéines assure les différentes fonctions des spermatozoïdes, les mécanismes à la base de cette compartimentation sont encore inconnus. Dans différents modèles cellulaires, la compartimentation des protéines de la membrane plasmique est assurée par la formation de domaines rafts enrichis en cholestérol et en sphingolipides. À partir du fait que les rafts sont présents dans les membranes plasmiques des spermatozoïdes, nous avons établi que P25b s'associe et s'accumule dans ces domaines au cours du transit épididymaire. Par contre, les protéines MIF sont toutefois exclues des rafts. Dans les spermatozoïdes éjaculés, P25b se dissocie complètement des rafts mais reste liée à la membrane plasmique. Nous avons déterminé que la dissociation de P25b est causée par une déstabilisation des structures des rafts à la suite d'une perte de cholestérol induite par la protéine NiemannPick C2. Puisque les épididymosomes sont à la fois riches en cholestérol et en sphingolipides et transportent des protéines portant un groupement GPI, nos études ont permis d'établir que les épididymosomes comportent aussi des rafts. La P25b présente dans les rafts des épididymosomes est transférée dans les rafts des spermatozoïdes épididymaires, alors que MIF se retrouve dans le compartiment cytosoluble. L'identification systématique du protéome des épididymosomes révèle la présence de certains membres de la famille des rabs et des SNARE, impliqués dans le traffic et la fusion vésiculaires, et associés aux rafts des spermatozoïdes. L'ensemble de ces résultats suggère que les rafts sont impliqués dans le transfert et la compartimentation des protéines des épididymosomes vers les différentes structures fonctionnelles des spermatozoïdes.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) infecte et se réplique dans les cellules du système immunitaire. À sa sortie de la cellule, le virus s’enveloppe d’une partie de la membrane cellulaire et acquiert alors certaines des protéines membranaires de la cellule hôte. C’est le cas de la protéine HLA-DR du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMH-II) nécessaire à la présentation antigénique. Son incorporation par le virus augmente le potentiel infectieux et contribue à la persistance du virus. Vpu est une protéine du VIH-1 qui contribue au bourgeonnement viral. Une étude récente a montré que Vpu pourrait diminuer l’expression de HLA-DR mature à la surface des cellules infectées. Toutefois, il est aussi reconnu que Vpu module l’acquisition de HLA-DR mature par le VIH-1. Ces résultats pouvaient être expliqués par un contrôle de la localisation intracellulaire de HLA-DR et/ou des protéines structurales du VIH-1 par Vpu. En somme, Vpu pourrait favoriser les interactions spécifiques entre HLA-DR mature et le VIH-1 tout en diminuant l’expression générale de HLA-DR mature à la surface de la cellule. Nous avons souhaité confirmer ce double rôle de Vpu qui est important dans la pathogénèse du virus puisqu’il bénéficie ainsi des avantages de l’incorporation du HLA-DR mature tout en court-circuitant son rôle dans la réponse antigénique normale. Il est également admis que le virus bourgeonne à partir des microdomaines (radeaux lipidiques) de la cellule hôte. Ces régions de la membrane sont riches en cholestérol et constituent le lieu d’expression préférentiel des molécules de HLA-DR mature. Lors d’un traitement avec de la Simvastatin™, les radeaux lipidiques sont affectés car cette drogue inhibe la synthèse du cholestérol et de surcroit, diminue l’expression de HLA-DR mature à la surface cellulaire. L’usage de la Simvastatin™ nous a renseigné sur l’endroit où le virion pouvait interagir et éventuellement incorporer la molécule de l’hôte HLA-DR dans son enveloppe. Ce projet de recherche à permis de caractériser les interactions entre Vpu et HLA-DR et ainsi de mieux comprendre les mécanismes par lesquels Vpu module à la fois l’expression de HLA-DR à la surface des cellules infectées ainsi que son incorporation sur les virions. Les études conduites en microscopie confocale par co-marquage fluorescent de Vpu et HLA-DR ont conduit à la mise en évidence de l’existence d’une interaction entre Vpu et HLA-DR au sein de la cellule infectée. Les mesures de l’expression de HLA-DR à la surface de cellules infectées et de son incorporation à la surface des virions à l’aide des techniques de cytométrie en flux et d’immunocapture ont également permis de confirmer la modulation de l’expression de HLA-DR par Vpu. Enfin, le traitement des cellules infectées avec la Simvastatin™ nous a permis d’émettre l’hypothèse que l’acquisition de HLA-DR s’effectuait à une étape antérieure au bourgeonnement viral. Pour finir, nous avons tenté de corréler les différences observées dans la pathogénèse de certains sous-types viraux avec la variabilité de la séquence de Vpu entre ceux-ci, en lien avec une différence de localisation subcellulaire de Vpu. Les études conduites dans le cadre de mon projet de maîtrise ont contribués à une meilleure compréhension des mécanismes d’acquisition des molécules de l’hôte et de leur possible répercussion sur la pathogénèse du VIH-1 par différents sous-types viraux. Elles renseignent également de manière substantielle sur le rôle de Vpu, protéine dont le rôle est demeuré relativement méconnu dans la pathogénèse du VIH-1 ainsi que sur les mécanismes d’acquisition des molécules de l’hôte par le VIH-1. Les résultats présentés dans ce mémoire devraient susciter un regain d’intérêt pour cette protéine ainsi que pour les mécanismes d’incorporation des molécules de l’hôte par le VIH-1. / The type-1 human immunodeficiency virus (HIV-1) infects and replicates itself in the immune system cells. When it buds out, the virus covers itself with a part of the plasma membrane and then acquires some of the host membrane proteins. It is the case for the HLA-DR protein from the major histocompatibility complex class II (MHC-II) necessary for antigen presentation. Its viral incorporation increases the infectious potential and contributes to viral persistence. Vpu is an HIV-1 protein which contributes to the viral budding process. A recent study showed that Vpu could decrease the mature HLA-DR expression at the infected cell surface. Nevertheless, it is also known that Vpu modulates the mature HLA-DR acquisition by HIV-1. Those results could be explained by a control of the intracellular localization of HLA-DR and/or some HIV-1 structural protein by Vpu. In summary, Vpu could promote specific interactions between mature HLA-DR and HIV-1 while decreasing the general expression of mature HLA-DR at the cell surface. We wished to confirm the dual role of Vpu which is important in the viral pathogenesis by getting the mature HLA-DR incorporation advantages while short-circuiting its role in the normal antigen response. It is also accepted that the virus buds out from the infected cell lipid raft. These region are highly enriched with cholesterol and the preferential expression location of mature HLA-DR. With a Simvastatin™ treatment, the lipid raft are disrupt because this drug inhibit the synthesis of cholesterol, therefore down-modulating the mature HLA-DR expression at the cell surface. Using Simvastatin™ inform us on where the virus could possibly acquire the mature host molecule HLA-DR in its envelop. This research project allowed us to characterise the possible interactions between Vpu and HLA-DR that led to a better understanding of the mechanism by which Vpu modulates HLA-DR at the infected cell surface and its viral incorporation. The study conducted by confocal microscopy using multiple fluorescent tagging of Vpu and HLA-DR has led to the evidence of an interaction between Vpu and mature HLA-DR in an infected cell. The measurement of the cell surface expression of HLA-DR and its viral incorporation by flow cytometer and immunocapture techniques also allowed the confirmation of the Vpu modulation on HLA-DR expression. Finally, the Simvastatin™ treatment on infected cells allowed us to hypothesis that the mature HLA-DR acquisition was done at an earlier stage that the viral budding. To conclude, we also attempted to correlate the difference in the pathogenesis of some HIV-1 subtype with the sequence variability of Vpu between them: a link with a different subcellular localization of Vpu. The studies that have been performed in order to complete my master diploma have contributed to a better understanding of the acquisition mechanism of certain host molecules and their impact on different sub-types of HIV-1 pathogenesis. They also give substantial information on the roles of Vpu, a virus-encoded protein whose involvement in HIV-1 pathogenesis remains to be defined and on the acquisition mechanism of some host molecule by HIV-1. The results presented in this thesis will probably arouse an interest renewal for this protein and for the host molecule incorporation mechanism used by HIV-1.

Endothelial cells (EC) are essential regulator of vascular homeostasis through the generation and release of various bioactive agents, including nitric oxide (NO). NO modulates several vascular functions such as vascular tone and permeability, through the stimulation of soluble guanylate cyclase (sGC) leading to the production of cGMP. Conversely, phosphodiesterases (PDEs) are enzymes metabolizing cyclic nucleotides (cGMP and cAMP) and are therefore major regulatory players for cGMP and cAMP signalling pathways. Although ECs are the main source of NO, little is known on the endothelial NO-cGMP signalling pathway and cellular outcomes. It was then hypothesized that a specific population of cGMP-phosphodiesterases allows ECs to stabilize cGMP levels despite the elevated production of NO. Expression of cGMP-phosphodiesterases was initially studied in resistance mesenteric arteries from mice. PDE5 and PDE6 were both found at mRNA and protein levels in native arteries but PDE6 is not found in cultured ECs. Interestingly, subcellular distributions of both enzymes were distinct. PDE5 appeared to be homogeneously distributed whilst PDE6 catalytic subunits (PDE6 and PDE6) showed a preferential staining in the perinuclear region. These results suggest that PDE6 might be involved in the regulation of cGMP microdomains. Based on these findings, a mathematical model was developed. Simulations of dynamic cGMP levels in ECs support the notion of cGMP microdomains dependent on PDE6 expression and localization. In the absence of PDE6, application of NO either as a single bolus or repetitive pulses led to a homogeneous increase in cGMP levels in ECs despite PDE5 homogeneous distribution. However, PDE6 subcellular targeting to the perinuclear membrane generated a cGMP-depleted perinuclear space. The findings from this study provide the first evidence of the expression and specific intracellular distribution of PDE6 in native endothelial cells that strongly support their involvement in the generation of cGMP microdomains / Les cellules endothéliales (CEs) participent au maintien de l’homéostasie vasculaire en générant et libérant de nombreux agents bioactifs, incluant l’oxyde nitrique (NO). Le NO module plusieurs fonctions vasculaires telles que le tonus et la perméabilité vasculaire via la stimulation de la guanylate cyclase soluble (GCs) provoquant la formation de GMPc. D’autre part, les phosphodiestérases (PDEs) sont des enzymes métabolisant les nucléotides cycliques (GMPc et AMPc) et participent donc à des étapes essentielles du contrôle des voies de signalisation du GMPc et de l’AMPc. Bien que les CEs soient la source principale de NO, la voie de signalisation NO-GMPc endothéliale et les répercussions fonctionnelles demeurent méconnues. Nous avons alors émis l’hypothèse qu’une population spécifique de PDEs ciblant le GMPc (PDEs-GMPc) permettrait aux CEs de maintenir des niveaux de GMPc faible malgré l’importante production de NO. L’expression des isoformes de PDEs-GMPc dans les artères mésentériques de souris fut initialement déterminée. PDE5 et PDE6 furent détectées tant sous la forme d’ARNm que de protéines dans les artères natives alors que PDE6 est absente de lignées de CEs en culture. La distribution intracellulaire des deux enzymes est distincte. Alors que PDE5 est distribué uniformément dans le cytoplasme des cellules endothéliales, les sousunités catalytiques de PDE6 ( et ) sont préférentiellement présentes dans la région périnucléaire. Ces résultats suggèrent que PDE6 puisse être impliqué dans le contrôle de microdomaines de GMPc. Des simulations effectuées à l’aide d’un modèle mathématique développé sur la base de ces données sont en accords avec la notion selon laquelle l’expression et la distribution subcellulaire de PDE6 sont responsables de microdomaines de GMPc dans l’endothélium. En absence de PDE6, l’ajout de NO sous forme de bolus unique ou répétée mène à une augmentation homogène de la concentration cytoplasmique en GMPc malgré la présence de PDE5. Toutefois, la présence de PDE6 à la membrane péri-nucléaire crée un espace péri-nucléaire pauvre en GMPc. Les résultats de cette étude forment les premières évidences de l’expression et de la distribution intracellulaire hétérogène de PDE6 dans les cellules endothéliales natives et suggèrent leur implication dans la génération de microdomaines.

La maladie d’Alzheimer (MA) est une démence progressive caractérisée dans ses stades précoces par une perte synaptique et une dégénérescence neuronale. Aucun traitement efficace n’est disponible à ce jour et les mécanismes moléculaires impliqués sont encore mal connus. Des études récentes, menées notamment par notre équipe, indiquent que les oligomères de peptide amyloïde-ß (Aß) interagissent avec la membrane plasmique et y induisent un stress cellulaire impliquant des cascades apoptotiques. Ce travail a été consacré à l’étude de l’influence du statut lipidique sur la sensibilité des neurones au peptide Aß soluble et sur la signalisation pro-apoptotique. Nous avons montré que ce peptide induit un remodelage membranaire conduisant à la mort neuronale en activant des voies pro-apoptotiques et en inhibant des voies de survie. Par contre, la supplémentation du milieu en acide docosahexaénoïque (DHA), acide gras polyinsaturé de type ?3, protège les neurones de la mort induite par le peptide Aß. Cet effet préventif semble dépendre d’une incorporation du DHA pouvant localement induire un remodelage membranaire discret capable de préserver des voies de croissance et de survie cellulaire. Le DHA n’agit toutefois pas en inhibant l’activation de la phospholipase A2 cytosolique (cPLA2) et le stress oxydant induits par le peptide Aß, mécanismes que nous avons observés être impliqués dans la voie pro-apoptotique menant à la production de céramides suite à l’activation des sphingomyélinases. Ces enzymes occupent une position essentielle dans la toxicité du peptide Aß, puisqu’un prétraitement par le DHA ou par la sphingosine-1-phosphate, connue pour son potentiel antiapoptotique, protège les neurones en inhibant la sphingomyélinase acide. Les travaux de cette thèse ont donc montré que les lipides, molécules structurales mais aussi médiateurs de signalisation, sont des acteurs essentiels à considérer pour le développement de stratégies préventives ou thérapeutiques contre la MA / Alzheimer’s disease (AD) is a progressive dementia characterised in the early stages by synaptic loss and neurodegeneration. Currently, no effective treatments are available and the molecular mechanisms implicated are still unknown. Recent studies, including ours, indicate that the direct interaction between soluble amyloid-ß (Aß) oligomers and the plasma membrane initiates a cellular stress involving apoptotic cascades. The present work focuses on the impact of lipid status on neuronal susceptibility to the toxicity of soluble Aß peptide and on the pro-apoptotic signalling pathways. We showed that this peptide induces membrane remodelling, thereby activating pro-apoptotic pathways and inhibiting survival signalling, which leads to neuronal cell death. This was however prevented in neurons cultured in a medium supplemented with docosahexaenoic acid (DHA), an ?3 polyunsaturated fatty acid. This protective effect seems to rely on subtle local membrane remodelling due to DHA incorporation, which maintains active survival and growth pathways. DHA did not prevent either cytosolic phospholipase A2 (cPLA2) or oxidative stress upon soluble Aß peptide exposure. These two events have already been reported by our team to be implicated in a pro-apoptotic cascade leading to ceramide production due to the activation of sphingomyelinases. These enzymes very likely play a central role in Aß peptide toxicity, as pretreatments with DHA or sphingosine-1-phosphate, a well-known anti-apoptotic compound, lead to neuronal protection through the inhibition of acid sphingomyelinase. This PhD thesis demonstrates that lipids, as structural molecules as well as signalling mediators, are essential players that could be used to develop strategies for the prevention or treatment of AD

L’exocytose est un mécanisme biologique fondamental qui permet la libération du contenu des granules de sécrétion dans le milieu extracellulaire. C’est un processus finement régulé par le calcium qui nécessite entre autre, la réorganisation de la membrane plasmique et la formation de domaines lipidiques. Dans les cellules chromaffines, l’annexine A2, protéine capable de lier les phospholipides et l’actine de manière calcium-dépendante, est responsable de la formation et de la stabilisation de ces plateformes lipidiques. Le résultat majeur de ma thèse concerne l’organisation tridimensionnelle et le rôle de l’actine au niveau des sites d’exocytose. Sachant que la phosphorylation de la tyrosine 23 de l’annexine A2 affecte sa liaison à l’actine et aux membranes, deux acteurs majeurs de l’exocytose, j’ai mis en évidence l’importance fonctionnelle de cette phosphorylation. Une autre conséquence de cette phosphorylation est le passage de l’annexine A2 de la face interne à la face externe de la membrane plasmique. Le mécanisme de sortie et le rôle de l’annexine A2 extracellulaire dans les cellules chromaffines ont également été étudiés. / Exocytosis is a fundamental biological mechanism which allows liberation of the contents of secretory granules into the extracellular medium. This calcium-regulated process requires the formation of lipid domains for the structural and spatial organisation of exocytotic sites. In the chromaffin cell, annexine A2, a calcium-, actin- and lipid-binding protein participates in the formation and stabilization of lipid microdomains. The major advance resulting from my thesis is the elucidation of the three-dimensional organization and the role of actin at the exocytotic site. Phosphorylation of the tyrosine 23 is known to affect the binding of annexin A2 to actin filaments and plasma membrane, two major actors of the exocytotic process and my results highlight the functional importance of this phosphorylation on exocytosis. Furthermore, tyrosine 23 phosphorylation also triggers a translocation of annexin A2 to the external face of the plasma membrane. The role and functional signification of this externalization was also examined.

Les inhibiteurs de la protéase virale (IPs) sont utilisés avec succès dans le cadre d'une thérapie anti-VIH-1. L'efficacité de ce traitement est incontestable notamment en terme de réduction de la charge virale et de maintient du taux de lymphocytes CD4 circulants. Depuis l'incorporation des IPs dans la prise en charge thérapeutique, on note une réduction significative de la morbidité et de la mortalité ainsi qu'un allongement de la durée de vie des patients. Cependant, la prise de ces molécules anti-rétrovirales s'accompagne de nombreux effets secondaires. Les plus préoccupants d'entre eux sont : une lipodystrophie partielle, une hyperlipidémie, une insulino-résistance, une athérosclérose prématurée, ainsi que des infarctus du myocarde. Les patients sont également confrontés à l'apparition de maladies généralement associées à l'âge telles que la neurodégenérescence, l'ostéopénie et le développement de tumeurs malignes. Les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans ces altérations métaboliques n'ont pas encore été élucidés. L'objectif de cette étude était d'étudier les effets cellulaires de quatre IPs (Atazanavir, Lopinavir, Ritonavir et Saquinavir) sur la cellule musculaire striée squelettique humaine. Ces travaux ont permis d'identifier une augmentation de la production d'espèces oxygénées réactives (ERO), une altération morphologique du réticulum sarco/endoplasmique (RS/RE) ainsi qu'une augmentation de l'expression de CHOP, un marqueur du stress de ce compartiment et une diminution de l'expression et de la localisation dans les microdomaines membranaires (lipid rafts) de la cavéoline 3 et de la flotilline 1. Enfin, l'utilisation d'un antioxydant, le Resvératrol protége le myotube primaire humain de ces différentes altérations engendrées par les IPs. Ces données suggèrent un rôle central de la surproduction d'ERO dans le développement du stress du RE/RS et de la perte de localisation des protéines résidantes des microdomaines membranaires. De plus , en l'absence de persceptive vaccinale concrète, le Resvératrol, au travers de ces effets protecteurs, pourrait se révéler un atout de choix dans l'atténuation des effets secondaires des IPs en contribuant ainsi à l'amélioration de la prise en charge du patient séropositif. / HIV protease inhibitors (PI) have been successfully used in highly active antiretroviral therapy (HAART) of HIV-1 infection, the most effective treatment currently available. Incorporation of protease inhibitors in HAART has significantly reduced the morbidity and mortality and prolonged the lifespan of patients with HIV infection. Protease inhibitor benefits are unfortunately compromised by a number of clinically important adverse side-effects. Most patients on HAART develop a metabolic syndrome associated with partial lipodystrophy, hyperlipidemia, insulin resistance, premature atherosclerosis and myocardial infarction. Moreover, these patients face a growing number of other age-related comorbidities, such as neurodegeneration, osteopenia and malignancies. The cellular and molecular mechanisms underlying protease inhibitor-associated metabolic abnormalities remain elusive, but they seem to be related to overproduction of reactive oxygen speci es (ROS), induction of endoplasmic reticulum stress and activation of the unfolded protein response (UPR). The objective of this thesis was to determine the cell effects of four PIs (Atazanavir, Lopinavir, Ritonavir and Saquinavir) in cultures of primary human skeletal myotubes. This study showed that PIs increased ROS production, altered sarco/endoplasmic reticulum (SR/ER) morphology, increased expression of C/EBP homologous protein, a SR/ER stress marker, and decreased expression and localization at lipid rafts of Caveolin 3 and Flotillin 1. In addition, we showed that the antioxidant Resveratrol protected the human primary myotube of these iatrogenic effects. These data suggest a central role of the overproduction of ERO in the development of SR/ER stress and mislocalization of lipid raft proteins induced by PIs. Besides, in absence of vaccine, Resveratrol may be used by a potentiel therapeutic agent to attenuate PI-induced side effects

La maladie de Niemann-Pick de type C (NPC) est une lipidose lysosomale complexe due à une mutation d’un des gènes NPC1 ou NPC2, qui codent pour ces protéines localisées dans les compartiments endo-lysosomaux (LE/LY). Leur absence altère le trafic intracellulaire et induit l’accumulation du cholestérol (Chol) dans les LE/LY. De plus, l’AnxA6 semble participer au transport vésiculaire du Chol en interagissant avec les microdomaines membranaires enrichis en Chol, ou avec le Chol lui-même. Dans ce travail, nous avons isolé des microdomaines membranaires résistant au Triton X-100 (également appelés DRMs pour detergent resistant membranes) à partir de lignée cellulaire NPC L1 ou de cellules saines. Les fibroblastes NPC contiennent plus de DRMs que les fibroblastes sains. Ceci semble être corrélé aux problèmes de transport du Chol dans les cellules NPC. Nous avons aussi montré qu’en présence de calcium, une partie de l’AnxA6 est associé aux DRMs, suggérant que l’AnxA6 participe à l’organisation de la membrane et par ce bias à l’étiologie de la maladie de NPC. Nous avons alors analysé les interactions de l’AnxA6-1 avec les microdomaines riches en Chol ainsi que l’implication de sa région flexible et de la séquence VAAEIL dans ces interactions. Leurs interactions avec des monocouches de Langmuir constituées de phosphatidylcholine, Chol et/ou d’acétate de cholestéryle. Nos résultats montrent que l’AnxA6 a la plus grande affinité pour les monocouches contenant du Chol ainsi que l’implication du groupement hydroxyle du Chol lors de ces interactions. / The Niemann-Pick type C (NPC) disease is a lysosomal lipid storage disorder caused by mutations in one of the two genes NPC1 or NPC2 encoding proteins of the late endosome/lysosome compartment (LE/LY). Defect in these proteins alters vesicular transport and leads to abnormal accumulation of cholesterol (Chol) in LE/LY. There are some lines of evidence suggesting that annexin A6 (AnxA6) participates in vesicular transport of Chol and may interact with membrane domains enriched in Chol and bind Chol. In this work we characterized the membrane microdomains resistant to Triton X-100, i.e., detergent-resistant membranes (DRMs) isolated from NPC patient-derived fibroblasts and from control cells. NPC cells contain a significantly higher amount of DRMs than the control cells that is consistent with the defect in Chol turnover in NPC cells. We also studied the mechanism of AnxA6 involvement in the NPC-induced changes in the membrane organization and showed that in the presence of calcium some AnxA6 molecules associate with the DRMs. This suggests that AnxA6 may play a role in the membrane lateral organization, contributing thus to the etiology of NPC disease. We then focused on the interaction of AnxA6-1 with Chol-rich membranes and on the involvement of its flexible region and VAAEIL sequence in these interactions. For this purpose, kinetics of the interfacial adsorption of human recombinant AnxA6 to Langmuir monolayers containing phosphatidylcholine, Chol and/or cholesteryl acetate were measured. Our data suggest that AnxA6 exhibits the highest affinity to Chol-containing monolayers and that the hydroxyl group of Chol plays a pivotal role in the AnxA6-lipid interactions in vitro.