Mitochondrion is believed to be an ubiquitous organelle which occurred about 1,5 billion years ago by a single endosymbiotic event. Mitochondria is mostly dependent on the protein import from cytosol thus the establishment of protein import machinery was essential for seizing the new endosymbiont. Possibilities of studying the evolution of protein import machineries are quite limited given that no "free living" mitochondria or amitochondriate organisms are known nowadays. One alternative is to study mitochondrial secondary reductive evolution of anaerobic parasitic protists. Giardia intestinalis is flagellated protozoan living in microaerofilic environment of the small intestine. It containes one of the most reduced mitochondrion (mitosome) described so far. Hence it serves as a great model for studying mitochondrial evolution. Although it is well understood that all mitosomal proteins are transported from cytosol, many aspects of protein import pathway remain elusive. While the main channel Tom40 is present in the outer membrane, two other main translocases (Sam50 which is required for betta-barrel assembly in the outer membrane and Tim17/22/23 which is essential for protein translocation through the inner membrane) have not been identified so far. Protein translocation through Tim17/22/23 channel...

Name of thesis: Impairment of cellular metabolism as common pathophysiological mechanism of CNS diseases Problem definition: Every human cell needs energy for living. If the prodcution of ATP (as an universal energy carrier) is broken, cell restricts its activity first and during longterm depletion of ATP, dies. It was found, that cellular metabolism is broken in most pathologies in CNS. Disorder of respiratory chain by free radicals is the best known at Parkinson's disease, epilepsy, brain ischemia etc. Mitochondria, where respiratory chain is situated, is not only the aim of free radicals, but it is their major producer. The activity of respiratory chain decreases during the life and this phenomenan is called aging. Aim of thesis: To determine whether there is increased production of free radicals in mitochondria of rat (LE Wistar) hippocampus during the epileptic seizure. Method: Thesis involves experiment which was done with acute rat hippocampal slices. To induce epileptic seizure it was used 4-aminopyridine model. It was used fluorescence imaging as imaging method. Changes of superoxide production was detected with MitoSOX. Electrophysiological record was taken by programme Spike 2 with stimulation and recording electrode inside the slice. Results: There was no significant difference between...

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative fatale de l'âge adulte, caractérisée par une perte de motoneurones, conduisant à une atrophie et une faiblesse musculaires. Des mutations de la superoxyde dismutase-1 (SOD1) provoquent une forme génétique de SLA. Comme chez les patients atteints de SLA, le modèle animal de SLA, SOD1 mutant, révèle que tous les motoneurones sont inégalement sensibles à l'évolution de la maladie. Les mitochondries, centrales énergétiques des cellules, sont des organelles précocement touchées dans la pathologie de la SLA. Un mécanisme attrayant qui sous-tend la susceptibilité différentielle est la nécessité bioénergétique variable de sous-ensembles distincts de motoneurones. Cela implique que dans le système nerveux central, la demande bioénergétique pourrait moduler le seuil pathologique. Même en l'absence de perte bioénergétique, on peut imaginer une situation dans laquelle une contrainte pathologique modifie le niveau à partir duquel la production ou la livraison de l'ATP devient insuffisant, précipitant la chute des neurones les plus vulnérables. Dans les neurones, la majorité de l'ATP est produite par les mitochondries et l'homéostasie des gradients d'ions est le procédé le plus énergivore. La fonction mitochondriale est moindre pour modifier les propriétés électriques des motoneurones si la disponibilité en ATP devient insuffisante pour permettre aux pompes ioniques de maintenir des gradients appropriés. Nous avons démontré que la concentration intracellulaire basale d’ATP dans des cultures de neurones moteurs est diminuée dans les cellules mutées SOD1 par rapport au type sauvage. Paradoxalement à ce résultat, le taux de consommation d'oxygène des mitochondries est augmenté dans les motoneurones SOD1m et il n'existe aucune preuve d'une augmentation de la consommation. Nos résultats appuient l'hypothèse intéressante qu'il y a un découplage entre la chaîne respiratoire et la production d'ATP. Ce découplage peut être utilisé comme une stratégie pour minimiser les propriétés toxiques des mitochondries hyper stimulées. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal adult-onset neurodegenerative disorder characterized by a loss of motor neurons, leading to muscle wasting and weakness. Mutations in superoxide dismutase-1 (SOD1) cause a form of ALS. As in ALS patients, the mutant SOD1 animal model of ALS reveals that not all motor neurons are equally susceptible to the disease process. An attractive mechanism underlying differential susceptibility is the variable bioenergetics need of distinct subsets of motor neurons. This implies that within the CNS, bioenergetics can modulate the pathological threshold. Even in the absence of loss in bioenergetics, one can envision a situation in which a pathological stress alters the level at which either the production or delivery of ATP becomes insufficient, precipitating the demise of the most vulnerable neuron types. In neurons, majority of ATP is produced by mitochondria and the homeostasis of ion gradients is the most energy-consuming process. Reduced mitochondrial function will modify the electrical properties of motor neurons if ATP availability becomes insufficient to allow ion pumps to maintain appropriate gradients. We demonstrated that the basal ATP intra-cellular concentration in motor neuron cultures lower in SOD1 mutated cells compared to wild type. Paradoxically to this result, the oxygen consumption rate of mitochondria is increase in mSOD1 cells and there is no evidence for an increase of consumption. Our results support the interesting hypothesis that there is an uncoupling between the respiratory chain and the ATP production. This uncoupling might be used as a strategy to minor the toxic properties of hyper stimulated mitochondrion.

Dans nos sociétés modernes, la presbyacousie, perte de l'audition liée au vieillissement, prend une place de plus en plus importante. Outre le vieillissement de la population, la prévalence de la presbyacousie est accentuée par l'exposition à des bruits toujours plus forts (concerts, baladeurs, environnement de travail, ...) et la prise de médicaments ototoxiques (cisplatine, aminoglycosides, ...). À ce jour, le lien entre l'endommagement de l'ADN, le stress oxydant et l'inflammation avec l'apparition précoce de certaines maladies liées au vieillissement (Alzheimer, démence, Parkinson, …) a été démontré. Cependant, il n'existe aucune donnée concernant le rôle des dommages de l'ADN dans la dégénérescence des cellules cochléaires et trop peu d'études témoignent de l'existence d'un stress oxydant dans la presbyacousie.Le premier objet de ce travail a donc été d'élucider le rôle des dommages de l'ADN dans la dégénérescence des cellules cochléaires. Pour ce faire, nous avons utilisé des approches de biologie moléculaire et cellulaire pour identifier des voies de signalisation associées aux lésions de l'ADN dans des explants cochléaires issus de souris âgées de 3 jours traités au cisplatine (CDDP). Cet antinéoplasique tire sa cytotoxicité de sa capacité à causer directement des dommages dans l'ADN et est connu pour ses effets nocifs sur l'audition en induisant la dégénérescence des cellules cochléaires. Enfin, nous avons étudié l'implication de p53, un des effecteurs clés de signalisation des dommages de l'ADN, in vivo en traitant avec le CDDP des souris dont le gène codant pour ce facteur de transcription a été invalidé. Nos résultats montrent que le CDDP induit des cassures double brin dans l'ADN des cellules ciliées qui sont à l'origine de l'activation de la voie ATM/DNA¬PK-Chk2-p53, de la formation de foyers βH2AX et 53BP1 et, in fine, de la mort de ces cellules par apoptose. Les cellules ciliées internes, plus résistantes au CDDP que les cellules ciliées externes, présentent une signalisation moins intense et un nombre inférieur de cassures double brin, un phénomène qui pourrait expliquer leur plus faible sensibilité. Nous avons également montré que l'absence de p53 in vivo prévient les pertes d'audition et la dégénérescence des cellules ciliées externes après injection intrapéritonéale de CDDP. Le second objectif a porté sur l'étude des effets délétères du vieillissement sur l'audition et les mécanismes moléculaires associés à cette pathologie. Pour ce faire, nous avons choisi les souris SAMP8 (senescence accelerated mice prone 8), un modèle bien établi de sénescence précoce et des maladies liées au vieillissement. Nous avons combiné des approches fonctionnelles, morphologiques, moléculaires et cellulaires pour phénotyper ces souris et identifier l'origine de l'atteinte de leur audition au cours du vieillissement. L'étude des souris SAMP8 nous a permis de montrer qu'elles sont un excellent modèle de presbyacousie mixte (atteinte de la strie vasculaire, de l'organe de Corti et du ganglion spiral), résumant la pathologie humaine. La dégénérescence des structures cochléaires que nous avons observée chez ces souris provient d'une profonde dysfonction mitochondriale, de l'augmentation du stress oxydant et des processus inflammatoires, d'un stress autophagique et de l'endommagement de l'ADN. Les mécanismes moléculaires aboutissant à la perte des cellules cochléaires constituent autant de cibles thérapeutiques à explorer dans l'avenir afin de tenter de prévenir les troubles de l'audition imputables à l'exposition au bruit ou aux médicaments ototoxiques et au vieillissement. / Our modern society is confronted with a dramatic increase in the number of patients suffering from presbycusis or age related hearing loss. Besides aging, presbycusis prevalence increases with exposition to loud noise (concerts, Walkman, work environment …) and ototoxic drugs (cisplatin, aminoglycosides …). It was reported that the early onset of some aging related diseases (Alzheimer, dementia, Parkinson …) are linked mechanistically to DNA damage, oxidative stress and inflammation. However, the role of DNA damages in cochlear cells degeneration is totally unknown and only few studies have investigated the implication of oxidative stress in presbycusis.The first goal of this study consisted in clarifying the role of DNA damage in cochlear cell degeneration. For this purpose, we used molecular and cellular biology approaches to identify the activation of DNA damage response pathways in cisplatin (CDDP) treated 3 days postnatal mouse cochlear explants in culture. Indeed, the cytotoxicity of CDDP arises from its capacity to directly damage DNA. It is also well known that one of the major dose limiting side effects of CDDP is its ototoxicity. Finally, we investigated the role of p53, a key effector of the DNA damage response pathway, in vivo by treating p53 knockout mice with CDDP. Our results show that CDDP induces double strand breaks leading to the activation of ATM-/DNA PK¬ Chk2 p53 pathway, βH2AX and 53BP1 foci formation and, in fine, apoptotic cell death. Inner hair cells, which are more resistant to CDDP treatment than outer hair cells, show a less intense signaling and fewer double strand breaks. This phenomenon could explain their weaker sensitivity to CDDP treatment. In vivo, p53 deletion prevents hearing loss and outer hair cells degeneration induced bay intraperitoneal injection of CDDP.The second goal consisted in studying the deleterious effects of aging on hearing and the molecular mechanisms involved in this pathology. Here, we studied the mechanism of presbycusis using the senescence-accelerated mouse prone 8 (SAMP8) which is a useful model to probe the effects of aging on biological processes. Based on complementary approaches combining functional, morphological, biochemistry, cellular and molecular biology, we found that the SAMP8 strain displays premature hearing loss and cochlear degeneration recapitulating the processes observed in human presbycusis (i.e. strial, sensory and neural degeneration). The molecular mechanisms associated with premature presbycusis in SAMP8 mice involve oxidative stress, mitochondrial dysfunction, chronic inflammation, autophagic stress and DNA damages. Molecular mechanisms leading to cochlear cells loss represent therapeutic targets of interest to explore in the future in order to prevent hearing impairments due to loud sound or ototoxic drugs exposure and due to aging.

Au cours de la croissance des levures, la cellule doit dupliquer sont génome nucléaire et mitochondrial, le processus de réplication est bien moins étudié dans les mitochondries. Néanmoins, si de multiples ADN polymérases sont impliquées dans les processus de réplication et de réparation dans le noyau, il est considéré jusqu’à aujourd’hui qu’une seule ADN polymérase est impliquée dans ces processus dans la mitochondrie. Des résultats récents mettent en exergue le fait que la situation est bien plus compliquée qu’il n’y apparait au départ. Pour élucider le processus de réplication dans la mitochondrie de levure, j’ai focalisé mon intérêt à tenter de purifier et de caractériser le complexe de réplication. Ce travail était important à développer étant donné la découverte au laboratoire d’une seconde ADN polymérase supplémentaire à la polymérase gamma, dans les mitochondries de levure. Une première partie de ma thèse a été de m’investir afin d’obtenir suffisamment de protéines dans le but d’une identification par spectrométrie de masse, compte tenu de la faible proportion des ADN polymérases dans la cellule et en particulier dans la mitochondrie. Nous avons démontré que cette polymérase est codée par le gène unique POL1. Par des techniques d’ultracentrifugation et d’analyse biochimiques, j’ai réussi à isoler et caractériser un complexe de réplication mitochondrial. Des techniques d’exclusion chromatographiques ont permis d’attribuer une masse native à ce complexe. Sa composition a été étudiée grâce à des colonnes ioniques et hydrophobes, une autre méthode d’analyse repose sur l’utilisation de colonnes d’affinité afin de reconstituer in-vitro les interactions existant entre plusieurs protéines présumées impliquées. Ainsi, un réseau d’interactions impliquant les deux ADN polymérases mitochondriales avec cinq autres protéines a été reconstitué. La masse native de différentes formes stables de ce complexe se situent à 500 kDa ou au-delà de 1 MDa. / During yeast growth, cells must duplicate their nuclear and mitochondrial DNA. The replication process involved is less studied in mitochondria. Nevertheless, if multiple DNA polymerases are implicated in the nuclear replication and repair mechanisms, until now it is believed that only one DNA polymerase is involved in these processes in mitochondria. Recent results pointed out that the situation is more complicated than preliminary believed. To elucidate the replication process in yeast mitochondria I focused my interest in attempts to purify and characterize the replication complexes. This work was important to develop in accord with the discovery in the laboratory of a second DNA polymerase in addition to the polymerase gamma in yeast mitochondria. One first part of my thesis was to hardly purify enough of this enzyme to be allowed to identify it by mass spectrometry as the DNA polymerase alpha, encoded by the unique POL1 gene. By ultracentrifugation and biochemical techniques, I succeeded to purify the complex. Exclusion chromatographies were managed to elucidate the native mass of this complex. In addition ionic and hydrophobic chromatographic columns were carried out to determine its composition. Another way to study the complex was the reconstitution in vitro of the interactions happening with some usual suspect proteins with the help of chromatographic affinity columns. I reconstituted partly an interactions model network, including the two mitochondrial DNA polymerases and 5 others proteins implicated in replication. I determined the mass of different stable forms of the isolated complexes, around 500 kDa and over 1 MDa

La morphologie mitochondriale résulte d’un équilibre dynamique entre les processus de fusion et de fission, impactant la physiologie cellulaire. Plusieurs données montrent une relation entre la fonction mitochondriale, des maladies cardiovasculaires et le vieillissement. OPA1 (optic atrophy 1) est une protéine qui contrôle la fusion de la membrane interne de la mitochondrie, et dont la mutation induit la maladie ADOA (autosomal dominant optic atrophy). Les travaux menés récemment indiquent que la mutation OPA1 est impliquée dans le dysfonctionnement cardiaque mais son impact sur la fonction vasculaire est encore inconnu. Notre étude a pour ambition d’examiner le rôle d’OPA1 sur la fonction vasculaire, notamment dans le développement de l’hypertension artérielle et le vieillissement vasculaire. Avec un modèle de souris hétérozygotes Opa1+/-, nous montrons dans cette étude que la protéine OPA1 joue un rôle protecteur dans le système vasculaire. En effet, les souris déficientes en OPA1 développent une hypertension-L-NAME dépendante plus grave qui est associée avec une dysfonction endothéliale plus importante et une altération de remodelage vasculaire. D’autre part, présentant une fonction vasculaire normale à 6 mois, les souris Opa1+/- commencent à développer un dysfonctionnement vasculaire à 12 mois qui pourrait induire le développement de pathologies vasculaires. En conclusion, ces résultats suggèrent pour la première fois que la dynamique mitochondriale peut jouer un rôle important sur la fonction et l’adaptation des vaisseaux dans les conditions pathologiques et dans le vieillissement vasculaire. Des études complémentaires seront nécessaires afin de clarifier le rôle de la protéine OPA1 dans l’hypertension. Ces données peuvent contribuer à la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir les complications de l’hypertension et les maladies vasculaires liées à l’âge. / Defects in mitochondrial dynamics have been associated with various disorders, including cardiovascular diseases. OPA1 is essential for mitochondrial inner membrane fusion. Mutation in Opa1 is associated with the autosomal dominant optic atrophy (ADOA). Since then, OPA1 has been reported to be associated with cell apoptosis, cell proliferation, mitochondrial ATP synthesis, calcium homeostasis and ROS production. These data suggest that OPA1 has a potential role in vascular cells and subsequently affects vascular function. On the other hand,OPA1 is also associated with age-related changes of mitochondria and simultaneously contribute to the development of many dysfunctions in different organs. In this study, we investigated impacts of OPA1 mutation on vascular function in physiological and pathological condition like hypertension and vascular aging. By using an Opa1+/- heterozygote mouse model, we show that the OPA1 protein plays a protective role in the vascular system. Indeed, Opa1+/- mice developed a hypertension more severe than WT mice which was associated with more important endothelial dysfunction and altered vascular remodeling. In addition, although initial vascular function was normal, at 12 months, Opa1+/- mice displayed vascular dysfunction which might predict onset of vascular diseases at a later time. These results suggest for the first time that mitochondrial dynamics might play an important role in vascular function and adaptation in pathological conditions and in vascular aging. More studies are needed to clarify the role of the protein OPA1 in hypertension. These data may help to identify novel therapeutic targets to prevent complications of hypertension and vascular age-related diseases.

The majority of the mitochondrial proteins is synthetized on the cytosolic ribosomes in the form of the protein precursors bearing mitochondrion-targeting signal presequences. Once the protein precursor has reached the mitochondrial matrix the signal presequence is no longer necessary and is cleaved off by heterodimeric mitochondrial processing peptidase (MPP; α/β). Although the crystal structure of MPP is available, the MPP mechanism of function is still matter of discussion. An all atomic, non-restrained molecular dynamics (MD) simulation in explicit water was used to study in detail the structural features of the highly conserved glycine-rich loop (GRL) of the regulatory α-subunit of the yeast MPP. Wild-type and GRL-deleted MPP structures were studied both in the presence and absence of a substrate in the peptidase active site. Targeted MD simulations were employed to study the mechanism of substrate translocation from the GRL to the peptidase active site. We demonstrate that the natural conformational flexibility of the GRL is crucial for the substrate translocation process from outside the enzyme towards the MPP active site. We show that the α-helical conformation of the substrate is important not only during its initial interaction with MPP (i.e. substrate recognition), but also later, at...

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Mitochondria are some of the most complex organelles of eukaryotic cell. They have their own genome and transcriptional apparatus and maintain several key cellular functions. A substantial part of cellular energetic metabolism happens in the mitochondria, as well as formation of iron-sulfur complexes, synthesis of several key molecules and they are also the essential organelles for the apoptotic pathway. In order to maintain the quality of proteins in their oxidative environment, mitochondria have developed a complex system of proteases that reaches all the mitochondrial compartments that degrade damaged proteins and thus promote mitochondrial turnover. The aim of this work was to characterise function of ClpP subunit of ClpXP matrix protease, which role was not yet extensively investigated in human cells. Therefore, we used RNA-interference to silence expression of ClpP in HEK 293 cells and then we performed rescue experiment during which we reintroduced ClpP in cells. Our results show that the ClpP subunit does not actively participate in apoptotic pathway, nevertheless it is essential for correct assembly of all the respiratory complexes as well as the quality of mitochondria itself. We have also shown that the system of mitochondrial proteases is highly functional and that a lack of ClpP...

Au cours du couplage excitation-contraction (CEC) cardiaque, une partie du calcium (Ca2+) libéré par le réticulum sarcoplasmique (RS) via les récepteurs de la ryanodine de type (RyR2) est captée par la mitochondrie. Une fois dans la matrice mitochondriale, le Ca2+ module l’activité de plusieurs enzymes du métabolisme oxydatif ainsi que la production d’ATP. Une altération de la libération de Ca2+ du RS et une dysfonction mitochondriale ont été décrites dans plusieurs pathologies cardiovasculaires associées à des troubles métaboliques comme la cardiomyopathie diabétique (CMD). Cependant, les mécanismes qui sous-tendent le remodelage du métabolisme et de l’homéostasie calcique au stade précoce de la CMD demeurent méconnus. Afin de déterminer dans quelle mesure la dynamique calcique et le couplage excitation métabolisme oxydatif sont altérés au stade précoce de la CMD, des souris C57Bl/6 ont été soumises à un régime enrichi en graisses et en sucres (HFS) pendant deux semaines. Au terme du régime, les souris HFS présentent un hyperinsulinisme, une euglycémie et une dyslipidémie. En plus de ce statut pré-diabétique, le flux mitral (E/A) évalué par échocardiographie, est significativement diminué chez les animaux HFS par rapport aux animaux Ctrl, suggérant une dysfonction diastolique précoce du ventricule gauche. A l’échelle du cardiomyocyte, une diminution du raccourcissement cellulaire sans modification de l’amplitude des transitoires calciques induits par stimulation électrique est responsable d’une diminution de l’efficacité du CEC en condition HFS. De plus, l’entrée dynamique de Ca2+ dans la mitochondrie, évaluée à l’aide de la technique de patch-clamp en configuration cellule entière, est également significativement diminuée. Bien que l’expression du canal anionique dépendant du voltage (VDAC) et de l’unipore calcique (MCU) demeure inchangée, l’expression de la protéine MICU1 augmente. Cette altération de l’entrée de Ca2+ dans la mitochondrie est responsable d’une diminution de l’activité de la pyruvate déshydrogénase via sa phosphorylation sur le résidu ser232, réduisant ainsi l’utilisation des glucides comme substrats énergétiques. Enfin, bien que les paramètres de base de l’ECG soient comparables entre les deux groupes, les souris HFS déclenchent spontanément des troubles du rythme et présentent une altération de la modulation de la fonction cardiaque par le système nerveux autonome.Ces travaux suggèrent que MICU1, en modulant l’homéostatisie calcique, le couplage excitation-métabolisme oxydatif et la flexibilité métabolique, pourrait jouer un rôle de senseur métabolique au sein des cardiomyocytes initiant ainsi la cardiomyopathie diabétique. / During cardiac excitation-contraction coupling (ECC) a fraction of the calcium (Ca2+) released by the sarcoplasmic reticulum (SR) through type 2 Ryanodine Receptor (RyR2) is taken up by mitochondria. Once in the matrix, Ca2+ modulates several enzymes of oxidative metabolism and ATP production. SR Ca2+ release alteration and mitochondrial dysfunction have been reported in several cardiovascular diseases associated with metabolic disorders such as diabetic cardiomyopathy (DCM). However, the mechanisms that govern the metabolic remodeling and Ca2+ handling at the early stage of DCM are currently unknown. To determine whether mitochondrial Ca2+ dynamics and excitation oxidative metabolism coupling are affected at the early stage of DCM, C57Bl/6 mice were fed a standard or high fat sucrose (HFS) diet for two weeks. At the end of the diet, HFS mice display hyperinsulinemia, euglycemia and dyslipidemia. In addition to this prediabetic state, the transmitral inflow (E/A), assessed by echocardiography, is significantly reduced in HFS mice compared to their control (Ctrl) littermates suggesting an early left ventricle diastolic dysfunction. At the single cardiomyocyte level, a decrease in peak cell shortening without any change regarding the amplitude of electrically evoked Ca2+ transients leads to reduced ECC efficiency under HFS conditions. Moreover, dynamic mitochondrial Ca2+ uptake measured using the whole cell patch-clamp technique is significantly decreased. While the expression of voltage-dependent anionic channel (VDAC) and mitochondrial uniporter (MCU) is unchanged, expression of mitochondrial Ca2+ uptake protein 1 (MICU1) increases. Impaired mitochondrial Ca2+ uptake leads to reduced pyruvate dehydrogenase activity through the phosphorylation of ser232, thus decreasing the use of carbohydrates as energetic substrate. Finally, although ECG basal parameters are comparable between the two groups, HFS mice trigger spontaneous arrhythmia and impaired autonomic modulation of cardiovascular function.This study suggests that MICU1 could act as a metabolic sensor by modulating mitochondrial Ca2+ handling, excitation–oxidative metabolic coupling and the metabolic flexibility paving the way to the DCM.