As neoplasias induzidas pela forma oncogênica da KRAS são doenças muito comuns, para as quais não existem terapias efetivas. Uma inibição direta da KRAS falhou em ensaios clínicos e esforços intensos tem sido feitos para identificar alvos de KRAS importantes para a oncogênese. Uma via promissora regulada por KRAS, que tem sido pouco explora a é a via dos microRNAs (miRNAs). Nossa meta foi identificar miRNAs regulados pela KRAS em células pulmonares e pancreáticas, que possam contribuir para o fenótipo oncogênico. Para alcançar esta meta nós usamos duas abordagens: (1) Nós investigamos o miRNA 486-5p como um alvo de KRAS em câncer de pâncreas e de pulmão. A expressão deste miRNA havia sido correlacionada positivamente com a presença de mutações em KRAS em pacientes portadores de câncer de cólon; (2) Nós usamos uma plataforma de microarranjo para identificar miRNAs diferencialmente expressos entre células humanas primárias imortalizadas pulmonares ou pancreáticas e suas linhagens isogênicas transformadas por KRAS. Na primeira abordagem, conseguimos mostrar que a expressão do miRNA 486-5p está correlacionada ao status de KRAS em células primárias pulmonares, mas não em células primárias pancreáticas. Além disso, geramos células pulmonares tanto com ganho e perda de função de KRAS e demonstramos que KRAS regula a expressão do miRNA 486-5p. Também de terminamos uma correlação negativa entre a expressão de KRAS e a expressão do alvo do miRNA 486-5p FoxO1, um supressor tumoral. Para avaliar como o miRNA 486-5p afeta as propriedades oncogênicas induzidas por KRAS, nós transfectamos oligonucleotídeos inibitórios para o miRNA 486-5p em células pulmonares positivas para mutações em KRAS. A inibição da expressão do miRNA 486-5p levou a uma redução da clonogenicidade e viabilidade celulares. Esta redução não está associada a um aumento de morte celular, mas a uma redução da proliferação celular. Interessantemente, a transfecção de oligonucleotídeos mímicos do miRNA 486-5p em células pulmonares negativas para mutações em KRAS ou em células com perda de função de KRAS por RNAi levou a um aumento da proliferação e clonogenicidade. Estes dados indicam que o miRNA 486-5p, não só é um alvo de KRAS em câncer de pulmão, mas também age como um oncomiR contribuindo para a proliferação celular induzida por KRAS. Na nossa segunda abordagem, nós identificamos 17 miRNAs com expressão aumentada e 3 com expressão diminuída em células primárias pancreáticas expressando KRAS oncogênica. Destes, 9 miRNAs foram foram também identificados por metanálise de dados de microarranjo publicados comparando amostras tumorais pancreáticas com amostras não tumorais. Apesar do experimento de microarranjo com as linhagens primárias pulmonares não ter produzido resultados estatisticamente significativos após a correção por FDR, uma tendência à expressão diferencial foi observada para vários miRNAs e nós validamos por qPCR a expressão diferencial dos miRNAs 720 e 139-3p. Em conclusão, nós conseguimos identificar miRNAs regulados pela KRAS tanto em células pulmonares, quanto pancreáticas. Um melhor entendimento das suas funções biológicas, bem como dos alvos por eles regulados nestes contextos, pode revelar novas vias para a exploração terapêutica. / KRAS-induced lung cancer is a very common disease, for which there are currently no effective therapies. Direct targeting of KRAS has failed in clinical trials and intense efforts are underway to identify KRAS targets that play a crucial role in oncogenesis. One promising KRAS-regulated pathway that has so far been overlooked is the micro RNA (miRNA) pathway. Our goal was to identify miRNAs regulated by oncogenic KRAS in lung and pancreatic cells that could contribute to the oncogenic phenotype. In order to achieve this goal we used two different approaches: (1) We investigated miRNA 486-5p as a KRAS target in lung and pancreatic cancer. The expression of this miRNA had been correlated to the presence of KRAS mutations in colon cancer patients; (2) we used a microarray platform to identify differentially expressed miRNAs between immortalized human primary pulmonary or pancreatic epithelial cell lines and their isogenic K-Ras-transformed counterparts. In our first approach, we were able to show that mi486-5p expression correlates with KRAS status in lung primary cells, but not in pancreatic primary cells. Furthermore, we generated lung cancer cells with either gain-of-function or loss-of-function of KRAS and demonstrated that KRAS regulates miRNA 486-5p in these cells. We also found, in all lung cell models analyzed, a negative correlation between expression of KRAS and expression of miR-486-5p target FoxO1, a tumor suppressor. In order to evaluate how miR-486-5p affects KRAS-induced oncogenic properties, we transfected miR-486-5p inhibitor oligonucleotides into KRAS-positive lung cancer cell lines. Inhibition of miR-486-5p expression leads to reduced clonogenic growth and viability. This reduction is not associated with increased cell death, but with decreased cell proliferation. Interestingly, transfection of miR-486-5p double-stranded RNA mimic oligonucleotides in to KRAS negative lung cancer cell lines or into cells with loss-of-function of KRAS by RNAi leads to enhanced proliferation and clonogenicity. These results indicate, not only that miR-486-5p is a KRAS target in lung cancer, but also that miR-486-5p acts as an oncomiR contributing to KRAS-induced cell proliferation. In our second approach, we identified 17 upregulated microRNAs and 3 downregulated microRNAs in the primary pancreatic cell line expressing KRAS. Of these, 9 miRNAs were also identified by a metanalysis of published microarray datasets comparing pancreatic cancer patient samples to non-cancerous pancreatic tissues. Even though our array experiment in the primary pulmonary cells did not produce statistically significant results after FDR correction, differential expression trends were seen for many miRNAs and we validated miRNAs 720 and 139-3p as differentially expressed. In conclusion we were able to identify miRNAs regulated by KRAS both in lung and pancreatic cancer cells. Further understanding of their biological function, as well as the targets they regulate in these settings, could uncover novel pathways for therapy design.

Der Cortex von Säugetieren ist der Hirnbereich, der fundamental für höhere kognitive Funktionen wie Lernen, Gedächtnis, Aufmerksamkeit und komplexes Denken ist. Die Entwicklung des Cortex wird von neuralen Vorläuferzellen gesteuert, die schnell proliferieren, um ihren Pool zu expandieren, bevor sie zu differenzierenden Zellteilungen wechseln, um alle Neuronen zu generieren, aus denen der reife sechs schichtige Neokortex besteht. Der schrittweise Wechsel von Selbsterneuerung zu Neurogenese ist ein zeitlich regulierter Prozess, dessen Fehler schwere lebenslange kognitive Erkrankungen verursachen können. Aus diesem Grund ist es enorm wichtig zu verstehen, welche Faktoren die Schicksalsentscheidung der neuralen Vorläuferzellen regulieren. In den letzten zwei Jahrzehnten haben mehrere Studien die Wichtigkeit von nicht-kodierenden RNAs, wie lange nicht-kodierende und micro RNAs, für diese zeitliche Regulierung hervorgehoben. Mithilfe der Generierung einer kombinatorischen RFP/GFP Reporter Mauslinie, die die Isolierung von proliferierenden und differenzierenden Vorläuferzellen und neugeborenen Neuronen erlaubt, wurde berichtet, dass die lange nicht-kodierende RNA Miat als ein Regulator des neuralen Vorläuferzellen-Schicksals mittels Spleißen fungiert. Die Arbeit dieser Thesis zeigt, dass die Überexpression von Miat den Wechsel der neuralen Vorläuferzellen von proliferierenden zu neurogenen Zellteilungen verzögert und etabliert eine Strategie, um Miat-gespleißte Ziele auf Einzelpopulationslevel während der Corticogenese zu entdecken. Außerdem wurde die doppelte Reporter Mauslinie genutzt, um einen umfassenden und kompletten Katalog von micro RNAs, die in neuralen Vorläuferzellen und Neuronen exprimiert sind, zu erstellen. Dies führte zur Identifizierung von miR-486-5p als ein neuer Regulator der neuralen Vorläuferzellen-Schicksalsentscheidung.

Als viert häufigste Karzinomerkrankung bei Männern und zwölft häufigste bei Frauen in Deutschland ist das BCa weitverbreitet in der Gesellschaft. Dies macht die Erforschung der komplexen, molekularen Mechanismen und die Entwicklung individualisierter Therapiestrategien notwendig. Neben externen Umwelteinflüssen wie der Konsum von Tabak, die Exposition von Chemikalien und chronische Entzündungen spielen auch genetische und molekulare Aberrationen eine relevante Rolle in der Tumorinitiation. Zu den molekularen Aberrationen gehört unter anderem die Dysregulation der miRNA-vermittelten RNA-Interferenz. Interessant für diese Arbeit waren die beiden Moleküle NRP2 und VEGFC, welchen in diversen Tumorentitäten eine onkogene Wirkung zugeschrieben wurde und welche bei vermehrter Expression die Tumorentstehung, -progression und Metastasierung über die Tumor-assoziierte Lymphangiogenese fördern. Um die Rolle von NRP2 und VEGFC im BCa näher zu untersuchen, wurden die Expressionen und die Korrelationen dieser und potentiell interagierender miRNAs in BCa- Geweben mittels in silico-Verfahren und in BCa-Zelllinien mittels qPCR-Analysen näher untersucht. Zur weiteren Analyse wurden anschließend auch die Expressionen und Korrelationen alternativer Targetgene und Hostgene sowie gemeinsame Signalwege von vier ausgewählten miRNAs evaluiert. In den in silico- und qPCR-Analysen zeigten sich NRP2 und VEGFC in den BCa-Geweben und -Zelllinien verglichen zu den gesunden Urothelgeweben und Zelllinien niedriger exprimiert. Diese Ergebnisse stehen im Widerspruch zu der Annahme, dass eine verstärkte Expression beider Targetgene mit der Tumorinitiation einhergeht. Jedoch zeigten sich NRP2 und VEGFC verstärkt exprimiert in allen CDDP-resistenten BCa-Zelllinien. Dies spricht dafür, dass beide Targetgene zur Resistenzbildung beitragen. Auch in den Auswertungen der BC- BET-Datenbank war die erhöhte Expression von NRP2 und VEGFC mit aggressiveren Tumoreigenschaften und einer schlechteren Prognose assoziiert. Diese Assoziation unterstützt die Annahme, dass die zunehmende Expression beider Targetgene mit einer Tumorprogression, Metastasierung und der Rezidivbildung in Verbindung steht. In einem weiteren Schritt wurde nach NRP2/VEGFC-regulierenden miRNAs geschaut. Dabei ergaben sich nach in silico- und Literaturrecherche 33 Kandidaten, wovon nach näherer Betrachtung die vier miRNAs miR-27a, -128, -195 und -338-5p zur weiteren Analyse ausgewählt wurden. Für die ausgewählten miRNAs wurden anschließend die Expressionen in BCa-Geweben mittels TCGA-Datenbank und die zellulären Grundexpressionen mittels qPCR-Analyse bestimmt. Hierbei zeigten sich miR-27a und -128 in den BCa-Geweben signifikant erhöht. MiR-195 hingegen war signifikant erniedrigt. Auch miR-338-5p war erniedrigt, jedoch nicht signifikant. Die Auswertungen der zellulären Grundexpressionen zeigte für miR-128 und miR-195 den Trend zu einer verstärkten Expression in den BCa- Zelllinien. Für miR-27a und miR-338-5p zeigte sich keine relevante Expressionsdifferenz. Um eine Aussage über die Signifikanz der Expressionsdifferenzen zu treffen, ist die Analyse einer größeren Anzahl von BCa- und gesunden Zelllinien notwendig. Die genauere Betrachtung der miRNA-Targetgen-Korrelationen sollte Auskunft über mögliche miRNA-mRNA-Interaktionen geben. Eine negative miRNA-Targetgen-Korrelation spricht für eine Inhibierung der Targetgene durch die miRNA. Eine positive Korrelation spricht für eine miRNA-induzierte Verstäkung der Targetgenexpression. Signifikant negative Korrelationen zeigten sich in den BCa-Geweben für miR-27a/NRP2, miR-128/NRP2 und miR-128/VEGFC. Ebenfalls konnten diese negativen Korrelationen in den CDDP-sensitiven und CDDP-resistenten BCa-Zelllinien für miR-27a/NRP2, miR-128/NRP2 und miR- 128/VEGFC verzeichnet werden. Das inverse Verhältnis in den CDDP-resistenten Zelllinien unterstreicht, dass die reduzierte Expression von miR-27a und miR-128 in einer Hochregulierung von NRP2 und VEGFC resultieren könnte, welche die Tumorprogression und Resistenzentwicklung fördern könnte. Gegensätzlich dazu waren die miR-195/VEGFC- und miR-195/NRP2-Korrelationen in den CDDP-resistenten BCa-Zelllinien positiv. In den BCa-Geweben der TCGA-Datenbank waren sie signifikant bzw. per Trend positiv. Dieses Expressionsmuster spricht dafür, dass miR-195 die Expression der beiden Targetgene induzieren könnte. Während sich miR-338-5p in den BCa-Geweben schwach herabreguliert zeigte, ergab die qPCR-Analyse keine relevante Expressionsdifferenz in den malignen und nicht-malignen Zelllinien. Jedoch war die Zelllinie mit der stärksten Expression, gegensätzlich zu den anderen drei miRNAs, eine gesunde Zelllinie. Auch war miR-338-5p, mit Ausnahme von 5637CDDP, in den beiden anderen CDDP-resistenten Zelllinien herabreguliert. Aufgrund der schwachen und nicht signifikanten Korrelationen von miR-338-5p mit den beiden Targetgenen NRP2 und VEGFC konnte keine klare Schlussfolgerung bezüglich der Rolle von miR-338-5p in der Tumorinitiation und –progression gezogen werden. Weiterhin wurde auch das Verhältnis der intragen liegenden miRNAs zu ihren Hostgenen genauer betrachtet. Dabei waren für miR-128/ARPP21 und miR-338-5p/AATK die Korrelationen jeweils signifikant positiv. Auch zeigten sich ARPP21 und AATK in den BCa- Geweben der TCGA-Datenbank signifikant stärker exprimiert. Das spricht dafür, dass eine Koexpression von miRNA und Hostgen vorliegt. Die Recherche nach weiteren alternativen Targetgenen ergab eine Liste von acht Kandidaten, wovon vier (CPD, EDEM3, EYA4, RELN) eine signifikante Expressionsdifferenz zwischen BCa- und gesunden Urothelgewebe aufwiesen. Diese vier alternativen Targetgene zeigten sich zudem in der Literaturrecherche vielfach in die Karzinogenese und Resistenzbildung diverser Tumorentitäten involviert. Die Korrelationen mit den miRNAs zeigten sich für miR-128/CPD, miR-27a/EDEM3, miR-27a/EYA4, miR-128/EYA4, miR- 27a/RELN, miR-128/RELN und miR-195/RELN signifikant. CPD und EDEM3 zeigten sich in den BCa-Geweben der TCGA-Datenbank höher exprimiert, ebenso wie miR-128 und miR- 27a. Die Ergebnisse der Literaturrecherche und die positiven Korrelationen sprechen dafür, dass miR-128 und miR-27a die Expression von CDP bzw. EDEM3 induzieren und die Tumorinitiation und Tumorprogression fördern könnten. Gegensätzlich dazu stehen die negativen Korrelationen von miR-27a und miR-128 mit NRP2 und VEGFC. Auch die Korrelationen mit EYA4 und RELN zeigten sich jeweils negativ. EYA4 konnte vielfach als Tumorsuppressor identifiziert werden, unter anderem im BCa. Es spricht dafür, dass miR- 27a und miR-128 hier eine onkogene Rolle einnehmen könnten. RELN hingegen wurde in der Literatur vielfach als Onkogen identifiziert. Die negative Korrelation mit miR-27a und miR-128 lässt daher annehmen, dass die beiden miRNAs auch tumorsuppressiv wirken. MiR-195 zeigte jeweils eine positive Korrelation mit NRP2, VEGFC und RELN. Unter der Annahme, dass NRP2, VEGFC und RELN, wie vielfach in der Literatur beschrieben, onkogen agieren, sprechen die positiven Korrelationen dafür, dass miR-195 eine Tumor- fördernde Rolle einnimmt. Die erniedrigte Expression der drei Targetgene und miR-195 in den BCa-Geweben der TCGA-Datenbank widersprechen jedoch dieser Annahme. Abschließend wurden gemeinsame Signalwege der vier ausgewählten miRNAs herausgefiltert. Hierbei ergab sich eine Liste von 77 Signalwegen, welche vielfach in diverse Tumorsignalwege involviert sind, unter anderem in den Signalweg der Karzinogenese des BCa. Insgesamt scheinen miRNAs und ihre Zielgene an den komplexen Mechanismen der BCa- Karzinogenese und -Chemoresistenz beteiligt zu sein, wobei sie sowohl onkogene als auch tumorsuppressive Funktionen ausüben können.

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Les microARN (miARN) sont de petits ARN non-codants qui répriment la traduction de leurs gènes cibles par hybridation à leur ARN messager (ARNm). L'identification de cibles biologiquement actives de miARN est cruciale afin de mieux comprendre leurs rôles. Ce problème est cependant difficile parce que leurs sites ne sont définis que par sept nucléotides. Dans cette thèse je montre qu'il est possible de modéliser certains aspects des miARN afin d'identifier leurs cibles biologiquement actives à travers deux modélisations d'un aspect des miARN. La première modélisation s'intéresse aux aspects de la régulation des miARN par l'identification de boucles de régulation entre des miARN et des facteurs de transcription (FT). Cette modélisation a permis, notamment, d'identifier plus de 700 boucles de régulation miARN/FT, conservées entre l'humain et la souris. Les résultats de cette modélisation ont permis, en particulier, d'identifier deux boucles d'auto-régulation entre LMO2 et les miARN miR-223 et miR-363. Des expériences de transplantation de cellules souches hématopoïétiques et de progéniteurs hématopoïétiques ont ensuite permis d'assigner à ces deux miARN un rôle dans la détermination du destin cellulaire hématopoïétique. La deuxième modélisation s'intéresse directement aux interactions des miARN avec les ARNm afin de déterminer les cibles des miARN. Ces travaux ont permis la mise au point d'une méthode simple de prédiction de cibles de miARN dont les performances sont meilleures que les outils courant. Cette modélisation a aussi permis de mettre en lumière certaines conséquences insoupçonnées de l'effet des miARN, telle que la spécificité des cibles de miARN au contexte cellulaire et l'effet de saturation de certains ARNm par les miARN. Cette méthode peut également être utilisée pour identifier des ARNm dont la surexpression fait augmenter un autre ARNm par l'entremise de miARN partagés et dont les effets sur les ARNm non ciblés seraient minimaux. / microRNAs (miRNAs) are small non coding RNAs that repress the translation of their target genes by pairing to their messenger RNA (mRNA). The identification of miRNAs' biologically active targets is a difficult problem because their binding sites are defined by only seven nucleotides. In this thesis, I show that it is possible to model specific aspects of miRNAs to identify their biologically active targets through two modeling of each one aspect of miRNAs. The first modeling considers the miRNAs regulations through the identification of regulatory loops between miRNAs and transcription factors (TFs). Through this modeling, we identified over 700 miRNA/TF regulatory loops conserved between human and mouse. With the results of this modeling, we were able to identify, in particular, two regulatory loops between LMO2 and the miRNAs miR-223 and miR-363. Using hematopoietic stem cells and progenitor cells transplantation experiment we showed that miR-223 and miR-363 are involved in hematopoietic cell fate determination. The second modeling focuses directly on the interaction between miARN and messenger RNA (mRNA) to determine the miRNA targets. With this work, we developed a simple method for predicting miRNA targets that outperforms the current state of the art tool. This modeling also highlighted some unsuspected consequences of miRNA effects such as the cell context specificity and the saturation of mRNA targets by miRNA. This method can also be used to identify mRNAs whose overexpression increases the expression level of another mRNA through their shared miRNA and whose global effects on other genes are minimal.

O músculo esquelético é o tecido mais abundante do organismo, é importante em diversas habilidades básicas nas atividades de vida diária, como: movimento, postura corporal e respiração, além de outros processos fisiológicos importantes para manutenção do equilíbrio metabólico e defesa imunológica. Para se manter em adequado funcionamento, o músculo esquelético possui uma alta plasticidade, remodelando sua estrutura e função de acordo com as exigências do ambiente. Os microRNAs são pequenos RNAs não codificadores de proteínas que podem regular a expressão gênica a nível pós-transcricional. Nas últimas décadas o conhecimento dos microRNAs na biologia do músculo esquelético vem abrindo portas para novas abordagens que visam otimizar a boa saúde da musculatura esquelética. Neste trabalho, nosso principal objetivo foi identificar e caracterizar microRNAs com potencial de modulação da regeneração e massa muscular esquelética. Utilizamos uma análise in silico para identificar os microRNAs que tem como alvo predito genes associados a vias que regulam a regeneração e massa muscular, em seguida manipulamos in vitro (células C2C12) e in vivo (camundongos C57BL/6) a expressão desses microRNAs, analisando a expressão desses genes e as consequências nas células e no tecido muscular. Na primeira parte deste trabalho, analisamos a hipótese de que certos microRNAs poderiam regular a expressão de MuRF1 e MuRF2 (E3-ligase importantes para o processo de regeneração muscular). Identificamos os microRNAs miR-29c e miR-101a que têm como alvo predito MuRF1, e miR-133a e miR-133b que tem como alvo predito MuRF2. MuRF1 é induzido nos primeiros estágios do processo de regeneração muscular e seus miRs potencialmente reguladores são reprimidos durante esse processo. A superexpressão de miR-29c e miR-101a reduz a expressão de MuRF1 em células C2C12, enquanto que, em um ensaio de luciferase, validamos MuRF1 como alvo direto apenas do miR-29c. Além disso, a superexpressão de miR-29c durante a diferenciação de células C2C12 promove a miogênese, com aumento do diâmetro e índice de fusão de miotubos, enquanto que a superexpressão do miR-101a provocou uma redução no diâmetro dos miotubos. Na segunda parte deste trabalho, identificamos in silico o miR-29c como um potencial regulador da massa muscular esquelética, em seguida através de um método de entrega gênica por meio de eletroporação, superexpressamos o miR-29c no músculo de camundongos. A superexpressão do miR-29c, promoveu um aumento da massa e do número de sarcomeros em serie, com ganho de força e função no músculo e esse efeito foi acompanhado de um remodelamento tecidual com aumento do número de células satélite ativadas. Tomados juntos, nossos resultados revelam que o miR-29c tem um efeito hipertrófico com ganho de função. A superexpressão deste microRNA pode ser uma ferramententa útil para futuras abordagens terapêuticas que visem a manipulação da massa muscular esquelética. / The skeletal muscle is the body most abundant tissue. It plays an important role in daily life activities, such as movement, posture, and breathing. In addition, this tissue is crucial at physiological processes like metabolic equilibrium and immune defense. The substantial adaptability in response to environmental change marks skeletal muscle as a plastic organ. This plasticity could be coordinated by microRNAs, those are small non-protein-coding RNAs that regulate post-transcriptional gene expression. This knowledge has fostered new approaches that aim to optimize the skeletal muscle health. Thus, in this work, we intended to identify and characterize microRNAs that modulate the muscle mass and the regeneration process. An in silico analyses has allowed the identification of microRNAs who possibly bind genes from pathways of skeletal muscle mass control and regeneration. After, we manipulated the expression of those microRNAs on C2C12 cells and C57BL/6 mice. Finally, we measured the transcriptional levels of target genes and the impact of these alterations on the cells and on muscle tissue. In the first section of this work, we hypothesized that microRNAs could regulate MURF1 and MURF2 expression, both E3-ligases important for the regeneration process. In our analysis, MURF1 was a predictable target of miR-29c and miR-101a while for MURF2 were identified miR-133a and 133b. During the regeneration process, MURF1 is up-regulated and its predicted target microRNAs are downregulated. In this context the hyperexpression of both miR-29c and miR-101a in C2C12 cells induced MURF1 down-regulation. Furthermore, miR-29c promotes myogenesis with an increase in myotubes diameter and fusion index. In contrast, miR-101a expression reduces myotubes diameter with no change at the fusion index. Lastly, luciferase assay validated only miR-29c directly target MURF1 3`UTR. In the second section of this work, we identified miR-29c as a potential regulator of skeletal muscle mass. Then through gene delivery by electroporation, we induce miR-29c overexpression in mice skeletal muscle. This procedure promoted an increase in muscle mass as well as a gain in strength, endurance and sarcomere number, furthermore the number of activated satellite cells. Taken together our results found that miR-29c has a hypertrophic effect with gain in muscle function. Thus, the overexpression of this microRNA could be a useful tool for future therapeutics that manipulate muscle mass.

A osteogênese imperfeita (OI) é caracterizada como uma desordem genética na qual uma osteopenia generalizada leva a baixa estatura, fragilidade óssea excessiva e deformidades ósseas graves. As células mesenquimais estromais multipotentes (CTMs) são precursores presentes na medula óssea adulta capazes de se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e mioblastos que passaram a ter grande importância como fonte terapia celular. O objetivo do presente estudo foi analisar o perfil de expressão gênica durante a diferenciação osteogênica a partir de células mesenquimais estromais multipotentes da medula óssea obtidas de pacientes diagnosticados com Osteogênese Imperfeita e de indivíduos controle. Foram coletadas amostras de três indivíduos normais e cinco amostras de pacientes portadores de Osteogênese Imperfeita. As células mononucleares (CMN) foram isoladas para a obtenção de células mesenquimais que foram expandidas até a terceira passagem quando iniciou-se o estímulo para diferenciação osteogênica. Também foram realizadas análises para contagem de CFU-F e para quatro das cinco amostras de pacientes portadores de OI, o número de CFU-F observado foi inferior ao geralmente encontrado para amostras de doadores normais. Foram coletadas células para análises de imunofenotipagem celular por citometria de fluxo e o RNA foi extraído originando a amostra denominada T0. As garrafas restantes tiveram suas células estimuladas para diferenciação osteogênica. Após um dia em cultura com estímulo, mais uma garrafa teve o RNA de suas células extraído (T1), e o mesmo procedimento foi realizado nos dias 2 (T2), 7 (T7), 12 (T12), 17 (T17) e 21 (T21). Todas as amostras demonstraram possuir potencial de diferenciação in vitro em osteoblastos e adipócitos. A imunofenotipagem de células mesenquimais foi realizada e as amostras de todos os pacientes apresentaram perfil imunofenotípico compatível com trabalhos anteriores. Foram identificadas mutações nos genes COL1A1 e/ou COL1A2 responsáveis pelo desenvolvimento da doença para quatro dos cinco pacientes avaliados. Para o paciente portador de Osteogênese Imperfeita e Síndrome de Bruck a região codificadora do gene PLOD2 também foi seqüenciada, porém não foram encontradas mutações. A análise da expressão gênica foi realizada pela técnica de microarranjos e foram identificados vários genes com expressão diferencial. Alguns genes com importância fundamental na diferenciação osteoblástica apresentaram menor expressão nas amostras dos pacientes portadores de OI, sugerindo um menor comprometimento das CTMs desses pacientes com a linhagem osteogênica. Outros genes também tiveram sua expressão diferencial confirmada por PCR em Tempo Real. Foi observado um aumento na expressão de genes relacionados a adipócitos, sugerindo um aumento da diferenciação adipogênica em detrimento à diferenciação osteogênica. A expressão das variantes do gene PLOD2 mostrou-se diferencial entre amostras normais, de OI e do paciente portador de Síndrome de Bruck. Também foi evidenciada uma expressão diferencial do microRNA 29b, um microRNA com papel estabelecido durante a diferenciação osteogênica, sugerindo um mecanismo de regulação dependente da quantidade de RNAm do seu gene alvo, o COL1A1. / Osteogenesis imperfecta (OI) is characterized as a genetic disorder in which a generalized osteopenia leads to short stature, bone fragility and serious skeletal deformities. Mesenchymal stem cells (MSCs) are precursors present in adult bone marrow that can differentiate into osteoblasts, adipocytes and myoblasts that have been given great importance as a source cell therapy. The aim of this study was to analyze the gene expression profile during osteogenic differentiation from mesenchymal stem cells from bone marrow taken from patients diagnosed with Osteogenesis Imperfecta and control subjects. Samples were collected from three normal individuals and five samples from patients with Osteogenesis Imperfecta. Mononuclear cells (MON) were isolated to obtain mesenchymal cells that were expanded until third passage when the stimulus for osteogenic differentiation was induced. Analyses were also conducted to count the CFU-F and for four of the five samples from patients with OI, the number of CFU-F observed was lower than generally found for normal samples. Cells were collected for analysis of cell immunophenotyping by flow cytometry and RNA was extracted from the resulting sample called T0. Remaining cells were stimulated for osteogenic differentiation. After a day in culture with stimulation, cells from another bottle had their RNA extracted (T1), and the same procedure was performed on days 2 (T2), 7 (T7), 12 (T12), 17 (T17) and 21 (T21). All samples have shown potential of in vitro differentiation into osteoblasts and adipocytes. Immunophenotyping of mesenchymal cells was performed and samples of all patients had immunophenotypic profile consistent with previous works. We identified mutations in COL1A1 and / or COL1A2 responsible for developing the disease for four of five patients. For the patient with Osteogenesis Imperfecta and Bruck Syndrome, coding region of the gene PLOD2 was also sequenced, but no mutations were found. The gene expression analysis was performed by microarray and identified several genes with differential expression. Some genes of fundamental importance in osteoblast differentiation showed lower expression in samples from patients with OI, suggesting a minor involvement of MSCs of patients with osteogenic lineage. Other genes also confirmed their differential expression by Real Time PCR. We observed an increased expression of genes related to adipocytes, suggesting an increased adipogenic differentiation at the expense of osteogenic differentiation. The expression of PLOD2 gene variants proved to be different between normal samples, OI and the patient with Bruck Syndrome. There was also evidence of differential expression of 29b microRNA, with established role during osteogenic differentiation, suggesting a mechanism dependent regulation of mRNA abundance of its gene target, COL1A1.

A diferenciação morfo-fisiológica entre rainhas e operárias de Apis mellifera decorre da alimentação recebida durante o desenvolvimento larval. Dentre as diferenças morfológicas entre as duas castas encontram-se estruturas especializadas para a coleta de pólen e própolis, localizadas nas pernas metatorácicas das operárias, ausentes nas pernas de rainhas. Os padrões de expressão de Ultrabithorax (Ubx) durante o desenvolvimento de operárias e rainhas estão associados aos padrões de cerdas das pernas de fêmeas adultas. Pernas mesotorácicas de operárias apresentam estruturas descritas como importantes na coleta de pólen, ausentes em rainhas. Por outro lado, as asas não possuem estruturas casta-específicas. No presente trabalho, análises globais de transcrição gênica por hibridação de lâminas de microarrays a partir de RNA total de pernas metatorácicas de operárias e rainhas em três estágios do desenvolvimento mostram 1952 genes diferencialmente expressos. Discos de pernas metatorácicas de larvas no início do quinto estágio larval, quando comparados aos de estágios mais tardios no desenvolvimento, têm alto níveis de transcritos de ativadores de Ubx, o qual está 25 vezes mais expresso em estágios subseqüentes do desenvolvimento. Buscas por motivos de ligação de fatores de transcrição nos promotores dos grupos de genes diferencialmente expressos revelam que os motivos para ligação de Ubx, Zeste e Twist estão super-representados em um dos conjuntos analisados. Dentro deste grupo, estão presentes genes cujos ortólogos em Drosophila são controlados por Ubx, como o caso do gene lola. Análises do processamento do mRNA de Ubx em pernas e asas de ambas as castas mostram que são produzidas três isoformas diferentes quanto à presença de dois microéxons (m1 and m2), que contêm 42 nt and 53 nt, respectivamente. A isoforma IIa-like, que contém o m2, entretanto, parece não ser capaz de produzir uma proteína Hox, já que possui um códon de terminação antes do homeodomínio. O perfil de transcrição diferencial de Ubx entre as castas está associado a apêndices que apresentam diferenças morfológicas, sendo Ubx mais transcrito em pernas meso e metatorácicas de operárias que rainhas. Quando analisadas as porcentagens de expressão de cada isoforma nos apêndices, claramente a isoforma IVa-like, sem microéxons, é a mais transcrita em todos os tecidos. Entretanto, nota-se que nas asas anteriores, onde há menos Ubx, a isoforma IIa-like é proporcionalmente mais transcrita que II nos outros apêndices. Destaca-se uma tendência à inclusão do microéxon m1 (isoforma IIIa-like) ao mRNA de Ubx transcrito em asas posteriores e pernas de rainhas em comparação a operárias, em detrimento da isoforma IVa-like. Análises do uso da região 3UTR em pupas de operárias mostram que há um microssatélite transcrito na porção distal da região 3UTR deUbx. A estrutura secundária predita agrupa separadamente as regiões codificadora e as regiões 3UTR proximal e distal. Análises de seqüenciamento de última geração revelaram que oito dos 51 microRNAs com sítios-alvo preditos na região 3UTR de Ubx estão mais expressos em asas anteriores, e outros dois em asas posteriores. Assim, nossos resultados mostram que o controle da expressão diferencial de Ubx é dada pela ativação desse gene por fatores de transcrição que se ligam ao promotor, controle do splicing alternativo, e expressão de microRNAs diferencial em cada casta e apêndice, controlando, assim, a morfogênese diferencial dos apêndices de fêmeas observada em A. mellifera. / Along with differences in physiological and behavioral characteristics, workers and queens of Apis mellifera also differ in appendage morphology. Some appendage specializations in the hind legs of honeybee workers, which are highly specialized pollinators, deserve special attention. The hind tibia of the worker has an expanded bristle-free region used for carrying pollen and propolis, the corbicula. In queens, this structure is absent. Although these morphological differences have been well characterized, the genetic inputs triggering the development of this alternative morphology have remained unknown. Through microarray analysis, we detected 1,952 genes that are differentially expressed during worker versus queen hind leg development. The gene expression signatures of the two castes have similar patterns of genes controlling development. At the beginning of the last larval instar, Ultrabithorax (Ubx) activators are more strongly expressed than in prepupae and early pupae; at this time Ubx expression is approximately 25 times higher. Within the gene expression signature, we identified a cluster formed by genes in which Ubx, Twist and Zeste binding sites are over-represented. This cluster includes genes for which Drosophila orthologs are known to be bound by Ubx, as in the case of lola. We also tested the extent of Ubx mRNA processing during wing and leg development. Unexpectedly, we found Ubx alternative splicing in both workers and queens; there were two microexons (m1 and m2) encoding 42 nt and 53 nt, respectively, arguing against the hypothesis that alternative splicing occurs exclusively within the Diptera. Inclusion of the m2 exon inserts a stop codon upstream from the exon containing the homeodomain, producing a truncated protein. Moreover, these bee microexons conserve the nucleotides known to be important for alternative splicing in Drosophila. During bee wing development, Ubx mRNA isoforms are transcribed in similar amounts in both castes; however, during leg development, queens produce 60% of the Ubx levels transcribed by workers. Analysis of 3UTR usage during bee development revealed a microsatellite region transcribed within the Ubx 3UTR. The predicted secondary structure locations separated the coding region into three branches and the proximal and the distal 3UTR regions. Deep-sequencing analysis revealed that eight out of 51 miRNAs predicted to target the Ubx mRNA are more highly expressed in worker forewings and two are more expressed in the hindwings. Therefore, we conclude that Ubx differential expression is activated by transcription factors that bind to its promoter, by control of alternative splicing, and moreover by microRNAs differentially expressed according to tissue and caste, resulting in differential morphogenesis of the hind leg in honeybee females.

No câncer, alterações em microRNAs (miRNAs), pequenos RNAs que regulam a tradução protéica, exerce efeito oncogênico (oncomiR). Os oncomiRs regulam genes chave para a proliferação celular e apoptose, sendo importantes para a biologia do câncer. O carcinoma papilífero de tiróide apresenta alterações genéticas alinhadas na via MAPK (RET>RAS>BRAF>ERK). Observamos que a indução do oncogene RET/PTC diminui a expressão de let-7 em células foliculares tiroidianas. Na linhagem TPC-1 (com RET/PTC-1), a introdução de let-7 diminui a proliferação celular e a fosforilaçãode ERK, indicando papel de gene supressor tumoral. No carcinoma anaplásico, avaliamos o papel da introdução do cluster miR-17-92 na linhagem ARO. Observamos que in vitro miR-17-92 atua de forma oncogênica aumentando proliferação e viabilidade celular de ARO. No entanto, estas células apresentam diminuição no crescimento em soft-agar. No xenotransplante, os tumores de ARO-miR-17-92 apresentam menor volume e expressam MMP-9 de forma reduzida, indicando também um papel de gene supressor tumoral para o cluster. / In cancer, alteration in microRNA, small RNAs (~22nt) that regulate post-transcriptionally protein levels, exerts oncogenic role (oncomiR). OncomiRs control genes involved in cell proliferation and apoptosis, influencing cancer biology. Papillary thyroid cancer displays activating genetic alterations in MAPK signaling pathway (RET>RAS>BRAF>ERK). Using conditional induction of oncogenes in thyroid cells, we observed that RET/PTC decreases let-7 miRNA expression. In papillary thyroid cancer cell TPC-1 (with RET/PTC-1) we observed that let-7 introduction inhibits cell proliferation and ERK phosphorylation, indicating tumor suppressor role for let-7. In anaplastic thyroid cancer, we evaluate the role of introduction of miR-17-92 cluster in ARO cell line. We observed in vitro that miR-17-92 increases ARO cell proliferation and viability, acting as oncogene. However, these cells show impaired soft agar growth. In xenotransplant, ARO-miR-17-92 tumors are smaller in volume and express reduced levels of MMP-9, indicating a tumor suppressor role for the cluster.

Nas abelhas sociais Apis mellifera a determinação de castas está relacionada à nutrição diferencial durante o desenvolvimento larval. Os indivíduos são alimentados com geléia real até o terceiro estágio larval, quando aqueles que são destinados a se tornarem operárias passam a receber uma mistura de secreções glandulares, mel e pólen. O conteúdo da dieta recebida após o terceiro estágio larval ativará respostas endócrinas diferenciais que resultarão no estímulo de vias distintas de expressão gênica que culminarão no desenvolvimento de rainhas e operárias. Vários modelos de determinação de castas foram propostos envolvendo diferentes fatores que atuam sobre o desenvolvimento de cada uma, em especial o Hormônio Juvenil (HJ), as vias de sinalização por insulina/IGF e TOR (target of rapamycin) a metilação diferencial e a proteína recentemente descoberta, royalactin, que favorecem o desenvolvimento de rainhas. Para o desenvolvimento de operárias foi sugerido estímulo de outras vias de sinalização, que possivelmente envolveria a participação dos genes ultraspiracle (usp), cryptocephal (crc) e retinoid- and fatty acid-binding protein (RfaBp). Utilizando diferentes abordagens avaliamos a participação destes genes no processo que culmina no desenvolvimento das castas. Através da análise de expressão gênica em larga escala utilizando microarrays, observamos a existência de genes diferencialmente expressos em rainhas e operárias, sendo a maior que parte deles apresentou expressão preferencial em operárias. Muitos destes genes, inclusive esterase do hormônio juvenil (jhe), failed axon connections (fax), activating transcription factor-3 (atf-3), cathepsin-D (cath-D) e peptidoglycan recognition protein-SC2 (pgrp-sc2), preferencialmente expressos em operárias, estão envolvidos, segundo análises de função por Gene Ontology, em processos essenciais no desenvolvimento das castas como crescimento, reprodução, apoptose, neurogênese, degradação do hormônio juvenil, entre outros. A partir destes resultados, incluímos o gene da esterase do hormônio juvenil (jhe) em nossas análises, como um possível candidato a determinante do desenvolvimento diferencial das operárias. Além disto, foi determinado o perfil de expressão de usp, crc, RfaBp e jhe, durante o desenvolvimento de rainhas e operárias. Observamos que os maiores níveis de expressão de cada um são encontrados em fases posteriores ao período crítico de determinação de castas e que em geral, os maiores níveis de expressão são encontrados em operárias, especialmente crc, RfaBp e jhe. Para usp, os níveis são distintos em rainhas e operária apenas em pontos específicos entre o quinto estágio larval e a fase pré-pupal. Adicionalmente avaliamos a influência da diminuição, através de interferência por RNA (RNAi), dos níveis de expressão de cada um destes genes sobre os níveis dos outros genes estudados, e também sua atuação no desenvolvimento. Vimos que mesmo pequenas modificações nestes níveis inibem ou estimulam a expressão de outros genes e, em alguns casos causam alterações no desenvolvimento das abelhas. Sabendo da importância dos microRNAs (miRNAs) na regulação da expressão gênica e do desenvolvimento, avaliamos os níveis de expressão dos miRNAs preditos como reguladores de jhe. Os resultados obtidos mostraram que alguns deles, como let-7, miR-2796 e miR-263b, por apresentarem correlação negativa com os níveis do gene alvo, são realmente fortes candidatos a seus reguladores. Além disto, alterações nos níveis do gene alvo, mostraram a capacidade de alterar os níveis de expressão da maioria dos miRNAs preditos. Este resultado foi corroborado por sequenciamento em larga escala das amostras tratadas com dsjhe e controle, que apontou também outros possíveis reguladores de jhe, entre eles miR-100, miR-306 e mi-13b. Analisando os resultados obtidos de forma conjunta podemos sugerir que o desenvolvimento de operárias está sob complexa regulação que envolve a participação dos genes aqui estudados, além de outros fatores como os miRNAs. Estes genes agem de maneira coordenada, inclusive com os miRNAs, em momentos específicos do desenvolvimento atuando sobre cascatas de expressão gênica de forma a ativar ou inibir a expressão uns dos outros e também de outros genes, o que culminará no desenvolvimento diferencial de rainhas e operárias em A. mellifera. / In Apis mellifera, a eusocial bee, caste determination during larval development is regulated by differential nutrition. All female larvae are fed royal jelly until the third larval stage, when the workerdestined ones have their diet switched to a gland secretion mix, honey and pollen, Queen-destined larvae, however, are provisioned with a rich diet throughout development. Changes in diet after the third developmental stage modulate larval endocrine responses and different nutritional regimes trigger distinct patterns of gene expression. Thus, nutritional regulation of specific signaling pathways controls development of worker and queen phenotypes. Several proposed models of this process involve caste-specific regulation of hormonal and nutritional factors and/or molecular processes including Juvenile Hormone (JH), insulin/IGF and TOR (target of rapamycin) signaling pathways, differential methylation and the newly discovered protein royalactin, which facilitates queen development. Previous research has also suggested the stimulus of other factors in signaling pathways that acts towards workers development, and they possibly involves the participation of some genes like ultraspiracle (usp), cryptocephal (crc), and retinoid- and fatty acid-binding protein (RfaBp). Using diverse molecular approaches, we evaluate the role of these genes in caste differentiation. We used microarrays to characterize global differences in gene expression between queen and worker larvae. Functional analysis of significantly, differentially expressed genes identified fundamental biological processes including growth, reproduction, apoptosis, neurogenesis and JH degradation that are involved in caste differentiation. Based on these findings, we selected several candidate genes including juvenile hormone esterase (jhe), failed axon connections (fax), activating transcription factor-3 (atf-3), cathepsin-D (cath-D), and peptidoglycan recognition protein-SC2 (pgrp-sc2) for investigation. Notably, these genes were preferentially upregulated in workers. In a separate experiment, we monitored expression of usp, crc, RfaBp and jhe, in queen and worker larval during stages critical to caste determination. In general, workers expressed crc, RfaBp and jhe at higher levels than queens. For usp, distinct expression levels between worker- and queen-destined larvae were observed only at specific points between the 5th larval stage and pre-pupal phase. Additionally we used RNA interference (RNAi) to monitor the impact of decreased levels of select candidate genes on larval development. We found that even small modification of gene expression levels inhibited or triggered expression of other genes, and, in some cases, caused developmental alterations. Furthermore, microRNAs (miRNAs) are also important regulators of gene expression during development and we identified miRNAs that were predicted jhe regulators and assessed their levels. Results determined that some miRNAs including let-7, miR-2796 e miR-263b were strong candidates for jhe regulation because they were significantly and negatively correlated with target gene expression levels. Furthermore, manipulation of target gene expression levels altered expression of most predicted miRNAs. These results were confirmed by deep sequencing of RNAi samples treated with double-stranded RNA for jhe gene (dsjhe) and controls (with no treatment) which also identified other candidate jhe regulators, like miR-100, miR-306 and mi-13b. Taken together, these results suggest that worker development is regulated by complex interactions that involve usp, crc, RfaBp and jhe in addition to other molecules, including miRNAs. These molecular participants coordinate development at specific time points by regulating activity of gene networks and each other, producing the differential development of workers and queens in A. mellifera.