L'objectif de cette thèse est de définir la chorégraphie de ségrégation des deux chromosomes circulaires de Vibrio cholerae, c'est à dire le positionnement de l'information génétique au cours de la croissance de la cellule, ainsi que les mécanismes dirigeant ces ségrégations. Il a longtemps été supposé que les bactéries étaient trop petites pour avoir une organisation intra-cellulaire, et le manque de techniques appropriées ne permettait pas d'infirmer cette hypothèse. Or la taille des chromosomes comparée à celle de la bactérie impose une compaction et aujourd'hui, de nouvelles techniques de microscopie et d'analyse génétique permettent d'affirmer que les chromosomes bactériens étudiés jusqu'à maintenant ont tous une organisation et une chorégraphie de ségrégation précises et différentes selon les espèces. Toutes les espèces étudiées à ce jour ont un chromosome circulaire unique : la réplication du chromosome commence à une origine unique bidirectionnelle, les deux fourches de réplication se déplacent le long des deux bras de réplication (ou réplichores) et finissent la réplication au terminus, diamétralement à l'opposée de l'origine de réplication sur la carte du chromosome. Peu d'espèces ont été étudiées, et Vibrio cholerae émerge progressivement comme un nouveau modèle : son génome est réparti sur deux chromosomes, et la chorégraphie de plusieurs chromosomes dans une cellule n'a jamais été décrite. De plus, cette espèce semble être au croisement évolutif entre Caulobacter crescentus et Escherichia coli : Vibrio cholerae a d'une part une morphologie en croissant, des systèmes de partition aux origines et un positionnement de l'origine du chromosome I, semblables à C. crescentus, et d'autre part un système de compaction du terminus et un set de gènes impliqués dans la maintenance du chromosome ayant co-évolué, qu'on ne retrouve que dans peu d'espèces proches d'E. coli. Une autre caractéristique intéressante de V. cholerae est que le chromosome II semble avoir été acquis récemment et n'est donc peut être pas gouverné par les mêmes mécanismes que le chromosome I, comme en témoignent le positionnement de son origine et son terminus, inédits pour des chromosomes bactériens. Parmi les Vibrios (environ 60 espèces principalement retrouvées dans les environnements aquatiques), certaines espèces sont des pathogènes dévastateurs pour les poissons, le corail, les crustacés ou les fruits de mer. Mais la plus documentée est Vibrio cholerae, car elle provoque chez l'Humain une maladie provoquée par l'ingestion d'eau contaminée qui peut être mortelle si le patient n'est pas réhydraté à temps. Bien que facilement traitable, le choléra fait encore de nombreuses victimes dans les pays en développement où les structures de santé et les règles d'hygiène font parfois défaut. Ainsi l'étude de Vibrio cholerae présente un intérêt médical, mais également par extension aux autres Vibrios, un intérêt environnemental non négligeable.

Le trafic membranaire est un processus universel qui est essentiel pour la fonction neuronale dans un large spectre de fonctions. De la croissance neuronale et le développement morphologique à la libération des neurotransmetteurs et la plasticité synaptique, il prend en charge l'activité neuronale et donne d'innombrables questions qui animent la recherche sur la neurobiologie d'aujourd'hui. Notamment, l’exocytose des endosomes de recyclage (ER) dans les compartiments somatodendritiques participe à la transmission synaptique et à la potentialisation synaptique à long terme (PLT). Cependant la machine moléculaire sous-tendant l’exocytose des ER reste encore méconnue. Afin d’identifier les protéines SNAREs vésiculaires (v-SNARE) impliquées dans les différentes formes d’exocytose des ER postsynaptiques, nous avons d'abord imagé les protéines VAMP neuronales fusionnées avec la pHluorine, une GFP mutée sensible au pH dans les neurones de l’hippocampe en culture. Nous avons constaté que seulement VAMP2 et VAMP4, mais pas VAMP7, rapportaient des événements d’exocytose somatodendritique dans les neurones matures. Après avoir identifié ces deux protéines candidates, nous avons utilisé la combinaison de différentes techniques de régulation négative chronique ou aiguë pour désactiver leur fonction et observer les conséquences sur l’exocytose des ER, la transmission synaptique basale ou la PLT. Nos résultats suggèrent que VAMP2 est impliqué dans une forme d’exocytose régulée importante pour la PLT, mais pas l’exocytose constitutive des récepteurs AMPA, qui stabilise la transmission basale. VAMP4 est nécessaire pour l'exocytose constitutive d'une grande partie des endosomes, mais l'implication fonctionnelle de ces endosomes doit encore être explorée, car la régulation négative de VAMP4 ne modifie pas la transmission basale. / Membrane trafficking is a universal process that is essential for neuronal function in a wide spectrum of applications. From neuronal growth and morphological development to neurotransmitter release and synaptic plasticity, it supports neuronal activity and gives countless questions that drive today’s neurobiology research. Notably, the trafficking of recycling endosomes (REs) in somatodendritic compartments participates in synaptic transmission and plasticity, such as long-term synaptic potentiation (LTP). However, the fusion machinery mediating RE exocytosis is still unclear. To identify the vesicular SNAREs (v-SNAREs) involved in different forms of postsynaptic RE exocytosis, we first imaged neuronal VAMP proteins fused with pH-sensitive pHluorin in cultured hippocampal neurons, and found that only VAMP2 and VAMP4, but not VAMP7, underwent somatodendritic exocytosis in mature neurons. After identifying these two candidate proteins, we used a combination of different downregulation techniques to chronically or acutely deactivate their function and observe consequences on REs exocytosis, basal synaptic transmission and LTP. Our results suggest that VAMP2 is involved in activity-regulated exocytosis important for LTP, but not constitutive postsynaptic AMPARs exocytosis, supporting basal transmission. VAMP4 is required for constitutive exocytosis of at least a large proportion of REs, but the functional implication of these endosomes still need to be explored, as VAMP4 downregulation did not alter basal synaptic transmission.

Le moteur flagellaire bactérien (BFM) est un complexe moléculaire qui permet aux bactéries de nager dans un milieu liquide. La rotation du moteur est générée à l’interface entre deux éléments clés: les protéines formant le stator (MotA and MoB) et l’anneau C “switching complex” à la base du rotor. Les stators sont des modules du moteur structurellement et fonctionnellement différentiables du reste du moteur, et leurs association et dissociation dynamique autour du rotor contrôle la génération du couple. Quand une protéine fluorescente (PF) est fusionnée à MotB, le moteur est en état de marche mais une réduction générale de la mobilité de la cellule a été observée. La raison précise d’une telle réduction de mobilité n’a pas été étudiée.Le but de cette étude est de comprendre comment la fusion PF de la protéine du stator modifie la génération du couple et le sens de rotation du moteur. C’est particulièrement important car le tag FP se trouve à l’interface entre le stator et le rotor, là où le couple et le changement du sens de rotation sont produits. Trois différentes PFs (eGFP, YPet, Dendra2) ont été fusionnées à la protéine MotB. Malgré la haute similarité de leurs structures, notre analyse a montré que les trois stators fusionnés génèrent des couples différents. Les stators marqués avec YPet produisent un couple moyen similaire au WT (stators sans tag PF), alors que les stators marqués avec eGFP et Dendra2 produisent respectivement 70% et 40% du couple moyen du WT. De plus, les moteurs utilisant les stators fusionnés ont montré des capacités de changement de sens de rotation réduites. Lors d’un changement de sens de rotation, la valeur absolue de la vitesse des moteurs WT ne change pas. Cette “symétrie” de vitesse lors du changement n’apparaît pas avec les moteurs à stators fusionnés et le changement peut être accompagné d’une importante diminution (~30%) de la vitesse absolue.En observant par microcopie TIRF avec détection de molécules uniques, des stators marqués dans un moteur en état de marche, les signaux de fluorescence sont détectés à la membrane comme prévu pour ces protéines, montrant une population de stators diffusant dans celle-ci. Les clusters fluorescents étaient visibles au centre des cellules en rotation, attachés au couvre-glace par une seule flagelle, confirmant que le tag de fluorescence peut être visualisé dans des moteurs en état de marche. Dans un second projet développé dans le laboratoire Bertus Beaumont à TU Delft, en prenant le BFM en tant que système modèle d’évolution expérimentale, sa modularité et son « évolubilité » ont été explorés pour apprendre les détails au niveau moléculaire de l’évolution de ce type de machine. Les stators de E.coli ont été échangés par un set de 21 stators étrangers homologues. L’expérience a révélé que les protéines du stator peuvent être échangées entre espèces de bactéries distantes et certains stators non compatibles peuvent être modifiés positivement par un procédé d’évolution pour devenir fonctionnels. Au cours de cette évolution, les bactéries ont accumulé des mutations avantageuses dans leurs gènes MotA et MotB étrangers, tout particulièrement dans leur domaine fonctionnel. Des mutations identiques dans des stators différents ont été observées, indiquant que l’évolution peut se reproduire. L’analyse fonctionnelle au niveau d’un seul moteur a révélé que ces mutations avantageuses amélioraient la génération du couple et/ou la capacité du moteur à changer de sens. Les investigations détaillées du génotype et du phénotype du BFM modifié par évolution apportés par cette étude, pourraient donner une idée sur la façon dont des machines moléculaires comme le BFM ont évolué, et les effets fonctionnels des mutations bénéfiques qui facilitent l'intégration fonctionnelle. / The bacterial flagellar motor (BFM) is the macromolecular complex which allows bacteria to swim in liquid media. Located at the base of the flagellum, anchored in the cell membrane, this remarkably small (~45nm) yet powerful rotary motor rotates each flagellum of the cell switching between counterclockwise (CCW) and clockwise (CW) direction. The motor rotation is generated at the interface between the two key components of the motor: the stator protein complexes (each composed of 4 MotA and 2 MotB proteins) and the C- ring protein complex at the base of the rotor. The stator complexes are structurally and functionally discernible modules of the motor, and their dynamical association and dissociation around the rotor controls the generation of torque.The first project of this study aims to investigate how the FP tag on the stator protein modifies the torque generation and switching of the motor. This is particularly important because the fluorescent protein tag lies at the interface between stator and rotor, where torque and switching are produced. Three different FPs (eGFP, YPet, Dendra2) were fused to MotB. Interestingly, despite the high similarity of their structures, our analysis revealed that the three fusion stators generate different torque. Furthermore, in the presence of fusion stators, the motor showed significantly impaired switching abilities. When switching direction of the rotation, the absolute value of the speed of WT motors does not change, whereas this symmetry of speed upon switching is not observed in the fusion stator motors, and switching can be accompanied with a significant (~30%) decrease in absolute speed. Both the impaired torque generation and the switching ability were improved by introducing a rigid linker between the stator and the FP tag. Taken together, this study provides a further insight into the dynamics of the stator and rotor interaction at its interface.When the cells carrying the fluorescently labeled stators were observed in a custom made TIRF-fluorescence microscope with single molecule capability, the fluorescence signals were detected as concentrated clusters in the membrane as expected for these membrane proteins around the motors, together with a population of stators diffusing in the membrane. Fluorescent clusters were visible at the center of rotating cells tethered to the glass slide by a single flagellum, confirming that the fluorescent tags can be visualized in functioning motors.In a second project developed in Bertus Beaumont lab at TU Delft, taking BFM as an experimental evolutionary model system, its modularity and evolvability have been explored to learn the molecular details of the evolution of molecular machines. The stators of E.coli have been exchanged by a set of 21 homologue foreign stators. The experiments revealed that the stator proteins can be exchanged between distant bacteria species, and some of the non-compatible stators can be positively modified by evolution to become functional. Those evolved strains accumulated beneficial mutations in their foreign motA and motB genes, especially on their functional domains. Identical mutations in different stators were common, indicating that evolution is repeatable. The functional investigation at the single motor level revealed that those beneficial mutations improved the torque generation and/or the switching ability of the motor. The detailed genotype and phenotype investigations of the evolutionary modified BFM may bring an insight into how molecular machines such as BFM have evolved as well as the functional effects of the beneficial mutations that facilitate functional integration.

L’objectif de mon travail de thèse a été de caractériser l’adhésion de vésicules géantes lipidiques et de cellules vivantes. Dans le but d’obtenir des informations quantitatives sur l’adhésion, j’ai développé deux techniques de nanoscopie de fluorescence basées sur la microscopie TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). Cette technique repose sur création d’une onde évanescente à proximité d’une interface. J’ai développé pour cela un montage optique, qui permet de contrôler finement les caractéristiques de l’onde évanescente (longueur d’atténuation, état de polarisation, etc.). L’adhésion des vésicules a été étudiée par nTIRF (TIRF normalisé) : les images TIRF sont normalisées par des images en épi-fluorescence. J’ai pu ainsi caractériser l’adhésion non spécifique (interaction électrostatique) et spécifique (interaction biotine-streptavidine) de vésicules sur différentes surfaces fonctionnalisées. Pour quantifier l’adhésion des cellules, j’ai utilisé l’approche VA-TIRF (TIRF à angle variable). Cette dernière consiste à enregistrer une série d’images en régime évanescent à différents angles d’incidence. Ceci nous a permis d’établir une cartographie des distances entre la membrane ventrale d’une cellule et la surface pour différents comportements d’adhésion initiés sur divers substrats : chimiques ou protéiques. Ces deux techniques permettent de mesurer la distance membrane-surface avec une précision nanométrique, ≈20nm, ce qui est particulièrement adapté à l’étude du processus d’adhésion / The aim of my thesis was to characterize the adhesion of Giant Unilamellar Vesicles and living cells. In order to obtain a quantitative information about the state of the adhesion, I developed two fluorescence nanoscopy techniques based on microscopy TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). This technique consist of creating an evanescent wave in the vicinity of an interface. I developed the experimental setup, which allows an accurate control of characteristics of the evanescent wave (penetration depth, polarization state, etc.). The vesicles adhesion was studied by nTIRF (normalized TIRF). TIRF images are normalized by epi-fluorescence images. I was able to characterize the nonspecific adhesion (electrostatic interaction) and specific adhesion (biotin-streptavidin interaction) of vesicles on different functionalized surfaces. To quantify the adhesion of cells, I used the VA-TIRF approach (variable angle TIRF). The latter is to record a series of images at different angles of incidence in the evanescent regime. This allowed us to map the distances between the ventral membrane of a cell and the surface for different adhesion behaviors initiated on various substrates: chemical or protein. These two techniques permit to measure the membrane surface-distance with the nanometer precision ≈20nm, which is particularly suitable for the study of the adhesion process

H. pylori est une bactérie à Gram négatif qui infecte l'estomac de près de 50% de la population mondiale. L'infection, en général asymptomatique, peut évoluer vers l'ulcère gastrique (15% des cas) ou le cancer de l'estomac (1% des cas). L'infection à H. pylori est traitée par antibiothérapie mais ces dernières années ont vu une augmentation du nombre de souches résistantes. Cette augmentation et la forte prévalence d'H. pylori sont probablement dues à son importante variabilité génétique qui a pour origine un fort taux de mutagénèse spontanée, associée à une recombinaison efficace et un important transfert horizontal de gènes. H. pylori est en effet naturellement compétente pour la transformation qui est le processus biologique permettant la capture, l'internalisation et l'intégration d'ADN exogène dans le génome de la bactérie. Ce processus favorise la diversité génétique au sein d'une population et peut permettre son adaptation rapide aux changements environnementaux. Durant ma thèse, j'ai participé au développement d'une méthode permettant de visualiser la transformation d'ADN fluorescent dans des cellules de H. pylori vivante. Cette méthode nous a permis, pour la première fois, de visualiser directement l'entrée d'un ADN transformant dans le cytoplasme d'une bactérie compétente. Elle nous a également permis de confirmer le rôle de la protéine ComEC dans l'internalisation de l'ADN dans le cytoplasme. Le travail que j'ai réalisé a également permis de mettre en évidence que le niveau de transformation de H. pylori est déterminé par le niveau d'expression du complexe membranaire d'internalisation. La quantité d'ADN capturée serait alors un facteur limitant pour la transformation. / H. pylori is a Gram negative flagellar bacterium that colonizes nearly 50% of the world population. Infection is generally asymptotic but can evolve to ulcerous gastritis (15% of the cases) or stomach cancer (1% of the cases). H. pylori infection is usually treated with antibiotic but the last years saw a dramatic increase in the number of resistant strains. This increase, and the high prevalence of H. pylori, are probably caused by its huge genetic variability likely due to a strong mutagenesis rate associated with efficient recombination and horizontal gene transfer. H. pylori is indeed naturally competent for transformation which is the biological process allowing capture, internalization and integration of exogenous DNA in the genome of a bacterium. This process promotes genetic diversity in a population and could permit rapid adaptation to environmental changes. During my thesis, I participated to the development of a method to visualize transformation in H. pylori living cells. Using fluorescently labelled DNA, this method allowed us for the first time to follow directly the entry of a transforming DNA into the cytoplasm of competent bacteria. It also allowed us to confirm the role of the ComEC protein in the internalization of the DNA in the cytoplasm. The work I performed also allowed to show that the level of expression of the uptake complex determines the transformation efficiency of H. pylori. The amount of captured DNA would then be a limiting factor for the transformation in this bacterium. Finally, I initiated the biochemical and genetic characterization of the NucT protein, a nuclease associated to the membrane and implicated in the transformation.

Haloferax volcanii est une archée appartenant au phylum euryarchaeota et à la classe des Halobacteriales. Les mécanismes liés à la réplication et à la réparation chez les archées sont très similaires à ceux rencontrés chez les eucaryotes, faisant d’H. volcanii un des organismes modèle pour l’étude de la réplication et de la biologie des archées, notamment car de nombreux outils génétiques sont disponibles chez cet organisme. De plus, H. volcanii possède la particularité de pouvoir avoir toutes ses origines de réplication supprimées, soulevant beaucoup de questions sur les mécanismes impliqués. Plusieurs hypothèses ont été émises sur la façon dont cette souche initie sa réplication, basées soit sur la dérivation des mécanismes liés à la réparation de l’ADN, soit sur un mécanisme d’initiation de la réplication indépendant des origines. Afin d’étudier ces mécanismes liés à la réplication, j’ai construit une souche d’H. volcanii capable d’incorporer des analogues de la thymidine dans l’ADN lors de sa synthèse grâce à la délétion de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse de la thymidine. Des temps de cultures courts de la souche en présence d’un analogue permet son incorporation au niveau des zones actives de réplication pour marquer spécifiquement l’ADN néosynthétisé. L’immunodétection de l’analogue incorporé à l’ADN, en travaillant en cellule entière avec un microscope à fluorescence, permet la localisation de l’ADN néosynthétisé, reflétant ainsi les régions où la réplication est active. Ces analyses révèlent majoritairement 2 à 3 régions de réplication actives dans des cellules en prolifération, sans localisation particulière. Ces régions ont déjà été observées en étudiant la localisation d’une protéine clé de la réplication (RPA2) fusionnée à la protéine verte fluorescente GFP, confirmant sa localisation aux zones actives de réplication. Une étonnante variabilité observée d’une cellule à l’autre et suggère une initiation probabiliste de la réplication. Il est également étonnant de n’observer qu’aussi peu de zones actives de réplication, comparé au fort taux de polyploïdie de cette souche. Se pose alors la question de ce à quoi correspondent ces zones de réplication. Pour cela, j’ai développé chez H. volcanii la technique de peignage moléculaire permettant d’isoler des molécules individuelles d’ADN et révéler spécifiquement les analogues incorporés pour pouvoir déterminer le nombre de copies du chromosome qui sont actives lors de la réplication, ainsi que le nombre d’origines actives sur chacune des copies. J’ai également développé une technique de Time-lapse dans le but de suivre ces régions au cours du temps en observant les divisions cellulaires directement sous le microscope. / Haloferax volcanii is an archaea belonging to the phylum euryarchaeota and the class Halobacteriales. The mechanisms related to replication and repair in archaea are very similar to those found in eukaryotes, making H. volcanii a relevant model organisms for the study of replication and archaeal biology, especially since many genetic tools are available. Interestingly, all replication origins can be removed from the chromosome of H. volcanii, raising many questions about the mechanisms involved. Several hypotheses have been proposed on how this strain initiates its replication, either relying on recombination-dependent replication initiation or an origin-independent mechanism. In order to study these replication-related mechanisms, I have constructed a strain of H. volcanii able to incorporate thymidine analogues into DNA during its synthesis by deleting genes involved in the thymidine biosynthesis pathway. A short-time cultures of the strain in the presence of an analogue allows its incorporation in nascent DNA. By immunodetection of the analog coupled to fluorescence microscopy observation of whole cells, it is possible to investigate the localization of neosynthesized DNA,which reflect the regions where replication is active. These analyses revealed mainly 2 to 3 active replication regions per cell, without any particular location. These regions had already been observed by studying the localization of a key replication protein (RPA2) fused to the fluorescent green protein GFP, confirming its location in active replication areas. A surprising variability in the number of replication foci from one cell to another was observed, suggesting a probabilistic initiation of replication. It is also surprising to observe so few active replication areas compared to the high polyploidy of this strain. This raises the question of what these replication areas correspond to. For further understanding, I developed for H. volcanii molecular combing, to isolate individual DNA molecules and specifically reveal incorporated analogues to determine the number of copies of the chromosome that are being replicated, as well as the number of active origins on each of the copies. I have also developed time-lapse approach to track these regions over time by monitoring cell proliferation directly under the microscope.

Le travail de cette thèse a été consacré au développement d’un nouvelle technique SELFI (pour self-interferences, auto-interférences en anglais). Cette méthode permet d’obtenir une localisation tridimensionnelle d’émetteurs fluorescents individuels. Nous avons démontré que cela permet l'imagerie super-résolue en 3D et le suivie 3D de molécules uniques en profondeur dans des échantillons biologiques denses et complexes. La technique SELFI se base sur l'utilisation des interférences auto-référencées (également appelées « auto-interférences ») pour remonter à la localisation 3D d’un émetteur en une seule mesure. Ces interférences sont générées via l’utilisation d'un réseau de diffraction placé en sortie du microscope de fluorescence : le signal de fluorescence diffracte sur le réseau et les ordres interfèrent, après une courte propagation, sur le détecteur. Les interférences ainsi formées sont décodées numériquement pour remonter à la localisation 3D d'une molécule fluorescente au sein de l'échantillon. Une molécule unique peut ainsi être localisée avec une précision d'une dizaine de nanomètre, et cela jusqu'à une profondeur d'au moins 50µm au sein d'un échantillon biologique vivant épais (par exemple un tissu biologique).En combinant la méthode SELFI à différentes techniques de super-résolution (PALM, dSTORM et uPAINT), nous montrons que cette méthode de localisation tridimensionnelle permet de retrouver la hiérarchie et l'organisation de protéines dans des objets biologiques. En effectuant du SELFI-PALM, nous avons pu observer différentes protéines des points focaux d’adhésion (talin-C terminale et paxiline) et retrouver les différences de hauteur attendues, et ceux sur des échantillons de cellules vivantes. Ces résultats confirment la résolution accessible avec la technique SELFI (environ 25nm) même pour un faible nombre de photons collectés (environ 500 photons par molécule).Nous mettons en évidence la robustesse de la technique SELFI en reconstruisant des images de super-résolution 3D de structures denses en profondeur dans des échantillons tissulaires complexes. En effectuant du SELFI-dSTORM, nous avons observé le réseau d’actine sur des cellules cultivées en surface de la lamelle dans un premier temps, et à différentes profondeurs (25 et 50 microns) au sein de tissus artificiels dans un second temps.Du suivi 3D de particule unique a aussi été effectué sein de tissus biologiques vivants. Nous avons observé la diffusion libre de quantum dots à différentes profondeurs (jusqu’à 50 microns, limité par l’objectif utilisé) dans des tranches vivantes de cerveau.Nous avons appliqué la technique SELFI à la détection de récepteurs postsynaptiques NMDA. Cela nous a permis d'observer, sur des échantillons de neurones en culture primaire mais aussi au sein de tranches de cerveaux de rats, une différence d'organisation entre les deux sous-unités GluN2A et GluN2B de ce récepteur au glutamate.Enfin, nous avons démontré l'importance de suivre l'évolution de l'environnement des échantillons biologiques vivants lors des acquisitions permettant la détection de molécules individuelles. Grâce à l'utilisation additionnelle et simultanée de l'imagerie de phase quantitative, nous avons pu étudier la dynamique de la membrane cellulaire durant l’activation par un facteur de croissance. L'analyse corrélative entre les images de phase quantitative en lumière blanche et les détections de molécules fluorescentes uniques permet d'obtenir de nouvelles informations pertinentes sur l'échantillon étudié. / The work of this thesis was devoted to the development of a new technique SELFI (for self-interferences). This method unlocks the three-dimensional localization of individual fluorescent emitters. We have demonstrated that this allows 3D super-resolved imaging and 3D tracking of single molecules deep into dense and complex biological samples. The SELFI technique is based on the use of self-referenced interference to go back to the 3D location of a emitter in a single measurement. These interferences are generated using a diffraction grating placed at the exit of the fluorescence microscope: the fluorescence signal diffracts on the grating and, after a short propagation, the orders interfere on the detector. The formed interferences are digitally decoded to extract the 3D location of a fluorescent molecule within the sample. A single molecule can thus be localized with a precision of approximatively ten nanometers up to a depth of at least 50 µm in a thick living biological sample (for example a biological tissue).By combining the SELFI method with different super-resolution techniques (PALM, dSTORM and uPAINT), we show that this three-dimensional localization method grants the access to the hierarchy and organization of proteins in biological objects. By performing SELFI-PALM, we observed different proteins of the adhesion focal points (talin C-terminal and paxilin) and found the expected elevation differences, and those within living cell samples. These results confirm the resolution capability of the SELFI technique (about 25 nm) even for a small number of photons collected (about 500photons per molecule).We highlight the robustness of the SELFI technique by reconstructing 3D super-resolution images of dense structures at depth in complex tissue samples. By performing SELFI-dSTORM, we observed the actin network in cells grown on the surface of the coverslip at first, and at different depths (25 and 50 microns) within artificial tissues in a second time.3D single particle tracking has also been performed in living biological tissues. We observed the free diffusion of quantum dots at different depths (up to 50 microns) in living brain slices.We applied the SELFI technique to the detection of NMDA postsynaptic receptors. We observed, in primary culture of neurons but also within slices of rat brains, a difference in organization between the two subunits GluN2A and GluN2B of this glutamate receptor.Finally, we show the importance of following the evolution of the living biological sample environment during the acquisition of images leading to detections of single molecules. Thanks to the additional and simultaneous use of quantitative phase imaging, we were able to study cell membrane dynamics during the activation by a growth factor. The correlative analysis between white light quantitative phase images and single fluorescent molecule detections provides new relevant information on the sample under study.

Les suspensions concentrées et les verres colloïdaux forment une classe de matériaux intéressante d'un point de vue de la physique mais également des applications. Ces matériaux présentent des comportements rhéologiques remarquables comme la présence d'un seuil d'écoulement, des phénomènes de glissement ou encore des dynamiques de relaxation très lentes et du vieillissement. Les techniques rhéologiques classiques ne permettant pas à elles seules de remonter à l'origine microscopique de ces phénomènes, il est nécessaire de les associer à des techniques permettant de sonder la structure et la dynamique à des échelles très locales. Dans ce travail nous développons et mettons en œuvre une série d'outils complémentaires utilisant la diffusion multiple de la lumière ou la microscopie par fluorescence et nous les appliquons à l'étude de la dynamique de suspensions concentrées de microgels polyélectrolytes au voisinage de l'équilibre, en cours de vieillissement ou en écoulement. Les principaux résultats portent sur la mesure des propriétés viscoélastiques linéaires dans une fenêtre de fréquences comprises entre des temps browniens et plusieurs heures, sur le vieillissement physique, et sur le rôle des parois dans la structuration des écoulements.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Ce est consacré à l’élaboration et à l’étude de mélanges de type polymères/maltènes (MP) et polymères/asphaltes (AMP). Les polymères sont des copolymères à blocs de styrène et de butadiène (SBS) présentant une architecture ramifiée en étoile à quatre branches. Ils ont été partiellement hydrogénés en SBEBS grâce à l’utilisation d’un catalyseur type Ziegler-Natta. Dans les conditions expérimentales utilisées, les analyses physico-chimiques des SBEBS ont clairement montré que l’hydrogénation a été réalisée sans dégradation ni réticulation des chaînes macromoléculaires. Les mélanges, fabriqués sous agitation à l’état fondu, ont ensuite été caractérisés par rhéologie et microscopie de fluorescence. Les résultats obtenus permettent d’établir que : - selon la teneur en copolymère, les AMP présentent soit une morphologie de type émulsion soit une structure de type macroréseau, - les mélanges polymères/maltènes sont des systèmes bi-phasiques constitués par une phase de copolymère gonflé et une phase de maltènes, tandis que les mélanges polymères/asphaltes sont des systèmes tri-phasiques constitués d’une phase de copolymère gonflé, d’une phase de maltènes et d’une phase d’asphaltènes stabilisés par des maltènes. Dans tous les cas, ces effets sont la conséquence directe du gonflement du copolymère dans les mélanges. Cette étude a donc permis d’établir que la microstructure des copolymères a une influence notoire sur leur gonflement et sur les performances rhéologiques des mélanges résultants / A study of maltenes/polymer and asphalt/polymer blends, with two styrene-butadiene-styrene (SBS) polymers with four-branch star-like chain architecture is reported in this work. The employed polymers, with the same overall composition and distribution, were in-situ partially hydrogenated using a Nickel II Ziegler-Natta type catalyst without cross-linking or chain scission reactions. Blends were prepared by a melt mixing procedure and studied by fluorescence microscopy and rheological measurements. Results indicate that maltene/polymers blends are bi-phase heterogeneous systems with swollen polymer-rich and maltenes-rich phases, while asphalt/polymers blends are tri-phase systems with swollen polymer-rich, maltenes-rich and stabilized asphaltenes phases. In both cases, the rheological behavior of blends is mainly affected by the swollen polymer rich phase. It was confirmed that the rheological properties of PMM depend on the molecular characteristics of the copolymer such as the total molecular weight and molecular architecture, which determine the material behavior