La microscopie de molécule unique (single-molecule microscopy, SMM) regroupe un ensemble de techniques pour la biologie moléculaire et cellulaire permettant de visualiser le mouvement de molécules biologiques individuelles. Néanmoins, les techniques SMM imposent de fortes contraintes en ce qui concerne les luminophores utilisés. Récemment, un nouveau luminophore appelé «particule à conversion ascendante» (upconverting nanoparticles, UCNP) a attiré l'attention de la communauté scientifique en raison de son émission efficace de lumière visible après une excitation par de la lumière infrarouge. Cette propriété fait des UCNPs un luminophore très intéressant pour les applications biologiques : l'excitation infrarouge permet d'éliminer l’autofluorescence, généralement associé à une excitation dans la gamme du visible. De plus, la photostabilité extrême des UCNP et l’absence de photoclignotement sont également de précieux atouts pour les expériences SMM. L’objectif de cette thèse était d’adapter les UCNPs aux applications SMM, avec le but ultime d’exploiter leurs propriétés uniques pour améliorer les performances des expériences SMM. Au cours du projet, les protocoles de dispersion des UCNPs dans des tampons aqueux ont été optimisées pour conserver une bonne monodispersité des particules; l'efficacité des UCNPs dans les expériences de transfert résonant d'énergie en particule unique a été estimée; des protocoles pour l'imagerie d'UCNPs uniques ont été développés; et la preuve de concept de l'utilisation des UCNPs dans des expériences de suivi de molécules uniques à la surface de cellules vivantes a été réalisée. Finalement, ces résultats forment une base solide pour de futures expériences SMM utilisant les UCNPs. / Single-molecule microscopy (SMM) is a powerful set of techniques for molecular and cell biology that allows visualizing the movement of individual biological molecules, but has strict requirements towards the utilized luminophores. Recently, a new luminophore called upconverting particles (UCNPs) gained attention of the research community due to their efficient emission of visible light upon excitation with infrared light. This property makes UCNPs a valuable luminophore for biological applications due to the elimination of autofluorescence background, commonly associated with regular visible light excitation. Extreme photostability of UCNPs and absence of sporadic photoswitching are also valuable for SMM experiments. The objective of this thesis was to adapt UCNPs to SMM applications, with the ultimate goal of exploiting their unique properties towards superior performance of SMM experiments. During the project, protocols for dispersing UCNPs in aqueous buffers were streamlined to provide superior particle monodispersity; the efficiency of UCNPs in single-molecule resonance energy transfer experiments was estimated; protocols for single-molecule imaging with UCNPs were developed; and a proof-of-concept system for targeted single-molecule tracking with UCNPs in live cells was demonstrated. Overall, these findings will serve as a foundation towards robust SMM assays based on UCNPs.

Les fibres musculaires et les touffes ciliaires mécanosensibles de l'oreille interne des vertébrés sont deux systèmes complexes capables de développer une activité mécanique spontanément oscillatoire, dans des conditions où, au niveau moléculaire, des groupes de moteurs moléculaires opèrent au voisinage de leur force d'arrêt et sont soumis à une force de rappel élastique.<br />Nous avons construit un dispositif reproduisant in vitro une configuration semblable. Nous avons observé qu'une assemblée de myosines II musculaires, consommant de l'ATP en interagissant avec un filament d'actine, et soumise à une force de rappel élastique exercée par une pince optique, est un système minimal capable d'osciller spontanément. La relation force-vitesse du système présente un comportement non-monotone lié à l'activité des moteurs. Cette propriété fournit un mécanisme pour interpréter les oscillations spontanées, comme il l'a été suggéré par différentes études théoriques antérieures.<br />Par ailleurs, des expériences préliminaires à l'échelle de la molécule individuelle indiquent que la raideur de l'accrochage actine-myosine II pourrait dépendre de la tension imposée au filament d'actine. Cette propriété pourrait expliquer les écarts entre les raideurs mesurées in vitro et estimées à partir d'expériences sur les fibres musculaires.

Nous étudions les propriétés de fluorescence de nanocristaux de<br />CdSe individuels. Nous montrons expérimentalement que le<br />clignotement de fluorescence de ces nanosources rend leur<br />fluorescence non ergodique, et génère un phénomène de<br />vieillissement statistique.<br /><br />Nous montrons que l'observation par microscopie défocalisée de<br />nanocristaux de CdSe individuels permet de mesurer leur position<br />et leur orientation tridimensionnelle.<br /><br />Nous prouvons expérimentalement que l'interaction d'un nanocristal<br />avec une interface diélectrique modifie son diagramme de<br />rayonnement ainsi que la durée de vie radiative de son état<br />excité. Ces modifications d'émission spontanée sont ensuite<br />utilisées pour mesurer le rendement quantique de l'état allumé<br />d'un nanocristal de CdSe.<br /><br />Enfin, nous montrons que l'excitation impulsionnelle d'un<br />nanocristal permet de réaliser une source de photons uniques<br />déclenchée, en vue d'applications en traitement quantique de<br />l'information.

Les mécanismes adhésifs jouent un rôle crucial en biologie. Les cadhérines classiques constituent une des principales familles de molécules d‟adhésion cellulaire dépendante du calcium. Ces glycoprotéines transmembranaires sont impliquées dans des interactions principalement homophiles. Ces interactions régulent des voies de signalisation impliquées dans de nombreux phénomènes biologiques. Cette thèse porte sur l‟étude comparative des dynamiques d‟interactions des cadhérines E- et -11, prototypes respectivement des cadhérines classiques de type I et II. Le ciblage d‟acides aminés particuliers de l‟interface adhésive nous a permis de montrer que pour les cadhérines de type I, l‟échange de brin beta avec le Trp2 ont un rôle clé ; pour les types II un mécanisme différent intervient. Nous avons aussi développé une chimie innovante pour contrôler l‟immobilisation orientée et covalente de protéines. Enfin une revue décrit une étude de l‟activation de voies de signalisation par engagement des cadhérines.

Les enzymes de réparation de l'ADN sont des facteurs essentiels pour assurer l'intégrité du génome. Ainsi, la compréhension de la dynamique de leurs mécanismes d'interaction est capitale. NucS est une nucléase récemment découverte chez l'archée Pyrococcus abyssi, qui interagit avec des structures branchées de l'ADN à simple brin libre, appelées flaps. Sa caractérisation biochimique a mis en évidence une affinité nanomolaire pour l'ADN simple brin, avec l'existence de deux sites de liaison (site I et II) ainsi qu'une activité bidirectionnelle caractérisée par la capacité à cliver les flaps 5' et 3'. Les mécanismes qui sont à l'origine de cette activité, notamment ses modalités de chargement, de localisation et de dissociation, restent toutefois peu connus. Afin de sonder la dynamique des interactions de NucS avec son substrat, nous avons mis en place un microscope à illumination en onde évanescente permettant la détection et le suivi des événements d'interaction individuels entre la protéine marquée avec un fluorophore et un substrat d'ADN attaché à la surface. Nous avons ensuite développé une nouvelle technique de colocalisation qui permet de positionner une protéine individuelle par rapport à son substrat avec une précision de 50 nm pour des durées arbitraires. Nous avons alors étudié la cinétique d'association et de dissociation des complexes NucS-ADN individuels afin de résoudre les mécanismes qui régulent l'activité de l'enzyme dans différentes conditions. Dans des conditions où le clivage est inhibé, nous avons montré que l'association était dépendante du site I, bidirectionnelle et symétrique pour les flaps 3' et 5' et que la dissociation était orientée avec une affinité supérieure pour les flap 5'. Nous avons également montré que la dissociation suivait une cinétique du premier ordre indépendante de la diffusion de NucS sur le flap. Ceci indique que, dans ces conditions non clivantes, NucS s'associe et/ou se dissocie à des positions arbitraires sur le flap. Par la suite, nous avons étudié la cinétique d'association et de dissociation du complexe NucS-ADN à 45 ◦ C en présence du cofacteur de la réparation PCNA. Nous avons démontré que PCNA augmente la vitesse d'association de NucS avec les substrats 3' et 5'. Ceci indique que PCNA agit comme une plateforme qui facilite la reconnaissance de la lésion, avec un chargement ciblé de NucS à la jonction. De plus, nous avons montré que PCNA déstabilise le complexe NucS-ADN, vraisemblablement en exerçant une force pour plier l'ADN afin d'amener l'extrémité du flap vers le site II. Dans le cas de flaps 5', nous avons montré que la dissociation suit un mécanisme en deux étapes, qui est indépendant de la longueur du flap. Ceci nous a permis de proposer un modèle où NucS se charge par son site I directement à la jonction, courbe le substrat pour capturer l'extrémité simple brin par le site II pour le cliver. Dans le cas d'un flap 3', nous avons montré que la dissociation suit un mécanisme du premier ordre ce qui est probablement dû à la rapidité de la seconde étape dans le mécanisme proposé pour les flaps 5'. Nos résultats constituent ainsi une nouvelle contribution à la caractérisation intramoléculaire des interactions NucS-ADN. Les méthodes que nous avons développées constituent en outre un moyen original pour sonder la cinétique des interactions entre biomolécules et pourront être appliquées à de multiples systèmes.

Certaines protéines qui interagissent avec l'ADN sont capables de trouver rapidement une séquence spécifique de quelques paires de bases. Pour expliquer ce phénomène connu des biologistes depuis longtemps, plusieurs mécanismes de localisation appelés diffusion facilitée ont été proposés. Tous supposent une association initiale à de l'ADN non spécifique, suivie d'une translocation le long de l'ADN jusqu'au site de reconnaissance. Le mécanisme qui sous-tend cette translocation est toujours discuté. Il pourrait impliquer une diffusion linéaire (sliding) et/ou une série de sauts (jumping). <br />Pour élucider ce mécanisme, nous avons utilisé la microscopie de fluorescence par onde évanescente pour visualiser l'interaction non spécifique de l'enzyme de restriction EcoRV. Dans nos expériences in vitro, l'ADN est étiré au dessus d'une surface et les enzymes sont couplées à des fluorophores. Nous avons ainsi visualisé les processus de sliding et de jumping et mesuré le coefficient de diffusion 1D des enzymes (D1 ~ 0,01 µm2.s-1) ainsi que le nombre de saut par interaction (~ 20). Un modèle simple a permis à partir des résultats expérimentaux de caractériser la diffusion facilitée d'EcoRV.

Le moteur flagellaire bactérien (BFM) est un complexe moléculaire qui permet aux bactéries de nager dans un milieu liquide. La rotation du moteur est générée à l’interface entre deux éléments clés: les protéines formant le stator (MotA and MoB) et l’anneau C “switching complex” à la base du rotor. Les stators sont des modules du moteur structurellement et fonctionnellement différentiables du reste du moteur, et leurs association et dissociation dynamique autour du rotor contrôle la génération du couple. Quand une protéine fluorescente (PF) est fusionnée à MotB, le moteur est en état de marche mais une réduction générale de la mobilité de la cellule a été observée. La raison précise d’une telle réduction de mobilité n’a pas été étudiée.Le but de cette étude est de comprendre comment la fusion PF de la protéine du stator modifie la génération du couple et le sens de rotation du moteur. C’est particulièrement important car le tag FP se trouve à l’interface entre le stator et le rotor, là où le couple et le changement du sens de rotation sont produits. Trois différentes PFs (eGFP, YPet, Dendra2) ont été fusionnées à la protéine MotB. Malgré la haute similarité de leurs structures, notre analyse a montré que les trois stators fusionnés génèrent des couples différents. Les stators marqués avec YPet produisent un couple moyen similaire au WT (stators sans tag PF), alors que les stators marqués avec eGFP et Dendra2 produisent respectivement 70% et 40% du couple moyen du WT. De plus, les moteurs utilisant les stators fusionnés ont montré des capacités de changement de sens de rotation réduites. Lors d’un changement de sens de rotation, la valeur absolue de la vitesse des moteurs WT ne change pas. Cette “symétrie” de vitesse lors du changement n’apparaît pas avec les moteurs à stators fusionnés et le changement peut être accompagné d’une importante diminution (~30%) de la vitesse absolue.En observant par microcopie TIRF avec détection de molécules uniques, des stators marqués dans un moteur en état de marche, les signaux de fluorescence sont détectés à la membrane comme prévu pour ces protéines, montrant une population de stators diffusant dans celle-ci. Les clusters fluorescents étaient visibles au centre des cellules en rotation, attachés au couvre-glace par une seule flagelle, confirmant que le tag de fluorescence peut être visualisé dans des moteurs en état de marche. Dans un second projet développé dans le laboratoire Bertus Beaumont à TU Delft, en prenant le BFM en tant que système modèle d’évolution expérimentale, sa modularité et son « évolubilité » ont été explorés pour apprendre les détails au niveau moléculaire de l’évolution de ce type de machine. Les stators de E.coli ont été échangés par un set de 21 stators étrangers homologues. L’expérience a révélé que les protéines du stator peuvent être échangées entre espèces de bactéries distantes et certains stators non compatibles peuvent être modifiés positivement par un procédé d’évolution pour devenir fonctionnels. Au cours de cette évolution, les bactéries ont accumulé des mutations avantageuses dans leurs gènes MotA et MotB étrangers, tout particulièrement dans leur domaine fonctionnel. Des mutations identiques dans des stators différents ont été observées, indiquant que l’évolution peut se reproduire. L’analyse fonctionnelle au niveau d’un seul moteur a révélé que ces mutations avantageuses amélioraient la génération du couple et/ou la capacité du moteur à changer de sens. Les investigations détaillées du génotype et du phénotype du BFM modifié par évolution apportés par cette étude, pourraient donner une idée sur la façon dont des machines moléculaires comme le BFM ont évolué, et les effets fonctionnels des mutations bénéfiques qui facilitent l'intégration fonctionnelle. / The bacterial flagellar motor (BFM) is the macromolecular complex which allows bacteria to swim in liquid media. Located at the base of the flagellum, anchored in the cell membrane, this remarkably small (~45nm) yet powerful rotary motor rotates each flagellum of the cell switching between counterclockwise (CCW) and clockwise (CW) direction. The motor rotation is generated at the interface between the two key components of the motor: the stator protein complexes (each composed of 4 MotA and 2 MotB proteins) and the C- ring protein complex at the base of the rotor. The stator complexes are structurally and functionally discernible modules of the motor, and their dynamical association and dissociation around the rotor controls the generation of torque.The first project of this study aims to investigate how the FP tag on the stator protein modifies the torque generation and switching of the motor. This is particularly important because the fluorescent protein tag lies at the interface between stator and rotor, where torque and switching are produced. Three different FPs (eGFP, YPet, Dendra2) were fused to MotB. Interestingly, despite the high similarity of their structures, our analysis revealed that the three fusion stators generate different torque. Furthermore, in the presence of fusion stators, the motor showed significantly impaired switching abilities. When switching direction of the rotation, the absolute value of the speed of WT motors does not change, whereas this symmetry of speed upon switching is not observed in the fusion stator motors, and switching can be accompanied with a significant (~30%) decrease in absolute speed. Both the impaired torque generation and the switching ability were improved by introducing a rigid linker between the stator and the FP tag. Taken together, this study provides a further insight into the dynamics of the stator and rotor interaction at its interface.When the cells carrying the fluorescently labeled stators were observed in a custom made TIRF-fluorescence microscope with single molecule capability, the fluorescence signals were detected as concentrated clusters in the membrane as expected for these membrane proteins around the motors, together with a population of stators diffusing in the membrane. Fluorescent clusters were visible at the center of rotating cells tethered to the glass slide by a single flagellum, confirming that the fluorescent tags can be visualized in functioning motors.In a second project developed in Bertus Beaumont lab at TU Delft, taking BFM as an experimental evolutionary model system, its modularity and evolvability have been explored to learn the molecular details of the evolution of molecular machines. The stators of E.coli have been exchanged by a set of 21 homologue foreign stators. The experiments revealed that the stator proteins can be exchanged between distant bacteria species, and some of the non-compatible stators can be positively modified by evolution to become functional. Those evolved strains accumulated beneficial mutations in their foreign motA and motB genes, especially on their functional domains. Identical mutations in different stators were common, indicating that evolution is repeatable. The functional investigation at the single motor level revealed that those beneficial mutations improved the torque generation and/or the switching ability of the motor. The detailed genotype and phenotype investigations of the evolutionary modified BFM may bring an insight into how molecular machines such as BFM have evolved as well as the functional effects of the beneficial mutations that facilitate functional integration.

La synapse est une structure macromoléculaire dont les composants sont renouvelés en permanence alors que l’assemblage est quasi-stable. A l’échelle mésoscopique, les récepteurs aux neurotransmetteurs (RN) sont accumulés dans le compartiment post-synaptique (PSD). Cette accumulation résulte de la diffusion latérale des RNs dans la membrane neuronale et de leurs immobilisations transitoires dans la PSD. Les protéines d’échafaudage (PE) localisées sous la membrane post-synaptique constituent des sites de capture en interagissant avec les RNs. Mon travail de thèse s’inscrit dans le cadre d’une collaboration avec des chimistes et des physiciens afin de comprendre les paramètres impliqués dans le processus de diffusion-capture. Nous nous sommes intéressés au cas de la capture du récepteur de la glycine (RGly) par les agrégats de PEs des synapses inhibitrices, les géphyrines. Nous avons étudié l’impact de la liaison RGly-géphyrine sur le processus de diffusion-capture sous deux aspects. Le premier est lié à la nature bimodale de liaison du RGly. Le second aborde l’impact des phosphorylations de la boucle M3-M4 de la sous-unité β du RGly sur la liaison avec la géphyrine.Mon travail de thèse montre qu’il est maintenant possible, en utilisant des approches de microscopie super-résolutive, de quantifier les aspects thermodynamiques des interactions moléculaires dans les cellules vivantes. / The synapse is a macromolecular structure whose components are constantly renewed while the assembly remains quasi-stable. At the mesoscopic level, neurotransmitter receptors (RNs) accumulate in the post-synaptic compartment (PSD). This accumulation is the result of the lateral diffusion of RNs in the neuronal membrane and transient immobilization within the PSD. This mechanism, called diffusion-trapping has been highlighted by single-molecule-tracking techniques. Scaffold proteins (PE) are localized under the post-synaptic membrane. These proteins form trapping-sites by interacting with RNs. Through an interdisciplinary approach in collaboration with chemists and physicists, the aim of my doctoral research was to understand the parameters that are involved in diffusion-trapping mechanisms. We especially focused on glycine receptor (RGly) trapping by PE clusters at inhibitory synapses, namely the scaffold protein gephyrin. The gephyrin- interaction motif of the GlyR is located within the cytoplasmic domain of the β-subunit of the receptor, the so-called β-loop. Two aspects of the impact of RGly-gephyrin binding on diffusion-trapping were studied. The first was to identify the source of the RGly-gephyrin bimodal binding. The second one addressed the regulation of gephyrin binding by phosphorylation of the GlyR βLoop.My research thus shows that it is now possible to quantify thermodynamic aspects of molecular interactions in living cells using high-density single-molecule-tracking.

La transcriptase inverse (RT) est un hétéro-dimère p66/p51 avec des activités ADN polymérase et ribonucléase H qui jouent un rôle critique dans le cycle viral du VIH-1. La RT convertit l’ARN génomique viral simple brin en ADN proviral double brin dans le cytoplasme de la cellule infectée. L’efficacité de la RT est augmentée par la protéine de la nucléocapside (NC) grâce à son activité chaperonne vis-à-vis des acides nucléiques et/ou une coopération entre les deux protéines. Dans ce travail, nous avons étudié par la technique de smFRET (single molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer) les effets de la NC sur l’interaction entre la RT et un substrat d’ADN au niveau de deux sites de pause de la synthèse de l’ADN(+). Nous avons d’abord réalisé et validé le montage de smFRET. Lors de la validation du montage avec des fluorophores Cy3 encapsulés dans des vésicules lipidiques, nous avons mis en évidence deux mécanismes différents entrainant le photoblanchiment du Cy3. Ensuite, après avoir déterminé les propriétés de liaison à l’équilibre de la RT et la NC sur différents substrats amorce/matrice à l’aide de mesures d’ensemble en solution, nous avons confirmé par smFRET que la RT adopte plusieurs conformations sur son substrat d’ADN, incluant celle qui conduit à la polymérisation de l’ADN. En présence de la NC, nous n’avons observé qu’une réorganisation modérée des différentes conformations du complexe RT/substrat. Par contre, une réorganisation beaucoup plus importante est induite par la NC en présence du dNTP, avec une très forte exaltation des conformations compétentes pour la polymérisation. Nous avons également montré que la NC augmente l’efficacité de synthèse de l’ADN au niveau de sites de pause en diminuant ou en augmentant le temps de dissociation du complexe RT/substrat/dNTP selon le type de site de pause. L’ensemble de ces données permet de mieux comprendre les mécanismes polyvalents par lesquels NC facilite l’activité de la RT. / The reverse transcriptase (RT) is a p66/p51 hetero-dimer with DNA polymerase and ribonuclease H activities which plays a critical role in the viral cycle of HIV-1. RT converts the viral genomic RNA to proviral DNA in the cytoplasm of infected cells. The efficiency of RT is increased by the nucleocapsid protein (NC) through its nucleic acids chaperone properties and/or via direct interaction with RT. In the present work, we investigated the effects of NC on the interaction between RT and its DNA substrate attwo pause sites during the synthesis of (+)DNA by using the smFRET (single molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer) technique. In a first step, we implemented and validated the smFRET set-up. Within the validation step, using Cy3 fluorophores encapsulated, in lipid vesicles, we monitored the photobleaching of Cy3 dyes and found out that it was governed by two parallel mechanisms. In a second step, we determined the affinity of RT and NC to different primer/template substrates by using steady-state fluorescence. Then, we confirmed by smFRET that RT adopts different conformations on its DNA substrate, including the one that leads to DNA polymerization. In the presence of NC, we observed only a moderate reorganization of the different conformations of RT/substrate complex. However, NC was found to induce a more important reorganization in the presence of dNTP, with a very strong promotion of the polymerization-competent conformations. We also showed that NC increases the efficiency of DNA synthesis at pause sites by either decreasing or increasing the dissociation time of the RT/substrate/dNTP complex, depending on the type of pause site. Together, these data allow us to further elucidate the mechanisms by which NC facilitates the RT.

La relation entre le repliement du génome et les processus cellulaires majeurs, notamment la transcription, la réparation de l’ADN et la réplication est une question biologique centrale. De nouvelles méthodes de la génomique ont révélé un niveau inconnu de l’architecture tridimensionnelle de la chromatine. A l’échelle en dessous de la mégabase, certaines séquences génomiques se trouvent préférentiellement à proximité les unes des autres formant ainsi des domaines topologiques associés (TAD). Les gènes situés dans le même TAD ont des propriétés épigénétiques similaires, et leur expression au cours de la différentiation semble corrélée, ce qui suggère un lien fort entre la structure de la chromatine et la transcription. Les TADs sont à leur tour séparés par des régions avec peu de contacts, appelées frontières, qui sont généralement occupées par des protéines dites isolatrices. Les déterminants de cette organisation chromatinienne particulière et ses implications fonctionnelles sont largement méconnus. Selon une hypothèse récente, les TADs seraient formés par des contacts entre les séquences des frontières, stabilisés par la formation de boucles via les protéines isolatrices. Les travaux présentés ici ont pour but d’étudier le rôle des protéines isolatrices dans le mécanisme de formation des TADs chez la drosophile. La microscopie super-résolue a été implémentée et une série de développements ont été réalisés en microscopie à illumination structurée (SIM) et la microscopie à localisation de molécules uniques (SMLM), avec une attention particulière sur le marquage fluorescent. Ces développements ont directement été appliqués à l’étude de l’organisation nucléaire de la protéine associée aux éléments frontières (BEAF), une des 11 protéines isolatrices identifiées à ce jour chez la drosophile. Le fort enrichissement aux frontières des TADs, ainsi que son activité dans la formation de boucles d’ADN font de BEAF un candidat intéressant pour tester l’hypothèse de regroupement de frontières comme mécanisme général de repliement de la chromatine. La technique SMLM multi-couleurs a systématiquement localisé BEAF à la périphérie des larges domaines portant la marque épigénétique H3K27me3. L’analyse quantitative des images SMLM a révélé que BEAF forme des centaines de foyers d’une taille de 45 nm, composés en moyenne de 5 molécules, ce qui est en désaccord avec la présence de boucles de chromatine à large échelle. Afin de tester le regroupement de gènes directement au niveau de l’ADN, des frontières ont été marquées par des oligonucléotides fluorescents. Le nombre de foyers détectés par SIM s’est à nouveau révélé incompatible avec le modèle de contacts entre les frontières tout le long du génome. Par ailleurs, les distances entre paires de frontières au niveau de deux régions génomiques ont montré <5% de contacts. Ensemble, ces résultats sont en désaccord avec l’établissement d’interactions entre barrières chez la drosophile. Enfin, ces travaux de thèse ont contribué au développement méthodologique de la microscopie super-résolue, ce qui a permis d’apporter des preuves expérimentales invalidant le modèle de regroupement des frontières comme mécanisme général du repliement chromatinien. / The interplay between genome folding and key cellular functions such as transcription, DNA repair and replication is a fundamental question in chromatin biology. Recent genome-wide developments unveiled a new level of three-dimensional chromatin architecture. At the sub-megabase scale, some genome sequences are preferentially found in proximity with one another forming Topologically Associating Domains (TADs). Genes located within the same TAD display common epigenetic properties and tend to have coordinated dynamics of expression during differentiation, suggesting a strong link between chromatin structure and transcription. TADs are in turn separated by regions of low contact, termed TAD borders, which are generally occupied by factors called chromatin insulators. What are the determinants of this particular type of chromatin organization and what are the functional implications is still largely unknown. In an emerging hypothesis, TADs could be formed through contacts between TAD border sequences stabilized by the looping activity of insulator proteins. This thesis investigates the roles of insulator proteins in the TAD formation mechanism using Drosophila melanogaster as model system. Superresolution imaging was implemented and a series of developments were performed in Structured Illumination Microscopy (SIM) and Single-molecule Localization Microscopy (SMLM), with particular attention on fluorescent labeling for single-molecule detection. These developments were directly applied to study the nuclear organization of the Boundary Element Associated Factor (BEAF), one of the 11 insulator proteins discovered to date in Drosophila. The strong enrichment on TAD borders and its demonstrated looping activity make BEAF a potent candidate to test for the clustering of TAD borders as a general mechanism of chromatin folding. Multicolor SMLM systematically located BEAF foci at the periphery of large H3K27me3 chromatin domains. Quantitative analysis of SMLM images indicated BEAF forms hundreds of 45 nm foci, containing a mean of 5 molecules, which argues against a large-scale looping of BEAF-bound chromatin. To directly probe for gene clustering at the DNA level, TAD borders were labeled using fluorescent oligonucleotide probes. The number of foci detected by SIM was once more incompatible with a model of chromosome-wide contacting of multiple TAD borders. Furthermore, TAD border pairs distances were measured in two genomic regions, resulting in <5% of paired contacts among the measured barriers. Taken together, these results are inconsistent with constitutive interactions between consecutive or non-consecutive barriers in Drosophila.In conclusion, this study contributed to the methodological development of super-resolution microscopy which was applied to provide experimental evidence invalidating the TAD border clustering model as a general mechanism of chromatin folding.