Pseudomonas aeruginosa PA14 est une bactérie pathogène très résistante aux antibiotiques et impliquée dans de nombreuses infections nosocomiales. Toutefois, la disponibilité d'agents antibactériens efficaces contre cette bactérie manque cruellement à ce jour. Explorer la physiologie de P. aeruginosa au niveau des modifications post-traductionnelles (PTMs) pourrait fortement contribuer au développement de nouveaux agents thérapeutiques. En effet, il a été montré certaines corrélations entre les PTMs et la virulence, l’adaptation et la résistance bactérienne. De plus, les progrès récents en protéomique ont permis d’accéder à un nombre croissant des protéines modifiées. Pourtant, leur description reste un véritable challenge.Dans une première partie, nous avons étudié l'impact des kinases et des phosphatases sur la physiologie de P. aeruginosa PA14. Cependant, aucune différence de phénotype n'a été observée entre les 8 mutants de ces enzymes et la souche sauvage.Dans une deuxième partie, nous avons caractérisé le succinylome et l'acétylome de la lysine chez P. aeruginosa PA14 dans quatre sources de carbone (glucose, citrate, succinate et glutamate) par enrichissement par anticorps couplé à la spectrométrie de masse. Ainsi, 1 530 sites succinylés (617 protéines) et 1 109 sites acétylés (526 protéines) ont été identifiés. De façon intéressante, 622 sites (312 protéines) ont été observés acétylés ou succinylés sur la même lysine, révélant ainsi l'existence de protéoformes pour une même protéine. Les protéines modifiées sont impliquées dans tous les processus biologiques. Toutefois, certaines d'entre elles ont des fonctions dans la résistance aux antibiotiques, le chimiotactisme et la virulence.Nous avons également quantifié les peptides succinylés et/ou acétylés dans les 4 sources de carbone. Les peptides succinylés étaient principalement sur-exprimés en citrate, mais aucune différence significative n’a été observée pour les peptides acétylées.Dans une troisième partie, nous avons étudié par immunoprécipitation le succinylome et l’acétylome de la lysine des protéines extracellulaire de P. aeruginosa. Nous avons montré que certaines lysines des protéines LasB et CbpD, deux facteurs de virulence, sont modifiées par 9 PTMs différentes. Une approche d’électrophorèse bi-dimensionnelle (2D) a permis de révéler et de quantifier les protéoformes des protéines extracellulaires et plus spécifiquement de ces facteurs de virulence.Dans une quatrième partie, une approche quantitative « label-free » a permis de mettre en avant 581 protéines qui varient différemment selon la source de carbone. Parmi ces protéines, 67 biomarqueurs ont été identifiés par approche statistique.Ces travaux constituent un point de départ prometteur pour de futures études sur le rôle de la succinylation de la lysine et d'autres PTMs chez P. aeruginosa. / Pseudomonas aeruginosa PA14 is a multi-drug resistant human pathogen largely involved in nosocomial infections. Unfortunately, today, effective antibacterial agents lacked. Explore its physiology at the post-translational modification (PTMs) level may contribute to the renewal of combat tactics. Indeed, some correlations between PTMs and the bacterial virulence, adaptation and resistance have been shown. The recent improvements in proteomics have increased the number of modified proteins. However, their characterization believes a real challenge.In the first part, we focused on the impact of kinases and phosphatases on bacterial physiology of P. aeruginosa PA14. For this purpose, we compared different phenotypes of 8 mutants of kinase and phosphatase with the WT strain. Unfortunately, no difference was observed.In the second part, we characterized the lysine succinylome and acetylome in P. aeruginosa PA14 in 4 carbon sources (glucose, citrate, succinate and glutamate) by mass spectrometry. Overall, a total of 1 530 succinylated sites (617 proteins) and 1 109 acetylated sites (526 proteins) were identified. Interestingly, we noticed that 622 sites (312 proteins) can be either acetylated or succinylated on the same lysine. This reveals the existence of proteoforms for a same protein. As expected, many modified proteins are involved in a wide range of biological processes but some of these proteins have interesting functions like antibiotic resistance, chemotaxis and virulence.We also tried to quantify succinylated and/or acetylated peptides in the 4 carbon sources. Succinylated peptides were mainly over-represented in the citrate condition whereas no significant difference was observed for the acetylated forms.In the third part, we investigated the lysine succinylome and acetylome of P. aeruginosa in extracellular compartment by immunoprecipitation. We showed that some lysines of two virulence factors, LasB and CbpD, were modified by 9 different PTMs. We also used a 2-dimensional gel approach to reveal and quantify proteoforms of extracellular proteins and more specifically virulence factors. In the fourth part, we did a label-free quantitative approach to obtain protein abundance in each carbon source. In total, 581 proteins vary differently depending on the carbon source. Among these proteins, 67 biomarkers were identified by statistical approach.This work is a promising starting point for further investigations on the biological role of lysine succinylation, and others PTMs, in P. aeruginosa.

La thèse est intitulée « Modifications chimiques de polysaccharides pour l'obtention de nouveaux systèmes polymère-principe actif ». Le thème de la recherche porte sur trois axes principaux, dont l’objectif majeur est la synthèse et la caractérisation de nouveaux systèmes pour la libération contrôlée de principes actifs. Le premier chapitre traite de l’optimisation de la méthode pour préparer des émulsions stables simples inverses (eau/huile) et multiples (eau/huile/eau) à base de polysaccharides (amidon et 2-hydroxyethyle cellulose). On a étudié le processus de relargage de la caféine, l’influence de la présence d’amidon dans la phase aqueuse sur la stabilité et cinétique de libérations. Le second chapitre a pour objet l’obtention de nouveaux principes actifs à partir d’aminoacides et leur immobilisation sur polysaccharides par couplage chimique covalent. Les conjugues polymère-médicament obtenus ont été caractérisés par spectroscopie, physico-chimie. Leur activité antimicrobienne, leur toxicité in vivo, l’efficacité de l’immobilisation et la cinétique de relargage in vitro de médicaments couplés ont été étudiées. Le dernier chapitre traite de la synthèse des dérivés de chitosane avec l’anhydride maléique et l’acide acrylique, ainsi que leur utilisation dans la préparation d’hydrogels sous forme de films et de nanoparticules par copolymérisation avec le méthacrylate de 2-hydroxyethyle et l’acrylamide de N- isopropyl. Les dérivés ont été évalués par leur degré de fonctionnalisation. Les nanosystèmes ont été caractérisés par leur potentiel zêta, leur capacité de gonflement, d’adhésion et de relargage in vitro. Tous les résultats expérimentaux ont été soutenus par importantes études bibliographiques / The thesis is entitled “Chemical modifications of polysaccharides for the obtaining of new drug-polymer systems“. The topic of research includes four main working axes, diverted from the major objective to synthesize and characterize new drug delivery systems. The first chapter treats the optimization of the preparation method of stable simple W/O emulsions and multiple W/O/W emulsions, based on polysaccharides (starch and 2-hydroxyethyle cellulose). We also studied the process of caffeine release outside the multiple emulsions particles and the influence of starch in the internal aqueous phase stage upon the stability and the drug release kinetics. The second chapter studies the obtaining of new active principles from aminoacid and their immobilization on polysaccharides by covalent coupling. The new drug-polymer conjugates were characterized by spectral, physicochemical properties, antimicrobial activity, in vivo toxicity, immobilization efficiency and I vitro drug release kinetics. The last chapter treats the synthesis of the chitosan derivatives with maleic anhydride or acrylic acid, and their use in the preparation of hydrogels as film and nanoparticles by copolymerization with 2-hydroxymethacrilate or N-isopropyl acrylamide. The derivatives were evaluated by determining the degree of functionalization and by spectral methods. The nanosystems were characterized by measurements of zeta potential, swelling and adhesion capacity and membership and in vitro drug release kinetics. All experimental results were supported by important bibliographic studies

Le marché de la cosmétique est l’un des marché les plus porteur actuellement dans le monde. La population française utilise énormément ces produits pour son hygiène quotidienne. Ce sont les shampoings ou autre crème de soins. Pour protéger ces produits, depuis maintenant de nombreuses années, les fabricants ajoutent des agents conservateurs pour augmenter la durée de conservation, ou encore éviter certaines contaminations microbiennes après les contacts avec la peau. Ces dernières années ont également vu les mentalités des consommateurs évoluer et actuellement, ces derniers souhaiteraient des produits cosmétiques le plus naturel possible, sans ajouts de conservateurs. Dans ce contexte, il semble intéressant de travailler sur la protection de ces produits par d’autres moyens. En premier lieu, nous vient immédiatement à l’esprit, la protection par l’emballage. L’idée est de modifier les emballages actuels pour leur conférer des activités antimicrobiennes et ainsi les rendre protecteurs. L’étude présentée s’intéresse à certaines possibilités de mises en oeuvre et modifications de polymères pour apporter une activité antimicrobienne. Deux voies de fabrications ont été étudiées dans cette thèse. Une première a consisté en la réalisation de revêtements antimicrobiens et protecteurs à basse température. Cette technique a montré la possibilité de créer des couches antimicrobiennes par photo-polymérisation à partir de monomères méthacrylates renfermant les agents antimicrobiens. C’est cette couche finale qui va venir s’ajouter à certaines zones spécifiques des emballages finaux pour assurer la protection antimicrobienne du contenu.La seconde voie d’action a étudié une fabrication plus industrielle à haute température. Cette technologie a permis de créer par extrusion des granulés antimicrobiens avec des introductions d’actifs de différentes natures. Ceux sont ces granulés qui sont par la suite injectés sous la forme d’emballages. Pour cette voie d’action, l’idée n’est plus de protéger l’emballage via une couche antimicrobienne, mais de substituer certaines pièces de l’emballage constituées de polymères naturellement antimicrobiens. Ces travaux ont permis la réalisation d’une large gamme de matériaux antimicrobiens. Les différentes solutions étudiées ont également permis de réaliser des prototypes d’emballages, ceci en collaboration avec certaines entreprises partenaires du projet. Tous ces prototypes seront prochainement testés en conditions réelles d’utilisations, c’est-à-dire par des essais de mises en contact avec le consommateur d’un système complet, à savoir le produit cosmétique conditionné dans des emballages protecteurs. Ces tests devront permettre de vérifier si les solutions proposées pourraient aboutir à une adaptation sur une chaine industrielle pour une utilisation à grande échelle / Today the cosmetic market is one of the most popular in the world. French people use many these products everyday as for examples, creams or shampoos. In order to protect the cosmetic products, the manufacturers introduced during these last year additives or conservative agents in cosmetic products to increase the shelf life or avoid a microbial contamination after a direct contact with the skin of consumers. However, recent years have also revealed that the consumer mindsets evolve and now, they would like cosmetics more natural, without addition of additives. In this context, it was interesting to work on the cosmetics protection by other ways. Firstly, we think immediately to the protection by use of packaging. The objective is to modify the current packaging to bring an antimicrobial activity and protect the cosmetics. This work presents different technologies of fabrication and modification of polymers to get an antimicrobial activity. For this, two techniques were studied. A first technology has consisted to develop antimicrobial coating at low temperature. This way has demonstrated possibilities of creation by photo-polymerization under UV radiations. Initially, the antimicrobial agents were introduced in liquid monomers before the polymerization and the fabrication of polymer networks. The final coatings were finally destiny to be added on specific areas of packaging, generally in contact with the consumers and prevent all risks of microbial contaminations from the products. The second technology has studied a way of polymer fabrication more industrial at high temperature. The technique has consisted to create antimicrobial pellets by extrusion with introductions of different natures of additives. The obtain pellets were injected at the end to fabricate certain pieces of the final packaging. This work has allowed the realization of a large range of antimicrobial materials. All the studied solutions have been used to fabricate prototype packaging in collaboration with partner companies of the project. All these prototypes will be tested by antimicrobial tests in real conditions of uses. If these tests prove successful, it will be possible to envisage an industrialization step

Cette thèse se place dans le cadre de l'étude in silico, c'est-à-dire assistée par ordinateur, des liens qui unissent la séquence d'une protéine à la (ou aux) structure(s) tri-dimensionnelle(s) qu'elle adopte. Le décryptage de ces liens présente de nombreuses applications dans divers domaines et constitue sans doute l'une des problématiques les plus fascinantes de la recherche en biologie moléculaire. Le premier aspect de notre travail concerne le développement de potentiels statistiques dérivés de bases de données de protéines dont les structures sont connues. Ces potentiels présentent plusieurs avantages: ils peuvent être aisément adaptés à des représentations structurales simplifiées, et permettent de définir un nombre limité de fonctions énergétiques qui incarnent l'ensemble complexe d'interactions gouvernant la structure et la stabilité des protéines, et qui incluent également certaines contributions entropiques. Cependant, leur signification physique reste assez nébuleuse, car l'impact des diverses hypothèses nécessaires à leur dérivation est loin d'être clairement établi. Nous nous sommes attachés à l'étude de certaines limitations des ces potentiels: leur dépendance en la taille des protéines incluses dans la base de données, la non-additivité des termes de potentiels, et l'importance souvent négligée de l'environnement protéique spécifique ressenti par chaque résidu. Nous avons ainsi mis en évidence que l'influence de la taille des protéines de la base de données sur les potentiels de distance entre résidus est spécifique à chaque paire d'acides aminés, peut être relativement importante, et résulte essentiellement de la répartition inhomogène des résidus hydrophobes et hydrophiles entre le coeur et la surface des protéines. Ces résultats ont guidé la mise au point de fonctions correctives qui permettent de tenir compte de cette influence lors de la dérivation des potentiels. Par ailleurs, la définition d'une procédure générale de dérivation de potentiels et de termes de couplage a rendu possible la création d'une fonction énergétique qui tient compte simultanément de plusieurs descripteurs de séquence et de structure (la nature des résidus, leurs conformations, leurs accessibilités au solvant, ainsi que les distances qui les séparent dans l'espace et le long de la séquence). Cette fonction énergétique présente des performances nettement améliorées par rapport aux potentiels originaux, et par rapport à d'autres potentiels décrits dans la littérature. Le deuxième aspect de notre travail concerne l'application de programmes basés sur des potentiels statistiques à l'étude de protéines qui adoptent des structures alternatives. La permutation de domaines est un phénomène qui affecte diverses protéines et qui implique la génération d'un oligomère suite à l'échange de fragments structuraux entre monomères identiques. Nos résultats suggèrent que la présence de "faiblesses structurales", c'est-à-dire de régions qui ne sont pas optimales vis-à-vis de la stabilité de la structure native ou qui présentent une préférence marquée pour une conformation non-native en absence d'interactions tertiaires, est intimement liée aux mécanismes de permutation. Nous avons également mis en évidence l'importance des interactions de type cation-{pi}, qui sont fréquemment observées dans certaines zones clés de la permutation. Finalement, nous avons sélectionné un ensemble de mutations susceptibles de modifier sensiblement la propension de diverses protéines à permuter. L'étude expérimentale de ces mutations devrait permettre de valider, ou de raffiner, les hypothèses que nous avons proposées quant au rôle joué par les faiblesses structurales et les interactions de type cation-{pi}. Nous avons également analysé une autre protéine soumise à d'importants réarrangements conformationnels: l'{alpha}1-antitrypsine. Dans le cas de cette protéine, les modifications structurales sont indispensables à l'exécution de l'activité biologique normale, mais peuvent sous certaines conditions mener à la formation de polymères insolubles et au développement de maladies. Afin de contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la polymérisation, nous avons cherché à concevoir rationnellement des protéines mutantes qui présentent une propension à polymériser contrôlée. Des tests expérimentaux ont été réalisés par le groupe australien du Professeur S.P. Bottomley, et ont permis de valider nos prédictions de manière assez remarquable. ---------------------------------------------------------------------------------------------------- The work presented in this thesis concerns the computational study of the relationships between the sequence of a protein and its three-dimensional structure(s). The unravelling of these relationships has many applications in different domains and is probably one of the most fascinating issues in molecular biology. The first part of our work is devoted to the development of statistical potentials derived from databases of known protein structures. These potentials allow to define a limited number of energetic functions embodying the complex ensemble of interactions that rule protein folding and stability (including some entropic contributions), and can be easily adapted to simplified representations of protein structures. However, their physical meaning remains unclear since several hypotheses and approximations are necessary, whose impact is far from clearly understood. We studied some of the limitations of these potentials: their dependence on the size of the proteins included in the database, the non-additivity of the different potential terms, and the importance of the specific environment of each residue. Our results show that residue-based distance potentials are affected by the size of the database proteins, and that this effect can be quite strong, is residue-specific, and seems to result mostly from the inhomogeneous partition of hydrophobic and hydrophilic residues between the surface and the core of proteins. On the basis of these observations, we defined a set of corrective functions in order to take protein size into account while deriving the potentials. On the other hand, we developed a general procedure of derivation of potentials and coupling terms and consequently created an energetic function describing the correlations between several sequence and structure descriptors (the nature of each residue, the conformation of its main chain, its solvent accessibility, and the distances that separate it from other residues, in space and along the sequence). This energetic function presents a strongly improved predictive power, in comparison with the original potentials and with other potentials described in the literature. The second part describes the application of different programs, based on statistical potentials, to the study of proteins that adopt alternative structures. Domain swapping involves the exchange of a structural element between identical proteins, and leads to the generation of an oligomeric unit. We showed that the presence of “structural weaknesses”, regions that are not optimal with respect to the folding mechanisms or to the stability of the native structure, seems to be intimately linked with the swapping mechanisms. In addition, cation-{pi} interactions were frequently detected in some key locations and might also play an important role. Finally, we designed a set of mutations that are likely to affect the swapping propensities of different proteins. The experimental study of these mutations should allow to validate, or refine, our hypotheses concerning the importance of structural weaknesses and cation-{pi} interactions. We also analysed another protein that undergoes large conformational changes: {alpha}1-antitrypsin. In this case, the structural modifications are necessary to the proper execution of the biological activity. However, under certain circumstances, they lead to the formation of insoluble polymers and the development of diseases. With the aim of reaching a better understanding of the mechanisms that are responsible for this polymerisation, we tried to design mutant proteins that display a controlled polymerisation propensity. An experimental study of these mutants was conducted by the group of Prof. S.P. Bottomley, and remarkably confirmed our predictions.

La rapamycine est un immunosuppresseur utilisé pour traiter plusieurs types de maladies dont le cancer du rein. Son fonctionnement par l’inhibition de la voie de Tor mène à des changements dans des processus physiologiques, incluant le cycle cellulaire. Chez Saccharomyces cerevisiae, la rapamycine conduit à une altération rapide et globale de l’expression génique, déclenchant un remodelage de la chromatine. Nous proposons que les modifications des histones peuvent jouer un rôle crucial dans le remodelage de la chromatine en réponse à la rapamycine. Notre objectif principal est d’identifier d’une banque de mutants d’histone les variantes qui vont échouer à répondre à la rapamycine dans une tentative de réaliser une caractérisation des modifications d’histone critiques pour la réponse à cette drogue. Ainsi, nous avons réalisé un criblage d’une banque de mutants d’histone et identifié plusieurs mutants d‘histone dont la résistance à la rapamycine a été altérée. Nous avons caractérisé une de ces variantes d’histone, à savoir H2B, qui porte une substitution de l’alanine en arginine en position 95 (H2B-R95A) et démontré que ce mutant est extrêmement résistant à la rapamycine, et non à d’autres drogues. Des immunoprécipitations ont démontré que H2B-R95A est défectueux pour former un complexe avec Spt16, un facteur essentiel pour la dissociation de H2A et H2B de la chromatine, permetant la réplication et la transcription par les ADN et ARN polymérases, respectivement. Des expériences de ChIP-Chip et de micropuce ont démontré que l’arginine 95 de H2B est requise pour recruter Spt16 afin de permettre l’expression d’une multitude de gènes, dont certains font partie de la voie des phéromones. Des évidences seront présentées pour la première fois démontrant que la rapamycine peut activer la voie des phéromones et qu’une défectuosité dans cette voie cause la résistante à cette drogue. / Rapamycin is an immunosuppressant used for treating many types of diseases such as kidney carcinomas. It works by inhibiting the Tor signaling pathway leading to changes in physiological processes, including cell cycle arrest. In Saccharomyces cerevisiae, rapamycin leads to a rapid and global alteration in gene expression, prompting chromatin remodeling. We propose that histone modification(s) might play a crucial role in remodeling of the chromatin in response to rapamycin. Our main objective is to identify from a histone mutant collection variants that fail to respond to rapamycin in an attempt to characterize histone modifications critical for this drug response. As such, we conducted a screen of the histone mutant collection and identified several hits that showed resistance to rapamycin. We characterized one of the histone variants, namely H2B, carrying alanine substitution at arginine 95 (H2B-R95A) and show that it is extremely resistant to rapamycin, but not to other drugs. Pull downs demonstrated that H2B-R95A was defective in forming a complex with Spt16, an essential factor that is required to disassociate H2A and H2B from the chromatin in order to allow replication and transcription by DNA and RNA polymerases, respectively. ChIP-Chip and microarray experiments showed that arginine 95 of H2B is required to recruit Spt16 to allow expression of several genes, a subset of which are involved in the pheromone signaling pathway. Evidence will be presented to show for the first time that rapamycin can activate the pheromone pathway and that defects in this pathway cause resistance to the drug.

Les positions des évènements de recombinaison s’agrègent ensemble, formant des hotspots déterminés en partie par la protéine à évolution rapide PRDM9. En particulier, ces positions de hotspots sont déterminées par le domaine de doigts de zinc (ZnF) de PRDM9 qui reconnait certains motifs d’ADN. Les allèles de PRDM9 contenant le ZnF de type k ont été préalablement associés avec une cohorte de patients affectés par la leucémie aigüe lymphoblastique. Les allèles de PRDM9 sont difficiles à identifier à partir de données de séquençage de nouvelle génération (NGS), en raison de leur nature répétitive. Dans ce projet, nous proposons une méthode permettant la caractérisation d’allèles de PRDM9 à partir de données de NGS, qui identifie le nombre d’allèles contenant un type spécifique de ZnF. Cette méthode est basée sur la corrélation entre les profils représentant le nombre de séquences nucléotidiques uniques à chaque ZnF retrouvés chez les lectures de NGS simulées sans erreur d’une paire d’allèles et chez les lectures d’un échantillon. La validité des prédictions obtenues par notre méthode est confirmée grâce à analyse basée sur les simulations. Nous confirmons également que la méthode peut correctement identifier le génotype d’allèles de PRDM9 qui n’ont pas encore été identifiés. Nous conduisons une analyse préliminaire identifiant le génotype des allèles de PRDM9 contenant un certain type de ZnF dans une cohorte de patients atteints de glioblastomes multiforme pédiatrique, un cancer du cerveau caractérisé par les mutations récurrentes dans le gène codant pour l’histone H3, la cible de l’activité épigénétique de PRDM9. Cette méthode ouvre la possibilité d’identifier des associations entre certains allèles de PRDM9 et d’autres types de cancers pédiatriques, via l’utilisation de bases de données de NGS de cellules tumorales. / The positions of recombination events cluster tightly together in recombination hotspots, which are determined in part by the rapidly evolving protein PRDM9 via its tri- methyltransferase activity. The locations of hotspots are determined by the repetitive ZnF array of PRDM9, which binds to DNA. Alleles of PRDM9 containing the k-ZnF have previously been associated with patients affected with childhood acute lymphoblastic leukaemia. PRDM9 alleles are notoriously difficult to type due to the repetitive nature of the ZnF arrays. Here, we propose a method to characterize the alleles of PRDM9 from next- generation sequencing samples, by identifying the number of alleles containing a specific ZnF type. Our method is based on the correlation between profiles from the sample, representing the counts of nucleotide sequences unique to each ZnF, and from ideal sets of short reads representing an allele pair. We conduct a simulation analysis to examine the validity of the predictions obtained by our method with all pairs of known alleles. We confirm that the method can accurately genotype previously unobserved PRDM9 alleles. We also conducted a preliminary analysis to identify the PRDM9 k-ZnF genotype in a cohort of paediatric glioblastoma (pGBM), a childhood cancer characterized by the recurrent mutations in the coding sequence of the histone H3, the target of the enzymatic activity of PRDM9. Although no associations of k-ZnF containing PRDM9 alleles is found in our pGBM cohort, this method opens the possibility of identifying associations between certain PRDM9 alleles with other types of early onset childhood cancers, through a data-mining effort in public cancer databases.

Mettre à jour des applications durant leur exécution est utilisé aussi bien en production pour réduire les temps d’arrêt des applications que dans des environnements de développement interactifs (IDE pour live programming). Toutefois, ces deux scénarios présentent des défis différents qui font que les solutions de mise à jour dynamique (DSU pour Dynamic Software Updating) existantes sont souvent spécifiques à l’un des deux. Par exemple, les DSUs pour la programmation interactives ne supportent généralement pas la détection automatique de points sûrs de mise à jour ni la migration d’instances, alors que les DSUs pour la production nécessitent une génération manuelle de l’ensemble des modifications et manquent d’intégration avec l’IDE. Les solutions existantes ont également une capacité limitées à se mettre à jour elles-mêmes ou à mettre à jour les bibliothèques de base du langage ; et certaines d’entre elles introduisent mêmle une dégradation des performances d’exécution en dehors du processus de mise à jour.Dans cette thèse, nous proposons un DSU (nommé gDSU) unifié qui fonctionne à la fois pour la programmation interactive et les environnements de production. gDSU permet la détection automatique des points sûrs de mise à jour en analysant et manipulant la pile d’exécution, et offre un mécanisme réutilisable de migration d’instances afin de minimiser les interventions manuelles lors de l’application d’une migration. gDSU supporte également la mise à jour des bibliothèques du noyau du langage et du mécanisme de mise à jour lui-même. Ceci est réalisé par une copie incrémentale des objets à modifier et une application atomique de ces modifications.gDSU n’affecte pas les performances globales de l’application et ne présente qu’une pénalité d’exécution lors processus de mise à jour. Par exemple, gDSU est capable d’appliquer une mise à jour sur 100 000 instances en 1 seconde. Durant cette seconde, l’application ne répond pas pendant 250 milli-secondes seulement. Le reste du temps, l’application s’exécute normalement pendant que gDSU recherche un point sûr de mise à jour qui consiste alors uniquement à copier les éléments modifiés.Nous présentons également deux extensions de gDSU permettant un meilleur support du développement interactif dans les IDEs : la programmation interactive transactionnelle et l’application atomique de reusinages (refactorings). / Updating applications during their execution is used both in production to minimize application downtine and in integrated development environments to provide live programming support. Nevertheless, these two scenarios present different challenges making Dynamic Software Update (DSU) solutions to be specifically designed for only one of these use cases. For example, DSUs for live programming typically do not implement safe point detection or insistance migration, while production DSUs require manual generation of patches and lack IDE integration. These sollutions also have a limited ability to update themselves or the language core libraries and some of them present execution penalties outside the update window.In this PhD, we propose a unified DSU named gDSU for both live programming and production environments. gDSU provides safe update point detection using call stack manipulation and a reusable instance migration mechanism to minimize manual intervention in patch generation. It also supports updating the core language libraries as well as the update mechanism itself thanks to its incremental copy of the modified objects and its atomic commit operation.gDSU does not affect the global performance of the application and it presents only a run-time penalty during the window. For example, gDSU is able to apply an update impacting 100,000 instances in 1 second making the application not responsive for only 250 milliseconds. The rest of the time the applications runs normally while gDSU is looking for a safe update point during which modified elements will be copied.We also present extensions of gDSU to support transactional live programming and atomic automactic refactorings which increase the usability of live programming environments.

La galactosémie congénitale est une maladie métabolique affectant la voie du galactose. En effet, l'enzyme responsable de la transformation du galactose-1-phosphate en glucose-1-phosphate, la galactose-1-phosphate uridyltransférase, est déficiente et rend donc l'utilisation du galactose par l'organisme quasiment impossible. Ceci entraîne une accumulation de galactose ainsi que ses produits dérivés, le galactose-1-phosphate et le galactitol. Ainsi, notre hypothèse de travail est que les métabolites impliqués dans cette pathologie provoquent des modifications post-traductionnelles des protéines induisant ainsi leur vieillissement prématuré. Nous avons donc étudié l'impact de la « galactation » sur la structure du collagène de type I et montré que ces modifications structurales sont beaucoup plus importantes avec le galactose qu'avec le glucose à la même concentration, aussi bien sur la structure primaire que fibrillaire. Au contact du collagène « galacté », les fonctions des cellules inflammatoires sont modifiées. La technique de spectroscopie infrarouge a été utilisée pour caractériser les métabolites impliqués dans la galactosémie ainsi que les collagènes modifiés. Dans un but de dépistage, une étude en spectroscopie infrarouge de plasmas galactosémiques nous a permis de mettre en évidence le potentiel de cette technique, du fait de sa bonne sensibilité et de son faible coût de revient. En conclusion, les modifications post-traductionnelles des protéines semblent très fortement impliquées dans la physiopathologie de la galactosémie congénitale. / The congenital galactosemia is a metabolic disease involved in the galactose pathway. Indeed, the enzyme responsible of the galactose-1-phosphate transformation in glucose-1-phosphate, the galactose-1-phosphate uridyltransferase, is deficient and then leads to a use of galactose almost impossible. This leads to an accumulation of galactose and its derived products, the galactose-1-phosphate and the galactitol. Thus, our work hypothesis is that metabolites involved in this disease cause post-translational modifications of proteins inducing their premature aging. We then studied the impact of the « galactation » on the type I collagen and showed that the structural modifications are more important with galactose than with glucose at the same concentration, on both the primary and the fibrillar structure. On contact with « galacted » collagen, the inflammatory cells functions are also modified. The infrared spectroscopy technique has been used to characterize the metabolites involved in the galactosemia, just as the modified collagens. With the aim of screening, an infrared spectroscopy study of galactosemic plasmas allowed us to highlight the potential of this technique, with its good sensibility and its low cost price. To conclude, the post-translational modifications of proteins seem strongly involved in the physiopathology of the congenital galactosemia.

Thesis (M.G.S.)--Miami University, Dept. of Sociology and Gerontology, 2008. / Title from first page of PDF document. Includes bibliographical references (p. 39-40).

Le principal intérêt de nos études présentées dans ce manuscrit, correspond à la compréhension des évènements, reliés aux acylations d’histones au niveau des lysines (Ks) dans les cellules germinales post méiotiques, qui régulent spécifiquement l’expression des gènes à l’échelle du génome entier.Dans la première partie de mon travail, nous avons élaboré une stratégie afin d’analyser le rôle des « histones acetyl transférases » (HATs), Cbp et p300, dans les cellules germinales post méiotiques. Pour ce faire, nous avons généré une lignée de souris conditionnellement et partiellement invalidée pour les gènes Cbp et p300 dans les cellules post méiotiques. Bien que les souris mâles sont fertiles et que la spermatogénèse semble se dérouler normalement, une analyse transcriptomique des cellules germinales haploïdes post méiotiques précoces et tardives nous a permis d’identifier une série de gènes dont l’expression est augmentée dans les cellules spermatogéniques tardives et qui sont sensibles à la diminution des niveaux de Cbp et p300. Ces résultats ont permis de révéler un programme spécifique d’expression de gènes dans les cellules germinales post méiotiques dépendant des HATs correspondantes.Prenant en compte qu’il existe une variété d’acylations des histones au niveau des lysines, nous avons étendu nos études à une modification à « quatre-carbone », la butyrylation. Nous avons alors initié une analyse comparative de l’acétylation et de la butyrylation de l’histone H₄ en positions K5 et K8 dans les cellules germinales mâles en différentiation. Nous avons cartographié à l’échelle du génome les marques H4K5ac, H4K5bu, H4K8ac, et H4K8bu au niveau de deux étapes développementales critiques avec les cellules méiotiques et les cellules post méiotiques haploïdes. Cette cartographie montre que la majorité des gènes exprimés fortement, à la fois dans les cellules méiotiques et les spermatides précoces rondes haploïdes, qu’au niveau des sites d’initiation de la transcription (TSSs) l’acétylation et la butyrylation sont interchangeables. De façon intéressante, beaucoup de ces promoteurs correspondants sont aussi reconnus par un régulateur essentiel de l’expression des gènes lors de la spermatogénèse, le factor à bromodomaine, Brdt. Une étude détaillée, des capacités de liaison du facteur Brdt sur les parties N-terminales de l’histone H4 portant des combinaisons variées d’acétylation et/ou de butyrylation en position K5 et K8, montre que la marque H4K5bu inhibe fortement la liaison du facteur Brdt. Nos résultats suggèrent qu’en addition à la fonction activatrice de Brdt vis-à-vis du programme d’expression de gènes méiotiques et post méiotiques, l’échange (« turnover ») induit par la butyrylation d’H4K5 est également important. Ce travail montre comment une interconnexion entre deux différentes acylations d’une même lysine peut jouer un rôle régulateur essentiel en augmentant la dynamique de liaison de la chromatine par un lecteur de lysine acétylé, Brdt.Enfin, au cours d’un travail collaboratif portant sur des approches structurales, nous avons montré, malgré le fait que p300 soit répertoriée comme une acétylase robuste, que son activité est réduite lorsque la longueur des chaines acyl augmente. Ces résultats suggèrent qu’in vivo, p300 puisse utiliser un co-facteur spécifique pour assurer des acylations d’histones autre qu’une acétylation.Ces investigations mettent en lumière comment la programmation du génome mâle est guidée par diverses acylations d’histone et révèlent pour la première fois l’existence d’un réseau moléculaire qui régule ces acylations et transmet un impact fonctionnel. / The main focus of the investigations reported in this manuscript is the understanding of the regulatory events that are based on histone lysine modifications in post-meiotic male germ cells, where specific and chromosome-wide regulations of gene expression occur. In the first part of my work we designed a strategy to specifically investigate the role of the histone acetyl-transferases (HATs), Cbp and p300, in post-meiotic male germ cells.Accordingly, we generated double Cbp and p300 conditional knock-out mice resulting in a partial depletion of Cbp and p300 in post-meiotic cells. Although the mice were fertile and spermatogenesis seemed to take place normally, a transcriptomic analysis of early and late post-meiotic germ cells led to the identification of a specific subset of genes with an increased expression in late spermatogenic cells that is highly sensitive to the decreased amounts of Cbp and p300. In conclusion, these results have revealed an interesting new gene expression program specific to post-meiotic male germ cells that are specifically regulated by the considered HATs.Taking into account the occurrence of a variety of histone lysine acylations, we extended these investigations to a four-carbon histone lysine modification, butyrylation. Accordingly, we have undertaken a comprehensive comparative analysis of histone H4 acetylation and butyrylation on its K5 and K8 positions in differentiating male germ cells. Genome-wide mapping of H4K5ac, H4K5bu, H4K8ac and H4K8bu at two critical developmental stages, meiotic and post-meiotic haploid cells, shows an interchangeable use of acetylation and butyrylation in the Transcriptional Start Sites (TSSs) of the most highly expressed genes in both meiotic and haploid round spermatids. Interestingly, many of these promoters are also bound by the essential regulator of spermatogenic gene expression, the BET bromodomain-containing factor, Brdt. A detailed analysis of Brdt binding capacity of H4 tails bearing various combinations of K5 and K8 acetylation and butyrylation showed that H4K5 butyrylation severely interferes with Brdt-binding. Our results therefore indicate that not only Brdt is required for the activation of a meiotic and post-meiotic gene expression program, but also its turnover induced by H4K5 butyrylation is equally important. This work hence highlights how an interplay between two different acylations occurring on the same lysines can play an essential regulatory role by increasing the chromatin binding dynamics of a critical lysine acetyl-reader, Brdt.Finally, in a collaborative work with structural biologists we showed that while p300 is a robust acetylase, its activity gets weaker with increasing acyl chain length. These results suggest that in vivo, p300 would use a specific co-factor to ensure non-acetyl histone acylations.Overall, these investigations shed an important light on how the male genome programming is guided by histone acylations and revealed for the first time a molecular network that regulates histone acylations and mediates its functional impact.