Ce travail porte sur l'étude de la fidélité de la traduction chez les eucaryotes d'un point de vue mécanistique et génomique. Au cours de ma thèse j'ai développé trois approches :Le premier projet porte sur l'étude du rôle du facteur de l'élongation eEF2 dans le maintien du cadre de lecture. La stratégie associe une mutagénèse aléatoire du gène EFT2 à un criblage phénotypique, elle permet d'isoler des mutants capables d'augmenter ou diminuer l'efficacité de recodage d'une séquence de décalage du cadre de lecture en -1.Le second projet décrit la mise au point d'un système de traduction en molécule unique qui permet d'étudier le ribosome eucaryote. La traduction est initiée grâce à l'IRES CrPV qui a pour caractéristique d'être totalement indépendante des facteurs d'initiation et de l'ARNt initiateur. L'élongation de la traduction est détectée grâce au départ d'un oligonucléotide fluorescent qui est décroché par l'activité hélicase du ribosome. Les résultats de ces expériences constituent une preuve de principe démontrant que l'étude de la traduction eucaryote en molécule unique est possible.Le troisième projet est une étude de génomique comparative qui permet de rechercher des événements de recodage ainsi que d'autres événements non-conventionnels de la traduction dans le génome de la levure Saccharomyces cerevisiae. L'approche est basée sur une recherche d'organisations génomiques conservées au sein de 19 génomes de levures. Les gènes candidats sont testés in vivo grâce à un vecteur double rapporteur. Cette étude a permis de mettre en évidence le gène VOA1 qui a été ensuite caractérisé plus en détails.

Avec l'avènement de la microélectronique et des techniques de miniaturisation, de nouveaux domaines transdisciplinaires sont nés au confluent des sciences de l'ingénieur, de la matière et du vivant. La technologie a désormais investi l'échelle du nanomètre ; elle parvient à sonder, mais aussi surtout à façonner les constituants élémentaires de la matière synthétique et organique, depuis les atomes jusqu'aux complexes macromoléculaires. La nécessité d'isoler des molécules et des assemblages supramoléculaires est motivée par leur découplage du milieu environnant avec lequel ils interagissent. Des stratégies de compartimentation se sont devéloppées pour répondre aux besoins grandissants d'isolement de ces entités, en particulier à travers deux approches classiques en nanotechnologie : top-down et bottom-up. L'approche top-down consiste à "sculpter" la matière pour lui conférer des dimensions compatibles avec les objets à confiner. La lithographie et les techniques de microfabrication en général rentrent typiquement dans cette catégorie. Des stratégies microfluidiques destinées à manipuler spécifiquement des assemblages supramoléculaires ont été ainsi développées soit en vu d'applications pour la microanalyse totale, soit pour des études biophysiques fondamentales. Dans l'approche bottom-up, des molécules de natures différentes sont agencées pour former l'entité qui va confiner les objets d'intérêt. La chimie et le vivant procèdent par cette approche pour synthétiser des assemblages supramoléculaires et des organismes. Dans cette optique, la compaction de polyélectrolytes par des agents lipidiques en particules nanométriques a été étudiée. Cette stratégie permet en particulier de transférer des gènes au sein des cellules. Enfin, toujours dans le cadre d'une approche bottom-up de la compartimentation, nous présentons une méthodologie résolument bio-inspirée qui exploite les propriétés naturelles d'auto-assemblage des virus. Cette autre statégie ouvre la voie à l'encapsulation d'une large variété de molécules et de nano-objets. Elle tire avantage de l'extraordinaire précision moléculaire de l'assemblage d'un virus et vise à tirer profit de ses propriétés circulatoires dans l'organisme. C'est dans cet esprit que se clôt ce mémoire avec une présentation succinte des perspectives à long terme orientées autour de l'assemblage de systèmes viro-inspirés. Les objectifs seront d'élucider les mécanismes moléculaires sur des systèmes de complexité croissante, et en parallèle de maîtriser ces mécanismes via le développement de méthodologies d'auto-assemblage dirigé.

L'ARN s'est longtemps vu attribuer un simple role de transmission entre l'ADN, garant de l'information genetique, et les proteines, assurant les fonctions et donc la survie cellulaire. Ce n'est qu'avec les decouvertes des ARNs de transfert dans les annees 70, puis des ribozymes dans les annees 80, qu'il a ete realise que l'ARN pouvait assurer ces deux roles : l'information genetique est stockee dans sa sequence lineaire, et l'adoption de structures tridimensionnelles complexes rend possible une activite catalytique. Depuis, de nouvelles fonctions de l'ARN n'ont cesse d'etre decouvertes, a tous les niveaux de regulation de l'expression genique entre autres. La majorite de ces fonctions repose sur la structuration tridimensionnelle d'ARNs simple brin.Dans ce travail, differents aspects de la structuration de l'ARN sont abordes, toujours en utilisant la technique de mesure de forces sur molecules uniques par piegeage optique. Dans un premier temps, une etude comparative d'une structure secondaire modele, le hairpin dans ses formes ARN et ADN, a ete realisee. La question de l'interaction d'une structure secondaire avec une proteine helicase (DbpA) a ensuite ete abordee. Enfin, dans le cadre plus general d'une etude sur l'assemblage du ribosome, nous avons debute le developpement d'une nouvelle methode d'analyse des structures secondaires. Cette methode repose sur le suretirement d'un hybride ARN ribosomique / ADN. / Traditionally, RNA has been considered as a mere intermediate between DNA, keeper of the genetic information, and proteins, which assume cells self-sustenance. With the discoveries of the transfert RNA in the 70s, and of the ribozymes in the 80s, RNA took on both roles: it can store information in its linear sequence, and tridimensional structuration enables catalytic functions. Since then, numerous roles devoted to RNA have been discovered, particularly for gene expression regulation. Most of these functions rely on tridimensional structuration of single stranded RNA. In this work, we used an optical tweezers setup to study several aspects of RNA structuration by single molecule force measurement. In a first part, we compared the dynamic behaviour of a model secondary structure made of either RNA or DNA, the hairpin. Then we considered the interaction of a secondary structure with a protein, the RNA helicase DbpA. Finally, within a wider study of ribosome assembly, we worked on the development of a new method to study tridimensional structuration. This method relies on the overstretching of a hybrid ribosomal RNA / DNA molecule.

La protéine SRSF1, aussi appelée ASF/SF2, fait partie de la famille des protéines SR, une famille de protéines liant l’ARN très conservées. Ces protéines jouent un rôle régulateur de l’épissage, également lors de l’épissage alternatif. Une centaine d’ARN cible ont été décrits pour SRSF1 mais la manière dont SRSF1 sélectionne ses cibles parmi tous les pré-ARNm est mal comprise. Des études in vitro et in vivo ont montré que les protéines SR reconnaissent un petit motif dégénéré qui est souvent présent en plusieurs copies dans les ESE («enhancer splicing element »). Bien que les protéines SR lient ces motifs avec une faible spécificité, la définition des exons se fait avec une grande fidélité. Afin de mieux comprendre le mécanisme d’action de SRSF1, j’ai réalisé une étude cinétique des interactions SRSF1-ARN dans les cellules vivantes par des techniques de microscopies avancées. Grâce au système CRISPR, j’ai pu étiqueter la protéine SRSF1 avec la protéine Halo puis j’ai combiné une technique de photo-blanchiment (FRAP) et une technique de suivi de particule unique (« single particle tracking, SPT) pour mesurer la diffusion de SRSF1 et son affinité pour l’ARN. J’ai mesuré la durée de vie des événements de liaison individuellement aussi bien sur le pool global de pré-ARNm que sur des cibles spécifiques. Nos résultats indiquent que la liaison de SRSF1 ne dépasse pas quelques secondes, même sur les cibles de haute affinité. Cette cinétique rapide permet à SRSF1 d’être en contact avec l’ensemble des transcrits naissants qui est produit en permanence dans la cellule. De plus, mon travail apporte une analyse cinétique de la dynamique des snRNP à la résolution de la molécule unique dans le nucléoplasme des cellules vivantes. Nous avons déterminé les coefficients de diffusion des snRNP et la durée de leur association à l’ARN dans ces cellules. / SRSF1, formerly known as ASF/SF2, belongs to the SR protein family, which is a conserved family of RNA-binding protein that plays essential roles as regulators of both constitutive and alternative splicing. Hundreds of RNA targets have been described for SRSF1 but how SRSF1 selects its targets from the entire pool of cellular pre-mRNAs remains an open question. In vitro and in vivo studies have shown that SR proteins recognize short degenerated motifs often present in multiple copies at ESEs. Similar cryptic motifs are however frequently present in pre-mRNAs, and this low specificity of binding contrasts with the great fidelity of exon definition. To better understand the mechanism of action of SRSF1, I performed a kinetic study of SRSF1-RNA interactions in live cells using advanced microscopic techniques. Taking advantage by the CRISPR system, I tagged endogenous SRSF1 with Halo protein, and I combined photobleaching (FRAP) and single particle tracking (SPT) techniques to estimate diffusion and binding rates of SRSF1. I measured the duration of individual binding events, both on the cellular pool of pre-mRNAs and on specific targets. Our results indicate that binding of SRSF1 does not exceed few seconds, even on high-affinity targets. This rapid kinetics allows SRSF1 to rapidly sample the entire pool of nascent RNAs continuously produced in cells. Moreover, we provided a kinetic analysis of snRNP dynamics at a single-molecule resolution in the nucleoplasm of living cells. Our results enabled us to determine diffusion coefficients of snRNPs and their RNA binding duration in vivo.

Hautement conservé, de la bactérie jusqu'à l’Homme, la recombinaison homologue est indispensable à la survie de tout organisme vivant. Chez l’humain, la protéine hRad51 (human Rad51) y joue un rôle clé en s’autoassemblant au site de cassure sur les extrémités simple-brin d’une molécule d’ADN endommagée pour former le filament nucléoprotéique. Ce filament est capable à lui seul d’effectuer la plupart des opérations nécessaires au bon déroulement de la recombinaison homologue; il va permettre la reconnaissance d’homologie, l’appariement des séquences homologues et l’invasion de brins requise pour la synthèse de l’ADN manquant.La recombinaison homologue est un processus complexe impliquant de multiples partenaires. Pour mieux comprendre le rôle du filament nucléoprotéique au sein de la réaction, on se propose d’étudier ce dernier en l’absence de tout partenaire. Plus précisément, on observe le comportement mécanique de filaments hRad51-ADNdb en fonction des conditions chimiques. La formation du filament nucléoprotéique modifie la conformation de l’ADN sur lequel il s’assemble, l’allongeant de 50% et le déroulant de 43% dans le cas d’une molécule double-brin. Les pinces magnétiques sont un outil permettant de contrôler la force et la torsion appliquées à une unique molécule d’ADN double-brin (ADNdb), elles sont donc l’outil idéal pour sonder les propriétés mécaniques de filaments nucléoprotéiques. Le système des pinces magnétiques a été modifié afin de mesurer des paramètres mécaniques précédemment inaccessibles tel que le couple ressenti ou exercé par le filament. Le but de cette thèse a été d’étudier les propriétés mécano-chimiques des filaments nucléoprotéiques tout en essayant de tracer le paysage énergétique qui régit les transitions de ces systèmes. / Highly conserved throughout the species, homologous recombination is crucial to the survival of any living organism. In humans, the hRad51 protein (human Rad51) plays a key role by self-assembling at the break site on the single stranded extremities of damaged DNA molecules thus forming the nucleoprotein filament. This filament is able by itself to accomplish most of the necessary operations of homologous recombination; it allows the homology search, the pairing of the homologous sequences and the strand exchange.Homologous recombination is a complex process involving many partners. In order to better understand the role of the nucleoprotein filament in this process, we propose to study it in the absence of any partners. We will focus on the study of the mechanical properties of hRad51-dsDNA filaments as a function of chemical conditions. The formation of the nucleoprotein filament modifies the conformation of the DNA molecule on which it assembles, stretching it by 50% and unwinding it by 43% in the case of a double stranded DNA. The magnetic tweezers are a tool allowing the control of the force and torsion applied to a single dsDNA molecule; they are therefore the ideal tool to probe the mechanical properties of nucleoprotein filaments. We modified the magnetic tweezers as to allow the measurement of previously inaccessible mechanical parameters such as the torque applied or felt by the filament. The goal of this thesis has been to study the mechano-chemical properties of nucleoprotein filaments while drawing the energy landscape that governs the various transitions of these systems.

La synthèse des protéines est un mécanisme central de la vie cellulaire dont la compré-hension est un enjeu pour la recherche biomédicale. Des phénomènes comme les erreurs programméesde la traduction eucaryote ou l’initiation par des structures IRES virales sont impliqués dans les processusde réplication de virus et de bactéries. Mieux appréhender ces processus est une étape essentiellepour aboutir au développement d’approches thérapeutiques innovantes. Les études en molécule uniquepermettent d’observer chaque système réactionnel individuellement et donnent accès à des évènementsasynchrones difficilement observables en mesure d’ensemble, tels la traduction de protéines.Ce manuscrit de thèse présente une approche d’étude de la traduction par un ribosome eucaryote(mammifère) en molécule unique. Nous observons les systèmes traductionnels grâce à des marqueursfluorescents liés à des oligonucléotides pouvant s’hybrider sur les séquences d’ARN messagers traduites.L’observation de ces marqueurs est faite par microscopie de fluorescence en réflexion totale (TIRFM),les ARNm étant accrochés à la surface de l’échantillon. En lisant l’ARNm, le ribosome détache lesmarqueurs, et leurs instants de départ nous permettent de remonter à la dynamique de traductionde ribosomes individuels. Cette méthode permet d’obtenir des données cinétiques statistiques surun grand nombre de systèmes traductionnels en parallèle pouvant alors être ajustées par des lois deprobabilité. Partant de ce principe, mes travaux de thèse ont eu pour objectif d’étendre nos expériencesà une nouvelle problématique biologique : l’étude des évènements non canoniques de la traductioneucaryote. Pour cela nous avons apporté les modifications et les optimisations nécessaires au dispositifet au protocole expérimental pour l’adapter à ces nouveaux enjeux.Nos mesures de la cinétique in vitro de l’élongation eucaryote ont mis à jour un délai dû à uneinitiation non-canonique. En effet, nous réalisons le recrutement du ribosome par l’ARNm grâce àune structure virale de type IRES. Dans nos conditions d’expérience, l’incorporation d’un acide aminéprend environ une seconde tandis que cette structure induit un retard à la traduction de plusieursdizaines de secondes. Nous avons réalisé une étude comparative de plusieurs de ces structures viraleset avons montré que le délai mesuré était une caractérisitique conservée dans le cadre de l’initiation noncanonique. Ce résultat ouvre des perspectives d’études cinétiques tant pour approfondir nos conclusionssur les IRES que pour aborder d’autres évènements non canoniques tel que le décalage de la phase delecture ou le franchissement du codon stop. / The synthesis of proteins is a central mechanism of cellular life whose understandingis an issue for biomedical research. Phenomena such as programmed errors of eukaryotic translation orinitiation by viral IRES structures are involved in virus and bacterial replication processes. A Betterunderstanding of these processes is an essential step towards the development of innovative therapeuticapproaches.Single molecule studies allow each reaction system to be observed individually and give accessto asynchronous events, such as protein translation, that are difficult to observe in overall measurements.This phD manuscript presents a single molecule approach to study translation by a eukaryotic(mammalian) ribosome.We observe the translational systems thanks to fluorescent primers linked to oligonucleotides thatare hybridized to the translated mRNA sequences. These markers are observed by Total InternalReflection Fuorescence Microscopy (TIRFM) ; with the mRNAs attached to the sample surface. Whilereading the mRNA, the ribosome detaches the primers, and their instants of departure give us access tothe translation dynamics of individual ribosomes. This method makes it possible to obtain statisticalkinetic data on a large number of parallel translational systems, which can then be fitted by probabilitylaws. On the basis of this principle, my phD work aimed at extending our experiments to a newbiological issue : the study of non-canonical events in eukaryotic translation. To this end, we havemade the modifications and optimizations necessary for the set-up and the experimental protocol toadapt them to these new challenges.Our measurements of the in vitro kinetics of eukaryotic elongation have revealed a delay due tonon-canonical initiation. Indeed, the ribosome are recruited on the mRNA thanks to a viral, IREStype structure. Under our experimental conditions, the incorporation of an amino acid takes aboutone second while this structure induces a translation delay of several tens of seconds. We carried outa comparative study of several of these viral structures and showed that the measured delay was acharacteristic preserved in the framework of the non-canonical initiation. This result opens up prospectsfor kinetic studies both to deepen our conclusions on IRES and to address other non-canonical eventssuch as programmed frameshifting or STOP codon readthrough.

Dans la majeure partie des cas, la séparation en taille de molécules d'ADN, étape primordiale lors d'unséquençage, est réalisée par électrophorèse sur gels, inadaptée à la séparation de longues molécules : larecherche de techniques de séparation alternatives est donc primordiale. Nous avons utilisé unetechnologie de fabrication alternative, la Lithographie par Décalage de Phase, pour fabriquer des matricesd’obstacles de 80 à 500 nm de diamètre, de formes cylindrique ou ellipsoïdale. Ces matrices nous ontpermis de mener une étude des dynamiques de collision ADN-obstacle à l’échelle de la moléculeindividuelle, par la caractérisation des effets de l’actionnement (électrophorétique ou hydrodynamique), dela dimension et de la forme des obstacles sur ces dynamiques, impliquées dans le processus de séparationen taille. Nous montrons enfin la première séparation hydrodynamique de fragments d’ADN dans desréseaux d’obstacles nanométriques / In most cases, separation by size of DNA molecules, a crucial step for sequencing, is realized by gelelectrophoresis, unadapted to long molecule separation: it is consequently relevant to investigate alternativeseparation techniques. We have used an alternative fabrication technology, Phase Shift Lithography, tofabricate obstacle matrices which sizes range from 80 to 500 nm, with cylindrical or ellipsoidal shapes.These matrices allowed us to investigate DNA-obstacle collision dynamics at the single molecule scale, bythe caracterisation of actuation effects (electrophoretic or hydrodynamic) and of the size and shape of theobstacles on these dynamics, involved in the separation by size process. We finaly showed the firsthydrodynamic separation of DNA fragments into nanopilar matrices

Nous avons étudié l'elasticité de molécule unique d'ADN et d'ARN. Nous avons montré que le couplage entre la traction et la rotation d'une molécule d'ADN permet d'obtenir des structures variées qui sont éloignées de quelques kT en énergie de la structure canonique Watson-Crick. Les fluctuations thermiques de longueur de la molécule expliquent le mécanisme d'interaction de la protéine RecA avec l'ADN. Les expériences de traction d'une molécule d'ARN unique montrent l'importance des réappariements transitoires au cours de la dénaturation mécanique.

Les mécanismes moléculaires d'assemblage et de bourgeonnement des virus tels que le VIH-1 dans les cellules infectées sont encore relativement mal connus. Toutefois, il semble établi que la multimérisation de la protéine Gag s'effectue à la membrane plasmique et que le bourgeonnement des particules virales a lieu au niveau de zones enrichies en tétraspanines. Ces protéines transmembranaires forment un réseau d'interactions protéiques à la surface de la cellule et s'organisent en microdomaines différents des radeaux lipidiques, bien qu'enrichis en cholestérol.En utilisant la technique de suivi de molécules uniques fluorescentes sur des cellules HeLa exprimant la protéine Gag, l'objectif de mon travail de thèse était d'abord de déterminer l'influence de l'assemblage et le bourgeonnement de pseudoparticules virales sur la dynamique et la répartition membranaires des tétraspanines CD9 et CD81. Nos résultats renforcent l'émergence d'un nouveau concept, selon lequel les composants cellulaires et viraux, plutôt que de se regrouper au niveau de plateformes membranaires préexistantes, s'organisent en structures de taille croissante où les tétraspanines sont peu à peu concentrées avec leurs partenaires pour former une architecture propice à l'assemblage et la sortie du VIH-1.Par ailleurs, nous avons montré que CD81 était plus confiné et moins dynamique que CD9 et avons donc étudié les mécanismes moléculaires expliquant cette différence de comportement membranaire. L'utilisation du pistage en molécule unique couplé à des marquages d'ensemble, l'emploi de protéines chimériques et de drogues spécifiques ont permis de révéler que la dynamique membranaire de CD81 est restreinte par le réseau d'actine, via l'ezrine, mais implique aussi EWI-2 et CD9P-1, deux partenaires membranaires de CD9 et de CD81. Enfin, cette étude montre que cette interaction avec le cytosquelette est impliquée dans le recrutement de CD81 et indirectement de CD9, lors de l'assemblage du VIH. / Molecular mechanisms of assembly and budding of HIV-1 particles in infected cells are still a matter of debate. However it is now well established that Gag assembly occurs at the plasma membrane and that budding involves tetraspanin-enriched areas. Tetraspanins are transmembrane proteins that form a network of protein interaction at the cell surface organized into microdomains enriched in cholesterol but distinct from rafts.Using single molecule tracking of fluorescent markers with Gag-expressing HeLa cells, the aim my PhD thesis was first to determine the influence of Gag assembly and budding of pseudo particles on the dynamics and partitioning of the tetraspanins CD9 and CD81 at the plasma membrane. Our results support an emerging concept that cellular and viral components, instead of clustering at preexisting microdomains or platforms, direct the organization of growing structures where tetraspanins are more and more concentrated with their partners, in order to form a membrane scaffold that helps HIV-1 assembly and egress.In a second work, we showed that CD81 is more confined and less dynamic than CD9, and tried to clarify the molecular mechanisms involved in this differential behavior at the plasma membrane. Single molecule tracking, in addition to ensemble labeling experiments, CD9/CD81 chimeric proteins, as well as specific drugs, demonstrated that CD81 membrane dynamics is restricted by the actin network through ezrin proteins, but also implicates EWI-2 and CD9P-1, primary partners of CD9 and CD81. Finally, this study reveals that this interaction with the cytoskeleton is in part responsible of the recruitment of CD81 and indirectly of CD9 during HIV-1 assembly.

Ce mémoire rapporte deux approches de la synthèse des protéines à l'échelle de la molécule unique. Nous utilisons la microscopie de fluorescence en onde évanescente pour sonder l'activité traductionnelle de deux types de ribosomes. Les premiers, issus d'E. Coli (organisme procaryote), sont mutés afin de les marquer d'un nanocristal semiconducteur (QD). La fin de la traduction, qui correspond au décrochage du ribosome de l'ARNm lorsque celui-ci atteint le codon stop, est alors mise en évidence par la disparition du QD de la surface de l'échantillon. Le deuxième type de ribosome étudié est quant à lui extrait de cellules de lapins (organisme eucaryote) et est dit "sauvage", c'est à dire qu'il n'a pas subi de modification, tandis qu'un oligonucléotide marqué d'un fluorophore est hybridé à l'ARNm. L'activité hélicase du ribosome lui permettant de séparer deux brins complémentaires, l'oligonucléotide et donc le fluorophore disparaissent en même temps que le ribosome parcourt l'ARNm, permettant ainsi de sonder l'activité du ribosome. Nous donnons pour ces deux types de ribosomes une vitesse moyenne de la traduction dans des milieux contenant les facteurs de la traduction issus d'extraits cellulaires.La deuxième approche de la synthèse des protéines porte sur les propriétés de l'ARNm, support de l'information génétique codant pour la séquence des protéines. Nous avons développé un montage de pince optique permettant de manipuler et caractériser les propriétés mécaniques d'oligonucléotides, ainsi qu'une méthode originale de calibration de ce piège optique. La cohérence de nos mesures sur l'étirement d'un double brin d'ADN avec la littérature nous permettra de poursuivre notre étude sur la mesure des forces nécessaires pour ouvrir une structure secondaire de l'ARNm. / We hereby report two approaches of the protein synthesis at the single molecule level. We use total internal reflection fluorescence microscopy to study the translation kinetic of two different types of ribosomes. The first ones, extracted from E. Coli (prokaryotic organism), are mutated in order to label them with a quantum dot (QD). The end of translation, which corresponds to the dissociation of the ribosome from the mRNA when the stop codon has been reached, is highlighted by the disparition of the QD from the surface. The second type of ribosome is extracted from rabbit cells (eukaryotic organism) and has not been modified (wild type), while a labeled oligonucleotide is hybridized on the mRNA. The helicase activity of the ribosome allowing the dissociation of two complementary strands, the oligonucleotide and so the label disappear at the same time while the ribosome moves along the mRNA and thus inform us about its activity. For these two types of ribosomes we measure their average translation speed in cell extracts.The second approach focuses on the properties of the mRNA, carrying the genetic code for the protein sequence. We developped an optical tweezer setup in order to manipulate and characterize the mechanical properties of nucleotides, as well as an original method to calibrate this optical trap. The consistency of our measurements with the litterature on the properties of a double stranded DNA will allow us to study secondary structures of mRNA.