Splicing é o processo de remoção de introns e ligação de exons em eucariotos. É realizado pelo spliceossomo, um complexo macromolecular composto por RNAs e mais de cem proteínas. Alguns introns possuem microRNAs, os quais devem ser processados para gerar moléculas maduras. O cluster intrônico miR-17-92 é composto por sete miRNAs que têm sido associados ao desenvolvimento de diferentes tumores em vários tecidos. Neste trabalho o splicing de dois miRNAs deste cluster foi analisado em células HeLa, BCPAP e TPC-I. Os resultados mostraram que introns com miR19a tem o splicing mais eficiente do que aqueles com miR18a em todas as três células analisadas. Além disso, a composição dos spliceossomos foi analisada por espectrometria de massas. Entre as principais proteínas encontradas, destaca-se a presença das hnRNPs, como hnRNP_A1 e hnRNP_A2/B1. Estes resultados são importantes para entender como esses miRNAs são processados, e quais são os principais componentes recrutados em diferentes tipos celulares. / Pre-mRNA splicing is the process of intron removal and exon ligation in eukaryotes. It is performed by the spliceosome, a multi-megadalton machinery composed of RNAs and more than a hundred proteins. Intronic miRNAs must be processed from the host gene to generate mature molecules. miR-17-92 is an intronic cluster composed of seven miRNAs which have been associated to the development of different tumors, in several different cells. In this work, we analyzed the splicing of two miRNAs belonging to this cluster in HeLa, BCPAP and TPC-I cells. Interestingly, we observed miR19a is more efficiently spliced than miR18a in all three cells. We also searched for specific proteins that can be involved in their respective splicing process. We observed hnRNP proteins are especially concentrated in spliceosomes assembled in introns containing these miRNAs, based on mass spectrometry data. These results are important to understand how these miRNAs are spliced and matured and also can explain their different expression levels in different cells.

Leucemia Linfóide Crônica (LLC) é a leucemia mais comum em países ocidentais, tem apresentação clínica e evolução heterogênea. Especula-se que todos os casos sejam precedidos por Linfocitose B Monoclonal (LBM). Não são bem conhecidos os mecanismos moleculares responsáveis por esta evolução. Alterações na expressão de miRNAs e em comprimento telomérico podem contribuir para desencadear esta neoplasia. O objetivo deste estudo foi identificar diferenças em comprimento telomérico e expressão de miRNAs entre pacientes com LLC, portadores de LBM clínica e populacional e controles saudáveis. Estudamos 21 pacientes com LLC, 11 portadores de LBM clínica, 6 de LBM populacional e 10 voluntários saudáveis. Para o controle de comprimento telomérico, utilizamos dados de estudo anterior do nosso serviço com grupo de 261 voluntários saudáveis de 0 a 86 anos. Realizamos separação de células CD19+CD5+ por citometria de fluxo nos grupos de estudo e de linfócitos B no grupo controle. Analisamos expressão dos miRNAs 15a, 16-1, 29b, 34a, 155, 181a e 181b por RT-qPCR e comprimento telomérico por qPCR. O miR- 155 foi o único que demonstrou expressão diferente entre os grupos LLC e LBM, sendo maior nos pacientes com LLC. Este miRNA e o miR-34a têm aumento de expressão nas células com fenótipo anormal, apesar desta diferença não ter tido significância estatística quando considerada a expressão do miR-155 na LBM. Os miRNAs 15a, 16-1, 181a e 181b são hipoexpressos nas células com fenótipo anormal. O miR-29b teve expressão semelhante nos grupos estudados. O comprimento telomérico foi semelhante nos 3 grupos de estudo e menor quando comparados ao grupo controle. O miR-155 tem diferente expressão em LBM e LLC, podendo ser um dos responsáveis por esta evolução. Alterações nos miRNAs 34a, 15a, 16-1, 181a e 181b contribuem para expansão clonal de linfócitos B CD5+. O papel do miR-29b na fisiopatogênese e evolução da LLC ainda não está bem definido. O comprimento telomérico diminuído em LLC e LBM pode fazer parte dos eventos iniciais da fisiopatogênese desta leucemia. / Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) is the most common leukemia on Western countries, it has an heterogeneous clinical presentation and outcome. Monoclonal BCell Lymphocytosis (MBL) may precede all CLL cases. The molecular mechanisms responsible for this evolution are not known. Aberrant miRNA expression and telomere shortening may contribute for the pathophysiology of this disease. The objective of this study was to identify differences on telomere length and miRNA expression between CLL patients, subjects with clinical and population-screening MBL and healthy volunteers. 21 CLL patients, 11 subjects with clinical MBL, 6 with population-screening MBL and 10 healthy volunteers were enrolled on this study. As control for telomere length, we used a group of 261 healthy volunteers aged 0 to 86 years old that had been enrolled on a previous study from our group. After diagnosis confirmation, it has been done a flow citometry CD19+CD5+ cell sorting for the study groups and CD19+ cell sorting for the control group. The expression of the miRNAs 15a, 16-1, 29b, 34a, 155, 181a and 181b was determined by RT-qPCR. The telomere length was determined by qPCR. miR-155 was the only one with different expression between the CLL and MBL groups, presenting higher expression on the CLL group. This miRNA and the miR-34a are overexpressed on the study groups when compared to the control group, although this difference did not reach statistical significance when the miR-155 expression in MBL is considered. miRNAs 15a, 16-1, 181a and 181b are underexpressed on the study groups. The miR-29b was the only one with similar expression on all groups. The telomere length was similar on the 3 study groups and shorter on these groups when compared to normal subjects. The expression of miR-155 is different in CLL and MBL, it may contribute for this evolution. Aberrant expression of miR 34a, 15a, 16-1, 181a and 181b may contribute for the clonal expansion of CD5+ B lymphocytes. The role of miR-29b on the CLL pathogenesis and evolution is still not understood. The reduced telomere length on CLL and MBL may be part of the initial events of this leukemia pathogenesis.

Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2017-07-26T18:47:21Z No. of bitstreams: 1 2014 - Marcela Jacques de Lemos Neves.pdf: 434472 bytes, checksum: c9817e97c5d136299acb936ad4b87b6f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-26T18:47:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014 - Marcela Jacques de Lemos Neves.pdf: 434472 bytes, checksum: c9817e97c5d136299acb936ad4b87b6f (MD5) Previous issue date: 2014-05-30 / FAPERJ / The main goal of this study was evaluate the effect of downregulation of the ammonium transporter OsAMT1.3 in the ammonium uptake through the high affinity system, as well as the effects on nitrogen metabolism. To perform the OsAMT1.3 gene silencing, it was used the artificial micro RNA (amiRNA) technology. In this system, the OsAMT1.3 coding region sequence (cds) is inserted in W marcelaMD3 website and putatives amiRNAs to silencing OsAMT1.3 were made. The amiRNA was inserted by PCR using the pNW55 vector as template. The amiRNA was inserted in the IRS154 vector using the T4 DNA ligase. The IRS154 plus amiRNA was cloned in the E. coli by electroporation. After rice transformation of Nipponbare variety through Agrobacterium and Hygromycin selection, 14 lineages were obtained. Six lineages showed high seed production and only one lineage with abnormal growth. After seed production in a greenhouse, the lineages L1, L2 and L6 were selected to further experiments evaluating the effects of OsAMT1.3 downregulation. First, the lineages selected were evaluated about the levels of OsAMT1.3 downregulation. The rice lineages transformed with amiRNA showed lower level of OsAMT1.3 expression compared to control plants, however, different levels of OsAMT1.3 downregulation was observed. The lineage L1 showed lower levels of OsAMT1.3 downregulation, L2 and L6 showed higher levels of OsAMT1.3 downregulation. The lineages L1, L2 and L6 as well as IRS control plant (transformed with empty vector) were grown in growth chamber at 30 days after germination, and the treatments used were: N starvation for three days, resupply with 0.15 mM of NH4+-N (low level) and 2.0 mM of NH4+-N (high level). The lineages L1, L2 and L6 showed lower NH4+ uptake with 0.15 mM of NH4+-N compared to control plants (IRS), on the other hand, the plants grown with 2.0 mM of of NH4+-N did not show NH4+ uptake differences, except L1. The expression of OsAMT1.1, OsAMT1.2 and OsAMT1.3 ammonium transporters were upregulated with 0.15 mM of NH4+-N in the control plants (IRS); in the lineages L1, L2 and L6 showed downregulation of the OsAMT1.1, OsAMT1.2 and OsAMT1.3 genes. The lower NH4+ uptake with 0.15 mM of NH4+-N resulted in lower levels of NH4+-N and Amino-N in the roots in the lineages, while the NH4+-N and Amino-N in the plants grown with 2.0 mM of NH4+-N was minimally changed. The results indicate that OsAMT1.3 downregulation leads to OsAMT1.1 and OsAMT1.2 downregulation as well, decreasing the NH4+ uptake. Despite the OsAMT1.3 lower expression compared to OsAMT1.1 and OsAMT1.2, the OsAMT1.3 transporter may be involved in the nitrogen uptake efficiency in low levels of NH4+. / O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito do silenciamento do gene do transportador OsAMT1.3 em arroz sobre a habilidade das plantas em absorver o N-NH4+ atrav?s do sistema de alta afinidade, bem como os reflexos sobre o metabolismo de nitrog?nio. Para o silenciamento do gene OsAMT1.3 foi usada a tecnologia do miRNA artificial (amiRNA). Para tanto, a sequ?ncia codante do gene (cds) OsAMT1.3 ? inserida no sistema WMD3 que indica sequ?ncias de amiRNA?s para silenciar o pr?prio OsAMT1.3. A inser??o do amiRNA foi feita por PCR usando o vetor pNW55 como molde. O miRNA foi inserido no vetor IRS154 por corte e liga??o usando a enzima T4 DNA ligase. O produto da liga??o foi introduzido em E. coli por eletropora??o. Ap?s a transforma??o de arroz da variedade Nipponbare mediada por Agrobacterium. A sele??o das plantas transformadas foi feita com o antibi?tico Higromicina. No total foram obtidas 14 linhagens transformadas. Para confirmar que as plantas mutantes possuiam a constru??o, foi realizado o teste com a folha bandeira em solu??o de higromicina. Seis linhagens apresentaram boa produ??o de sementes e houve uma linhagem com crescimento anormal. Ap?s a multiplica??o das linhagens em casa de vegeta??o, foram selecionadas as linhagens L1, L2 e L6 para os experimentos de an?lise dos efeitos do silenciamento do gene OsAMT1.3. Primeiramente, as linhagens selecionadas foram avaliadas quanto ao n?vel de silenciamento do gene OsAMT1.3. As linhagens de arroz transformadas apresentaram maior n?vel de silenciamento do gene OsAMT1.3 quando comparadas ?s plantas controle, no entanto, diferentes n?veis de silenciamento foram observados. A linhagem L1 apresentou menor n?vel de silenciamento do gene OsAMT1.3, enquanto L2 e L6 apresentaram maior silenciamento. As linhagens L1, L2 e L6 e a planta controle IRS (transformada com o vetor vazio) foram cultivadas em c?mara de crescimento at? os 30 dias ap?s a germina??o, com a aplica??o dos seguintes tratamentos: sem N por tr?s dias, ressuprimento com 0,15 mM de N-NH4+ ap?s tr?s dias de priva??o de N (baixa dose) e 2,0 mM de N-NH4+ constante (alta dose). As linhagens L1, L2 e L6 apresentaram menor absor??o de NH4+ com 0,15 mM de N-NH4+ quando comparadas com as plantas controle (IRS), enquanto as plantas cultivadas com 2,0 mM de N-NH4+ n?o apresentaram diferen?as na absor??o de NH4+. A express?o dos genes dos transportadores de NH4+ OsAMT1.1, OsAMT1.2 e OsAMT1.3 foi induzido pelo tratamento com 0,15 mM de N-NH4+ nas plantas controle (IRS), enquanto as linhagens transformadas apresentaram repress?o dos genes OsAMT1.1, OsAMT1.2 e OsAMT1.3. A menor absor??o de NH4+ com 0,15 mM de N-NH4+ causou menor n?vel de N-NH4+ e N-amino nas ra?zes das linhagens transformadas, enquanto nas plantas com 2,0 mM de N-NH4+ houve pouca altera??o nos conte?dos de N-NH4+ e N-amino. Os resultados indicam que o silenciamento do gene OsAMT1.3 provoca regula??o negativa dos transportadores OsAMT1.1 e OsAMT1.2, alterando a absor??o de NH4+. Apesar do gene OsAMT1.3 ser menos expresso que os genes OsAMT1.1 e OsAMT1.2, o transportador OsAMT1.3 pode estar envolvido na efici?ncia de absor??o em baixas doses de NH4+.

A infertilidade é um problema de saúde pública com um significativo impacto social, econômico e psicológico. Em todo o mundo, a incidência da infertilidade entre a população geral é estimada em 10-15%. Cerca de 50% da infertilidade dos casais são de origem masculina. Em mais da metade dos homens inférteis, a causa da infertilidade é desconhecida (idiopática). Etiologicamente, a infertilidade masculina apresenta causas genéticas e não genéticas. Dentre as causas genéticas mais conhecidas temos mutação do receptor de andrógenos, mutação do gene regulador da condutibilidade transmembrana da fibrose cística (CFTR), anomalias cromossômicas clássicas, anomalias meióticas, microdeleções do cromossomo Y, etc. As anomalias cromossômicas são encontradas com muito mais frequência em homens inférteis, com uma incidência de 4-16% em relação à incidência de 0,4% na população fértil. Estudos mostram que as CNVs também podem estar relacionadas com a infertilidade masculina, especificamente com a falha na espermatogênese. CNVs encontradas tanto no cromossomo Y quanto nos cromossomos autossômicos também foram associadas a possíveis falhas na espermatogênese. Um outro fator que também pode estar envolvido com a infertilidade masculina é a expressão desregulada dos miRNAs. O presente trabalho teve como objetivo promover a análise em larga escala da distribuição de CNVs e do perfil transcricional dos miRNAs em amostras de biopsias testiculares de paciente com azoospermia. Para o estudo das CNVs nós utilizamos a metodologia do CytoScan HDTM da Affymetrix. O perfil transcricional de miRNAs nos indivíduos estudados foi avaliado por meio da tecnologia de microarranjos também da plataforma Affymetrix. Para estas analises montamos dois grupos de estudo (Parada de Maturação (MA) de Células Germinativas e Síndrome de Células Sertoli Only (SCOS)) e um grupo controle (azoospermia obstrutiva e espermatogênese normal). Através das análises das CNVs nós encontramos 94 CNVs nos cromossomos autossômicos e sexuais, 35 (37%) CNVs foram classificadas como benignas, 24 (23%) como potencialmente benignas, sete CNVs (7,4%) como patogênicas e sete foram classificadas como potencialmente patogênica. Todas as CNVs classificadas como patogênica estão presentes no cromossomo Y, cinco CNVs são do tipo duplicação e duas do tipo deleção. A CNV do tipo duplicação foi encontrada no paciente MA e a CNV do tipo deleção foi encontrada no paciente SCOS. As CNVs se sobrepõem e quando analisadas em conjunto (formando uma única CNV de cada condição) elas apresentam um tamanho parecido. Estas CNVs apresentam genes envolvidos na espermatogênese. As CNVs classificadas como potencialmente patogênicas estavam presentes nos cromossomos autossômicos e cromossomo X. Nestas CNVs estavam presentes genes que foram associados com a falha na espermatogênese. A análise da expressão dos miRNAs revelou um perfil transicional muito mais alterado nos pacientes com SCOS. As duas condições apresentaram miRNAs exclusivos, mas também compartilharam: 30 miRNAs. Nós identificamos duas famílias de miRNAs (miR449 e miR34) diferencialmente expressos nas duas condições e que apresentam expressão preferencial no testículo. Nossos resultados mostram que alterações no número de copias (CNVs) no cromossomo Y levam a infertilidade masculina e CNVs nos cromossomos autossômicos e X podem levar a infertilidade masculina. As alterações do tipo deleção podem levar a uma falha na espermatogênese maior que as alterações do tipo duplicação. A expressão diferencial dos miRNAs em tecido testicular de pacientes com diferenças histopatológicas (SCOS e MA) apresentam um padrão de expressão de miRNAs diferentes devido ao tipo de células germinativas que eles apresentam no tecido epitelial do testículo. / Infertility is a public health problem with significant social, economic and psychological impact. Worldwide, the incidence of infertility in the general population is estimated at 10- 15%. Approximately 50% of infertility of couples is of male origin. In more than half of infertile men, the cause of infertility is unknown (idiopathic). Etiologically, male infertility has genetic and non-genetic causes. Among the best known genetic causes we found the mutation of the androgen receptor, the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), classic chromosomal abnormalities, meiotic abnormalities and microdeletions of the Y chromosome. Chromosomal abnormalities are found much more frequently in infertile men, with an incidence of 4-16% in the incidence of 0.4% in the fertile population. Studies show that CNVs can also be related to male infertility, specifically in the failure of spermatogenesis. CNVs found in both the Y and autosomes chromosomes were also associated with possible failures in spermatogenesis. Another factor that may also be involved in male infertility is the deregulated expression of miRNAs. This work aimed to promote the analysis of large-scale distribution of CNVs and the transcriptional profile of miRNAs in testicular biopsy samples from patients with azoospermia. For the study of CNV we used the CytoScan HDTM Affymetrix methodology and the transcriptional profile of miRNAs in the samples was assessed by means of microarray technology from Affymetrix platform. For these analyzes we set up two study groups (Stop Maturation (MA) of Germ Cells and Sertoli Cell Only Syndrome (SCOS)) and compared them to a control group (obstructive azoospermia, normal spermatogenesis). Through analysis of CNVs, we found 94 CNVs in sexual and autosomes chromosomes, 35 (37%) were classified as benign CNVs, 24 (23%) as a potentially benign seven CNVs (7.4%) as pathogenic and 7 were classified as potentially pathogenic. All CNVs classified as pathogenic are present on the Y chromosome, five CNVs are of duplication type and two are deletion type. The duplication type CNV was found in MA patients and deletion type CNV was found in SCOS patient. We identified that CNVs overlap and when analyzed jointed - as a single CNV of each condition - they have a similar size. These CNVs have genes involved in spermatogenesis. CNVs classified as potentially pathogenic were present in autosomes and in the X chromosome. In these CNVs were present genes that were associated with failure in spermatogenesis. The analysis of the expression of miRNAs revealed a transitional profile much more altered in patients with SCOS. The two conditions presented exclusive miRNAs, but shared 30 miRNAs differentially expressed when compared to the control group. We identify two families of miRNAs (miR449 and miR34) which exhibit preferential expression in testis as differentially expressed in both conditions. Our results show that changes in the number of copies (CNVs) on the Y chromosome lead to male infertility and CNVs in autosomes and X chromosomes may lead to male infertility. The deletion type changes can lead to a failure of spermatogenesis greater than the duplication type changes. The differential expression of miRNAs in patients with testicular tissue histopathologic differences (SCOS and MA) has a different pattern of miRNA expression due to the type of germ cells they present in epithelial tissue of the testis.

Introdução: O Alcoolismo e o Diabetes são doenças bastante prevalentes em todos os continentes e seriam fatores de risco relacionados com a Disfunção Erétil. Dentre os muitos mecanismos relacionados com a ereção temos a Endotelina e seus receptores, causando intensa e sustentada contração da musculatura lisa dos corpos cavernosos penianos (CC). Acredita-se que poderia haver regulação das vias dos receptores de endotelina pelos microRNAs, que são RNAs não codificantes, regulam a expressão gênica e poderiam sofrer alteração pelos efeitos do álcool e / ou diabetes. Objetivos: Avaliar, experimentalmente com utilização de ratos, se há alteração nas vias dos receptores da endotelina devido ao efeito crônico do alcoolismo, do diabetes ou de sua associação e se existiria correlação com os microRNAs miR-155 e miR-199. Materiais e Métodos: Utilizaram-se 48 Ratos Wistar machos divididos em 4 grupos: Controle (GC), Alcoolizado (GA), Diabético (GD) e Diabético+Alcoolizado (GD+A). Foi utilizado PCR em tempo real e imunoistoquímica para estudar a expressão gênica e proteica dos receptores da endotelina ETA e ETB em corpos cavernosos e PCR em tempo real para avaliar a expressão gênica dos miR-155 e miR-199 no sangue e CC. Resultados: Análise imunohistoquímica encontrou baixa expressão dos receptores de endotelina no GC e elevada nos grupos experimentais, sendo que os receptores ETA estavam distribuídos de forma difusa e em maior concentração, enquanto os receptores de ETB localizavam-se na periferia dos CC. Análise por PCR em tempo real dos CC verificou: aumento não significativo de ETA no GD e de ETB no GD+A; hipoexpressão significativa do miR-199 no GD+A e hipoexpressão não significativa do miR-199 e miR-155 nos demais grupos experimentais em relação ao GC. Análise no sangue: hipoexpressão significativa do miR-155 no GA+D e não significativa nos demais grupos em relação ao GC, hipoexpressão significativa do miR-199 no GD e GD+A e não significativa no GA, todos em relação ao GC. Conclusões: Foi encontrado aumento dos receptores de endotelina como efeito do álcool, do diabetes e de sua associação, também identificou-se diminuição, principalmente, da expressão gênica do miR-199 nos corpos cavernosos dos grupos experimentais o que sugere a hipótese de que o aumento da endotelina poderia ser determinado pela diminuição da ação supressora do miR-199 que se encontra hipoexpresso em decorrência dos efeitos deletérios do álcool e diabetes. A descoberta de alterações em microRNAs associada ao desenvolvimento continuado da genômica pode propiciar novos diagnósticos e marcadores para inúmeras doenças, além de ajudar a identificar possíveis terapêuticas alvo moleculares. / Introduction: Alcoholism and Diabetes are very prevalent diseases in all the continents and are considered risk factors related to erectile dysfunction. Endothelin and its receptor are some of the mechanism related to erection, causing intense and sustained contracture of the penile corpus cavernosum (CC) smooth muscle. It\'s thought that micro-RNAs could regulate endothelin receptors pathways. Micro-RNAs are not coding RNAs that regulate gene expression and could be affected by alcohol and/or diabetes. Objectives: To experimentally evaluate, using rats, alterations in receptors pathways due to chronic effects of alcoholism, diabetes, alone or in association, and to correlate this alterations with miR-155 and miR-199 microRNAs. Materials and Methods: 48 male Wistar rats were used. They were divided in four groups: Control group (GC), Alcoholic group (GA), Diabetic group (GD) and Diabetic+Alcoholic group (GD+A). We used real time PCR and immunohistochemical study to evaluate gene and protein expression of endothelin ETA and ETB in corpus cavernosum tissue and real time PCR to evaluate gene expression of miR-155 and miR-199 in blood and CC. Results: Immunohistochemical analysis showed low expression of endothelin receptors in GC and high expression in experimental groups; ETA receptors were distributed in diffuse pattern and higher concentration although ETB receptors had a peripheral pattern in CC. Real time PCR analysis in CC showed: not significant ETA increase in DG and ETB increase in GD+A; significant miR-199 hypoexpression in GD+A and not significant miR-199 and miR-155 hypoexpression in other experimental groups compared to GC. Blood analysis showed significant miR-155 hypoexpression in GD+A and not significant in other experimental groups compared to CG, significant miR-199 hypoexpression in GD and GD+A and not significant in GA, compared to GC. Conclusions: We found endothelin receptors increase as an effect of alcohol abuse, diabetes and its association; we also found decrease, mainly in gene expression, of miR-199 in corpus cavernosum tissue of experimental groups, what suggests the hypothesis that endothelin increase could be determined by a decrease of suppress action of miR-199, that is hypo expressed because of deleterious effect of alcohol and diabetes. Finding microRNAs changes, associated to continuous development in genomics, could propitiates new diagnostic tools and markers to innumerous diseases and even help to identify possible new molecular target therapies.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-07-05T17:50:48Z No. of bitstreams: 1 maynadasilveiragomide.pdf: 1825099 bytes, checksum: b38d85ac825f80bd92aced8a24024f86 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-07-13T16:27:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 maynadasilveiragomide.pdf: 1825099 bytes, checksum: b38d85ac825f80bd92aced8a24024f86 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-13T16:27:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 maynadasilveiragomide.pdf: 1825099 bytes, checksum: b38d85ac825f80bd92aced8a24024f86 (MD5) Previous issue date: 2012-12-19 / Apesar de grandes avanços no campo do tratamento e controle da progressão do câncer, grandes lacunas ainda permanecem. Terpenóides encontrados nos óleos essenciais de plantas do gênero Lippia, já foram relatados como potenciais compostos anticancerígenos para alguns tipos de tumores. Desta forma, este estudo objetivou investigar a possível propriedade farmacológica como agente anticancerígeno sobre linhagens tumorais dos compostos presentes no óleo essencial de cinco espécies de Lippia. Os resultados mostraram, através de ensaio de MTT, efeito citotóxico nas linhagens de carcinoma de cólon de camundongo CT26.WT e de melanoma de pele humano MeWo, com IC50 e comprometimento da viabilidade celular acima de 50% sob ação dos óleos essenciais de L. alba quimiotipos geraniol e carvona, L.sidoides, L. salviifolia, L. rotundifolia e L. lacunosa. O ciclo celular foi bloqueado na fase G0/G1 após 24 h de tratamento da linhagem MeWo com os óleos de L. alba quimiotipos geraniol (50 μg/mL) e carvona (100 e 150 μg/mL) e L. rotundifolia (200 μg/mL). Além disso, os óleos de L. alba geraniol (200 μg/mL por 24 h) e L. lacunosa (10, 50, 100 e 200 μg/mL) provocaram morte celular de MeWo, caracterizada por elevada fragmentação de DNA, confirmada como apoptose para o óleo de L. alba geraniol por ensaio de TUNEL. Sobre a linhagem CT26.WT, o óleo de L. alba geraniol provocou parada de ciclo celular nas fases G0/G1 (10 μg/mL por 12 h; 10 e 200 μg/mL por 24 h) e G2/M (50 e 100 μg/mL por 12 e 24 h; 87 μg/mL por 72h). L. sidoides também provocou parada em G0/G1 com 100 μg/mL por 24 h e parada em G2/M com 100 e 150 μg/mL por 12 h e 150 μg/mL por 24 h. O óleo de L. salviifolia induziu apenas parada em G2/M na concentração de 150 μg/mL por 24 h, o de L. rotundifolia, parada em G0/G1 com 50, 100 e 200 μg/mL por 12 h e 50 μg/mL por 24 h. L. lacunosa (50 μg/mL com exposição de 72 h) provocou parada em G2/M. Os óleos de L. alba geraniol e L. lacunosa, no ensaio de 72h, provocaram aumento de DNA fragmentado, mas este não atingiu níveis tão elevados quanto aqueles observados para a linhagem MeWo. Tratamento de L. alba geraniol (200 μg/mL por 12 h) sobre MeWo e de L. alba geraniol, L. lacunosa. L. rotundifolia e L. sidoides (100 μg/mL por 12 h) sobre CT26.WT foram submetidos a análise de expressão diferencial de microRNAs através de real-time PCR com painel de 95 microRNAs relacionados a câncer. Os microRNAs de MeWo apresentaram-se down-regulados em relação ao controle negativo, que pode ter sido devido ao efeito apoptótico de L. alba geraniol sobre esta linhagem. Sobre CT26.WT, 26 microRNAs para os óleos de L. alba geraniol e L. lacunosa e 35 para L. rotundifolia e L. sidoides foram encontrados significativamente (p<0,05) desregulados em relação ao controle. Os óleos essenciais das espécies de Lippia testados, portanto, comprometeram a viabilidade celular das linhagens MeWo e CT26.WT, indicando que podem ser bons candidatos como fonte de biomoléculas anticâncer. / Despite the great progress in the treatment and progressive control of cancer, significant gaps still remain. Terpenoids which were found in the essential oils of several species from the genus Lippia were reported as potential anticancer compounds for some types of tumors. Consequently, this study aimed to investigate the possible pharmacological property as anticancer agent against tumor cell lines of compounds present in the essential oil of five Lippia species. The results showed, through the MTT assay, cytotoxic effect on mouse colon carcinoma cell lines CT26.WT and human skin melanoma MeWo with IC50 and effect on the cell viability above 50% under the use of essential oils of L. alba chemotypes geraniol and carvone, L.sidoides, L. salviifolia, L. rotundifolia and L. lacunosa. The cell cycle was arrested in G0/G1 phase after 24 h treatment of of MeWo with the oils of L. alba chemotypes geraniol (50 μg/ml) and carvone (100 and 150 μg/mL) and L. rotundifolia (200 μg/mL). Additionally, the oils of L. alba geraniol (200 μg/mL for 24 h) and L. lacunosa (10, 50, 100 and 200 μg/mL) resulted in cell death of MeWo, characterized by high DNA fragmentation, and it was confirmed as apoptosis for the L. alba geraniol oil by TUNEL assay. As far as the CT26.WT cell line is concerned, the oil of L. alba geraniol caused cell cycle arrest in G0/G1 (10 μg/ml for 12 h, 10 and 200 μg/ml for 24 h) and G2/M (50 to 100 μg/ml for 12 and 24 h; 87 μg/ml for 72 h) phases. The L. sidoides also caused an arrest in G0/G1 with 100 μg/ml during 24 h and an arrest in G2/M with 100 and 150 μg/ml for 12 h and 150 μg/ml for 24 h. The L. salviifolia oil only induced stops in G2/M at a concentration of 150 μg/ml for 24 h, the oil of L. rotundifolia only stops in G0/G1 with 50, 100 and 200 μg/ml for 12 h and 50 μg/ml for 24 h. L. lacunose (50 μg/ml with 72 h of exposure) caused an arrest in G2/M. The L. alba geraniol and L. Lacunosa oils, in the 72h assay, caused an increase in fragmented DNA, but this did not reach levels as high as those observed for the MeWo cell line. Treatment of L. alba geraniol (200 μg/ml for 12 h) on MeWo and L. alba geraniol, L. lacunosa, L. rotundifolia and L. sidoides (100 μg/ml for 12 hours) on CT26.WT were subjected to analysis of differential expression of microRNAs by real-time PCR with a panel of 95 cancer-related microRNAs. All MeWo microRNAs showed downregulation compared to the negative control, which may have been due to the apoptotic effect of L. alba geraniol against this cell line. About CT26.WT 26 microRNAs for L. alba geraniol and L. lacunosa oils and 35 for L. rotundifolia and L. sidoides were found significantly desregulated (p<0.05) compared to control. The essential oils of tested Lippia species thus affected cell viability of MeWo and CT26.WT cell lines, indicating they might be good candidates as source of new anticancer biomolecules.

Philosophiae Doctor - PhD / The discovery of microRNAs (miRNAs) is one of the most exciting scientific breakthroughs in the last decade. miRNAs are short RNA molecules that do not encode proteins but instead, regulate gene expression. Over the past several years, thousands of miRNAs have been identified in various insect genomes through cloning and sequencing, and even by computational prediction. However, information concerning possible roles of miRNAs in mosquitoes is limited. Within this context, we report here the first systematic analysis of these tiny RNAs and their target mRNAs in one of the principal African malaria vectors, Anopheles funestus s.s. Firstly, to extend the known repertoire of miRNAs expressed in this insect, the small RNAs from the four developmental stages (egg, larvae, pupae and the adult females), were sequenced using next generation sequencing technology. A total of 98 miRNAs were identified, which included 65 known Anopheles miRNAs, 25 miRNAs conserved in other insects and 8 novel miRNAs that had not been reported in any species. We further characterized new variants for miR-2 and miR-927 and stem-loop precursors for miR-286 and miR-2944. The analysis showed that many miRNAs have stage-specific expression, and co-transcribed and co-regulated during development. Secondly, for a better understanding of the molecular details of the miRNAs function, we identified the target genes for the Anopheles miRNAs using a novel approach that identifies overlap genes among three target prediction tools followed by filtering genes based on functional enrichment of GO terms and KEGG pathways. We found that most of the miRNAs are metabolic regulators. Moreover, the results suggest implication of some miRNAs not only in the development but also in insect-parasite interaction. Finally, we developed the InsecTar database (http://insectar.sanbi.ac.za) for miRNA targets in the three mosquito species; Anopheles gambiae, Aedes aegypti, and Culex quinquefasciatus, which incorporates prediction and the functional analysis of these target genes. The proposed database will undoubtedly assist to explore the roles of these regulatory molecules in insects. This type of analysis is a key step towards improving our understanding of the complexity and regulationmode of miRNAs in mosquitoes. Moreover, this study opens the door for exploration of miRNA in regulation of critical physiological functions specific to vector arthropods which may lead to novel approaches to combat mosquito-borne infectious diseases.

As Neoplasias Mieloproliferativas Crônicas (NMPC) Trombocitemia Essencial (TE), Mielofibrose (MF) - são desordens hematopoéticas resultantes da expansão clonal da célula tronco hematopoética alterada. Essas doenças caracterizam-se pela independência dos progenitores hematopoéticos aos estímulos dos fatores de crescimento e citocinas e pela proliferação exacerbada das células da linhagem mielóide com maturação preservada. Os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na patogênese e progressão da TE e MF não foram ainda esclarecidos, mas o mieloacúmulo presente nessas doenças parece estar associado à alteração de proliferação e apoptose celular. Nesse contexto, os objetivos deste trabalho foram avaliar em células CD34+ da medula óssea e leucócitos dos pacientes com TE e MF: (1) a expressão de apoptomirs e de genes pró- e anti-apoptóticos pertencentes à via intrínseca e extrínseca da apoptose pela metodologia de RT-PCR em tempo real; (2) expressão de proteínas pró- e anti-apoptóticas por Western-blot; (3) o perfil de sensibilidade das células mononucleares à apoptose induzida por diferentes agentes apoptogênicos pela técnica de citometria de fluxo e (4) correlacionar os resultados obtidos com dados clínico-laboratoriais dos pacientes e com a expressão do gene PRV-1. Em TE, nas células CD34+, foi detectado aumento da expressão de a1, mcl-1, bid, bok e noxa e diminuição de bax em relação aos controles. Nos leucócitos, foi detectada a elevação da expressão de a1, bcl-2, bcl-w e bcl-xL, bad e bok e diminuição de bid e bimEL. Em comparação com o grupo controle, os pacientes com MF apresentaram maior expressão dos genes a1, bcl-w bak, bok e noxa e menor de bcl-2 nas células CD34+. Nos leucócitos dos pacientes com MF foi verificado aumento da expressão dos genes bcl-2, bcl-w e bcl-xL, bad e bok. O c-iap-1 apresentou maior expressão nas células CD34+ dos pacientes com MF e TE, enquanto que o c-iap-2 estava elevado nos leucócitos e células CD34+. Foi ainda detectada a expressão diferencial em TE e MF dos genes pertencentes a via de receptor de morte, como a maior expressão dos genes fas, fas-L, faim e dr4 nas células CD34+ dos pacientes e menor expressão do fas-L e trail nos leucócitos dos pacientes com TE e MF. Os resultados indicaram associação da expressão do gene PRV-1 com a mutação JAK2V617F e com a expressão dos genes a1, bcl-w, bik, bax, c-iap-2 e trail. Com relação à expressão proteica, BCL-XL estava aumentada e TRAIL diminuída em leucócitos de pacientes com MF enquanto que a molécula BID estava diminuída em leucócitos de pacientes com TE. Os miRNA26a, let 7d e miR15a estavam mais expressos nos leucócitos de pacientes com TE e MF. Em pacientes com TE o miR130b estava elevado e o mIR16 diminuído, enquanto que nos pacientes com MF o miR198 estava aumentado. Os linfócitos dos pacientes com TE e MF apresentaram maior resistência à apoptose estimulada por: actinomicina, etoposídeo, teniposídeo, citarabina e estaurosporina do que os linfócitos dos controles. Em conclusão, os dados obtidos sugerem a ligação da alteração do processo de apoptose celular, com a expressão do gene PRV-1 e status da mutação JAK2V617F. Esses resultados contribuem para o melhor entendimento da fisiopatologia das NMPC visto que associam a fisiopatologia da TE e MF com a resistência das células alteradas à apoptose. Essas informações serão úteis no futuro, possibilitando o desenho de novos alvos terapêuticos e a descrição de novos marcadores de prognóstico. / Chronic Myeloproliferative Neoplasms (cMPN) - Essential Thrombocythemia (ET), Primary Myelofibrosis (PMF) and Polycythemia Vera (PV) - are clonal hematopoietic stem cell malignancies characterized by an accumulation of mature myeloid cells in bone marrow and peripheral blood. It seems that apoptotic machinery deregulation contribute to ET and PMF pathogenesis. Despite the advances in the molecular knowledge, the physiopathology of these diseases remains unknown. This study investigated cellular and molecular mechanisms involved in apoptosis process regulation in bone marrow haematopoietic progenitor CD34+ cells and leukocytes from ET and PMF patients. The specifics aims were: (1) to evaluate death receptors family members and Bcl-2 related genes expression as well apoptosis-related microRNAs by Real Time PCR; (2) apoptosis-related protein expression by Western Blot; (3) access mononuclear cells apoptosis resistance by flow cytometry and (4) to correlate the results with JAK2V617F mutation, PRV-1 gene expression and as well clinical data. In ET CD34+ cells, we found overexpression of a1, mcl-1, bid, bok e noxa and a decrease of bax compared to controls, while in leukocytes a1, bcl-2, bcl-w e bcl-xL, bad e bok expression was increased and bid and bimEL expression was lower than in controls. In PMF, a1, bcl-w bak, bok e noxa were overexpressed and bcl-2 downregulated in CD34+ cells. In PMF leukocytes bcl-2, bcl-w e bcl-xL, bad e bok mRNA levels were increased. c-iap-1 was increased in ET and PMF CD34+ cells and c-iap-2 expression elevated in ET and PMF CD34+ cells and leukocytes. Death receptor related genes showed overexpression of fas, fas-L, faim and dr4 in patients CD34+ cells and downregulation of fas-L and trail in ET and PMF leukocytes. We found differential expression of several genes between patients JAK2V617F positive and negative, as well we found correlation between gene expression and JAK2V617F allele burden, white blood cells and platelets count and splenomegaly. PRV-1 gene was overexpressed in ET and PMF leukocytes and showed correlation with JAK2V617F mutation and a1, bcl-w, bik, bax, c-iap-2 and trail gene expression. Regarding protein expression, BCL-XL was increased and TRAIL decreased in PMF leukocytes and BID was decreased in ET leukocytes. miRNA26a, let 7d e miR15a was overexpressed in ET and PMF leukocytes, while miR130b was increased only in ET and miR198 only in PMF. miR16 was downregulated in ET leukocytes comparing to controls. We also detected a resistance to apoptosis-inducers in ET and PMF lymphocytes and we observed correlation between apoptosis percentage and the expression of many studied genes. In conclusion, the results indicate the participations of Bcl-2 family genes and Death Receptor pathway genes, as well PRV-1 and JAK2V617F mutation in these disorders, which contribute to elucidate cMPN physiopathology and might lead to the discovery of new cMPN therapies and molecular markers.

A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa resultante da expansão clonal da célula hematopoética precursora. Sua fisiopatologia está associada ao cromossomo (cr) Philadelphia (Ph) originado da t(9;22) e ao oncogene bcr-abl1 que codifica a proteína Bcr-Abl1 com constitutiva atividade de tirosinoquinase (TK). A expressão de Bcr-Abl determina a leucemogênese por meio da alteração da adesão das células progenitoras leucêmicas ao estroma medular e resistência à apoptose. Os inibidores de TK, o mesilato de imatinibe, dasatinibe e nilotinibe são utilizados no tratamento da LMC, entretanto, casos de resistência têm sido relacionados à presença de mutações em Bcr-Abl1, duplicação do cr Ph e superexpressão do gene bcr-abl1. A resistência ou refratariedade de alguns pacientes ao tratamento com inibidores de TK impulsiona a realização de estudos para melhor conhecimento da fisiopatologia da LMC e descrição de novos alvos terapêuticos. Nesse contexto, o presente estudo investigou a participação de microRNAs na modulação da expressão de genes que regulam a apoptose. O objetivo geral deste trabalho foi investigar o efeito de bcr-abl1 e da atividade tirosinoquinase de Bcr-abl na expressão desses miRNAs em linhagens celulares e pacientes com LMC. O RNA das linhagens celulares, de pacientes e controles foram obtidos por meio da extração com Trizol® e o cDNA sintetizado com o kit High Capacity cDNA reverse transcription. A expressão dos microRNAs e dos genes alvoss foi quantificada por PCR em tempo real utilizando o kit SYBR Green PCR Master Mix® e TaqMan Universal PCR Master Mix®. A inibição de Bcr-Abl1 na linhagem HL-60.Bcr-Abl1 tratada com o mesilato de imatinibe aumentou a expressão de miR-let-7d, miR-15a, miR-130a e miR-145 e diminuiu os níveis de miR-21. O tratamento com dasatinibe aumentou a expressão de miR-let-7e, miR-15a, miR-16, miR-21, miR-30e, miR-130a e miR-142-3p. O nilotinibe aumentou a expressão de miR-let-7e, miR-15a, miR-16, miR-130a e miR-145 e, diminuiu os níveis de miRlet- 7d e miR-21. Os resultados obtidos da análise entre os de pacientes com LMC em diferentes fases da doença mostraram elevados níveis de miR-15a, miR-130b e miR-145 em pacientes na fase crônica versus controles e baixos níveis de miR-16, miR-26a e miR-146a. Pacientes em fases avançadas versus controles apresentaram baixa expressão de miR-let-7d, miR-16, miR-142-3p, miR-145 e miR-146a. Baixos níveis de miR-let-7d, miR-15a, miR-16, miR-29c, miR-142-3p, miR-145 e miR-146a foram observados nas fases avançadas da LMC em relação a fase crônica. Os genes anti-apoptóticos a1, bcl-2, c-flip, ciap-1 e ciap-2 estavam mais elevados na fase crônica do que nos controles. A expressão do gene c-flip estava diminuída e dos genes a1, ciap-1 e mcl-1 aumentada nas fases avançadas em relação aos controles e a fase crônica. Pacientes com LMC resistentes ao MI apresentaram menores níveis de miR-26a, miR-29c, miR-130b, miR-146a e dos genes anti-apoptóticos ciap-1 e mcl-1. Os dados obtidos sugerem que a TK Bcr-Abl modula a expressão de microRNAs que possuem como alvos genes que regulam a apoptose celular / Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disease resulting from clonal expasion of hematopoietic precursor cells. Its physiopathology is associated to Philadelphia (Ph) chromosome (cr) originated from the t(9;22) and bcr-abl1 oncogene that encodes the Bcr-Abl protein with constitutive tyrosine kinase activity (TK). The Bcr-Abl1 expression determines leukemogenesis by altering the leukemic progenitor cells´ adhesion by bone marrow stroma and apoptosis resistance. TK inhibitors imatinib mesylate, dasatinib and nilotinib are used to treat CML, however, cases of resistance have been linked to mutation in Bcr-Abl1, duplication of the cr Ph and overexpression of the bcr-abl1. The resistance or refractoriness of some patients to treatment with TK inhibitors drives the studies to better understand the CML physiopathology and description of new therapeutic targets. In this context, this study investigated the participation of microRNAs in modulating expression of the genes that regulate apoptosis. The aim of this study was to investigate the effect of Bcr- Abl1 and its kinase activity in the expression of miRNAs in cell lines and CML patients. The RNA from cell lines, patients and controls were obtained by extraction with Trizol® and cDNA was synthesized with the kit High Capacity cDNA reverse transcription. The expression of miRNAs and target genes was quantified by real time PCR using SYBR Green PCR Master Mix® kit and TaqMan Universal PCR Master Mix®. The Bcr-Abl1 inhibition in the cell line HL-60.Bcr-Abl1 treated with imatinib mesylate increased the expression of miR-let- 7d, miR-15a, miR-130a and miR-145 and decreased miR-21 levels. Treatment with dasatinib increased the expression of miR-let-7e, miR-15a, miR-16, miR-21, miR-30e, miR-130a and miR- 142-3p. Nilotinib increased the expression of miR-let-7e, miR-15a, miR-16, miR-130a and miR- 145 and, decreased miR-let-7d and miR-21 levels. The results of the analysis among patients with CML in different stages of disease showed high levels of miR-15a, miR-130b and miR-145 in chronic phase versus controls and low levels of miR-16, miR-26a and miR-146a. Patients in advanced phases versus controls showed low expression of miR-let-7d, miR-16, miR-142-3p, miR-145 and miR-146a. Low levels of miR-let-7d, miR-15a, miR-16, miR-29c, miR-142-3p, miR-145 and miR-146a were observed in CML advanced phases when compared with chronic phase. The antiapoptotic genes a1, bcl-2, c-flip, ciap-1 and ciap-2 were higher in chronic phase than in controls. The c-flip expression was decreased and a1, ciap-1 and mcl-1 expression was increased in advanced phases when compared to controls and chronic phase. CML patients resistant to imatinib mesylate presented low levels of miR-26a, miR-29c, miR-130b, miR-146a and ciap-1 and mcl-1 antiapoptotic genes. The data obtained suggest that Bcr-Abl1 TK modulates the miRNA expression which has target genes involved in the apoptosis´ regulation.

O excesso de iodo inibe a proliferação celular e secreção hormonal, enquanto retarda os efeitos oncogênicos da ativação de RET/PTC3 na célula folicular tiroidiana. A mutação BRAF (T1799A) é a mais prevalente no câncer de tiroide, e modelo transgênico desenvolve câncer que progride para histotipo agressivo. Altos níveis de microRNAs (miRNAs) do cluster miR-17-92 estão associados a histotipos agressivos de câncer de tiroide e modulam a tradução de mRNAs alvo componentes de vias de sinalização oncogênicas. Neste estudo, avaliamos a influência da alta dose de iodo sobre miRNAs frente ativação do oncogene BRAF e seu efeito na biologia da célula folicular tiroidiana. A indução de BRAFT1799A ativa uma robusta expressão de miR-17-92 enquanto alta dose de iodo bloqueia este efeito na célula tiroidiana. miR-19 inibe a tradução de Smad4 e bloqueia a transdução do sinal de TGFb, efeito revertido pelo iodo. O iodo interfere na expressão de miR-17-92 por bloquear ativação da sinalização Notch induzida por BRAF. Estes resultados indicam que o iodo protege a célula folicular tiroidiana durante a indução de BRAFT1799A, revertendo a ativação dos miRNAs oncogênicos do cluster miR-17-92 e restaurando os níveis protéicos de Smad4 por interferir na via de sinalização Notch. / Iodine excess blocks cell proliferation and inhibits hormone synthesis, while delays oncogenic effects of RET/PTC3 activation in thyroid follicular cells. BRAF mutation (T1799A) is the most prevalent genetic alteration in thyroid cancer, and transgenic mice model for BRAF develops thyroid cancer that progress to aggressive histotypes. High levels of microRNAs (miRNAs) of miR-17-92 cluster are associated to aggressive thyroid cancer and modulate translation of target mRNAs in oncogenic signaling pathways. In this study, we evaluated the influence of high dose iodine in miRNAs under BRAF oncogene activation, and its effects in thyroid follicular cell biology. BRAF induction induces high expression of miR-17-92 while high dose iodine blocks this effect in thyroid follicular cells. miR-19 inhibits Smad4 translation and impairs TGFb signaling transduction, effect reverted by iodine. Iodine modulates miR-17-92 expression by interfering in BRAF-induced Notch signaling activation. These results indicate that iodine protects thyroid follicular cell during BRAF induction, reverting oncogenic miR-17-92 activation and restoring protein levels of Smad4 by Notch signaling modulation.