O câncer de mama é uma das neoplasias mais freqüentes em mulheres, conseqüentemente muitos esforços têm sido feitos na tentativa de se chegar a um diagnóstico mais precoce ou até mesmo na obtenção de maiores índices de cura. Neste sentido, o presente trabalho avaliou três tipos de alterações em nível de DNA mitocondrial com a intenção de verificar relações entre a apresentação clínico-patológica do tumor, na ocasião do ato cirúrgico, a ocorrência de mutações no DNA mitocondrial do tecido neoplásico primário e linfonodos axilares metastásicos. Para tanto, 82 amostras foram analisadas quanto à presença de alterações na alça D (D310 e microsatélite (CA).) e a ocorrência de grandes deleções na região 8295-13738. Os resultados mostraram que variações na região correspondente a alça D do mtDNA, tanto na região D310 quanto no microsatélite (CA)., são freqüentes, confirmado esta região como um "hot-spot" mutacional. Por outro lado, a deleção de 4977pb foi rara (4%) nas amostras analisadas, diferindo de resultados obtidos em outros trabalhos. Uma nova deleção de 5247pb na região 8295¬13738 foram constatadas numa amostra de linfonodos metastásico. Comparação direta entre tumores primários e linfonodos metastásicos mostrou que em 53% dos linfonodos comprometidos apresentam alterações em nível de mtDNA. Estas alterações correspondem a deleções no microsatélite (CA). na região D310 e um caso de deleção de 4977pb. Considerando que as alterações em nível de mtDNA refletem a instabilidade do genoma, tal constatação pode ser tomada como indicativo do maior grau de malignidade das células presentes nos linfonodos metastásicos, e a ocorrência seleção de grupos celulares durante o processo de metastização. / Breast cancer is one ofthe most ftequent diseases among women, consequently much effort has been done in order to have earlier diagnosis or even to achieve higher cure rates. In this way, the present work had assessed three kinds of alterations in mitochondrial DNA aiming to verify possible relations between clinical and pathological data at the time of surgery and the occurrence of mitochondrial DNA mutations in the primary neoplasic tissue and metastasic axillary lymphonodes. In this sense, 82 samples were analyzed with respect to alterations at the D¬loop region (D310 and microsatelite (CA)n) and occurrence of large deletions at the 8295-3738 region. The results showed that variations at the D-Ioop region of the mtDNA, both at the 0310 location and the microsatellite (CA)n are frequent, confirming this region as a mutational hot-spot. Conversely, the deletion of 4977bp was rare (4%) in the analyzed samples, differing from results obtained in other works. A new deletion of 5247 pb within the region 8295-\3738 was found in a metastatic lymphonode sample. Direct comparison between primary tumor and metastatic lymphonodes showed that 53% of the compromised lymphonodes exhibit alterations at the mtDNA level. This alterations correspond to deletions at the microsatellite (CA)n, the D31O region, and one case of 4977bp delection. Considering that alterations at mtDNA level reflect the genomic instability, the present results can be considered as indicative of the higher degree of malignance of the cells present at the metastatic lynphonodes, and the occurrence of clonal selection during the metastatic process.

Orientadores: Ana Maria Lima de Azeredo-Espin, Ana Claudia Lessinger / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T23:15:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_MarcosTuliode_M.pdf: 4922399 bytes, checksum: 9af5c489b44982daee534a4e0f7e937c (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: o DNA mitocondrial (DNAmt) dos metazoários possui uma série de características, tais como organização circular, simples e compacta, conteúdo gênico conservado, herança predominantemente materna e ausência ou baixa taxa de eventos de recombinação, que fazem com que este genoma seja amplamente usado em diversos estudos evolutivos. Geralmente, o DNAmt animal possui 37 genes (13 codificadores de proteínas, 22 para RNAt e 2 para RNAr) e uma principal região não-codificadora, a região-controle. O objetivo do projeto foi o seqüenciamento e a caracterização estrutural e evolutiva de regiões gênicas e do genoma mitocondrial de espécies da família Muscidae (Diptera: Calyptratae), incluindo a mosca-dos chifres, Haematobia irritans, a mosca doméstica, Mosca domestica, a mosca menor das frutas, Atherigona orientalis, "the black dump fly", Ophyra aenescens, e a mosca-dos-estábulos, Stomoxys calcitrans. A estrutura da tese foi dividida em quatro capítulos. No primeiro capítulo, a seqüência completa do gene da subunidade I da cito cromo oxidase c (COI) foi caracterizada. COI é o gene mais seqüenciado entre os insetos e tem sido usado em diversos estudos evolutivos e taxonômicos. Este gene mostrou-se estruturalmente semelhante aos demais dípteros, incluindo o uso de um códon de iniciação não usual, TCG (serina). O segundo capítulo descreve um novo conjunto de oligonucleotídeos iniciadores que ajudou a amplificar e seqüenciar regiões do DNAmt de vários dípteros onde há alta chance de ocorrer rearranjos e/ou duplicações (regiões de "hot spots" ou "instabilidade estrutural" no DNAmt de artrópodes, que incluem a região-controle e agrupamentos de RNAt). O terceiro capítulo descreve a seqüência completa da região-controle de H. irritans, M domestica e A. orientalis, define padrões evolutivo-estruturais para moscas da subordem Brachycera e sugere a atuação de elementos cis-regulatórios no controle da replicação e transcrição do DNAmt de insetos. Ao tentar acessar a região-controle de O. aenescens e S. calcitrans, foi evidenciado um possível evento de rearranjo e/ou duplicação no genoma mitocondrial destas espécies envolvendo os genes que flanqueiam a região-controle. O quarto capítulo descreve uma análise comparativa entre os genomas mitocondriais de H. irritans (16078bp) e S. calcitrans (18Kb). Um conjunto de estratégias, incluindo amplificação via LongPCR, construção de bibliotecas de "shotgun", montagem, anotação e análises estruturais utilizando recursos de bioinformática, foi otimizada durante este trabalho. Os genomas mitocondriais de H. irritans e S. calcitrans possuem conteúdo e organização gênicos conservados, considerando-se o modelo ancestral proposto para artrópodes, exceto pela regiãocontrole de S. calcitrans (2,5Kb), que teve 60% de sua seqüência caracterizada, suficientes para indicar a ocorrência de duplicação gênica envolvendo elementos internos da região-controle e o gene de RNAt para isoleucina (I). A duplicação de 1 no DNAmt de S. calcitrans é muito semelhante a que ocorre no DNAmt de espécies de Chrysomya (Diptera: Calliphoridae), reforçando que esta região é um "hot spot" de duplicação no genoma mitocondrial de dípteros. Uma árvore filogenética usando os genes codificadores de proteínas foi inferida para a ordem Diptera e o resultado difere da filogenia tradicional proposta para o grupo / Abstract: The mitochondrial DNA (mtDNA) of Metazoan has features, such as circular, simple and compact organization, conserved gene content, predominantly maternal inheritance, and lack or low rate of recombination, which have made this genome widely used in a range of evolutionary studies. In general, animal mtDNA presents 37 genes (13 protein-coding genes, 22 genes for tRNA and 2 for rRNA) and a major non-coding region, the control region. The aim ofthis project was the sequencing and the structural and evolutionary characterization of gene regions and the mitochondrial genome of species from family Muscidae (Diptera: Calyptratae): the horn fly, Haematobia irritans; the house fly, Musca domestica; the pepper fruitfly, Atherigona orientalis; the black dump fly, Ophyra aenescens; and the stable fly, Stomoxys calcitrans. The structure of the thesis was divided in four chapters. In the first chapter, the complete sequence of the cytochrome c oxidase subunit I (COI) gene was characterized. COI is the most sequenced gene in insects and have been used in a wide range of evolutionary and taxonomic studies. This gene in Muscidae showed a structure similar to other dipterans, including the use of an uncommon start codon, TCG (serine). The second chapter describes a new set of primers that improved the amplification and sequencing of regions from many dipterans mtDNA in which there is a high probability of rearrangements andlor duplications occur (regions involved in structural "hot spots", including the control region and tRNA clusters). The third chapter describes the complete sequence of H. irritans, M domestica and A. orientalis, defines evolutionary and structural patterns for Brachyceran flies and suggests cis-regulatory elements for the mtDNA repÍication and transcription control in insects. Trying to access the control region of O. aenescens and S. calcitrans, a possible event of rearrangement andlor duplication in the mitochondrial genome of these species was evidenced involving the control region flanking genes. The fourth chapter describes a comparative analysis of H. irritans (l6078bp) and S. calcitrans (-18Kb) mitochondrial genomes. A set of strategies, including the amplification via Long-PCR, construction of a shotgun library, assemblage, annotation and structural analysis using bioinformatic tools, was optimized in this work. The mitochondrial genomes of H. irritans and S. calcitrans showed gene content and organization conserved regarding the ancestral model proposed to arthropods, except for S. calcitrans control region (-2.5Kb), which had 60% of its sequence characterized. This characterization indicated the occurrence of duplicated regions involving control region nternal elements and the tRNAgene for isoleucine (I). The duplication of 1 is very similar to that of Chrysomya (Diptera: Calliphoridae) mtDNA, reinforcing that this region is a duplication hot spot in the mitochondrial genome of dipterans. A phylogenetic tree using the protein-coding genes was inferred for the Diptera order and the results differ from the traditional phylogeny proposed for the grou / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Ana Maria Lima de Azeredo-Espin, Claudia Augusta de Moraes Russo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T11:33:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Junqueira_AnaCarolinaMartins_D.pdf: 11103944 bytes, checksum: 9e7bb5e64272846641444a5fa3b833b0 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O DNA mitocondrial (mtDNA) de três espécies da família Calliphoridae foi completamente sequenciado, apresentando 15004 pb em Chloroprocta idioidea, 16143 pb em Calliphora vomitoria e 16635 pb em Phormia regina. Os três genomas mitocondriais apresentaram a ordem gênica ancestral de Pancrustacea, contendo 13 genes codificadores de proteínas (GCPs), duas subunidades de RNA ribossomal e vinte e dois RNAs transportadores (tRNAs). No entanto, P. regina apresentou uma duplicação envolvendo a sequência completa dos genes de tRNAIle e tRNAGln, além da sequência parcial do tRNAMet. Uma duplicação similar foi previamente descrita para espécies do gênero Chrysomya na mesma localização, inserida no domínio hipervariável da região controle do mtDNA. A composição de nucleotídeos dos mtDNAs sequenciados mostrou um alto viés de bases A e T (71.7% em C. idioidea, 72.9% em C. vomitoria e 75.6% em P.regina), principalemente nas terceiras posições do códon e regiões não-codificadoras, onde o conteúdo A+T é >90%. As reconstruções filogenéticas foram conduzidas com todas as espécies de dípteros com mtDNAs completos, cosistindo no estudo mais amplo com sequências de mtDNA da ordem Diptera. O emprego de genes individuais para a reconstrução de filogenias resultou em topologias variadas com baixo suporte, enquanto o uso de sequências concatenadas de nucleotídeos e aminoácidos dos GCPs mostrou resolução para as relações internas de Diptera. A monofilia de Muscomorpha não obteve suporte nas análises apresentadas neste trabalho, assim como a de Acalyptratae. A família Calliphoridae foi recuperada como monofilética, mas as relações internas de Oestroidea recuperaram espécies de Muscoidea como um grupo irmão de Calliphoridae. As relações entre as subfamílias de Calliphoridae indicaram que Luciliinae e Calliphorinae são grupos irmãos, relacionados a Chrysomyinae. Devido à importância médica, veterinária, sanitária, econômica e forense da família Calliphoridae, o esclarecimento das relações evolutivas desta família é interessante para guiar futuros estudos acerca da evolução do parasitismo e do hábito de causar miíases, além de contribuir para o diagnóstico espécie-específico. Além disso, a caracterização de genomas mitocondriais completos também pode contribuir na resolução de filogenias da ordem Diptera e estudos em evolução molecular e divergências antigas de insetos. / Abstract: In this study, we present the complete mitochondrial DNA (mtDNA) sequence of three Calliphoridae (Diptera: Brachycera) species: Chloroprocta idioidea, Calliphora vomitoria and Phormia regina, which had 15004, 16143 and 16635 bp, respectively. Each genome was arranged in the same order described for insects and crustaceans, containing 13 protein coding genes (PCGs), two ribossomal RNA subunits (rRNA) and twenty-two transfer RNA (tRNA), with the exception of P. regina, which presented a duplication involving the complete sequences of tRNAIle and tRNAGln genes, besides a partial sequence of the tRNAMet. A similar duplication has been previously described for Chrysomya species in the same location, inserted in the hypervariable domain of the mitochondrial control region. The nucleotide composition was heavily biased toward As and Ts (71.7% for C. idioidea, 72.9% for C. vomitoria and 75.6% for P.regina), mainly when considering third codon positions and non-coding regions, where the A+T content was >90%. The phylogenetic reconstructions were conducted for all available dipteran species in GenBank, this being the most comprehensive study carried out so far with complete mitochondrial genome sequences. The use of single genes has shown that different topologies were obtained with low support, whereas the use of nucleotide and amino-acid data sets with concatenated PCGs usually provided resolution for intraordinal relationships in Diptera. The monophyly of Muscomorpha was not supported in our analyses, as well as the monophyly of Acalyptratae, which is a major clade of Schizophora. The Calliphoridae was a monophyletic family, but the superfamily Oestroidea was disrupted by the inclusion of Muscoidea species as a sister group of Calliphoridae. Within Calliphoridae, the subfamilies Luciliinae and Calliphorinae were clustered together, related to the Chrysomyinae subfamily. In view of its sanitary, medical, economic and forensic importance, knowledge of Calliphoridae relationships is of interest to guide future works on parasitism evolution of the myiasis habit and specific molecular diagnosis of species. In addition, the characterization of complete mitochondrial sequences could provide insights with regard to dipteran relationships and general molecular evolutionary studies on deep-level phylogenies of insects. / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Ana Maria Lima de Azeredo-Espin / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T14:57:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Duarte_GustavoTurqueto_M.pdf: 29004339 bytes, checksum: 8f4329468621fc63871c823f6f4664b1 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: As espécies da família Calliproridae, conhecidas como moscas varejeiras, apresentam ampla distribuição geográfica no Velho e Novo Mundo. Por serem causadores de miíases e vetores de doenças, muitas espécies possuem hábito sinantrópico, importância econômica, médico-sanitária e forense. Enquanto algumas espécies são pragas da pecuária e acarretam grande prejuízo econômico devido às infestações, outras são importantes para a entomologia forense, auxiliando na investigação de crimes e questões médico-legais. Neste contexto, os marcadores moleculares têm sido de grande valia para estudos genéticos relacionados à família Calliphoridae, sendo utilizados em estudos populacionais, evolutivos e biogeográficos, complementando análises ecológicas e sistemáticas. Dentre os marcadores moleculares, o DNA mitocondrial (DNAmt) tem mostrado potencial para estudos evolutivos relacionados à família Calliphoridae, devido a várias características, tais como: possuir uma estrutura genética simples, geralmente não apresentando íntrons, DNA repetitivo, elementos transponíveis e pseudogenes; exibir uma forma de transmissão predominantemente linear (herança materna); grande número de cópias e, finalmente, por apresentar maior taxa de substituição nucleotídica, quando comparada ao DNA nuclear. Na maioria das espécies animais, o DNAmt possui cerca de 16-20kb e apresenta 37 genes, dos quais 13 são codificadores de proteínas, 2 de subunidades ribossomais (rRNAs) e 22 de tRNAs. Neste genoma, a maior porção não codificadora é chamada região controle (RC), ou A+T em insetos, por ser rica nesses dois nucleotídeos. Bridências experimentais com insetos, crustáceos e vertebrados sugerem que essa região esteja relacionada à replicação e transcrição do genoma mitocondrial. Eventos de rearranjos gênicos envolvendo a região controle e os tRNAs adjacentes são relativamente freqüentes em insetos. Recentemente uma duplicação do gene para tRNA de isoleucina (tRNAIle) foi descrita em três espécies do gênero Chrysomya, não sendo encontrada nas demais espécies de Calliphoridae estudadas até então, sugerindo que a duplicação poderia ter se originado num evento evolutivo anterior à diversificação desse gênero e que seria um marcador molecular eficiente para sua identificação. Dessa forma, com o intuito de caracterizar a região controle do DNAmt m família Calliphoridae bem como a duplicação do tRNAIle, 15 espécies pertencentes a sete gêneros desta família foram analisadas. Nos califorídeos estudados, a região controle apresentou-se dividida em dois domínios com característica distintas: um conservado, devido à presença de blocos de seqüê ncia conservados além de estruturas conservadas em vários grupos de insetos, que podem estar relacionadas à replicação e transcrição do DNAmt; e um domínio variável, tanto em tamanho quanto em seqüência. Enquanto o domínio conservado apresentou potencial para estudos filogenéticos, o domínio variável apresentou características interessantes para estudos com estrutura de populações. A caracterização da RC de califorídeos também permitiu a identificação da duplicação do tRNAIle em outras duas espécies de Chrysomya, além de uma espécie do gênero Calliphora. Um segundo tipo de duplicação, envolvendo os tRNAIle e tRNAGln, foi identificada na espécie do gênero Phormia. Os dados sugerem que o domínio variável da região controle possa atuar como um "hot spot" para eventos de rearranjo. Para a avaliação do potencial para estudos filogenéticos do domínio conservado, foram analisadas as seqüências desse domínio da região controle de 26 indivíduos pertencentes a 18 espécies de califorídeos. Os resultados dão suporte à monofilia dás três subfamílias estudadas (Chrysomyinae, Luciliinae e Calliphorinae) corroborando estudos morfológicos e moleculares realizados previamente em Calliphoridae. Além disso, o domínio conservado da região controle mostrou-se um marcador eficiente para a identificação de espécies de califorídeos, mesmo quando espécies semelhantes morfologicamente foram comparadas. Os resultados obtidos indicam um potencial dessa região do genoma mitocondrial tanto para estudo com taxa com divergência recente como para o diagnóstico de espéciés de importância forense / Abstract: The species of family Calliphoridae, known as blowflies, present wide geographic distribution throughout Old and New World and many have synantropic habit, being of economic, medical, sanitary and forensic importance for causing myiasis and for being vectors of diseases. While some species are parasites of livestock and causes great economic prejudices, others are important for forensic entomology, helping in legal investigations. Molecular markers are providing valuable results on genetic-evolutive studies related to the family Calliphoridae, been used in population structure, evolutive and biogeographic studies, complementing ecological md systematic analyses. Among the molecular markers, the mitochondrial DNA have shown a great potential for evolutive studies related to family Calliphoridae, being many the features that make it a rich source of genotypic characters: simple genetic structure, which usually lacks introns, transposable elements and pseudogenes; its predominant1y maternal inheritance; high copy number and its higher rate of nucleotide substitution compared to nuclear DNA. In most animal species, mtDNA is a circular, double-stranded 16-20 kb molecule that generally contains 37 genes, being 13 protein-coding genes, two genes for subunits of ribosomal RNA (rRNA) and 22 transfer RNA (tRNA) genes. Within this genome, the major non-coding region is known as control region, or A+T region in insects for being rich in these nucleotides. Experimental evidences with insects, crustaceans and vertebrates suggest that this region is related to the replication and transcription of the mitochondrial genome. Rearrangements events involving the control region and its flanking tRNAs may be frequent in insects. In recent works, an isoleucine tRNA gene (tRNAIle) duplication was reported for three Chrysomya species, not been identified in the other calliphorids species studied so far, suggesting that the duplication may have occurred before the diversification of this genus and that it would be an efficient marker for its identification. Therefore, intending to characterize the control region of mitochondrial DNA in family Calliphoridae just as the tRNAIle duplication, 15 species belonging to seven genera of this family were analyzed. In the studied calliphorids, two domains were recognized in the control region: a conserved domain with conserved sequence blocks and conserved structures also identified in other insect groups, which relates the control region to the replication and transcription of mitochondrial DNA; and a variable domain that varies markedly in sequence and length Whereas the conserved domain has shown a potential for phylogenetic stud ies, the variable domain has interesting features for population studies. The characterization of the control region in various calliphorids species also showed the presence of the duplication of the tRNAIle in two other species of Chrysomya and in a species of genus Calliphora. A different duplication, involving the tRNAIle and tRNAGln, was identified in the species of genus Phormia. The present data suggests that the variable domain of the contraI region may act as a hot spot for rearrangement events. For evaluating the potential of the conserved domain for . phylogenetic studies, sequences of this domain were analyzed for 26 specimens belonging to 18 calliphorid species. The results supports the monophyly of the three subfamilies studied (Chrysomyinae, Luciliinae and Calliphorinae), corroborating previous morphologic and molecular studies. Moreover, the cohserved domain of control region showed to be I useful for calliphorids species identification, even when morphologic similar species were compared. The data reveals a potential of this region of the mitochondrial genome for studies with recent diverged taxa and also for the diagnosis of species with forensic importance / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: João Aristeu da Rosa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T20:03:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mendonca_VagnerJose_M.pdf: 9704244 bytes, checksum: c343d08640ae10d944866e45beb0b3ae (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Triatomíneos silvestres coletados por Cerqueira em 1975 em Santo Inácio/BA foram estudados por Papa et al. (2002) que concluíram tratar-se de uma nova espécie, denominada T. sherlocki ao compará-la com outros Triatominae. No intuito de ampliar o conhecimento dessa nova espécie e inferir relação filogenética para as espécies da subfamília Triatominae foram seqüenciados genes nucleares, ITS-2 e 28S, e mitocondriais, citocromo b e 16S, de T. sherlocki e T. brasiliensis. As seqüências foram alinhadas no programa Clustal W do BioEdit e as relações filogenéticas construídas utilizando metodologias de distâncias com os parâmetros p-distance e Kimura-2 do algoritimo Neighbor-Joining, do programa MEGA 3.1, e Máxima Parsimônia, do programa PAUP 4.1. A filogenia baseada nos dois genes mitocondriais revelou que a espécie T. sherlocki é estritamente relacionada com a espécie T. melanica, e que T. brasiliensis aparece como espécieirmã dessas duas, exceção para a análise de Parcimônia do gene 16S que apresenta T. melanica como espécie-irmã da relação mais estreita entre T. sherlocki e T. brasiliensis. P. megistus e T. infestans aparecem relacionadas com espécies norte-americanas nas filogenias inferidas do gene 16S e das seqüências dos aminoácido do citocromo b, respectivamente. A filogenia baseada no gene nuclear 28S revelou uma politomia envolvendo as espécies T. sherlocki, T. brasiliensis e T. melanica. Essa filogenia foi subestimada pelo baixo número de espécies presentes na árvore. Essa mesma relação ocorreu na filogenia do gene do ITS-2 na análise baseada em Parcimônia. A análise de distância desse gene revelou a proximidade entre T. sherlocki e T. brasiliensis, com T. melanica como espécie-irmã. Essa filogenia apresentou as espécies T. maculata, T. brasiliensis e T. infestans estritamente relacionadas com espécies de triatomíneos norte-americanas. Algumas espécies como T. infestans e P. megistus apresentaram mais de uma topologia dependendo do gene analisado, sendo necessários mais estudos para definir uma posição filogenética dessas espécies. A proximidade de T. sherlocki com os haplótipos de T. brasiliensis, principalmente com a espécie T. melanica, pode inferir uma possível filogeografia a partir de ancestrais de T. brasiliensis, tratando-se portanto de espécies derivadas / Abstract: Wild triatomines collected by Cerqueira in 1975 in Santo Inácio,BA, Brazil were studied by Papa et al. (2002), who observed morphological differences from other species of the Triatominae, concluding that they represented a new species, named Triatoma sherlocki. Mitochondrial (cytocrome b and 16S) and nuclear (ITS-2 and 28S) gene sequencing of T. sherlocki and T. brasiliensis was carried out with the aim of learning more about the new species and its phylogenetic relationship to the species of the Triatominae subfamily. The sequences ware aligned with the Clustal W application of the BioEdit freeware program and the phylogenetic relationship inferred by estimating distances with the Kimura 2-parameter and p-distance methods of the Neighbor-Joining algorithm in the MEGA 3.1 program and Maximum Parsimony (MP) method of the PAUP 4.1 program. The phylogeny based on the two mitochondrial genes disclosed that T. sherlocki and T. melanica were closely related and that T. brasiliensis was a sister species of the two, with the exception that in for the Parsimony analysis of the 16S gene, T. melanica appeared as a sister species of the clade formed by T. sherlocki and T. brasiliensis. The species Panstrongylus megistus and T. infestans are related to North American species in phylogenetic analyses of the large subunit ribosomal RNA mitochondrial gene (16S) and the amino acid sequences of cytocrome b, respectively. The phylogeny based on the large subunit ribosomal D2 (28S) nuclear gene revealed to a polytomy involving T. sherlocki, T. brasiliensis and T. melanica. This phylogeny was underestimated due to the small number of species present in the tree. This same relationship occurred in the phylogeny of internally transcribed spacer 2 (ITS-2) nuclear gene, in analysis based on Maximum Parsimony. The analysis of distance in this gene revealed proximity between T. sherlocki and T. brasiliensis, with T. melanica as sister species. This phylogeny showed T. maculata, T. brasiliensis and T. infestans to be closely related to North American triatomines. Certain species, such as T. infestans and P. megistus, exhibited more than one topology with different genes, and fusther study is needed to define the phylogenetic positions of these species. The proximity of T. sherlocki to the T. brasiliensis haplotypes, especially with the species T. melanica, may reveal a possible phylogeography originaling from T. brasiliensis ancestors, thus implying derived species / Mestrado / Mestre em Parasitologia

Orientadores: Edi Lucia Sartorato, Andrea Trevas Maciel-Guerra / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T16:54:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Miranda_PauloMauriciodoAmorDivino_M.pdf: 2620124 bytes, checksum: aacc629866a9ff7880f48f266f4f3743 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Nos seres humanos, a visão é o sentido que retrata com melhor fidelidade o ambiente que os cerca. A ausência do sentido da visão é definida como cegueira. As conseqüências da cegueira são problemas de saúde pública importantes, pois têm um impacto significativamente negativo sobre o desenvolvimento econômico e social dos indivíduos afetados. A perda visual pode ser resultado de lesão nos centros nervosos superiores, nas vias ópticas ou em estruturas do próprio olho. As causas vão desde traumas oculares até doenças congênitas, como: glaucoma congênito, catarata congênita e Neuropatia Óptica Hereditária de Leber (LHON). A LHON é uma doença, causada por alterações no DNA mitocondrial, caracterizada pela perda repentina da visão em ambos os olhos, devido a uma degeneração do nervo óptico. Atualmente, 17 principais mutações associadas à LHON foram registradas, onde três dessas mutações representam 95% dos casos (mutações primárias) e as 14 mutações subseqüentes representam apenas 5% do total (mutações secundárias). Não foram relatados, até o momento, estudos que definam a freqüência das mutações ou estudos populacionais de prevalência no Brasil. Desta forma, o presente estudo teve como principal objetivo definir a freqüência das mutações da LHON em pacientes brasileiros. Foram avaliados 55 pacientes com hipótese diagnóstica de LHON ou neuropatia óptica adquirida de origem desconhecida. Mutações primárias (G11778A, T14484C e G3460A) e mutações secundárias nos genes MT-ND1, MT-ND4, MT-ND4L, MT-ND5, MT-ND6 e MT-CYB foram rastreadas em todos os indivíduos estudados. O rastreamento das mutações primárias foi realizado pelo método de restrição enzimática. Para os pacientes que não apresentaram mutações primárias procedeu-se o seqüenciamento direto para rastrear mutações secundárias. O método de DHPLC foi padronizado para o rastreamento de mutações primárias. Mutações primárias foram encontradas em 19 pacientes, ou seja, em 38,2% dos casos. A freqüência dessas mutações ficou definida como: 67% da mutação G11778A (13 casos), 28% da mutação T14484C (5 casos) e 5% da mutação G3460A (apenas 1 caso). A mutação G11778A apresentou números próximos aos encontrados nas populações estudadas em outras partes do mundo, confirmando ser a principal causa de LHON também em pacientes brasileiros. A mutação T14484C, como na maioria das populações mundiais, mostrou-se como a segunda maior causa da LHON, porém mostrou uma freqüência quase duas vezes maior que o descrito na literatura. Enquanto que a mutação G3460A apresentou freqüência muito baixa se comparada as das demais populações estudadas. Não foram encontradas mutações secundárias. A ausência dessas mutações pode ser atribuída à possibilidade de haver mutações em regiões do DNA mitocondrial não rastreadas no presente estudo. Há também a possibilidade de os pacientes em que não foram localizadas mutações não serem portadores da LHON, apresentando outra anomalia com dados clínicos semelhantes. No presente estudo também foi possível, a partir do teste molecular a confirmação da hipótese diagnóstica de LHON em alguns pacientes / Abstract: The vision is the sense that best expresses the environment surrounding the mankind. The term blindness is used to define the absence of the vision. The consequences of blindness are important problems of public health concern as they cause a negative impact on the economic and social development of the affected individuals). The visual loss is characterized by congenital deprivation and it can be total or partial, permanent or temporary. Furthermore, visual loss may result from superior nerve centers damage, optic pathways lesions or physic damage of the eye itself. Thus, the visual loss causes range from trauma to ocular congenital diseases such as congenital glaucoma, congenital cataract and Leber Hereditary Optic Neuropathy (LHON). LHON is a mitochondrial disease characterized by sudden loss of vision in both eyes, due to an optic nerve degeneration. Currently, 17 main LHON associated mutations were published, three of which account for 95% of the cases (primary mutations) and the subsequent fourteen account for only 5% of the total (secondary mutations). The frequencies of mutations envolved in LHON in Brazilian patients have not been reported so far. Therefore, the aim of this study was to define the LHON mutations frequency in Brazilian patients. We evaluated 55 patients with LHON diagnosis or acquired optic neuropathy of unknown origin. Primary mutations (G11778A, T14484C and G3460A) and secondary mutations in the genes MT-ND1, MT-ND4, MT-ND4L, MT-ND5, MT-ND6 and MT-CYB were screened in all individuals studied. Screening of primary mutations was performed by the method of enzyme restriction. Patients who did not have primary mutations were screened for secondary mutations by direct sequencing. The DHPLC method was used for primary mutations screening. Primary mutations were found in 19 patients, ie 38.2% of cases. The frequency of these mutations was defined as 67% for the G11778A mutation (13 cases), 28% for the T14484C mutation (5 cases) and 5% for the G3460A mutation (only 1 case). The mutation G11778A showed numbers similar to those found in the populations studied in other parts of the world, confirming that the main cause of LHON also in Brazilian patients. The T14484C mutation, as in most world populations, showed up as the second leading cause of LHON, but it showed a frequency almost twice that reported. While the G3460A mutation frequency showed very low compared to the other populations studied. No secondary mutation was found. The absence of these mutations can be attributed to the possibility of mutations in mitochondrial DNA regions not screened in this study. There is also the possibility that patients in whom no mutations were not found to be carriers of LHON, with another anomaly with similar clinical data. This study evaluated the situation of primary and secondary mutations associated with LHON in a sample of Brazilian individuals. It was also possible, from the molecular testing to confirm the diagnosis of LHON in some patients / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Nos casos de carbonização humana usualmente há uma limitação do emprego dos remanescentes biológicos para estudo. Nestes casos, têm-se usado por eleição dentes para análises forenses, já que sua constituição anatômica proporciona proteção ao material genético. No presente estudo avaliou-se a amplificação por PCR do DNA obtido de dentes submetidos ao calor (200°C, 400°C, 500°C e 600°C) durante 60 minutos testando-se três métodos de extração (orgânico, acetato de amônia/isopropanol e sílica). Foram utilizados 8 pares de dentes de indivíduos diferentes, sendo que um foi mantido in natura (gold standart) e o outro submetido à queima. Para amplificação do DNA empregaram-se iniciadores de DNA genômico (STR-F13A01) e DNA mitocondrial (MPSs). Para o DNA genômico, a análise em gel de poliacrilamida permitiu verificar que com o método orgânico 50% das amostras foram amplificadas, 38% com o acetato de amônia/isopropanol, e 0% com a sílica. Para os MPSs, o seqüenciamento das amostras mostrou que o método orgânico confirmou 100% dos resultados em 200ºC, 50% em 400ºC e 0% em 500ºC e 600ºC. Para o método acetato de amônia/isopropanol em 100% das temperaturas foi possível a análise do mtDNA. Para o método da sílica, obtivemos resultados de 50% em 400°C e 500°C, e 0% em 200°C e 600°C. Nossos resultados permitem concluir que o método acetato de 8 amônia/isopropanol é o mais indicado para obtenção de DNA amplificável por PCR de amostras carbonizadas nas temperaturas utilizadas neste trabalho. / Biological remains of carbonized human bodies are usually not possible to use in forensic analysis. In these cases, teeth are usually selected since enamel, dentin and cement provides protection to the genetic material. The present study evaluates DNA extracted using three methods (organic, isopropilic alcohol and silica) of teeth submitted to different temperatures (200°C, 400°C, 500°C and 600°C). The method of evaluation was amplification by PCR. Two third molars of eight different individuals were used; one was kept in natura (gold standart) and the other submitted to burning. For amplification primers for genomic (STR-F13A01) and mitochondrial (MPSs) DNA were used. For genomic DNA, polyacrylamide gel analysis showed that 50% of the samples extracted with organic method were amplified, 38% with isopropilic alcohol, and 0% with the silica method. For mitochondrial DNA, amplicons sequencing showed that 100% of the samples extracted with isopropilic alcohol method were confirmed in all temperatures; 100% with the organic method in 200°C, 50% in 400°C, and 0% in 500°C and 600°C. For silica method, 50% in 400°C and 500°C and 0% in 200°C and 600°C. Our results show that the isopropilic alcohol method is the best method to extract DNA from burned teeth of all used temperatures.

Em sua distribuição autóctone, as abelhas Apis mellifera apresentam diversas diferenciações morfológicas, comportamentais e ecológicas, que as possibilitam habitar os mais variados ambientes, apresentando grande diversidade de subespécies adaptadas a cada região. Com a introdução das abelhas africanas Apis mellifera scutellata no Brasil, em 1956, surgiram populações polí-hibridas denominadas Africanizadas, sendo que essas abelhas se tornaram interessantes para várias atividades econômicas e essenciais para a apicultura no Brasil. Um local que se apresenta como um bom candidato para o entendimento da dinâmica populacional das abelhas Africanizadas é o Nordeste brasileiro, que, recentemente, tem apresentado grandes avanços na área da apicultura. A análise do DNA mitocondrial tem se mostrado muito útil por permitir a obtenção de polimorfismos genéticos diretamente do DNA, resultando em um rápido e preciso estudo da variabilidade existente. Evidências morfométricas também têm sido utilizadas para estimar a composição genética destas abelhas. Neste contexto, este trabalho tem como objetivo avaliar a variabilidade de abelhas Africanizadas em diferentes localidades do Nordeste brasileiro. Foram coletadas 10 operárias por colônia em várias localidades dentro dos Estados do Rio Grande do Norte, Piauí, Alagoas, Paraíba e Sergipe. Foram feitas análises de DNA Mitocondrial do gene COI e análises do padrão de venação da asa através de Morfometria Tradicional e Geométrica utilizando as localidades e os climas das regiões amostradas como marcadores. Para as análises de morfometria foram utilizadas cinco abelhas por colônia epara a análise molecular, foi utilizada uma abelha por colônia. Foram obtidos fragmentos de 624 pb e identificados 11 diferentes haplótipos, correspondentes a 9 sítios variáveis. Os resultados das análises morfométricas e moleculares quando classificados por localidade corroboram entre si, indicando ausência de estruturação populacional na área amostrada. Essa falta de estruturação populacional provavelmente está relacionada ao alto fluxo gênico entre as populações, que tem como principal fator as altas taxas de enxameação durante os períodos de seca no Nordeste. Outros fatores que provavelmente também estão envolvidos são a apicultura migratória existente na região e, em menor escala, o comercio de compra e venda de rainhas e enxames. Os resultados da análise morfométrica usando como classificador o clima da região amostrada, mostra certa estruturação entre os três climas amostrados (Tropical, Litorâneo Úmido e Semiárido), sugerindo grupos relativamente adaptados a estas condições ambientais, apesar de haver fluxo gênico entre eles. Outra explicação para tal fato pode ser a influência do ambiente na formação das características das asas. / In its native distribution, Apis mellifera exhibit various morphological, behavioral and ecological differences that allow them to inhabit various environments and show great diversity of subspecies adapted to each region. With the introduction of African bees Apis mellifera scutellata to Brazil in 1956, emerged hybrid populations called Africanized honey bees, and, overtime, these bees have become important for various economic activities and essential for beekeeping in Brazil. A good candidate for the understanding of population dynamics on Africanized bees is the Brazilian Northeast, which recently has made great advances in the field of beekeeping. The analysis of mitochondrial DNA has proved to be very useful for allowing obtaining genetic polymorphisms directly from DNA, resulting in a fast and accurate method to studies of variability. Morphometric evidence has also been used to estimate the genetic profile of these bees. In this context, this work aims to evaluate the variability of Africanized bees in different localities of Brazilian Northeast. Ten workers per colony were collected at various locations in the states of Rio Grande do Norte, Piauí, Alagoas, Sergipe and Paraiba. Mitochondrial DNA analysis of the COI gene and analysis of the venation pattern of the wing were made through Traditional and Geometric Morphometrics using as markers the localities and climates of the sampled regions. For the analyzes of morphometry were used five bees per colony and for molecular analysis one bee colony was used. Fragments of 624 bp were obtained and 11 different haplotypes were identified, corresponding to 9 variable sites. The results of morphometric and molecular analyzes by location corroborate each other, indicating the absence of population structuration in the sampled area. This is probably related to high gene flow among populations, whose main factor is probably the high rate of swarming during periods of drought in the Northeast. Other factors are probably also involved are migratory beekeeping existing in the region and, to a lesser extent, the trade of buying and selling queens and swarms. The results of morphometric analysis using classifier as the climate of the survey area, showing some structure between the three sampled climates (Tropical, Coastal Humid and Semiarid), suggesting relatively groups adapted to these environmental conditions, although there is gene flow between them. The influence of the environment in shaping the characteristics of the wings is also a possible explanation.

Pimelodella Eigenmann & Eigenmann, 1888 é um dos gêneros mais especiosos pertencentes à família Heptapteridae, com 71 espécies distribuídas desde o sul da América do Sul até o Panamá e América Central. A compreensão das relações filogenéticas desse grupo é ainda bastante confusa devido a dificuldades na identificação das espécies por suas semelhanças morfológicas, além da sua ampla diversidade e distribuição. Para melhor entendermos as relações existentes entre as espécies pertencentes a este gênero, nosso trabalho utilizou abordagens moleculares e morfológicas e foi organizado em quatro capítulos. No primeiro é apresentada uma breve revisão da bibliografia relacionada à Pimelodella, a área de estudo e as ferramentas que foram utilizadas para tentarmos compreender as relações filogenéticas e biogeográficas das espécies pertencentes ao gênero. Assim, para respondermos às questões propostas, no segundo capítulo avaliamos o potencial do método do código de barras do DNA para auxiliar na identificação das espécies, combinado com a análise de alguns caracteres morfológicos diagnósticos. Essas metodologias se mostraram muito úteis e eficazes, e nossos resultados indicam que é possível identificar grande parte das espécies com as metodologias escolhidas. O terceiro capítulo teve como objetivo estabelecer, as relações filogenéticas entre as espécies de Pimelodella incluídas nesse estudo, utilizando para tanto quatro genes mitocondriais (ATPase 6 e 8, citocromo b, COI e ND2). Através da análise de parcimônia foram obtidas seis árvores mais parcimoniosas. Os valores de suporte foram maiores nos nós mais internos. No quarto capítulo, apresentamos uma análise genético-populacional baseada em cinco loci de microssatélites na espécie troglóbia das cavernas da região do PETAR (Parque Estadual Turístico do Alto Ribeira). Os loci amplificados apresentaram altos níveis de polimorfismo e o número de alelos por loci variou de 9 no loco PC58 a 34 no locos PC87, o número médio de alelos por locus foi de 21,2. A estimativa global de FST, considerando-se todas as populações e todos os loci, foi significativamente diferente de zero (FST = 0,1353) sugerindo a ocorrência de diferenciação populacional na amostra. / Pimelodella Eigenmann & Eigenmann, 1888 is one of the most specious genus of the Siluriform family Heptapteridae, with 71 species distributed from southern South America to Panamá and Central America. The understanding of phylogenetic relationships within the genus is somewhat confusing due to the difficulties in morphological identification and its broad distribution. In order to assess the problems with species identification and phylogenetic relationships our work employed morphological and molecular tools is it is organized in four chapters. The first chapter contains an introduction to the problems and a revision of what its known in Pimelodella, as well as a brief description of the tools used. The second chapter deals with species identification and its subdivided into: morphology and the used of DNA barcoding. The results obtained with the combination of these two methodologies indicated, for example, that Pimelodella gracilis might comprise more than one species. The third chapter presents a phylogenetic analysis of the species included in this work based on nucleotide sequences of the mitochondrial genome. The parsimony analysis recovered six most parsimonious trees as expected the support values are larger towards the deeper nodes. The fourth chapter presents an population analysis based on five microsatellite loci to investigate whether or not the troglobitic species P. kronei displays population structuring in the caves of the PETAR (Parque Estadual Turístico do Alto Ribeira). The loci presented high polymorphism, the number of alleles raged from 9 in the locus PC58 to 34 in the locus PC87, the mean number of alleles per loci was 21,2. All loci showed private alleles PC17 and PC58 had 3 alleles and PC90 showed 22 private alleles distributed among all sampling locales. The global FST, estimative was significantly different from zero (FST = 0,1353) suggesting population.

Pesquisas envolvendo a sistemática e a taxonomia de camarões de água doce do gênero Macrobrachium Bate, 1868 ainda são pouco elucidativas para alguns de seus membros. Este é o caso de Macrobrachium olfersii (Wiegmann, 1836) que ocorre desde o sudeste dos Estados Unidos até o sul do Brasil e é comumente confundido com espécies que ocorrem preferencialmente na América Central (M. faustinum (de Saussure, 1857), M. digueti (Bouvier, 1895), M. crenulatum Holthuis, 1950, M. hancocki Holthuis, 1950 e M. acanthochirus Villalobos, 1967). Em 1969 estas espécies foram designadas por Villalobos como complexo de espécies por compartilharem características morfológicas, principalmente quanto ao segundo par de pereópodos. Outras citações afirmaram esta forte afinidade, colocando algumas espécies em sinonímia. Diante deste problema, realizou-se uma revisão taxonômica e utilizaram-se dados moleculares para verificar a validade destas espécies e explorar as relações evolutivas entre elas. As hipóteses filogenéticas foram baseadas em sequências parciais dos genes 16S rDNA, COI mtDNA, H3 e 18S nDNA por meio de análise de Máxima Verossimilhança e Inferência Bayesiana. Embora detalhada a redescrição das espécies, ressaltando as diferenças entre elas, as análises morfológicas não foram suficientes para inferir a filogenia desse grupo, devido a presença de caracteres plásticos e variáveis entre indivíduos da mesma espécie e outros conservados interespecificamente no gênero. Porém, todas as identidades foram suportadas com a análise molecular complementar baseada nos quatros marcadores, rejeitando a existência de sinonímias. Foi demonstrado através da análise baseada no gene 16S rDNA que estas espécies são evolutivamente relacionadas com M. zariqueyi Holthuis, 1949, da costa oeste da África, como compartilham características morfologicas, acredita-se que ela deva pertencer ao complexo M. olfersii, porém há a necessidade de verificar a taxonomia, analisar a morfologia e investigar outras sequências desta espécie. Os genes COI mtDNA e 16S rDNA apresentaram um amplo sinal filogenético permitindo uma boa resolução dos dendrogramas e H3 e 18S nDNA mostraram a recente divergência entre algumas espécies do grupo. / Studies on systematic and taxonomy of freshwater shrimp of the genus Macrobrachium Bate, 1868 are still unclear for some of its members, such as Macrobrachium olfersii Wiegmann, 1836). This species occurs from the southeastern United States to southern Brazil and is commonly mistaken with species that occur mainly in Central America (M. faustinum (de Saussure, 1857), M. digueti (Bouvier, 1895), M. crenulatum Holthuis, 1950, M. hancocki Holthuis, 1950 e M. acanthochirus Villalobos, 1967). In 1969 these species have been designated as a species-complex by Villalobos, because they share morphological characteristics, particularly in the second pair of pereiopod. This strong affinity and proposed some synonyms species is pointed by other authors. Faced with this problem, the validity of these species and the evolutionary relationships between them were verified by a wide taxonomic and molecular data. The phylogenetic hypotheses were based on partial sequences of 16S rDNA, COI mtDNA, 18S and H3 nDNA using analysis of Maximum Likelihood and Inference Bayesian. The diagnoses of the species were detailed, highlighting the differences between them. Nevertheless the morphological analysis were not enough to infer the phylogeny of this group because of the presence of plastic and variables characters among individuals of the same species and other preserved characters among different species of the genus. However, all identities were supported with additional molecular analysis based on four markers, rejecting the existence of synonymy. These species are evolutionarily related to M. zariqueyi Holthuis, 1949, from the west coast of Africa and share morphological character. The latter species could also belong to the M. olfersii complex because has philogenetic closeness, but before this afirmation it may be verified by morphological and molecular analysis. The mitochondrial genes (COI and 16S) showed a broad phylogenetic signal allowing a good resolution of the dendrograms. The nuclear genes (H3 and 18S) showed the recent divergence between some members of the group.