Le CD154 est une glycoprotéine transmembranaire de type II, appartenant à la famille des facteurs de nécrose tumorale (TNF) et s’exprime d’une façon transitoire à la surface des lymphocytes T activés et des plaquettes. Notre laboratoire a démontré que la forme membranaire devient soluble suite à un clivage enzymatique par les métalloprotéinases (ADAM-10 et ADAM-17). De plus, il a été montré que le CD154 soluble (sCD154) peut aussi être relâché du milieu intracellulaire sans qu’il soit exprimé à la surface cellulaire suite à un clivage enzymatique intracellulaire entre les résidus acide Glutamique 112 (E112) et Méthionine 113 (M113). Les deux formes du CD154, soluble et membranaire, possèdent une structure trimérique nécessaire pour son activité biologique. Son récepteur principal, le CD40, est une glycoprotéine de type I appartenant à la famille des récepteurs des TNFs. Il est exprimé constitutivement à la surface des cellules B, des cellules dendritiques, des macrophages, des basophiles, des plaquettes, ainsi qu’à la surface de certaines cellules non hématopoïétiques telles que les cellules endothéliales, les fibroblastes et les cellules du muscle lisse vasculaire. Outre le CD40, quatre autres récepteurs appartenant à la famille des intégrines, ont été identifiés: l’αIIbβ3, l’α5β1, l’αMβ2, l’αvβ3 et l’α4β1. Les études de notre laboratoire ont démontré que l’interaction du CD154 avec ses récepteurs induit une activation bidirectionnelle, cependant, on a observé que le clivage du CD154 de la membrane cellulaire reste une propriété privilège au CD40. Le travail illustré dans cette thèse consiste à étudier l’inhibition du clivage enzymatique du CD154 et son effet dans la régulation de la réponse immune. Les résultats générés ci-dessous montrent que le CD154 résistant au clivage est un stimulant plus important que sa forme clivable. En effet, la double mutation des résidus E112 et M113 du CD154 abolit sa libération spontanée du milieu intracellulaire ainsi que son clivage de la membrane médié par le CD40 sans affecter sa liaison à ce dernier. Ce mutant s'est avéré capable d'induire une réponse apoptotique plus importante des cellules B, des réponses prolifératives plus prononcées et déclenche la différenciation des cellules B humaines d’une manière plus significative que le CD154-WT. De plus, notre étude met en évidence le développement et la caractérisation d'un anticorps monoclonal (mAb), le Clone 8, capable d'inhiber la libération/le clivage du CD154 à partir des cellules et ainsi de le maintenir à la surface cellulaire et d'augmenter sa puissance en tant qu'activateur des réponses induites par le CD40. Le Clone 8 est capable de lier le CD154 murin et d’inhiber son clivage de la surface cellulaire de la même façon que celle étudiée dans les cellules humaines. Ces travaux vont permettre le passage de cet anticorps bloquant le clivage du CD154 au stade des essais cliniques afin de mettre en place un nouveau traitement efficace pour les maladies auto-immunes et le cancer. / CD154 is a type II transmembrane glycoprotein belonging to the tumor necrosis factor superfamily (TNF), that is transiently expressed on the surface of activated T cells and platelets. We have demonstrated that this membrane form becomes soluble following an enzymatic cleavage by metalloproteinases (ADAM-10 and ADAM-17). CD154 also exists in a soluble form originating from a direct release of an intracellular processing without being expressed on the cell surface. This fragment is the result of an intracellular enzymatic cleavage between the residues Glutamic acid at position 112 (E112) and Methionine at position 113 (M113). Both soluble and membrane-bound forms of CD154 occur as non-covalently-linked homotrimers a property conveying to CD154 its biological activity. Its main receptor, CD40, is a type I glycoprotein belonging to the TNF receptor family. It is constitutively expressed on the surface of immune and non-immune cells including B cells, dendritic cells, macrophages, basophils, endothelial cells, fibroblasts, and vascular smooth muscle cells. CD154 was also shown to bind other receptors: αIIbβ3, α5β1, αMβ2, αvβ3 and α4β1 integrin. We have shown that the interaction of CD154 with its receptors induces bidirectional activation, however, only CD40 was capable of inducing the cleavage of CD154 from T cell surface. Our results here consist in studying the inhibition of the enzymatic cleavage of CD154 and its effect in the regulation of the immune response. Our data show that the cleavage resistant CD154 is a more potent stimulant than its cleavable form. Indeed, the double mutation of residues E112 and M113 of CD154 abolishes its spontaneous release from the intracellular milieu as well as its cleavage from the membrane. This mutant was found to be able to induce a stronger apoptotic response from B cells, induce more pronounced proliferative responses and trigger human B cell differentiation in a more significant way than CD154-WT. In addition, our study highlights the development and characterization of a monoclonal antibody (mAb), Clone 8, capable of inhibiting the release/cleavage of CD154 from cells and thus maintain it on the cell surface and increase its potency as an activator of CD40-induced responses. Clone 8 binds murine CD154 and inhibit its cell surface cleavage in the same way that in human cells. This study will allow the passage of this antibody blocking the cleavage of CD154 to the stage of clinical trials to develop a novel tool to treat diseases in which CD154 is implicated.

Optical sensor systems that integrate Long-Period-Gratings (LPG) as the detection arm have been proven to be highly sensitive and reliable in many applications. With increasing public recognition of threats from bacteria-induced diseases and their potential outbreak among densely populated communities, an intrinsic, low-cost biosensor device that can perform quick and precise identification of the infection type is in high demand to respond to such challenging situations and control the damage those diseases could possibly cause. This dissertation describes the development of a biosensor platform that utilizes polymer thin films, known as ionic self-assembled multilayer (ISAM) films, to be the sensitivity- enhancing medium between an LPG fiber and specific, recognition layer. With the aid of cross- linking reactions, monoclonal antibodies (IgG) or DNA probes are immobilized onto the surface of the ISAM-coated fiber, which form the core component of the biosensor. By immersing such biosensor fiber into a sample suspension, the immobilized antibody molecules will bind the specific antigen and capture the target cells or cell fragments onto the surface of the fiber sensor, resulting in increasing the average thickness of the fiber cladding and changing the refractive index of the cladding. This change occurring at the surface of the fiber results in a decrease of optical power emerging from the LPG section of the fiber. By comparing the transmitted optical power before and after applying the sample suspension, we are able to determine whether or not certain bacterial species have attached to the surface of the fiber, and as a consequence, we are able to determine whether or not the solution contains the targeted bacteria. This platform has the potential for detection of a wide range of bacteria types. In our study, we have primarily investigated the sensitivity and specificity of the biosensor to methicillin- resistant Staphlococcus aureus (MRSA). The data we obtained have shown a sensitive threshold at as low as 102 cfu/ml with pure culture samples. A typical MRSA antibody-based biosensor assay with MRSA sample at this concentration has shown optical power reduction of 21.78%. In a detailed study involving twenty-six bacterial strains possessing the PBP2a protein that enables antibiotic resistance and sixteen strains that do not, the biosensor system was able to correctly identify every sample in pure culture samples at concentration of 104 cfu/ml. Further studies have also been conducted on infected mouse tissues and clinical swab samples from human ears, noses, and skin, and in each case, the system was in full agreement with the results of standard culture tests. However, the system is not yet able to correctly distinguish MRSA and non-MRSA infections in clinical swab samples taken from infected patient wounds. It is proposed that nonspecific binding due to insufficient blocking methods is the key issue. Other bacterial strains, such as Brucella and Francisella tularensis have also been studied using a similar biosensor platform with DNA probes and antibodies, respectively, and the outcomes are also promising. The Brucella DNA biosensor is able to reflect the existence of 3 Brucella strains at 100 cfu/ml with an average of 12.2% signal reduction, while negative control samples at 106cfu/ml generate an average signal reduction of -2.1%. Similarly, the F. tularensis antibodies biosensor has shown a 25.6% signal reduction to LVS strain samples at 100 cfu/ml, while for negative control samples at the same concentration, it only produces a signal reduction of 0.05%. In general, this biosensor platform has demonstrated the potential of detecting a wide range of bacteria in a rapid and relatively inexpensive manner. / Ph. D.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Swine postweaning diarrhea (PWD) is a disease of considerable economic importance and is commonly associated with Escherichia coli. However, the vimlence mechanisms of E. coli associated with PWD have not all been elucidated. In the present study, a collection of 32 porcine E. coli 045 strains isolated from PWD were examined genotypically for the presence of virulence detenninants and phenotypically for adherence to mammalian cells in vivo and in vitro and for the expression of virulence factors related to their pathogenicity. Our results indicated that these isolates did not possess the virulence determinants, LT, STap, STb, VT1, VT2, F4, F5, F6, and F41 of enterotoxigenic or verotoxigenic E. coll. However, the majority of the strains carry eae^-related nucleotide sequences and are able to induce attaching and effacing (A/E) lesions in experimentally inoculated gnotobiotic piglets in vivo and on pig ileal expiants in vitro. The A/E lésions induced by these strains were characterized by intimate adherence of bacteria to the intestinal epithelial cell membrane with effacement of the microvilli, identical to those observed in the natural infection of pigs and to those induced by human A/E E. coli (AEEC). We also observed that the severity and extent of A/E lésions appeared to be related to the time of onset and the severity of the diarrhea in the inoculated piglets indicating an implication of A/E lesions in the induction of diarrhea in the experimentally inoculated piglets. However, none of these 045 isolates exhibited localized adherence to HEp-2 cells. The A/E-positive 045 isolates expressed an antigenically related 97 kDa outer membrane protein. The amino-terminal sequence of this protein showed 100% identity in the stretch of all known thirteen amino acids to the EaeA protein derived from the eaeA genes of human enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli, indicating that it is the eaeA gene product of porcine A/E isolates. The EaeA protein of E. coli 045 is serologically related to the EaeA protein of rabbit and human AEEC strains. It has an apparent isoelectric point of 8.4, is located in the bacterial outer membrane and is exposed on the bacterial surface. Most notably, the capacity of 045 isolates to induce A/E lesions appears to be correlated to the production of the EaeA protein, suggesting that expression of the EaeA protein is important for bacterial attachment to and effacement of enterocytes. Thus, we demonstrated that the E. coli 045 isolates associated with PWD in pigs are AEEC and that expression of the EaeA protein plays an important role in the pathogenicity of these isolates. We suggest that E. coli isolates capable of inducing A/E lesions could be one of the causative agents of swine PWD. / Escherichia coli (E. colî) est une bactérie gram-négative appartenant à la famille des entérobactéries. Elle constitue une grande partie de la flore intestinale normale chez l'homme et les animaux. Toutefois, certaines souches peuvent entraîner des infections intestinales ou extra-intestinales (237). Actuellement, les souches de E. coli responsables d'infections intestinales peuvent être regroupées en sept différentes classes: E. coli entérotoxinogènes (ETEC); E. coli entéroinvasifs (EIEC); E. coli entéropathogènes (EPEC); E. coli entérohémorrhagiques (EHEC); E. coli vérotoxinogènes (VTEC); E. coli adhèrent de manière diffuse (DAEC); E. coli entéroaggregatifs (EAggEC) (214). E. coli est capable d'induire la diarrhée, via divers mécanismes. En effet, ce micro-organisme possède différents facteurs de virulence spécifiques interagissant avec la muqueuse intestinale. Les ETEC adhèrent à la muqueuse de l'intestin grêle, grâce à des adhésines fimbriaires, sécrètent des entérotoxines provocant ainsi une diarrhée aqueuse. Les EIEC envahissent les cellules épithéliales du côlon et entraînent une dysenterie (217). Les EPEC sont responsables d'un grand nombre de diarrhées infantiles. Ils sont définis comme des souches non-entéroinvasives qui ne produisent aucune entérotoxine classique (73). Les EPEC adhèrent intimement à la muqueuse intestinale causant la destruction des microvillosités. Ce type de phénomène est appelé communément des lésions attachantes et effaçantes (A/E). Le nom de AEEC a été attribué aux souches d’E. coli produisant ce type de lésions (73). Les EHEC sécrètent des vérotoxines (VT) et sont de plus en plus souvent incriminés dans des épidémies de colite hémorragique. Ces souches sont également des AEEC. Les VTEC produisent une vérotoxine. Quant aux infections induites par DAEC et par EAggEC, leur mécanisme pathogène demeure actuellement peu connu (214). Parmi les différentes catégories d'E. coli diarrhéiques, seuls les ETEC et les VTEC ont été formellement identifiés chez le porcelet (99). D'autres classes d'E. coli entéropathogènes existent probablement chez le porcelet; toutefois, leur rôle demeure méconnu. En période post-sevrage, la diarrhée constitue l'une des principales causes de morbidité et de mortalité (99). La pathogénicité de ce type de diarrhée apparaît beaucoup plus complexe que celle des diarrhées néonatales. Des agents infectieux tels que E. coli, le rotavirus et le coronavirus de la gastro-entérite transmissible sont régulièrement mis en évidence chez les porcelets diarrhéiques en période post-sevrage (99). Les E. coli sont impliqués dans 50% et plus de cas de diarrhée qui apparaissent généralement pendant la première semaine post-sevrage. La majorité des souches isolées chez ces porcelets appartiennent aux classes ETEC (155, 242), ou VTEC (122). Il existe toutefois d'autres souches d'E. coli impliquées dans les troubles de diarrhée post-sevrage. Au Québec, nous avons caractérisé des souches appartenant au sérogroupe 045 qui sont associées à la diarrhée post-sevrage du porcelet et à des lésions d'A/E. Cependant, le mécanisme impliqué dans le développement de ces diarrhées reste encore inconnu. Les objectifs de notre étude étaient multiples: (l) caractériser génotypiquement plusieurs souches 045 afin d'identifier la présence de facteurs de virulence spécifiques aux ETEC, VTEC et AEEC; (2) déterminer la capacité de ces souches à causer les lésions d'A/E au niveau de l'épithélium intestinal de porcelets gnotobiotiques et une toxicité au niveau des cellules HEp-2; (3) développer une technique in vitro permettant d'étudier la capacité des différentes souches d'E. coli 045 d'induire les lésions d'A/E; (4) identifier les principales structures membranaires d'E. coli responsables du développement des lésions d'A/E. Dans le but de caractériser génotypiquement des souches 045, nous avons démontré que les 32 souches d'E. coli 045 examinées étaient majoritairement négatives pour les sondes spécifiques aux entérotoxines LT, STap, STb, VT2 et pour les fimbriae F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P) et F41 rencontrés chez ETEC et VTEC. Parmi ces souches, une seule était positive pour STb et trois l'étaient pour le fimbriae F4. De plus, les souches isolées ont été examinées aussi pour la présence de eaeA Ç"E. coli attaching and effacing") b^jA ("bundle-forming pili") et EAF ("E. coli adherence factor"). Ces gènes étant associés aux souches AEEC chez l'homme. Des 32 souches isolées, 25 hybridaient avec une sonde spécifique au gène eaeA et 11 avec une sonde spécifique à la protéine EAF. Cependant, aucune souche n'a réagit avec la sonde spécifique au gène bjpA. Ces résultats indiquent que les souches 045 n'appartiennent ni à la famille des ETEC ni à celle des VTEC, mais possèdent certains facteurs de virulence des AEEC. Dans le but de déterminer la capacité des souches 045 à provoquer les lésions d'A/E au niveau de l'épithélium intestinal de porcelets gnotobiotiques et une toxicité au niveau des cellules HEp-2, nous avons démontré que 10 des 12 souches eaeA-positives causent les lésions d'A/E chez les porcs nouveau-nés infectés expérimentalement, alors qu'aucune lésion d'A/E n'a été décelée avec les trois souches eaeA-négatives. De plus, nous avons observé un attachement intime des bactéries à la surface cellulaire et un effacement des microvillosités accompagnés d'une formation de structures en piédestal et en forme de coupe. Ces lésions semblent être identiques à celles décrites pour les souches d'EPEC chez l'homme. Cependant, contrairement aux souches AEEC humaines, aucune souche porcine n'a pu démontré une adhérence au niveau des cellules HEp-2. Chez le porc inoculé, nous avons pu observer une corrélation entre la sévérité des lésions et celle de la diarrhée. Cette observation indique que les lésions d'A/E pourraient être impliquées dans l'induction de la diarrhée. Nos résultats démontrent l'importance du gène eaeA dans les souches porcines. Nous avons également montré que les souches d'E. coli 045 font partie intégrante de la famille des AEEC. Nos résultats suggèrent aussi l'existence de différents mécanismes de pathogénicité chez les souches 045. Afin de déterminer la capacité des souches d'E. coli 045 à induire des lésions d'A/E, nous avons développé une nouvelle technique m vitro utilisant la culture de l'iléon de porcelet nouveau-né. Lors de l'inoculation des cultures avec des isolats 045, nous avons observé un attachement des bactéries et un effacement des microvillosités accompagnés de structures en piédestal et en forme de coupe. L'attachement initial des bactéries aux entérocytes a été observé deux à quatre heures après l'inoculation et les lésions de type A/E ont été observées huit heures après l'inoculation. Nous proposons ici un modèle in vitro permettant d'étudier la capacité des E. coli à causer des lésions de type A/E. Les résultats obtenus montrent que 22 des 24 isolais 045 eaeA-positifs induisent des lésions de type A/E dans les explants de l'iléon. De plus, in vitro, certaines souches sont plus pathogènes que d'autres. Cette différence de rapidité dans l'induction des lésions d'A/E est probablement due aux facteurs de virulence de la bactérie. Ces résultats indiquent que certains déterminants impliqués dans le développement des lésions d'A/E pourraient être présents dans certains isolats et absents dans d'autres. Utilisant des modèles in vitro et in vivo, nous avons aussi démontré que seuls les isolats eaeA-positïîs sont capables d'induire les lésions d'A/E typiques. Nos résultats suggèrent donc que le déterminant eaeA joue un rôle important dans l'induction des lésions d'A/E. Cependant, ti-ois isolats eaeA-positïîs n'ont pas induit ce type de lésions. Quatre hypothèses sont déjà suggérées: (l) une défectuosité du gène eaeA; (2) une régulation de l'expression du gène eaeA; (3) l'absence d'un déterminant dont la fonction est similaire au BFP; (4) ou alors l'intervention d'un facteur inconnu. Afin d'identifier les structures de surface d'E. coli du sérotype 045 impliquées dans le développement des lésions d'A/E, l'expression de la protéine EaeA ou intimine, produit du gène eaeA, a été déterminé sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et immunobuvardage. Les résultats obtenus montrent que la majorité (20/22) des souches attachantes et effaçantes d'E. coli expriment une protéine de 97 kDa, alors que cette protéine est absente dans les dix souches non attachantes et non effaçantes. D'autre part, la séquence d'acides aminés N-terminale de la protéine de 97 kDa démontre une homologie avec la protéine EaeA déduite par le gène eaeA des souches EPEC et EHEC humaines. Les résultats du séquençage protéique suggèrent également que la maturation de la protéine EaeA des AEEC ainsi que celle de la protéine EaeA des EPEC et des EHEC s'effectue au niveau du 40e acide aminé. Le premier acide aminé inconnu de la protéine de 97 kDa de la souche 045 porcine correspond au 40 acide aminé (asparagine) de la protéine EaeA des EPEC et des EHEC. Ces conclusions ont été obtenues par comparaison avec le gène eaeA. Une électrophorèse (isoelectric focusing) de la protéine EaeA purifiée par la technique d'immunoaffinité indique que le pl de la protéine EaeA est de 8.4 comparé au pl de 9.5 de la protéine EaeA des souches humaines (358). La protéine EaeA du sérotype 045 constitue une des protéines de la membrane externe des bactéries. Enfin, en utilisant le sémm polyclonal généré par une immunisation de lapin avec des E. coli porcins 045, ou RDEC-1 ou encore en utilisant des anticorps (E2348/69) d'origine humaine, nous avons observé des réactions sérologiques croisées chez différentes espèces animales. Nous avons produit des anticorps monoclonaux spécifiques à la protéine EaeA de souche porcine. L'hybridome Cil, dirigé spécifiquement contre la protéine EaeA, réagit avec une protéine EaeA des souches AEEC de lapin, mais ne reconnaît pas les souches d'origines humaine et canine. Cet anticorps monoclonal semble reconnaître la forme conformationnelle de l'épitope ainsi que sa forme dénaturée. Par immunobuvardage, cet anticorps réagit également avec la protéine EaeA de la souche de lapin (RDEC-1), mais ne réagit pas avec des souches d'origine humaine (E2348/69) ou canine (89-4221). Nous avons démontré, à l'aide d'anticorps polyclonaux, par immunobuvardage et ELISA, que les protéines EaeA sont spécifiques des sérogroupes 045, excepté pour la souche 81-4420. Dans la présente étude, nous avons observé par ELISA des variations dans la production des protéines EaeA parmi les isolats porcins A/E 045. Une ix n correlation significative (p < 0.05) a été observée entre la quantité de protéine EaeA exprimée et la sévérité des lésions d'A/E induites m vivo par les isolats du sérogroupe 045. Ces résultats montrent une corrélation entre la production de la protéine EaeA et la capacité d'induire les lésions d'A/E. D'autre part, la quantité de protéine EaeA produite in vitro, pourrait aussi déterminer la sévérité des lésions d'A/E in vivo. Utilisant une technique d'immunofluorescence (IF) et un test de sensibilité de la protéine EaeA à certaines protéases, nous avons démontré que la protéine EaeA est localisée A la surface de la bactérie. D'une part, l'anticorps Cil réagit avec la bactérie entière indiquant ainsi la présence de la protéine native EaeA à la surface bactérienne. D'autre part, la dégradation de la protéine EaeA de la souche 045 AEEC par la papaïne a été observée lorsque (a) la cellule bactérienne est intacte; (b) les OMPs et la protéine EaeA purifiée sont soumis à des concentrations croissantes de papaïne, indiquant que la protéine EaeA est exposée A la surface externe de la bactérie. La localisation sur la surface externe de la bactérie est probablement nécessaire pour que la protéine EaeA puisse se lier à un ligand présent sur les cellules de mammifères. En conclusion, nous avons démontré qu'E. coli du sérogroupe 045, associé à la diarrhée post-sevrage du porc, induit des lésions attachantes et effaçantes m vivo et in vitro. Ces souches sont donc des AEEC. Leur capacité d'induire des lésions d'A/E semble être liée à la présence du gène eaeA et non au gène bjpA ou au facteur EAF. Nos résultats suggèrent que la protéine EaeA du sérotype 045 joue um rôle important dans la pathogénicité de la bactérie. En tenant compte des différents sérogroupes et de la presence ou absence du gène bjpA, les isolats d’E. coli du sérogroupe 045 différent des EPEC humains. Cependant, ces isolats ressemblent beaucoup plus aux EPEC humains qu'à toute autre catégorie d'E. coli diarrhéique. Nous considérons donc que les isolats d'E. coli caractérisés dans cette étude sont des EPEC-porcins (EPEC-P).

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Le virus Epstein-Barr (VEB) est fortement associé au développement de syndromes lymphoprolifératifs (SLP) en greffe pédiatrique. Ce virus a la capacité d’immortaliser les lymphocytes B et de provoquer leur prolifération incontrôlée chez l’hôte immunodéprimé. Plusieurs études démontrent que le cycle lytique du virus jouerait un rôle primordial dans la genèse des SLP en produisant des particules virales pouvant infecter les cellules B adjacentes. Chez un individu immunodéprimé, ces cellules B nouvellement infectées peuvent donner naissance à une expansion lymphocytaire. Le projet présenté dans ce mémoire fait partie d’un programme de recherche visant à élucider le rôle de l’infection productive par le VEB dans le développement des SLP. L’objectif précis de ce projet est de développer un anticorps monoclonal chimère contre la glycoprotéine gp350 du VEB dans le but de neutraliser le virus et d’ainsi prévenir son entrée dans les cellules B. Notre laboratoire a construit une version chimère de l’anticorps monoclonal murin 72A1, lequel se lie à la gp350 et bloque l’infection. Les premiers essais ont révélé la présence de chaînes non fonctionnelles (aberrantes) dans l’hybridome produisant l’anticorps 72A1. La construction de la chaîne légère authentique est maintenant complète alors que celle de la chaîne lourde est toujours en cours. Le processus de caractérisation de l’anticorps chimère inclura des essais de cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC). Dans cette optique, une lignée cellulaire exprimant de façon stable la gp350 a été établie. Notre anticorps chimère anti-gp350 pourrait éventuellement être utilisé comme thérapie préventive chez les greffés présentant un risque élevé de SLP en empêchant l’infection des cellules B adjacentes. / The Epstein-Barr virus (EBV) is associated with B-cell post-transplant lymphoproliferative disease (PTLD). EBV has the unique property of immortalizing B lymphocytes, thereby causing their uncontrolled proliferation in an immunocompromised host. Certain evidence suggests that EBV productive infection may play a primary role in the genesis of PTLD by generating virus particles which can infect bystander B cells. In an immunocompromised individual, these infected B cells may then give rise to expanding B-cell clones. The project presented in this thesis is part of a research program seeking to elucidate the role of EBV productive infection in the genesis of PTLD. The specific aim of this work was to design a chimeric monoclonal antibody against the EBV envelope glycoprotein gp350 in order to neutralize the virus, thereby preventing entry into B cells. Our laboratory constructed a chimeric version of the murine monoclonal antibody, 72A1, which binds to gp350 and blocks infection. The initial cloning attempts revealed the presence of nonfunctional (aberrant) transcripts in the hybridoma line producing the 72A1 antibody. The chimeric version of the authentic light chain is now completed while the chimeric heavy chain construction is ongoing. As part of the characterisation process for the chimeric antibody, a cell line stably expressing surface gp350 was generated. This gp350-expressing cell line will be used for antibody dependent cellular cytotoxicity assays (ADCC). This anti-gp350 chimeric antibody could be useful as a preventive therapy in transplant patients at high risk for PTLD by blocking the infection of bystander B cells.

Le virus Epstein-Barr (VEB) est un pathogène opportuniste qui a la capacité d’immortaliser les lymphocytes B et de provoquer une prolifération maligne, appelée syndrome lymphoprolifératif post-transplantation (SLP), chez les individus immunodéprimés. A l’intérieur de ce groupe, les personnes à plus haut risque sont les enfants, puisqu’ils sont à risque de développer une infection primaire par le VEB pendant leur régime d’immunosuppression post-greffe. Dans le but de développer un anticorps préventif, notre laboratoire s’est attardé au rôle du cycle lytique du VEB dans le développement du SLP. À cette fin, le premier objectif du présent projet vise à fournir la preuve expérimentale de l’existence ou non d’une phase réplicative productive pendant l’infection aiguë des lymphocytes B sanguins. Un examen des événements qui se déroulent au tout début de l’infection par le VEB tant au niveau de la réplication virale qu’au niveau de l’expression des gènes lytiques précoces et tardifs a révélé l’existence d’une phase réplicative productive pendant l’infection aiguë. Ceci a permis de justifier l’élaboration, dans notre laboratoire, d’un anticorps chimère (murin-humain) neutralisant, dirigé contre la protéine gp350 située sur l’enveloppe virale. Le deuxième objectif, quant à lui, vise à fournir la preuve expérimentale de la capacité neutralisante de cet anticorps chimère. Des essais de caractérisation in vitro ont démontré une capacité de reconnaissance de la protéine cible, notamment la gp350, et une capacité de neutralisation du virus par l’anticorps chimère. L’anticorps chimère anti-gp350 pourra faire l’objet d’essais précliniques in vivo en vue d’évaluer sa capacité à reconnaître le virus et à prévenir l’apparition de tumeurs de type SLP chez les souris SCID. Il pourrait être éventuellement utilisé, par la suite, comme traitement préemptif contre les tumeurs dans l’espoir de mieux gérer les patients à risque de développer un SLP. / Epstein-Barr virus (EBV) is an opportunistic pathogen in immunocompromised transplant patients. In these patients EBV infection can lead to malignant B-cell lymphoproliferation, called post-transplant lymphoproliferative disease (PTLD). This thesis project aimed to investigate the role of lytic EBV infection in the genesis of PTLD. The first experimental objective was to provide in vitro proof that EBV could induce productive replication upon acute in vitro infection of B cells. Data obtained through study of viral DNA replication and transcription during the first 96 hours post-infection indicate that lytic infection does occur. These results provided justification for proceeding to the second experimental objective which involved the characterization of an anti-gp350 human-mouse chimeric antibody for its capacity to recognize and neutralize EBV. Results showed that this antibody did possess neutralization activity. Further study of this anti-gp350 chimeric antibody in SCID mice is necessary in order to evaluate its in vivo efficacy against PTLD.

Lorsqu’il est surexprimé ou activé constitutivement par mutation, le récepteur tyrosine kinase KIT est impliqué dans le développement de pathologies prolifératives comme les mastocytoses, les tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST) et certaines leucémies. La voie de signalisation KIT représente donc une cible thérapeutique majeure en oncologie. Le développement d’une nouvelle classe de molécules pharmacologiques appelées inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) est en plein essor. Un exemple majeur d’ITK est l’imatinib qui cible, entre autre, KIT et est efficace dans la plupart des GIST. Cependant, le traitement aux ITK est souvent confronté au phénomène de résistance primaire ou acquise par mutation secondaire. C’est pourquoi nous cherchons à développer de nouveaux composés ciblant KIT ou les voies de transductions activées par ses formes oncogéniques, et ce par 3 approches.Nous avons récemment montré que les mutants oncogéniques de KIT ont une localisation intracellulaire alors que KIT sauvage est exprimé à la membrane. L’inhibition de l’activité kinase des mutants restaure une localisation normale. A partir de cette observation, nous avons créé et validé un test de criblage par cytométrie mesurant la relocalisation de KIT muté à la surface cellulaire. Le criblage d’une chimiothèque nous a permis de sélectionner de nouveaux inhibiteurs de la signalisation KIT actifs sur des lignées cellulaires mutées pour KIT.Nous avons utilisé la technique du phage display pour sélectionner des anticorps au format scFv et VHH spécifiques de la partie intracellulaire de KIT mutant. Lors de leur expression dans le cytosol (on parle alors d’intrabodies), leur fixation au niveau de KIT inhibe soit directement l’activité kinase, soit le recrutement de partenaires de signalisation. Nous avons obtenu des intrabodies de différentes spécificités vis-à-vis des formes de KIT dont la caractérisation fonctionnelle est en cours Les intrabodies inhibiteurs seront utilisés pour cribler des chimiothèques par ELISA. Les molécules chimiques recherchées empêcheront la fixation des intrabodies sur la région intracellulaire de KIT. On sélectionnera donc des molécules inhibant potentiellement l’oncogénicité de KIT.Nous avons développé des anticorps au format scFv-Fc par phage display qui reconnaissent le domaine extracellulaire de KIT. Deux des anticorps sélectionnés inhibent donc la signalisation induite par le SCF. Dans des lignées de leucémie exprimant KIT WT, nous avons montré que l’utilisation de ces anticorps entraîne une diminution de la viabilité cellulaire. De plus, ils diminuent également la prolifération de lignées de leucémie à mastocytes sensibles et résistantes à l’imatinib (HMC11 et HMC12, respectivement). Ils représentent donc des outils thérapeutiques potentiels pour le traitement des pathologies impliquant KIT ainsi que pour contourner la résistance aux ITK de certains mutants. / When overexpressed or constitutively active by mutation, the tyrosine kinase receptor KIT is involved in some proliferative diseases such as gastro-intestinal stromal tumors (GIST), mastocytosis and some leukemia. Therefore, KIT signaling represents a major target in oncology. Development of a new therapeutic class called tyrosine kinase inhibitors is in full expansion. A major example of TKI is imatinib which targets KIT and is efficient in the majority of GIST cases. However, TKI treatment is often unpaired by primary or acquired resistance due to secondary mutations. That is why we aim to develop new compounds to target KIT or associated signaling pathways by three strategies.We have recently shown that oncogenic KIT mutants are intracellularely localized whereas WT KIT is expressed at the cell surface. Kinase activity inhibition leads to membrane mutants’ relocalization. Based on this finding, we developed and validated a screening assay measuring mutants’ relocalization by cytometry. Chemicals library screening allows us to select new KIT signaling inhibitors active on KIT mutant cell lines.We used phage display to generate scFv and VHH antibodies which are specific to KIT intracellular domain. When expressed in cytoplasm (they are called intrabodies), their binding on KIT inhibits kinase activity directly or signaling partners’ recruitment. Selected intrabodies are specific to various KIT isoforms and their functional characterization is ongoing. KIT inhibitory intrabodies will be used to screen chemical libraries by ELISA for drugs that block intrabodies binding on KIT intracellular domain. We will then select molecules that potentially inhibit KIT oncogenicity.We developed scFv-Fc antibodies by phage display that recognize KIT extracellular domain. Two selected antibodies inhibit SCF induced signaling. In WT KIT expressing leukemic cell lines, we showed that antibody treatment reduces cell viability. Moreover, they also diminish cell proliferation of 2 imatinib sensitive and resistant mast cell leukemia cell lines (HMC1.1 and HMC1.2, respectively). They represent potential therapeutic tools for treatment of KIT involved diseases and for bypass TKI resistance of some mutants.

In this study, we demonstrated that membrane immunofluorescence (MIF) with canine erythrocytes is a much more sensitive diagnostic technique compared with the Coombs test to detect auto-antibodies on RBC. We also demonstrate how the evaluation of the MIF test can be made more precisely which results in a more clear interpretation. Till nowadays the Evans syndrome (combined thrombocytopenia and anemia) is not very well diagnosed in dogs. Only a few studies with low animal numbers tested auto-antibodies on RBC and thrombocytes. Here we describe the frequency of Evans syndrome based on the evaluation of a large data set with 557 dogs. The novelty of the thesis also lies in making a research of the amount of CICs in sera of AIHA/AITP patients is described as well as the cytotoxic potential of patient’s sera for canine leucocytes. These new aspects of diagnosis (AIHA) and pathogenesis (AIHA/AITP) are not only relevant for dogs but also for humans and can be used for better differential diagnosis in medicine. The new findings with respect to circulating immune complexes and cytotoxicity are also offer new therapeutic concepts. Besides, the study has resulted in the characterization of monoclonal antibodies which allow for the detection of so far undetectable canine differentiation antigens (CD molecules) on canine erythrocytes (CD235) and thrombocytes (CD42a). The identified mAbs are useful in the identification of relevant target structures for autoantibodies on these cells.

Le virus Epstein-Barr (VEB) est fortement associé au développement de syndromes lymphoprolifératifs (SLP) en greffe pédiatrique. Ce virus a la capacité d’immortaliser les lymphocytes B et de provoquer leur prolifération incontrôlée chez l’hôte immunodéprimé. Plusieurs études démontrent que le cycle lytique du virus jouerait un rôle primordial dans la genèse des SLP en produisant des particules virales pouvant infecter les cellules B adjacentes. Chez un individu immunodéprimé, ces cellules B nouvellement infectées peuvent donner naissance à une expansion lymphocytaire. Le projet présenté dans ce mémoire fait partie d’un programme de recherche visant à élucider le rôle de l’infection productive par le VEB dans le développement des SLP. L’objectif précis de ce projet est de développer un anticorps monoclonal chimère contre la glycoprotéine gp350 du VEB dans le but de neutraliser le virus et d’ainsi prévenir son entrée dans les cellules B. Notre laboratoire a construit une version chimère de l’anticorps monoclonal murin 72A1, lequel se lie à la gp350 et bloque l’infection. Les premiers essais ont révélé la présence de chaînes non fonctionnelles (aberrantes) dans l’hybridome produisant l’anticorps 72A1. La construction de la chaîne légère authentique est maintenant complète alors que celle de la chaîne lourde est toujours en cours. Le processus de caractérisation de l’anticorps chimère inclura des essais de cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC). Dans cette optique, une lignée cellulaire exprimant de façon stable la gp350 a été établie. Notre anticorps chimère anti-gp350 pourrait éventuellement être utilisé comme thérapie préventive chez les greffés présentant un risque élevé de SLP en empêchant l’infection des cellules B adjacentes. / The Epstein-Barr virus (EBV) is associated with B-cell post-transplant lymphoproliferative disease (PTLD). EBV has the unique property of immortalizing B lymphocytes, thereby causing their uncontrolled proliferation in an immunocompromised host. Certain evidence suggests that EBV productive infection may play a primary role in the genesis of PTLD by generating virus particles which can infect bystander B cells. In an immunocompromised individual, these infected B cells may then give rise to expanding B-cell clones. The project presented in this thesis is part of a research program seeking to elucidate the role of EBV productive infection in the genesis of PTLD. The specific aim of this work was to design a chimeric monoclonal antibody against the EBV envelope glycoprotein gp350 in order to neutralize the virus, thereby preventing entry into B cells. Our laboratory constructed a chimeric version of the murine monoclonal antibody, 72A1, which binds to gp350 and blocks infection. The initial cloning attempts revealed the presence of nonfunctional (aberrant) transcripts in the hybridoma line producing the 72A1 antibody. The chimeric version of the authentic light chain is now completed while the chimeric heavy chain construction is ongoing. As part of the characterisation process for the chimeric antibody, a cell line stably expressing surface gp350 was generated. This gp350-expressing cell line will be used for antibody dependent cellular cytotoxicity assays (ADCC). This anti-gp350 chimeric antibody could be useful as a preventive therapy in transplant patients at high risk for PTLD by blocking the infection of bystander B cells.

Le virus Epstein-Barr (VEB) est un pathogène opportuniste qui a la capacité d’immortaliser les lymphocytes B et de provoquer une prolifération maligne, appelée syndrome lymphoprolifératif post-transplantation (SLP), chez les individus immunodéprimés. A l’intérieur de ce groupe, les personnes à plus haut risque sont les enfants, puisqu’ils sont à risque de développer une infection primaire par le VEB pendant leur régime d’immunosuppression post-greffe. Dans le but de développer un anticorps préventif, notre laboratoire s’est attardé au rôle du cycle lytique du VEB dans le développement du SLP. À cette fin, le premier objectif du présent projet vise à fournir la preuve expérimentale de l’existence ou non d’une phase réplicative productive pendant l’infection aiguë des lymphocytes B sanguins. Un examen des événements qui se déroulent au tout début de l’infection par le VEB tant au niveau de la réplication virale qu’au niveau de l’expression des gènes lytiques précoces et tardifs a révélé l’existence d’une phase réplicative productive pendant l’infection aiguë. Ceci a permis de justifier l’élaboration, dans notre laboratoire, d’un anticorps chimère (murin-humain) neutralisant, dirigé contre la protéine gp350 située sur l’enveloppe virale. Le deuxième objectif, quant à lui, vise à fournir la preuve expérimentale de la capacité neutralisante de cet anticorps chimère. Des essais de caractérisation in vitro ont démontré une capacité de reconnaissance de la protéine cible, notamment la gp350, et une capacité de neutralisation du virus par l’anticorps chimère. L’anticorps chimère anti-gp350 pourra faire l’objet d’essais précliniques in vivo en vue d’évaluer sa capacité à reconnaître le virus et à prévenir l’apparition de tumeurs de type SLP chez les souris SCID. Il pourrait être éventuellement utilisé, par la suite, comme traitement préemptif contre les tumeurs dans l’espoir de mieux gérer les patients à risque de développer un SLP. / Epstein-Barr virus (EBV) is an opportunistic pathogen in immunocompromised transplant patients. In these patients EBV infection can lead to malignant B-cell lymphoproliferation, called post-transplant lymphoproliferative disease (PTLD). This thesis project aimed to investigate the role of lytic EBV infection in the genesis of PTLD. The first experimental objective was to provide in vitro proof that EBV could induce productive replication upon acute in vitro infection of B cells. Data obtained through study of viral DNA replication and transcription during the first 96 hours post-infection indicate that lytic infection does occur. These results provided justification for proceeding to the second experimental objective which involved the characterization of an anti-gp350 human-mouse chimeric antibody for its capacity to recognize and neutralize EBV. Results showed that this antibody did possess neutralization activity. Further study of this anti-gp350 chimeric antibody in SCID mice is necessary in order to evaluate its in vivo efficacy against PTLD.