Dans ce travail de thèse, nous avons développé et optimisé une stratégie originale pour la caractérisation des extrémités N-terminales des protéines et des sites de clivages protéolytiques. Elle s’appuie sur la dérivation chimique spécifique des amines N-terminales et nous l’avons adapté à différents types d’échantillons biologiques. L’application de cette stratégie dans des études en biologie nous a permis d’apporter plusieurs éléments de réponse à différentes problématiques. Nous avons ainsi caractérisé les peptides de transit des protéines mitochondriales humaines et ainsi validé/corrigé expérimentalement leurs prédictions dans les banques de données. Nous avons aussi appliqué cette stratégie à l’étude du protéome du parasite P. falciparum. La mise au point de la dérivation N-terminale de protéines immobilisées dans un gel SDS PAGE nous a permis d’étudier le mécanisme d’export des protéines de ce parasite vers sa cellule hôte et de déterminer le rôle des acides aminés impliqués dans cet export. Un réactif de dérivation marqué aux isotopes stables permet d’effectuer des études différentielles des processus protéolytiques que subissent les protéines. Cette stratégie quantitative a été appliquée à l’étude du protéome hépatique du rat soumis au jeûne expérimental. D’autres applications de l’analyse protéomique en biologie sont aussi présentées dans ce manuscrit. / In this manuscript, we describe the development and the optimization of an original strategy for the characterization of protein N-termini and protease cleavage sites. The strategy is based on specific chemical derivation of alpha-amines. We applied this method to the characterization of mitochondrial proteins’ transit peptides which allowed us to experimentally validate/correct their prediction in protein databases. In another study, the strategy was applied to the analysis of the proteome of the malaria parasite Plasmodium falciparum. The optimization of ingel N-terminal derivation and its application to the study of parasite exported proteins allowed us to determine the role of implicated amino acid residues in the signaling and export mechanism of these proteins to the host cell. To enable differential studies of proteolysis, we introduced an isotope labeled derivation reagent. This quantitative method was applied in the context of a study of the rat liver proteome after experimental long-term fasting. Other applications of proteomics in biology are also presented in this manuscript.

L’objectif de ces travaux consiste à développer de nouvelles briques de terre cuite à base d’agents porogènes biosourcés dans le but d’obtenir des matériaux à haute performance thermique. Les matières premières, argile et biomasse, ont d’abord été caractérisées de manière individuelle. L’utilisation de co-produits agricoles (paille de blé, tourteau de tournesol et farine de noyaux d’olive) en tant qu’agents porogènes pour l’obtention de briques de terre cuite porosées a ensuite été étudiée. L’intérêt d’ajouter des éléments biosourcés entraînant une augmentation de la porosité, une augmentation de la résistance thermique malgré une diminution des propriétés mécaniques a alors été démontré. Toutefois, des problèmes de plasticité causant des soucis de mise en forme au niveau des échantillons ont été identifiés. Après avoir optimisé le taux de sable, l’impact de la granulométrie des matières végétales ainsi que leur taux d’incorporation ont été évalués. Une porosité maximale de 34,4 %, constituée de macropores, a été obtenue dans les conditions expérimentales optimales conduisant à une conductivité thermique de 0,45 W/m.K, soit une diminution de 15 % par rapport à un échantillon de référence sans matière végétale. Afin de continuer à améliorer les propriétés du matériau argileux obtenu, il a ensuite été envisagé de créer une microporosité en modifiant chimiquement les matières végétales qui seraient ensuite dégradées lors de la cuisson. Pour cela, les matières végétales ont été modifiées soit par imprégnation directe de carbonates soit par greffage de nouvelles fonctions carbonates ou esters. Les matières ainsi modifiées ont ensuite été incorporées dans les formulation de terre cuite et les propriétés des matériaux obtenus ont été mesurées (physiques, mécanique et thermique). Enfin, l’impact environnemental potentiel des échantillons contenant des additifs modifiés a été étudié à travers une Analyse de Cycle de Vie. Les différents scénarios, simples (avec un seul agent porogène) ou combinés (avec un agent végétal et un agent de synthèse) ont été comparés avec la méthode ReCiPe. Les étapes présentant les impacts les plus importants ont été mises en exergue. Il a également été démontré que le choix de l’unité fonctionnelle pouvait modifier radicalement les conclusions de l’étude. / The objective of this work is to develop new clay bricks with biobased pore-forming agents in order to obtain materials with high thermal performance. The raw materials, clay and biomass, were first characterized individually. The use of agricultural by-products (wheat straw, sunflower seed cake and olive stone flour) as pore-forming agents for the production of porous clay bricks was then studied. The benefits of the addition of biobased components that increase the porosity and the thermal resistance was demonstrated even if it results in a decrease of mechanical properties. However, problems of plasticity causing trouble during the extrusion of samples were identified. After optimizing the sand rate, the impact of the particle size of the biomass and the rate of incorporation were assessed. A maximum porosity of 34.4%, made up of macropores was obtained under optimal experimental conditions, leading to a thermal conductivity of 0.45 W/m.K, representing a decrease of 15 % compared to the reference brick without additive. In order to improve the properties of the resulting material, it was considered to create microporosity, thanks to the chemical modification of the vegetable materials that will be degraded during the firing process. For this, the agricultural by-products were modified either by direct impregnation of carbonates or by grafting of new chemical moieties (carbonate or ester). These modified matters were then incorporated into the clay formulation and the properties of the obtained bricks were measured (physical, mechanical and thermal ones). Finally, the potential environmental impact of the modified samples containing additives was studied through a Life Cycle Assessment. Different scenarios, simple (with one pore-forming agent) or combined (with a crude vegetable agent and a synthesized one) were compared with the ReCiPe method. The steps from the process with the most significant impacts were highlighted. It was also shown that the choice of the functional unit could radically alter the conclusions of the study.

Le carbure de bore B4C est envisagé en tant qu'absorbeur de neutrons dans les réacteurs nucléaires à neutrons rapides et à caloporteur sodium, RNR-Na, de génération IV. Cette filière de réacteur constitue aujourd'hui la référence pour l'avenir du nucléaire en France. Ainsi, un premier concept de réacteur RNR-Na, nommé ASTRID, devrait être construit aux alentours de 2025. L'objectif de notre étude est de comprendre, d'un point du vue fondamental, les effets induits par les irradiations aux ions, sur la structure cristallographique de B4C, dans différents domaines de pouvoirs d'arrêt. Pour cela, des échantillons de B4C, frittés par Spark Plasma Sintering (SPS) au SPCTS de Limoges, ont été irradiés par des ions de différentes natures et de différentes énergies, nous permettant de favoriser: (i) le pouvoir d'arrêt nucléaire Sn, afin d'induire un endommagement dit balistique dans le matériau, ou (ii) le pouvoir d'arrêt électronique Se, pour induire un endommagement dit électronique. Les irradiations en régime balistique ont été réalisées à l'aide d'ions C+, Ar+ et Au+ à des énergies inférieures au MeV, sur le VdG 4 MV de l'IPNL et auprès de la plateforme JANNuSOrsay. Les modifications structurales de B4C dans des gammes d'endommagement compris entre 0 et 9 dpa ont ainsi pu être étudiées. Les irradiations en régime électronique ont été effectuées par des ions S9+ et I9+ de 60 et 100 MeV sur l'accélérateur Tandem de l'IPNO. L'impact des excitations électroniques sur B4C à des pouvoirs d'arrêt électronique compris entre 4 et 15 keV.nm-1 a été déterminé. Afin d'étudier également les effets couplés de l'irradiation et de la température, toutes les irradiations ont été réalisées à température ambiante (RT), à 500°C et à 800 °C. Les caractérisations microstructurales des échantillons irradiés ont été effectuées principalement par microspectrométrie Raman au CEA Saclay et par Microscopie Electronique en Transmission (MET) in situ à JANNuS-Orsay. Nos études ont permis de mettre en évidence un seuil d'amorphisation du B4C dans les deux régimes d'endommagement à RT. En régime balistique, l'amorphisation du matériau est atteinte pour un taux de 9 dpa environ. En régime électronique, un pouvoir d'arrêt de 9 keV.nm-1 a permis de mettre en évidence une amorphisation du matériau induite par la formation de traces latentes nanométriques amorphes, et leur recouvrement à hautes fluences. De plus, nous avons également montré que la température permettait de limiter l'endommagement dès 500°C dans B4C, voire de l'inhiber presque totalement à 800°C / Boron carbide B4C is a material considered as neutron absorber for the Sodium Fast reactors SFR of the fourth generation. This type of reactor is the reference for the future of the nuclear technology in France. A first prototype of SFR, called ASTRID, should be built around 2025. The aim of this study is to understand, from a fundamental point of view, the effects induced by ion irradiation on the crystallographic structure of B4C, in different energy ranges. So, boron carbide samples were sintered by Spark Plasma Sintering (SPS) technique at the SPCTS laboratory in Limoges (France) and then irradiated with ions of different natures and energies, favoring: (i) the nuclear stopping power, creating ballistic damage in the material, or (ii) the electronic stopping power, creating mainly electronic damage. For the irradiations in the ballistic regime, we used C+, Ar+ and Au+ ions with energies below 1 MeV, on the accelerator VdG 4 MV of the IPNL and on the JANNuS-Orsay plateform. The structural modifications of B4C were studied between 0 and 9 dpa. The irradiations in electronic regime were performed with S9+ and I9+ ions with energies of 60 and 100MeV, at the 15 MV Tandem accelerator of the IPNO. The electronic excitations values corresponding to those conditions are ranging between 4 and 15 keV.nm-1. The irradiations were carried out at room temperature, 500°C and 800°C to study the coupled effects of temperature and irradiation. The structural characterizations of the samples after irradiation were performed by Raman spectrometry at CEA Saclay and by in situ Transmission Electron Microscopy at the JANNuS-Orsay facility. Our study demonstrated the existence of an amorphisation threshold in boron carbide in both irradiation regimes at room temperature. In the ballistic regime, the amorphisation of the material is reached around a value of 9 dpa. In the electronic regime, from a stopping power in between 9 and 10 keV.nm-1 an amorphisation process, induced by the formation of latent tracks and their overlapping at high fluences was observed. Moreover, at 500°C, we showed that the temperature slowed down the damage induced by the irradiation in B4C, and almost totally prevented it at 800°C

All cellular RNAs contain numerous chemically modified nucleosides, but the largest number and the greatest variety are found in transfer RNA (tRNA). These modifications are posttranscriptionally introduced by modification enzymes during the complex process of tRNA maturation. The function of these modified nucleosides is not well known, but it seems that when present in the anticodon region, they play a direct role in increasing translational efficiency and fidelity, while modifications outside the anticodon region would be involved in the maintenance of the structural integrity of tRNA. Among the naturally occurring nucleoside modifications, base and ribose methylations are by far the most frequently encountered. They are catalyzed by tRNA methyltransferases (MTases), using generally the S-adenosyl-L-methionine (AdoMet) as methyl donor. Most of the knowledge about tRNA MTases comes from studies on bacterial and eukaryal model organisms, and very few informations are available about tRNA methylation in Archaea, particularly for thermophilic and hyperthermophilic Archaea whose GC-rich tRNAs are difficult to sequence. Nevertheless, some works on tRNA hydrolyzates from thermophiles or hyperthermophiles highlighted the presence of numerous methylated nucleosides. Furthermore, it has been shown that the only sequenced tRNA from an hyperthermophilic Archaea, the initiator methionine tRNA (tRNAiMet) from the Sulfolobus acidocaldarius, contains ten modified nucleosides, nine of them bearing a methylation on the base, on the ribose or on both base and ribose.<p>Of special interest is the modified nucleoside found at position 9 of this tRNA. It is an adenosine derivative, but the exact nature of the modification is unknown. In the yeast S. cerevisiae, some tRNAs with a guanosine at this position are methylated by the MTase Trm10p to form m1G9 (126). Since Trm10p-related proteins are found in hyperthermophilic archaea, such a homolog could be responsible for modification at position 9 of S. acidocaldarius tRNAiMet. In this work, we showed indeed that the Trm10p-related protein Saci_1677p from S. acidocaldarius methylates position 9 of tRNAs, but is specific for position N1 of adenosine, forming m1A rather than m1G. Interestingly, we demonstrated that Tk0422p from T. kodakaraensis, the euryarchaeal homolog to Saci_1677p, is the first tRNA MTase presenting a broadened nucleoside recognition capability, methylating both position N1 of A and of G to form m1A and m1G at position 9 of tRNAs. <p>This unique tRNA (m1A-m1G) MTase activity was further studied on one hand by site-directed mutagenesis of residues potentially important for the catalytic activity of Tk0422p enzyme, and on the other hand by determining the importance of the pH on the efficacy of the methylation reaction. Indeed, protonation state of atom N1 of A and G differs at physiological pH (N1 of G being protonated contrary to N1 of A), and we showed that m1G formation was increased with increasing pH. This could reflect the need of the enzyme to deprotonate G to be able to catalyze de methyltransfer. We showed also that the activity of the two archaeal enzymes (Saci_1677p and Tk0422p) present different dependence toward the structure of tRNA, the euryarchaeal Tk0422p requiring the intact tRNA structure while its crenarchaeal counterpart Saci_1677p being able to modify some truncated tRNAs.<p>Finally, some attempts to unveil the in vivo function of these enzymes, as well as their enzymatic mechanisms were undertaken, but these experiments are very preliminary and underline the needs for the development of genetic tools applicable to Archaea./ Tous les ARN cellulaires contiennent des nucléosides modifiés chimiquement, mais ce sont les ARNt qui en contiennent la plus grande variété et la plus grande proportion. Ces modifications sont introduites post-transcriptionnellement par des enzymes de modification durant le processus complexe de maturation des ARNt. Parmi les nucléosides modifiés, les méthylations de bases ou de riboses sont les plus fréquemment rencontrées. Elles sont catalysées par des ARNt méthyltransférases (MTases) utilisant pour la plupart de la S-adenosyl-L-methionine (AdoMet) comme donneur de méthyle. <p>La plupart des connaissances relatives aux ARNt MTases provient d’études sur des organismes modèles eucaryotes et bactériens, et peu de choses sont connues en ce qui concerne les archées, plus particulièrement les archées thermophiles et hyperthermophiles dont les ARNt GC riches sont difficiles à séquencer. Néanmoins, des travaux sur des hydrolysats d’ARNt de thermophiles et hyperthermophiles ont mis en évidence la présence d’un grand nombre de nucléosides modifiés. De plus, le seul ARNt d’archée hyperthermophile séquencé à ce jour, l’ARNtiMet de S. acidocaldarius contient 10 nucléosides modifiés, essentiellement par méthylation de la base, du ribose, ou des deux à la fois. Le nucléoside présent en position 9 de cet ARNt porte une modification chimique de nature encore inconnue. Or, chez la levure S. cerevisiae, certains ARNt possédant une guanosine à cette position sont méthylés par la MTase Trm10p pour former la 1-méthylguanosine. Etant donné qu’il existe une protéine apparentée à Trm10p chez les archées hyperthermophiles, celle-ci pourrait être responsable de la modification trouvée en position 9 de l’ARNtiMet de S. acidocaldarius. Dans ce travail, nous avons montré qu’effectivement la protéine Saci_1677p de la crénarchée S. acidocaldarius, orthologue à Trm10p, modifie la position 9 des ARNt, mais catalyse la formation de 1-methyladénosine (m1A) plutôt que de m1G dans les ARNt. De façon intéressante, nous avons montré que chez l’euryarchée T. kodakaraensis, l’enzyme Tk0422p homologue à Saci_1677p est capable de méthyler à la fois une adénosine et une guanosine en position 9 des ARNt. A notre connaissance, cette enzyme est la première ARNt MTase présentant une capacité élargie de reconnaissance de substrat.<p>Le présent travail a contribué à la caractérisation fonctionnelle et structurale de ces deux enzymes archéennes, et a permis d’améliorer la connaissance générale de la machinerie de modification des ARNt d’archées.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La poly(ADP-ribosyl)ation est une modification post-traductionnelle des protéines par les poly(ADP-ribose) polymérases (PARPs). PARP3 a été identifiée comme un nouvel acteur de la réparation des cassures double-brin (DSBs). Nous avons évalué la contribution de PARP3 dans les différentes voies de réparation (HR, C-NHEJ ou A-EJ). Les résultats obtenus définissent PARP3 comme un modulateur de l’étape de résection d’ADN simple-brin permettant d’engager le choix de la voie de réparation. Nous avons montré que PARP3 favorise le recrutement du complexe Ku70/Ku80 aux sites de cassures et module la balance BRCA1/53BP1. Ces deux événements limitent l’étape de réparation de la voie HR et A-EJ et oriente la réparation vers la voie du C-NHEJ. Par immunoprécipitation de la chromatine, nous avons étudié les conséquences de l’absence de PARP3 sur les modifications d’histones, connues pour moduler la décision entre les différentes voies de réparation. Nos résultats actuels ne nous ont pas permis d’établir de lien entre PARP3 et les modifications d’histones en réponse aux DSBs. Nous avons toutefois observé qu’en absence de dommages, l’absence de PARP3 induit un enrichissement de H3K36me2 une marque d’histone connue pour réguler les gènes transcriptionnellement actifs. Dans un second projet, nous avons étudié l’impact de l’absence de PARP3 sur la viabilité cellulaire et la progression tumorale de cellules cancéreuses mutées en BRCA1. Nous avons montré par des approches in vitro et in vivo que l’absence de PARP3 induit une diminution de la survie et de la prolifération cellulaire plus marquée, une amplification exacerbée des centrosomes, ainsi qu’un ralentissement plus important de la progression tumorale, faisant de PARP3 une cible prometteuse en thérapie du cancer. / Poly(ADP-ribosyl)ation is a post-translational modification of proteins catalyzed by poly(ADPribose) polymerases (PARPs). PARP3 was identified as a novel actor of the double-strand break (DSBs) repair pathway. We evaluated the contribution of PARP3 in these repair pathways(HR, C-NHEJ ou A-EJ). Our results defined PARP3 as a modulator of the single strand DNA resection process which plays a role in driving the repair pathway choice. We showed that PARP3 enhances the recruitement of the Ku70/Ku80 complexe to damaged sites and modulates the BRCA1/53BP1 balance. These two events prevent the DNA end resection step initiating HR and A-EJ and drives the repair towards the C-NHEJ. By chromatin immunoprecipitation, we studied the consequences of the absence of PARP3 on histone modifications, known to modulate the decision of the DSBs repair pathways. Our current results didn’t allow us to establish a link between PARP3 and histone modifications in response to DSBs. However, in absence of DNA damage and PARP3, we observed an accumulation of H3K36me2, a histone mark known to regulate transcriptionally active genes. In a second project, we studied the impact of the absence of PARP3 on cell viability and tumor progression in breast cancer cell lines mutated in BRCA1. By in vitro and in vivo approaches, we showed that the absence of PARP3 induces an important decrease in cell survival and proliferation, an increase in centrosomal amplification and a strong delay in tumor progression. The roles of PARP3 in both cellular response to DNA damage and mitotic progression introduce PARP3 as a possible promising therapeutic target in cancer therapy.

Les génomes nucléaires eucaryotes sont empaquetés au sein d’une structure nucléoprotéique appelée chromatine et dont l’unité fondamentale est le nucléosome. Celui-ci est composé d’un octamère d’histones, contenant deux molécules de chacune des histones H2A, H2B, H3 et H4, autour duquel 147 pb d’ADN sont enroulées. Les modifications post-traductionnelles (PTMs) des histones et de l’ADN (méthylation des cytosines) constituent des marqueurs épigénomiques primaires qui participent à la régulation et au contrôle de l’accessibilité des différentes régions du génome. Ainsi, la chromatine forme une structure dynamique influencée par les changements environnementaux et développementaux et contribue à orchestrer diverses fonctions du génome. L’objectif principal de ma thèse était de caractériser l’organisation spatiale et la dynamique temporelle des états chromatiniens chez Arabidopsis par des approches à l’échelle du génome permettant l’étude des profils de méthylation de l’ADN et d’un ensemble de modifications post-traductionnelles des histones. La méthylation de l’ADN, une marque caractéristique de l’inactivation épigénétique et de l’hétérochromatine chez les plantes et les mammifères, est largement confinée aux séquences répétées, dont les éléments transposables (TEs). Par mon travail de thèse, j’ai montré que chez Arabidopsis les séquences de TEs faiblement méthylées ou non associées à des petits ARN interférents (siRNAs), donc potentiellement non régulées par la machinerie de RNA-directed DNA methylation (RdDM), peuvent acquérir une méthylation de l’ADN par diffusion à partir de séquences adjacentes ciblées par les siRNAs. Cette diffusion de la méthylation de l’ADN sur des régions promotrices pourrait expliquer, au moins en partie, l’impact négatif des TEs associés à des siRNAs sur l’expression des gènes à proximité immédiate. Dans une seconde partie de ma thèse, j’ai contribué à l’analyse intégrée de la méthylation de l’ADN et de onze modifications des histones. L’utilisation d’analyses combinatoires et en cluster m’a permis de montrer que l’épigénome d’Arabidopsis présente des principes simples d’organisation. En effet, ces analyses nous ont conduit à distinguer quatre états fondamentaux de la chromatine chez Arabidopsis, préférentiellement associés aux gènes actifs, aux gènes inactifs, aux TEs et aux régions intergéniques. Dans une troisième partie, j’ai intégré des données épigénomiques et transcriptomiques obtenues à différents temps afin d’étudier les dynamiques temporelles des états chromatiniens en réponse à un stimulus externe, la première exposition à la lumière des plantules suite à la germination. Ces travaux nous ont permis de montrer que la monoubiquitination de l’histone H2B participe à la modulation fine et sélective des changements rapides de l’expression de gènes. L’ensemble du travail présenté contribue à une meilleure compréhension de l’organisation de la chromatine le long du génome des plantes et de la dynamique des états chromatiniens en réponse aux changements de l’environnement. / Eukaryotic genomes are packed into the confines of the nucleus through a nucleoproteic structure called chromatin. Chromatin is a dynamic structure that can respond to developmental or environmental cues to regulate and orchestrate the functions of the genome. The fundamental unit of chromatin, the nucleosome, consists of a protein octamer, which contains two molecules of each of the core histone proteins (H2A, H2B, H3, H4), around which 147 bp of DNA is wrapped. The post-translational modifications (PTMs) of histones and methylation of the cytosine residues in DNA (DNA methylation) constitute primary epigenomic markers that dynamically alter the interaction of DNA with nucleosomes and participate in the regulation and control access to the underlying DNA. The main objective of my thesis was to understand the spatial and temporal dynamics of chromatin states in Arabidopsis by investigating on a genome-wide scale, patterns of DNA methylation and a set of well-characterized histone post-translational modifications. DNA methylation, a hallmark of epigenetic inactivation and heterochromatin in both plants and mammals, is largely confined to transposable elements and other repeat sequences. I show in this thesis that in Arabidopsis, methylated TE sequences having no or few matching siRNAs, and therefore unlikely to be targeted by the RNA-directed DNA methylation (RdDM) machinery, acquire DNA methylation through spreading from adjacent siRNA-targeted regions. Further, I propose that this spreading of DNA methylation through promoter regions can explain, at least in part, the negative impact of siRNA-targeted TE sequences on neighbouring gene expression. In a second part, I have contributed to integrative analysis of DNA methylation and eleven histone PTMs. I have shown through combinatorial and cluster analysis that the Arabidopsis epigenome shows simple principles of organisation and can be distinguished into four primary types of chromatin that preferentially index active genes, repressed genes, TEs, and intergenic regions. Finally, in a third part, I integrated epigenomics with transcriptome data at three different time points in a developmental window to investigate the temporal dynamics of chromatin states in response to an external stimulus. This used the light-induced transcriptional response as a paradigm to assess the impact of histone H2B monoubiquitination (H2Bub), and showed that this PTM is associated with active transcription and implicated in the selective fine-tuning of gene expression. Taken together, the work presented here contributes significantly to our understanding of the spatial organisation of chromatin states in plants, its dynamic nature and how it can contribute to allow plants to respond to a signal from the environment.

La méthylation de l'ADN est l’une des marques épigénétiques les plus étudiées et est largement conservée. Mes travaux de thèse présentent le premier méthylome d'une diatomée marine P. tricornutum qui appartient à la famille des Stramenopiles. P. tricornutum présente une méthylation d’environ 6% qui est présente en mosaïque sur l’ensemble du génome. Une méthylation importante a été retrouvé chez les éléments transposables, en particulier les éléments amplifiés récemment de type Copia. L’analyse met en évidence plus de 320 gènes méthylés dans trois contextes génomiques différents : à proximité des éléments transposables, en grappes de gènes méthylés, et dans des gènes uniques. En outre, les gènes largement et complètement méthylés ont été trouvé fortement corrélés avec le silencing transcriptionnel et l'expression différentielle dans des conditions spécifiques. Enfin, il a été constaté que les gènes susceptibles d’avoir été acquis par transfert horizontal de gènes bactériens étaient préférentiellement insérés dans des régions riches en éléments transposables, ce qui suggère un mécanisme par lequel l'expression de gènes étrangers peut être tamponnée à la suite de leur insertion dans le génome. En résumé, P. tricornutum a une faible méthylation de l'ADN et une methylation relativement importante des éléments transposables et seulement quelques gènes méthylés. Ce premier méthylome d’une diatomée Stramenopile ajoute de manière significative à notre compréhension de l'évolution de la méthylation de l'ADN chez les eucaryotes. En ce qui concerne les modifications des histones, la distribution des marques H3K4me2, H3K9me2 et H3K27me3 a été examinée chez P. tricornutum. H3K4me2 est principalement associée à des gènes alors que les deux marques H3K9me2 et H3K27me3 ciblent principalement des éléments transposables. La répartition de H3K27me3 est inhabituelle et différente de ce qui a été observé chez les espèces modèles étudiées à ce jour. Les gènes marqués par H3K27me3 ont tendance à être faiblement exprimés et de façon différentielle. H3K27me3 et H3K9me2 ont tendance à co-marquer non seulement les éléments transposables méthylés, mais aussi des gènes fortement méthylés, ce qui semble être important pour le maintien du silencing des gènes différentiellement exprimés. L'analyse combinatoire de différentes marques d’histones et la méthylation de l'ADN nous a donné un aperçu du paysage de la chromatine chez les diatomées, et aidera à définir les caractéristiques structurales et fonctionnelles conservées. / DNA methylation is the most extensively studied and widely conserved epigenetic mark. Here the first whole genome methylome from a stramenopile, the marine model diatom P. tricornutum is reported. In P. tricornutum, around 6% of the genome was methylated in a mosaic landscape. Extensive methylation in transposable elements (TEs), especially in recently amplified Copia-like elements was found. Over 320 genes were found methylated occurring in three different genomic contexts: in the proximity of TEs, in clusters of methylated genes, and in single genes. Furthermore, genes extensively and completely methylated correlated strongly with transcriptional silencing and differential expression under specific conditions. Finally, it was found that genes likely acquired by horizontal gene transfer from bacteria were preferentially inserted within TE-rich regions, suggesting a mechanism whereby the expression of foreign genes can be buffered following their insertion in the genome. In general, P. tricornutum has low DNA methylation with relatively extensive DNA methylation on TEs and a few methylated genes. This first Stramenopile methylome adds significantly to our understanding of the evolution of DNA methylation in eukaryotes. As for the histone modifications, genome wide distribution of H3K4me2, H3K9me2 and H3K27me3 were examined in P. tricornutum. H3K4me2 is mainly associated with genes while both H3K9me2 and H3K27me3 marks target mainly transposable elements (TEs). The distribution of H3K27me3 is unusual and different from what have been profiled in model species so far. The genes marked by H3K27me3 tend to be lowly and differentially expressed. H3K27me3 and H3K9me2 tend to co-mark not only methylated TEs but also heavily methylated genes, which appears to be important for maintaining the silencing of differentially expressed genes. The combinatorial analysis of different histone marks and DNA methylation gave us an overview of diatom chromatin landscapes, and will help to define conserved structural and functional features.

En influençant le degré de compaction de la chromatine ainsi que ses interactions avec différents partenaires protéiques, les modifications post-traductionnelles des histones sont impliquées dans la régulation de l’expression des gènes. Avec les différents variants d’histones incorporés dans la chromatine, ces modifications dynamiques et sensibles à l’environnement sont constitutives du code histone. Ce travail présente une approche globale de criblage baptisée approche histonomique, visant à révéler une perturbation épigénétique à l’échelle des histones. Cette approche originale offre une comparaison rapide et fiable des abondances relatives des variants d’histones et de leurs modifications post-traductionnelles dans des cellules humaines en une seule analyse LC-MS. Comme preuve de concept, des cellules BeWo issues de choriocarcinome humain ont été exposées au butyrate de sodium, un inhibiteur non spécifique d’histones désacétylases. Les histones extraites des échantillons témoins ou traités au butyrate de sodium à 1 ou 2,5 mM ont été analysées par chromatographie liquide ultra performante couplée à un spectromètre de masse de type Q-TOF. Les analyses statistiques multivariées ont permis de discriminer les échantillons témoins des échantillons traités sur la base des différences de degrés d’acétylation observés sur plusieurs formes d’histones. La même approche a ensuite été appliquée à des cellules exposées au B[a]P à 1 μM et a révélé deux principaux marqueurs caractéristiques d’un remodelage de la chromatine induit par les effets génotoxiques duB[a]P. En résumé, cette approche histonomique globale pourrait se révéler être un outil complémentaire très utile pour explorer une potentielle perturbation du code histone lors d’exposition à des xénobiotiques environnementaux. / While acting upon chromatin compaction, histone post-translational modifications (PTMs) are involved in modulating gene expression through histone–DNA affinity and protein–protein interactions. These dynamic and environment-sensitive modifications are constitutive of the histone code that reflects the transient transcriptional state of the chromatin. Here we describe a global screening approach for revealing epigenetic disruption at the histone level. This original approach enables fast and reliable relative abundance comparison of histone PTMs and variants in human cells within a single LC-MS experiment. As a proof of concept, we exposed BeWo human choriocarcinoma cells to sodium butyrate (SB), a universal histone deacetylase (HDAC) inhibitor. Histone acide xtracts equally representing 3 distinct classes, Control, 1 mM and 2.5 mM SB, we reanalyzed using ultra-performance liquid chromatography coupled with a hybrid quadrupoletime-of-flight mass spectrometer (UPLC-QTOF-MS). Multivariate statistics allowed us to discriminate control from treated samples based on differences in the acetylation level of several histone forms. We then applied the same procedure to cells treated with 1 μMB[a]P and suceeded in revealing two markers of chromatin remodeling in relation withgenotoxic properties of B[a]P. Indeed, this untargeted histonomic approach could be auseful exploratory tool in many cases of environmental xenobiotic exposure when histone code disruption is suspected.

Troisième dystrophie musculaire en terme d’incidence, la dystrophie facio-scapulo-humérale est une maladie qui reste encore énigmatique. Bien qu’elle a été montrée comme associée à la contraction d’un macrosatellite, D4Z4, au niveau du subtélomère 4q35 au début des années 1990, l’origine des modifications observées chez les patients est encore mal connue. C’est pourquoi nous nous sommes intéressés à différents aspects de la pathologie. Tout d’abord, nous avons étudié l’expression des gènes de la région 4q35 ainsi que de gènes impliqués dans la physiologie musculaire chez des fœtus et des adultes porteurs ou non d’une contraction du nombre de D4Z4 et avons ainsi pu mettre en évidence que les dérégulations géniques étaient déjà observable chez les fœtus, faisant de ceux-ci un modèle relevant d’étude de la pathogénèse précoce de la FSHD. Nous nous sommes ensuite intéressés à la régulation épigénétique de deux gènes situés au niveau du locus 4q35 et avons pu observer que des modifications épigénétiques globales pouvaient, ou non, moduler l’expression de ces gènes et ce dépendamment du nombre de répétitions du macrosatellite. Enfin, nous avons analysé la régulation de la région par l’effet de position télomérique et avons remarqué que seuls certains gènes de la région, distants, étaient régulés par ce mécanisme épigénétique. Ces résultats nous ont permis d’avancer un peu plus dans la connaissance de la dystrophie facio-scapulo-humérale et de valider un nouveau modèle d’étude de la pathologie. / Hird more frequently myopathy, the facioscapulohumeral dystrophy is an enigmatic disease. It is associated with the macrosatellite D4Z4 contraction since 90’s but the origin of the modifications observable in patients remains unclear. That’s why, we have focused our work in different aspects of this disease. First of all, we have studied expression of 4q35 and muscular genes in fetuses and adults carrying a contraction of the D4Z4 macrosatellite and shown that the molecular deregulations can be observed since the fetal stage. So, we have validated this model as an interesting model to study the early FSHD pathogenesis. Secondly, we have been interested in epigenetic regulation of two genes located in the 4q35 region and have observed a modulation of their expression in a global epigenetic modulation contest. Those deregulations depend on the number of D4Z4 repeats. Finally, we have analyzed the region regulation by telomere position effect and have noted only some genes are deregulated by this epigenetic mechanism. With those results, we have progressed in the FSHD pathogenesis knowledge and we have validated a new model to study this pathology.

Les ascidies présentent des propriétés remarquables au sein des métazoaires qui en font un modèle particulièrement intéressant pour étudier le fonctionnement et l’évolution des éléments cis-régulateurs dans un contexte développemental. Ciona intestinalis et Phallusia mammillata, deux espèces d’ascidies qui ont divergé il y a environ 300 millions d’années, combinent une grande conservation de leurs processus développementaux avec une grande divergence de leur séquence génomique. Pour comprendre comment « fabriquer » des embryons similaires avec des génomes divergents, nous avons identifié les éléments cis-régulateurs actifs au cours du développement de Ciona intestinalis et Phallusia mammillata en développant et en appliquant la méthode de ChIP-Seq sur des modifications d’histones sur des jeunes gastrulae. La définition puis la validation fonctionnelle de différentes catégories d'éléments cis-régulateurs nous a permis de révéler quelques propriétés de la cis-régulation au sein de génomes compacts et intensément remaniés. En sus, les données que nous avons produites constituent une resource fonctionnelle unique pour la caractérisation des éléments cis-régulateurs chez les ascidies et l'étude de leur évolution au sein des Chordés. / Ascidians display remarkable features within metazoans making them particularly suited for the study of function and evolution of cis-regulatory elements in the context of embryonic development. Ciona intestinalis and Phallusia mammillata, two ascidian species that diverged about 300M years ago, combine high conservation of their developmental processes with high divergence of their genome sequence. To understand how to “make” similar embryos with divergent genomes, we identified active cis-regulatory elements during Ciona intestinalis and Phallusia mammillata development by developing and applying the ChIP-Seq method on histone modifications in early-gastrula embryos. Definition then functional validation of different categories of cis-regulatory elements led us to reveal some features of cis-regulation within compact and highly dynamic genomes. Together, our data constitute a unique functional resource for characterizing cis-regulatory elements in ascidians and questioning their evolution within the Chordates.