CONTEXTE: Bien que la dysfunction mitochondriale et le stress oxydant jouent des rôles prépondérants dans plusieurs conditions pathologiques, ils n’ont pas été étudiés de façon extensive au niveau du tube digestif qui est constamment exposé aux oxydants (provenant de l’alimentation) et à divers agents pathogènes. L’ingestion simultanée de sels ferreux et d’acide ascorbique peut causer le dommage des macromolécules par oxydation. Le ‘’Nuclear factor erythroid 2 related factor’’ (Nrf2) est un important facteur de transcription sensible au potentiel redox et qui protège contre le stress oxydant en induisant des gènes anti-oxydants et de detoxification par sa liaison à l’élément de réponse antioxydante (ARE). Les fonctions anti-oxydantes et anti-inflammatoires de Nrf2 ont été décrites dans une variété de types cellulaires et de tissus. Cependant son rôle est très peu connu au niveau du tube digestif. OBJECTIFS: Les objectifs sont d’évaluer comment la peroxydation lipidique médiée par le fer/ascorbate (FE/ASC) affecte les fonctions mitochondriales dans les cellules Caco-2/15, et de déterminer l’ampleur de l’implication de Nrf2. MÉTHODES: Le stress oxydant a été induit dans les cellules Caco2/15 en les traitant avec 0.2mm/2mm de FE/ASC. L’augmentation de l’expression de Nrf2 a été obtenue suite au prétraitement des cellules Caco2/15 avec 50 μM d’Olitpraz (OPZ), un puissant activateur. L’invalidation du gène de Nrf2 a été réalisée dans les cellules par transfection avec un vecteur lentiviral contenant un shRNA contre Nrf2. RÉSULTATS: Nos résultats montrent que le traitement des cellules Caco-2/15 avec du FE/ASC (0.2 mm/2 mm) augmente les niveaux du malondialdehyde (MDA), réduit la production d’ATP, entraîne une surcharge mitochondriale de calcium, active l’expression protéique du cytochrome C et de l’AIF (apoptotic inducing factor), réduit l’activité des complexes I, II, 2 III et IV de la chaîne respiratoire mitochondriale, augmente les niveaux de 8-OHdG, un marqueur des dommages à l’ADN mitochondrial, diminue la DNA glycosylase, et altère les expressions génique et protéique des facteurs de transcription mitochondriaux (mtTFA, mtTFB1, mtTFB2). De plus, nos observations montrent que l’induction et l’activation de Nrf2 dans les cellules Caco-2/15 résultent en: une augmentation des enzymes anti-oxydantes endogènes (catalase, glutathion peroxydase, et superoxyde dismutase), une réduction du facteur nucléaire NFκβ et de TNF-α, une augmentation de la production d’ ATP et de l’activité des complexes respiratoires (I, II, III, IV) et de PGC-1α, et une régulation des niveaux de la prohibitine mitochondriale, du Bcl-2 anti-apoptotique et de l’occludine. CONCLUSION: Dans l’ensemble, nos résultats montrent que l’exposition aigüe des cellules Caco-2/15 à la peroxydation par le FE/ASC entraîne des effets pathologiques sur les fonctions mitochondriales et l’intégrité de l’ADN, qui sont abolis par l’induction de Nrf2. Il en ressort que Nrf2 joue un rôle majeur dans la protection de l’épithélium intestinal contre le stress oxydant. / Background: Although mitochondrial dysfunction and oxidative stress are key mechanisms in various pathological conditions, they have not been extensively studied in the gastrointestinal tract, which is known to be constantly exposed to luminal oxidants from ingested foods and pathogens. Key among these is the simultaneous ingestion of iron salts and ascorbic acid, which can cause oxidative damage to macromolecules. The protein ‘’Nuclear factorerythroid 2- related factor’’ (Nrf2) is an important redox-sensitive transcription factor, which protects against oxidative stress by inducing antioxidant and detoxifying genes through binding with antioxidant response element (ARE). Many of Nrf2 antioxidant protective and anti-inflammatory functions have been established in various cells and tissues. However, limited information is available on its role in the gastrointestinal tract. Objectives: The objectives are to evaluate how iron-ascorbate (FE/ASC)-mediated lipid peroxidation affects mitochondrion functioning in Caco-2/15 cells, and to mechanistically determine the role of Nrf2. Methods: Caco2/15 cells were treated with 0.2mm/2mm of FE/ASC to induce oxidative stress. To increase Nrf2 expression, cultured Caco2/15 cells were pre-treated with 50 μM Olitpraz (OPZ). To down regulate the Nrf2 function, Nrf2 gene was knocked down by transfecting Caco-2/15 cells with a pGFP-RS lentiviral vector containing shRNA against Nrf2. 4 RESULTS: Our results show that the treatment of Caco-2/15 cells with FE/ASC (0.2 mm/2 mm): increased the levels of malondialdehyde (MDA), a marker of oxidative stress; reduced ATP production; raised mitochondrial calcium content; regulated the protein expression of cytochrome C and apoptotic inducing factor (AIF); decreased mitochondrial respiratory chain complexes I, II, III and IV activity; prevented mtDNA damage as illustrated by the raised levels of 8-OHdG; lowered DNA Glycosylase, and altered the gene expression and protein mass of mitochondrial transcription factors (mtTFA, mtTFB1, mtTFB2). Furthermore, our observations indicate that the induction and activation of Nrf2 in Caco2/15 cells resulted in an augmentated endogenous antioxidants enzymes (catalase, glutathione peroxidase, and superoxide dismutase), a reduction of nuclear factor-kappaB (NFκβ) and Tumor Necrosis Factor- Alpha (TNF-α), an increase in the ATP production, mitochondrial respiratory complexes (I, II, III, VI), PGC1α , and a regulation of the mitochondrial Prohibitin, anti-apoptotic Bcl-2 protein, and Occludin level. CONCLUSION: Findings indicate that acute exposure of Caco-2/15 cells to FE/ASC-catalyzed peroxidation produces pathological effects on mitochondrial functions and DNA integrity, which were diminished by Nrf2 induction. It appears that Nrf2 plays a critical cytoprotective role in intestinal epithelial cells against oxidative stress.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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La dystrophie facioscapulohumérale (FSHD) est une dystrophie musculaire autosomique dominante, dégénérative et progressive. Les traitements élaborés jusqu'à présent n'ont pas réussi à améliorer le quotidien des patients FSHD. Plusieurs études se sont focalisées sur les mécanismes moléculaires de cette pathologie, néanmoins plusieurs d'entre elles sont contradictoires. La vision actuelle de la FSHD est celle d'une pathologie due à un mécanisme épigénétique complexe et les mécanismes moléculaires responsables de cette pathologie sont encore mal connus. Plusieurs analyses comparatives des profils d'expression des ARNm et des protéines de muscles de patients atteints de FSHD et de contrôles ont permis de montrer que plusieurs gènes impliqués dans le stress oxydant sont dérégulés de façon spécifique dans les muscles FSHD. Nos travaux ont permis de montrer dans la FSHD, aussi bien au niveau systémique, musculaire et cellulaire (cultures primaires musculaires) une augmentation des dommages oxydatifs qui se traduisent par une augmentation des peroxydes lipidiques et protéines oxydées, associés à une altération des défenses antioxydantes. Ce stress oxydant dans les biopsies musculaires et cultures primaires musculaires est associé à un dysfonctionnement mitochondrial. Des analyses plus fines sur l'action des espèces réactives de l'oxygène et leurs sources pourraient contribuer à une meilleure compréhension des bases physiopathologiques de la FSHD et permettre la sélection de thérapeutiques adaptées aux anomalies des patients FSHD. / Facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) is an autosomal inherited muscular dystrophy. Actually no treatment led to improve the quality of life. Many studies have been focused on the molecular mechanisms of this disease, several of them were contradictory. The present view of the FSHD seems to be due to a complex epigenetic mechanism. Actually, no gene has been identified. Several comparative studies permit the identification of many genes involved in oxidative stress, deregulated in FSHD myoblasts and biopsies in comparison to healthy ones. Analysis of oxidative stress markers show that patients with FSHD present increased oxidative damage in blood as well as in biopsy muscle and muscular primary cell culture associated with altered antioxidant enzyme defenses. Oxidative stress is also associated with mitochondrial dysfunction. Complementary studies focusing in pathway of reactive oxygen species would contribute to a better understanding of pathophysiological bases of FSHD in order to establish a very helpful therapeutics for FSHD patients.

Aim: To determine the effect of diet-induced steatosis in the development of mitochondrial dysfunction in the liver and hepatic sensitivity to the partial ischemia. Methods: Male Wistar rats (361 ± 8.8 g) were fed standard (SD) or high-fat diet (HFD). Partial ischemia was induced by short-term clamp (20 min) of vein porta two days before the end of the experiment. Results: Ten-week HFD administration lead due to increased ketogenesis the altered glucose tolerance elevated serum NEFA. We demonstrated the inhibitory effect of HFD on the respiratory capacity of mitochondria in vitro. HFD negatively affected the activity of antioxidant systems and stimulated the formation of lipoperoxides. Partial ischemia had no efect on the mitochondrial oxidative capacity but significantly elevated the oxidative stress. Conclusion: HFD administration lead to the development of fatty liver that was still not accompanied by biochemical markers of liver injury. Nevertheless, we proved the impairment of to mitochondrial respiratory capacity, signs of structural damage of mitochondria and the increased sensitivity to oxidative damage of the liver. Subject words: biochemistry, physiology Keywords: mitochondria, HFD, ischemia, respiratory chain, antioxidant systém, ROS

AAbbssttrraacctt:: The mammalian organism is entirely dependent on ATP production by oxidative phosphorylation system (OXPHOS) on the inner mitochondrial membrane. OXPHOS is composed of respiratory chain complexes I-IV, ATP synthase and also include two electron transporters cytochrome c and coenzyme Q. Disorders of mitochondrial energy metabolism caused by OXPHOS defects are characterized by extreme heterogeneity of clinical symptoms, variability of tissues affected and the severity of the defect at the level of individual tissues. The mitochondrial disorders are not always clearly expressed at the level of available tissue or most easily available cultured fibroblasts and/or currently available methods are not capable to detect the defects on the fibroblasts level. The aim of this master thesis was to identify by biochemical methods, especially by high sensitive polarography, OXPHOS disorders in cultured fibroblasts. Cell lines from 10 patients with isolated (SURF21, SCO1 ND1, ND5) or combined defects of OXPHOS complexes whose biochemical defect was confirmed in muscle tissue as well as 14 patients with non- mitochondrial diseases (8 patients with Huntington disease, 6 patients with disorder of sulphur amino acids metabolism) were analysed. Furthermore impact of various cultivation conditions on OXPHOS...

L’expression des gènes mitochondriaux est grande partie dirigée par des protéines codées dans le noyau et importées dans l’organite depuis le cytosol. Diverses études ont montré que les protéines de la famille PentatricoPeptide Repeat (PPR) jouent un rôle prépondérant et varié dans ce phénomène. Au cours de ma thèse, j’ai déterminé la fonction de deux nouvelles protéines PPR chez Arabidopsis thaliana, nommées MTSF1 (pour Mitochondrial Stability Factor 1) et PPR24. Chacune de ces protéines est impliquée dans l’expression d’un ARNm mitochondrial codant une sous-unité du complexe I de la chaine respiratoire. J’ai montré que la protéine MTSF1 était requise pour stabiliser l’ARN mitochondrial nad4. Le site de liaison de MTSF1 a été déterminé et il correspond aux vingt derniers nucléotides de l’ARN nad4. Nous pensons donc qu’en s’associant à l’extrémité 3’ terminale de cet ARN, la protéine MTSF1 bloque la progression d’exoribonucléases 3’-5’ et stabilise ainsi l’ARN nad4 in vivo. L’étude de la protéine PPR24 nous a conduit à observer qu’elle était essentielle à la traduction de l’ARNm mitochondrial nad7. J’ai pu démontrer que la protéine NAD7 n’était pas synthétisée chez les mutants ppr24 et que cela était associé à l’absence de ribosomes sur l’ARNm nad7. J’ai aussi montré que la protéine PPR24 pouvait se lier spécifiquement à une courte région située au milieu de la 5’ UTR de l’ARN nad7. La modélisation de la 5’ UTR de cet ARN indique que ce site de liaison se situerait à la base d’une structure en tige-boucle pouvant diminuer fortement l’accessibilité au codon initiateur de la traduction de l’ARN nad7. Il est donc possible que la fixation de la protéine PPR24 puisse déstabiliser cette structure en tige-boucle et permettre aux ribosomes mitochondriaux d’accéder plus facilement au codon AUG. L’ensemble de ces études a permis d’apporter des informations essentielles sur la fonction et le mode d’action des protéines PPR dans l’expression génétique mitochondriale chez les plantes. / Gene expression in mitochondria is for the most controlled by nuclear encoded proteins that are from the cytosol into the organelle. Recent genetic and biochemical analysis have revealed that proteins of the PentatricoPeptide Repeat (PPR) family play preponderant and multifarious role in this process. During my thesis, I characterized the function of two novel Arabidopsis thaliana PPR protein called MTSF1 (for Mitochondrial Stability Factor 1) and PPR24. Each of these proteins is involved in the expression of a single mitochondrial gene encoding respiratory complex I subunit. I showed that the MTSF1 protein is essential for the stabilization of nad4 mRNA. The MTSF1 binding site was determined and was shown to correspond to the last twenty nucleotides of nad4 3’ UTR. We propose that, through an interaction with the extremity of nad4 transcript, the MTSF1 protein blocks the progression of 3’ to 5’ exoribonucleases and protects nad4 mRNA from degradation in vivo. PPR24 analysis indicated that this PPR protein is essential for nad7 mRNA translation. I observed that the NAD7 protein is not produced in ppr24 mutants and that this correlated with lack of ribosome loading of nad7 mature mRNA. I also showed that PPR24 binds to a short RNA fragment with high specificity located in the center of nad7 5’ leader. Structural predictions indicated that PPR24 binding site could correspond to the basis of a long stem-loop RNA structure just upstream of the AUG codon, which could prevent the accessibility to the nad7 translation codon. PPR24 binding could destabilize this stem-loop structure and permit a better access of the ribosome to the nad7 translation initiation codon. These findings shed light on the function and the mode of action of PPR proteins involved in mitochondrial gene expression in plants.

Les mitochondries sont des organelles de quelques micromètres qui proviendraient de l'incorporation d'une alpha-protéobactérie dans le cytoplasme des cellules eucaryotes par endosymbiose. Dans les cellules eucaryotes, la mitochondrie joue un rôle central dans la production d'ATP, mais aussi dans la mort cellulaire programmée par apoptose ainsi que dans la biosynthèse de nombreuses molécules. Les mitochondries sont très polymorphes, leurs taille, forme et organisation varient considérablement selon le type cellulaire ou l'état physiologique ou pathologique de la cellule. Depuis une vingtaine d'année, l'étude des mécanismes qui contrôlent la morphogenèse, la dynamique de fission et de fusion mitochondriale et leurs rôles physiologiques est devenue un domaine majeur dans la recherche sur la mitochondrie. De plus, avec les progrès de la vidéo-microscopie, il est devenu possible de filmer des mitochondries dans le cytoplasme de cellules vivantes. Durant ma thèse, j'ai participé à la caractérisation de la fonction du gène Pantagruelian Mitochondria I (PMI), un nouveau déterminant de la morphologie des mitochondries que nous avons découvert chez la drosophile. PMI est une protéine de la membrane interne qui, en intervenant dans l'organisation de cette membrane, est indispensable à la formation de mitochondries de forme tubulaire. J'ai également contribué au développement d'outils et de méthodologies permettant la visualisation et l'étude de la dynamique mitochondriale dans des embryons de drosophiles vivants. / Mitochondria are organelles which are a few micrometers long and are originated from the incorporation of an alpha-proteobacteria in the cytoplasm of eukaryotic cells through endosymbiosis. In eukaryotic cells, mitochondria play a central role in ATP production as well as in programmed cell death and in the biosynthesis of many molecules. Mitochondria are highly polymorphic in size and form. Their organization also varies considerably according to the cell type or physiological or pathological state of the cell. In the last two decades, the study of the mechanisms controlling morphogenesis, dynamic of mitochondrial fission and fusion and their physiological roles has become a major research field of mitochondria. In addition, the progress in video-microscopy enable to record mitochondrial dynamics in the cytoplasm of living cells. I participated in the research on the characterization of gene function called Pantagruelian Mitochondria I (PMI), a novel determinant of the mitochondrial morphology that we discovered in Drosophila. PMI, a protein of the inner membrane, is involved in its membrane organization and essential to form tubular mitochondria. I also contributed to the development of experimental tools and protocols to visualize and study the mitochondrial dynamics in living Drosophila embryos. Interestingly, a stereotyped process of mitochondrial remodeling during Drosophila embryogenesis has been found and it raised a question about its role in developmental processes through my work.

L'utilisation des antirétroviraux (ART) a permis une augmentation de la durée des patients infectés par le VIH. Par ailleurs, les comorbidités, retrouvées au cours du vieillissement physiologique, semblent être plus fréquentes et d'apparition plus précoce ce qui pourrait suggérer une modification du programme de vieillissement chez ces patients. L'étude ANRS EP45 « Aging » (clinicalTrials.gov, NCT01038999) a pour objectif d'analyser chez des patients infectés par le VIH traités ou non les mécanismes cellulaires connus pour être impliqués dans le vieillissement. Les PBMC d'une cohorte de 130 patients infectés par le VIH 1 appariés en âge et en sexe avec 49 sujets séronégatifs ont été analysés. Trois centres spécialisés (Marseille, Montpellier, Nice) ont recruté des patients infectés naïfs ou sous première ligne de traitement. Les résultats présentés dans ce manuscrit rapportent l'analyse des mitochondries et des lamines nucléaires. La maturation de la lamine A ne semble pas modifiée dans les PBMC de patients sous traitement contenant un inhibiteur de protéase. Cependant, ces cellules pourraient ne pas être le modèle le plus adapté pour explorer ce volet. D'autre part, l'infection est responsable d'anomalies mitochondriales dans les lymphocytes, partiellement corrigées par les traitements antirétroviraux qui modifient les mitochondries des monocytes moins sensibles à l'infection. Bien que les secondes générations de ART soient moins toxiques que les premières, leurs effets secondaires pourraient néanmoins, sur « le long terme » et/ou généralisés à l'ensemble de l'organisme, être l'un des facteurs modifiant le programme de vieillissement de ces patients. / Antiretroviral therapy (ART) has increased life expectancy in HIV-infected patients. Moreover, some age-related disorders were found to be more frequent in HIV infected and treated patients than in an age-matched general population, suggesting a modified time course of aging in HIV infected patients. The ANRS EP45 « Aging » study (clinicalTrials.gov, NCT01038999) investigated in PBMC from HIV-1 infected patients under treatment or not the cellular mechanisms known to be involved in aging. The study was performed on a cohort of 130 patients HIV-1 infected age- and sex-matched with 49 seronegative control subjects. Patients never treated with ART (naïve) or under first line were recruited by 3 AIDS centres (Marseille, Montpellier, Nice). Results presented here describe explorations of mitochondria and nuclear lamin. No alteration of lamin A maturation was detected in PBMC from HIV-1 infected patients under treatment with protease inhibitor. However, these cells could not be the most appropriate models to investigate lamin A-related aging pathway. On another hand, mitochondrial modifications were observed in lymphocytes from HIV infected naive patients. These alterations were only partly rescued by ART whereas its induced slight changes in monocytes that appeared to be less sensitive to infection. While second generation of ART are less toxic than the first one, their secondary effects, due to long term exposure and/or generalised to different tissues, could lead to a modified time course of aging in HIV infected patients.