Cardiovascular intervention studies are a very important issue given that the ischaemic heart disease is one of the main mortality and morbidity causes in the Western world. Cardioprotection is mediated through a variety of signalling pathways in the cell that may directly or indirectly affect energy metabolism and mitochondria. Ischaemia-reperfusion injury of the heart significantly affect mitochondrial function revealing a potential therapeutic target. The role of mitochondria in the myocardium is not only in the field of energy homeostasis, but also in mediating the cellular response to reduced oxygen supply and in apoptosis regulation. This thesis aims to elucidate the response of the hypertrophied heart of the spontaneously hypertensive rat (SHR) and the derived conplastic strain with mitochondrial genome of normotensive Brown Norway (SHR-mtBN ) to the cardioprotective regime of adaptation to chronic normobaric hypoxia (CNH, Fi 0.1). The adaptive changes were studied at the cellular, protein and gene levels using Real-time RT-PCR, Biomark Chip Analysis, Western Blot, spectrophotometric measurements of enzyme activity and quantitative immunofluorescence analyses. The present thesis was based on a different cardioprotective phenotype between SHR and SHR-mtBN strains, i.e. a significantly smaller...

Le nombre de lymphocytes T (LT) présents dans l’organisme est contrôlé de manière étroite et maintenu constant. En réponse à une chute de ce nombre, par exemple suite à une infection, un traitement de chimiothérapie ou lors d’une greffe de moelle osseuse, les LT résiduels ou transférés se divisent activement et repeuplent les compartiments lymphoïdes, rétablissant ainsi un nombre «normal» de cellules immunes périphériques. Ce processus, appelé prolifération homéostatique, est soutenu par l’IL-7 ainsi que les signaux TCR et mène à la génération de LT effecteurs/mémoire. Ces cellules effectrices/mémoire peuvent favoriser le développement d’une réponse anti-tumorale mais sont aussi impliquées dans le développement de maladies auto-immunes et inflammatoires.Des changements métaboliques sont étroitement liés à la différenciation et aux fonctions des LT. De plus, un nombre grandissant de données suggère qu’une modulation du métabolisme permet d’influencer le cours d’une réponse immune. L’AMP-activated protein kinase (AMPK) est un senseurmajeur du stress métabolique qui régule l’homéostasie des mitochondries, la glycolyse et l’équilibre rédox. Si l’AMPK est activée lors de la stimulation du TCR, son implication dans la biologie des LT reste confuse.Au cours de cette thèse, nous avons entrepris une série d’expériences afin d’évaluer le rôle de l’AMPK sur la biologie des LT et plus particulièrement au cours de leur prolifération homéostatique. Grâce à différents modèles in vivo et in vitro, nous avons montré que l’AMPK, bien que dispensable pour les étapes précoces de l’activation du TCR, est requise pour soutenir la viabilité et l’expansion des LT au cours de proliférations de longues durées. L’AMPK promeut l’accumulation de LT effecteurs/ mémoire au cours d’une prolifération homéostatique. En accord avec ces données, la transplantation de LT AMPK-KO dans un hôte allogénique conduit au développement d’une réaction du greffon contre l’hôte de moindre gravité.D’un point de vue métabolique, l’AMPK soutient le potentiel de membrane mitochondrial, permet une plus grande flexibilité métabolique, limite la production de dérivés toxiques de l’oxygène (ROS) et protège les LT contre le stress oxydant. En outre, la neutralisation des ROS par un traitement antioxydant restaure partiellement la prolifération des LT AMPK-KO.Nos données suggèrent qu’en limitant l’accumulation de dégâts mitochondriaux et oxydatifs au cours de cycles de divisions prolongées, l’AMPK soutient la viabilité, la prolifération et les fonctions effectrices des LT. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La production cyclique d'adénosine monophosphate (AMPc) régule certains aspects de la fonction mitochondriale des cardiomyocytes de rongeurs, tels que la production d'ATP, la consommation d'oxygène, les importations de calcium et la transition de perméabilité mitochondriale (MPT), mais le contrôle de ce pool d'AMPc n'est pas bien connu. Dans la première partie de cette thèse, nous avons étudié l'expression, la localisation et l'activité de plusieurs enzymes dégradant l'AMPc, les phosphodiestérases (PDEs), dans des mitochondries cardiaques isolées de rongeurs. L'expression de la PDE2 a été principalement détectée dans les mitochondries sous-sarcologiques, et l'activité de la PDE2 stimulée par le GMPc était plus importante que celle de la PDE3 et de la PDE4; leurs activités ont ensuite été confirmées dans les cardiomyocytes de rats nouveau-nés par analyse FRET en temps réel. De plus, l’inhibition pharmacologique ou la surexpression cardiaque spécifique de la respiration mitochondriale modulée par la PDE2, la perte de potentiel de la membrane mitochondriale, le MPT et l’importation de calcium. Ainsi, la dégradation de l'AMPc par les PDE représente un nouveau mécanisme de régulation de la fonction mitochondriale et devient une cible potentielle dans le traitement des maladies cardiovasculaires.En outre, l'amélioration récente du traitement anticancéreux entraîne une augmentation du nombre de patients survivants, mais un risque de cardiotoxicité à long terme. Ainsi, dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons identifié des molécules cardioprotectrices à partir de bibliothèques chimiques en développant un test de criblage à haut débit. Nous avons identifié 6 molécules à effets puissants et spécifiqies et les avons validés dans 3 modèles cellulaires. Nous avons étudié les mécanismes d'action de chaque molécule en utilisant l’extinction par siARN, l'analyse par western blot, l'imagerie par fluorescence et les analyses métaboliques en temps réel. Trois molécules pourraient entrer rapidement dans les études précliniques et cliniques en association avec des agents de radiothérapie ou des agents chimiothérapeutiques pour le développement thérapeutique, tandis que les trois autres molécules pourraient nécessiter une optimisation chimique supplémentaire. / Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) production regulates certain aspects of mitochondria function in rodent cardiomyocytes, such as ATP production, oxygen consumption, calcium imports and mitochondrial permeability transition (MPT), but how this cAMP pool is controlled is not well known. In the first part of this thesis, we investigated the expression, localization and activity of several cAMP-degrading enzymes, phosphodiesterases (PDEs), in isolated rodent cardiac mitochondria. PDE2 expression was mainly detected in subsarcolemmal mitochondria, and cGMP-stimulated PDE2 activity was largest than PDE3 and PDE4, their activities were further confirmed in neonatal rat cardiomyocytes by real time FRET analysis. Moreover, the pharmacological inhibition or the cardiac-specific overexpression of PDE2 modulated mitochondrial respiration, mitochondrial membrane potential loss, MPT and calcium import. Thus, cAMP degradation by PDEs represents a new regulatory mechanism of mitochondrial function, and becomes a potential target in cardiovascular diseases therapy.In addition, the recent improvement of anticancer treatment results in an increase in surviving patients, but with a risk of long-term cardiotoxicity. Thus, in the second part of this thesis, we identified cardioprotective molecules from chemical libraries by developing a high throughput screening assay. We identified 6 potent and specific hits and validated them in 3 cellular models. We investigated the mechanisms of actions of each molecule and their cellular impact by using siRNA silencing, western-blot analysis, fluorescent imagery and real-time metabolic analyses. Three molecules could enter rapidly in preclinical and clinical studies in combination with radiation or chemotherapeutic agents for therapeutic development, while other three molecules may require further chemical optimization.

Historical experiments regarding the influence of low ambient temperatures were often accompanied with the development of detrimental effects. Our laboratory recently published a protocol of mild cold acclimation (5 weeks in 8 ± 1 řC) which induces cardioprotective phenotype in rats (Rattus norvegicus). An important mechanism of cold acclimation is the activation and increase of brown adipose tissue. Besides the nonshivering thermogenesis brown adipose tissue can produce a multitude of autocrine, paracrine, and endocrine factors which might positively influence whole-body metabolism and function of other important organs. The effect of cold acclimation on brown adipose tissue is not however explored very well. The aim of this work was to asses selected parameters of respiration of isolated brown adipose tissue mitochondria of control rats living in 24 ± 1 řC and compare it with that of rats exposed to 8 ± 1 řC for 1 day, 3 days, 10 days, and 5 weeks. Results of this works were 1) the increase in respiration occurs after the 1-day cold exposure and 2) the highest respiration per 1 mg of mitochondrial protein appears to be after the 10 days of cold exposure. Key-words: Brown adipose tissue, mitochondria, respiration, cold acclimation

Les maladies cardiovasculaires constituent un problème de santé publique. Les pré et postconditionnement ischémiques mais aussi pharmacologiques constituent autant d‘avancées qui permettront l‘amélioration de la prise en charge des malades en situation d‘ischémie/reperfusion myocardique. Néanmoins, la morbi-mortalité des maladies cardiovasculaires reste importante et nécessite le développement de nouvelles techniques. Les premiers résultats de la thérapie cellulaire myocardique ont été décevants, et s‘il est désormais établi que l‘on ne peut régénérer le myocarde, les effets bénéfiques observés, notamment avec les cellules souches mésenchymateuses semblent en rapport avec un effet paracrine qui passe par l‘activation de la voie de signalisation PI3kinase/Akt sur un mécanisme comparable à celui du postconditionnement ischémique. Les médiateurs de cet effet sont vraisemblablement des facteurs de croissance comme le VEGF ou l‘IGF-1 même si un effet individuel direct de l‘une ou l‘autre de ces molécules n‘a pu être mis en évidence. La modulation de l‘activité de l‘ATP synthase mitochondriale est également une cible thérapeutique prometteuse. Cette enzyme inverse son activité et hydrolyse l‘ATP durant l‘ischémie, conduisant à dépléter le pool d‘ATP intracellulaire et accélérer la survenue de la mort cellulaire. De nouvelles molécules ayant un effet similaire à l‘IF1 permettent de bloquer cette inversion d‘activité de l‘ATP synthase, de préserver l‘ATP et donc d‘améliorer la survie cellulaire par un effet de type préconditionnement ischémique. Ces 2 techniques, très différentes mais non antinomiques, pourraient faire partie de l‘arsenal thérapeutique dans les années à venir / Cardiovascular diseases are a major problem of public health management. Ischemic and pharmacological pre and postconditioning should significantly improve the prognosis of patients suffering from myocardial ischemia/reperfusion. However, the morbi-mortality of these patients is still high and research must remain active. The first results of myocardial stem cell therapy show that we cannot regenerate myocardium but a recent meta-analysis reported positive effects that can be explained through a paracrine mechanism. Mesenchymal stem cells protect ischemic cardiomyocytes from reperfusion injury through a paracrine activation of the PI3kinase/Akt pathway in a similar way to ischemic postconditioning. The mediators of this protection could be growth factors such as VEGF or IGF-1 though we couldn’t demonstrate a direct effect of one or the other. Modulating the activity of the ATP synthase during ischemia is another promising therapeutic target. This enzyme reverses its activity and hydrolyses ATP when the supply in oxygen is impaired. This leads to the reduction of the cellular pool of ATP and accelerates cell death. We identified new small molecules with a similar effect to IF1 that can selectively inhibit the reverse activity of the ATP synthase, preserve ATP and thus increase cell survival in a preconditioning-like effect. These two different techniques could be part of the therapeutic arsenal against ischemia/reperfusion in the next decades.

Résumé : La schizophrénie est une maladie mentale chronique caractérisée par trois types différents de symptômes cliniques : positifs (hallucinations), négatifs (manque de motivation) et cognitifs (dysfonction exécutive). Parmi de nombreuses perturbations neurochimiques, un débalancement entre la production des espèces réactives de l’oxygène et l’activité des enzymes antioxydantes, suggère l’existence de dysfonctions mitochondriales. Notre laboratoire a récemment développé un modèle juvénile à double atteinte de schizophrénie, chez la souris, combinant deux facteurs de risques environnementaux (inflammation immunitaire gestationnelle par l’injection de polyIC, suivie à l’âge juvénile d’un stress de contention du jour postnatal 33 à 35) afin de mieux comprendre la phase précoce de la maladie. Nous avons présenté précédemment, des anomalies comportementales et neurochimiques, incluant un stress oxydatif (mesuré par une augmentation de la carbonylation des protéines), nous permettant de valider le modèle. De plus, un antioxydant, l’acide lipoïque (AL) renverse ces déficits, appuyant les anomalies observées. Ici, nous avons évalué la fonction mitochondriale dans ce modèle juvénile à double atteinte de schizophrénie chez la souris. L’activité mitochondriale a été déterminée dans deux régions d’intérêt (cortex préfrontal (PFC) et striatum) associées à la schizophrénie. Nos mesures ont été faites en stade 3, avec des substrats pour le complexe I (glutamate-malate + ADP) et complexe II (succinate + ADP) induisant la respiration mitochondriale. Nous avons observé une augmentation de l’activité respiratoire induite par le complexe I dans le PFC et le striatum dans les deux sexes mais une augmentation de l’activité induite par le complexe II seulement chez les mâles. Le traitement à l’AL prévient seulement l’augmentation de la respiration induite par le complexe II chez les mâles mais n’a pas d’effet sur l’activité induite par le complexe I. Les niveaux d’expression protéique des différents complexes de la chaine respiratoire, des groupements carbonyl ainsi que des protéines de fission/fusion ne sont pas modifiés. En conclusion, notre modèle juvénile à double atteinte de schizophrénie montre une augmentation de l’activité respiratoire induite par le complexe II chez les mâles, sans changement de l’expression protéique. D’autres expériences sont requises pour comprendre l’origine de ces modifications. / Abstract : Schizophrenia is a chronic mental illness characterized by different clinical symptoms with three core features: positive (eg hallucinations), negative (eg lack of motivation) and cognitive (eg executive dysfunction). Among a large array of neurochemical disturbances, imbalance between production of reactive oxygen species and activity of antioxidant enzymes, convincingly points toward mitochondrial dysfunction. Our laboratory has recently developed a juvenile murine two-hit model (THM) of schizophrenia based on the combination of two environmental risk factors (gestational inflammation induced by poly IC, followed by juvenile restraint stress at postnatal days 33-35) to gain a better understanding of the early disease onset. We previously reported relevant behavioral and neurochemical disturbances, including oxidative stress (as assessed by an increase in protein carbonylation), thus providing preliminary validation of this THM of schizophrenia. Moreover, the antioxidant lipoic acid (LA) reversed these deficits, thereby pointing to a key role of oxidative stress. Here, we investigated mitochondrial function in this juvenile murine THM of schizophrenia. The mitochondrial activity was determined using the Mitoxpress commercial kit within two relevant regions (prefrontal cortex (PFC) and striatum) associated with schizophrenia. Our measures were performed in state 3, with substrates for complex I (glutamatemalate + ADP) and complex II (succinate + ADP) inducing mitochondrial respiratory activity. We observed an increase in complex I induced respiratory activity in the PFC and striatum in both sexes but an increase in complex II activity only in males. LA treatment prevented this increase only in complex II induced respiration in males but had no effect on complex I induced activity. Expression levels of the different respiratory chain complexes were not modified under our conditions, as well as fission/fusion protein and carbonyl group levels. In conclusion, our juvenile two-hit model of schizophrenia shows an increase in mitochondrial activity reversed by lipoic acid treatment, specifically in complex II induced respiratory activity in males, without any change in respiratory chain protein expression. Further investigations are required to determine the causes and consequences of these modifications.

La protéine proapoptotique Bax joue un rôle fondamental au cours de la voie intrinsèque de l’apoptose. Elle participe au déclenchement de la mort en permettant la libération de facteurs apoptogéniques mitochondriaux vers le cytosol. Un des points-clé de la fonction de Bax est son activation, caractérisée par la transition entre une forme cytosolique, globulaire et inactive de la protéine et une conformation mitochondriale, membranaire et active. Les différentes étapes de l’activation de Bax sont relativement bien connues, toutefois un grand nombre de questions reste en suspens quant-à leur régulation.Ce travail s’est focalisé sur la régulation de l’activation de Bax par les kinases Akt et GSK-3β ainsi que par la protéine antiapoptotique Bcl-xL . Ces régulations ont été caractérisées en exprimant la protéine Bax humaine chez la levure Saccharomyces cerevisiae, un paradigme d’étude simplifié qui permet d’accéder aux composantes individuelles des mécanismes d’activation de Bax.Les données obtenues suggèrent qu’il existe deux étapes régulées indépendamment au cours de l’activation de Bax. Nous avons montré que la protéine kinase GSK-3β favorise l’adressage de Bax vers la mitochondrie mais qu’elle n’entraîne pas un changement de conformation suffisant à son activation complète et à la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe. Des changements de conformations complémentaires de Bax sont requis pour conduire à une forme capable d’entraîner la libération des facteurs apoptogéniques mitochondriaux. La protéine kinase Akt est impliquée dans le contrôle de Bax via la phosphorylation de la sérine 184 et participe à l’inhibition de l’apoptose. Nous avons mis en évidence qu’une mutation phosphomimétique de la sérine 184 ou l’expression d’Akt, en l’absence de partenaires antiapoptotiques, stimulent un changement de conformation de Bax vers une forme active. Akt semble donc plus jouer un rôle sur la conformation de Bax qu’entraîner une inhibition directe. La présence de protéines antiapoptotiques serait ainsi requise pour l’inhibition de Bax en présence d’Akt.D’autre part, nous nous sommmes intéressés aux mécanismes d’action de la protéine antiapoptotique Bcl-xL . Nous avons déterminé que Bcl-xL pouvait favoriser l’adressage de Bax vers la membrane mitochondriale tout en exerçant un rôle antiapoptotique. Ceci suggère que Bcl-xL intervienne dans le contrôle des étapes tardives de l’activation de Bax. Ce contrôle est dépendant d’une interaction stable entre les deux protéines. Inversement, un variant de Bcl-xL n’interagissant que de façon transitoire avec Bax (Bcl-xL ∆C) entraîne l’activation de Bax. Cette observation est en faveur d’un modèle d’activation indirecte de Bax consécutive à la rupture de l’interaction avec Bcl-xL et dans lequel les protéines à BH3-seulement telles que Bad joueraient un rôle crucial. / Proapoptotic protein Bax plays a major role during apoptosis intrinsic pathway. Bax promotes cell death by inducing the release of apoptogenic factors from mitochondria to cytosol. Bax activation is a key step of its function which involves a change from a globular, cytosolic and inactive conformation to an active mitochondrial, membrane inserted conformation. Bax activation substeps are rather well known, however their regulation remains to be characterized.This work focuses on the study of the regulation of Bax activation by kinases Akt and GSK-3β and by antiapoptotic protein Bcl-xL . Human Bax regulations have been studied by expressing the protein in yeast Saccharomyces cerevisiae which represents a simplified paradigm for the understanding of the individual components of Bax activation mecha- nisms.Our data suggest that there are two independently regulated steps during Bax activation. We showed that GSK-3β expression led to Bax addressing to mitochondria but was not sufficent to promote a complete activation and mitochondrial outer membrane premeabilization. Further conformational changes are required to promote Bax full activation and the release of mitochondrial apoptotic factors. Protein kinase Akt is involved in Bax activation control through the phosphorylation of serine 184 and contributes to apoptosis inhibition. We observed that either a phosphomimetic mutation of serine 184 or coexpression of Akt, in the absence of antiapoptotic partners, were responsible of Bax conformational change into an active form. By itself Akt did not inhibit Bax but appeared more likely to control its conformational change. Thus, implication of antiapoptotic proteins seems to be critical in a model of Bax inhibition by Akt.Furthermore, we tried to understand the molecular mechanisms of antiapoptotic protein Bcl-xL inhibition on Bax. We determined that Bcl-xL could increase Bax mitochondrial localization while leading to its inhibition suggesting that Bcl-xL controled Bax late activation steps. Bax inhibition was dependent on a stable interaction with Bcl-xL . Conversely, a variant of Bcl-xL having a transitory interaction with Bax (Bcl-xL ∆C) was able to promote Bax activation. This supports a model of Bax indirect activation following the rupture of interaction with Bcl-xL in which BH3-only proteins like Bad would play an important role.

L'acquisition, en laboratoire, des génomes mitochondriaux complets de plusieurs espèces de rongeurs Arvicolinae permet la définition de l'histoire évolutive du groupe dans un cadre évolutif et temporel. Ces relations phylogénétiques sont inférés sur un grand nombre de caractères (16000 pb), grâce à des méthodes d'analyses statistiques novatrices.La base de données moléculaires constituée représente un échantillon de génomes mitochondriaux à évolution dite "rapide", ouvrant des perspectives quant à la description des points chauds mutationnels dans des études de génomique comparative, et permettant d'identifier plus globalement la source de l'hétérogénéité des taux de substitution mitochondriale au sein des génomes mitochondriaux des Mammifères. / Experimental acquisition of complete mitochondrial genome for several Arvicolinae species allows defining evolutionary history of the group in evolutionary and temporal frames. These phylogenetic relationships are inferred on a great number of characters (16000 bp), thanks to innovator statistical analysis methods.Constituted molecular data set represents a sample of "fast evolving" mitochondrial genomes, and allows describing mutational hots spots in comparative genomic studies, and identifying globally the origin of mitochondrial substitution rate heterogeneity detected in Mammalian mitochondrial genomes.

Bien que les progrès thérapeutiques aient permis de freiner la progression des maladies cardio-vasculaires (CV), mais surtout d'améliorer leur prévention et par conséquent de réduire la survenue d'accidents CV, ces maladies devraient rester les premières causes mondiales de décès dans les prochaines années. Cet état des lieux épidémiologique illustre donc des insuffisances concernant à la fois la prévention, mais également la prise en charge du risque CV. Ce travail de thèse s'est alors intéressé à la compréhension des mécanismes physiopathologiques de l'insuffisance cardiaque ischémique (ICi), maladie CV la plus répandue, afin de proposer des stratégies préventives limitant le remodelage cardiaque délétère ; ainsi qu'à l'étude de la pollution atmosphérique comme potentiel facteur de risque CV. Le couplage excitation-métabolisme-contraction (E-M-C), qui sous-tend la fonction de la pompe cardiaque, s'adapte en réponse à différents stimuli par une modification des interrelations spatiales et temporelles complexes entre activités électriques, énergétiques et mécaniques. Ces modifications à différents niveaux peuvent initier un remodelage délétère évoluant vers une altération du fonctionnement, voire une défaillance chronique, du myocarde.Ce travail de thèse met en évidence un découplage entre les activités mitochondriales et contractiles, à l'origine d'un déséquilibre des homéostasies ioniques et redox, responsables des dysfonctions cardiaques étudiées dans des contextes d'ICi et d'exposition en milieu pollué au CO. Ainsi, une approche thérapeutique, visant à restaurer les fonctions mitochondriales et à rétablir le couplage E-M-C cardiaque, pourrait être considérée afin de préserver au mieux la fonction myocardique. Ce travail de thèse permet alors une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques de l'ICi, et identifie la pollution atmosphérique comme facteur de risque CV à considérer en clinique afin de mieux prévenir le risque CV. / Abstract non available.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.