MARINHO, Aline Diogo. Efeitos renais e mecanismos de morte celular promovidos pelo veneno da serpente Bothropoides pauloensis. 2013. 100 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-06-20T16:18:04Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_admarinho.pdf: 2712150 bytes, checksum: 026b5412cf5d91c170caa483b64e28e7 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-06-20T16:18:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_admarinho.pdf: 2712150 bytes, checksum: 026b5412cf5d91c170caa483b64e28e7 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-06-20T16:18:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_admarinho.pdf: 2712150 bytes, checksum: 026b5412cf5d91c170caa483b64e28e7 (MD5) Previous issue date: 2013 / According to the Ministry of Health of Brazil, Bothrops are the main involved in snakebites in the country and acute kidney injury is a serious complication of poisoning by these snakes. In this work, we investigated the renal effects of total venom Bothropoidespauloensis (VBP) in isolated rat kidney system and in cultured renal tubular cell line MDCK (Madin - Darby Canine Kidney). For perfusion of isolated kidney Wistar rats were used weighing 250- 300g, whose kidneys were surgically excised and perfused with Krebs- Henseleit solution containing 6% w/v pre-dialysed bovine serum albumin. The effects of VBp (n = 3μg/mL and 10 mg/mL; n=6) was investigated. Reduction was observedin perfusion pressure (PP) at a concentration of 10μg/mL at 90 and 120 min. Renal vascular resistance (RVR) also decreased the concentration of 10μg/mL at 90 and 120 minutes and at a concentration of 3 mg/mL at 120 min. The urinary flow (FU) decreased at 90 and 120 minutes in both concentrations, no significant difference between the concentrations at the time of 120min. The glomerular filtration rate (GFR) was reduced to 60 minutes in both concentrations and remained decreased until the end of the experiment, no significant difference between the concentrations in the time of 60min. The percentage of tubular sodium transport (%TNA+) was reduced by both concentrations in times of 60, 90 and 120 min, with no significant difference between the concentrations at time 60 min. The tubular transport of chloride (%TCl-) was also reduced to 60, 90 and 120 min. In both concentrations; the tubular potassium transport (%TK+) decreased at 60, 90 and 120 minutes at a concentration of 10μg/mL in a concentration of 3μg/mL reduced to 60 min, returning to near control at 90 and 120min values. No significant difference between the concentrations in the times of 60 and 90 min. The analysis showed the presence of significant morphological changes such as the accumulation of proteins plate level in the culture of MDCK cells, the VBP was able to reduce cell viability (IC50 = 7.5 g/ mL). Flow cytometry with Annexin V and propidium iodide showed that cell death occurred by apoptosis predominantly. VBP treatment ( 7.5 mg/ml) led to a significant depolarization of the mitochondrial membrane potential. We verified the generation of Reactive Oxygen Species. Morphological analysis of the cells showed features indicative of apoptosis. These results demonstrate that the venom of B. pauloensis altered all renal parameters evaluated in the kidney perfusion was cytotoxic to isolated and MDCK cell culture. / De acordo com o Ministério da Saúde do Brasil, as serpentes do gênero Bothrops são as principais envolvidas nos acidentes ofídicos no país e a insuficiência renal aguda (IRA) é uma complicação grave dos envenenamentos por estas serpentes. Neste trabalho, foram investigados os efeitos renais do veneno total de Bothropoides pauloensis (VBp) em sistema de rim isolado de rato e em cultura de células tubulares renais da linhagem MDCK (Madin-Darby Canine Kidney). Para perfusão de rim isolado foram utilizados ratos Wistar pesando entre 250 e 300g, cujos rins foram excisados cirurgicamente e perfundidos com solução de Krebs-Henseleit contendo 6%p/v de albumina bovina previamente dialisada. Foram investigados os efeitos do VBp (3µg/mL e 10 µg/mL; n=6). Verificamos queda na pressão de perfusão (PP) na concentração de 10μg/mL aos 90 e 120 min. A resistência vascular renal (RVR) também diminuiu na concentração de 10μg/mL aos 90 e 120 minutos e na concentração de 3 μg/mL aos 120 min. O fluxo urinário (FU) diminuiu aos 90 e 120 minutos em ambas as concentrações, não apresentando diferença significativa entre as concentrações no tempo de 120min. O ritmo de filtração glomerular (RFG) apresentou uma redução aos 60 minutos em ambas as concentrações, mantendo-se diminuída até o final do experimento, não havendo diferença significativa entre as concentrações no tempo de 60min. O percentual de transporte tubular de sódio (%TNA+) foi reduzido em ambas as concentrações nos tempos de 60,90 e 120min, não apresentando diferença significativa entre as concentrações no tempo de 60 min; O transporte tubular de cloreto(%TCl-) também foi reduzido aos 60, 90 e 120min. Em ambas as concentrações; O transporte tubular de potássio (%TK+) diminuíram aos 60, 90 e 120 minutos na concentração de 10μg/mL, na concentração de 3μg/mL reduziu aos 60 min,retornando a valores próximos ao controle no tempo de 90 e 120min. Não havendo diferença significativa entre as concentrações nos tempos de 60 e 90 min. A análise mostrou a presença de alterações morfológicas significativas, como acúmulo de proteínas a nível tubular. Na cultura de células MDCK, o VBp foi capaz de diminuir a viabilidade celular (CI50= 7,5μg/mL). Citometria de fluxo com anexina V e iodeto de propídio mostrou que a morte celular ocorreu predominantemente por apoptose. Tratamento com VBp (7,5 μg / mL) levou a despolarização significativa do potencial de membrana mitocondrial. Verificamos a geração de Espécies Reativas de Oxigênio. A análise morfológica das células mostrou características indicativas de apoptose. Esses resultados demonstram que o veneno de B. pauloensis alterou todos os parâmetros renais avaliados na perfusão de rim isolado e foi citotóxico para cultura de células MDCK.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / A galactosemia é uma condição causada pela deficiência de uma das quatro enzimas envolvidas no metabolismo da galactose: galactose mutarotase, galactocinase, galactose-1-fosfato uridiltransferase e UDP galactose - 4 - epimerase. Como consequência deste bloqueio, os indivíduos afetados pela galactosemia não podem efetivamente converter galactose em glicose, apresentando acúmulo de galactose e seus metabólitos em seus tecidos, especialmente nas células do tecido nervoso central, fígado e rins. Dentre os principais achados clínicos, destaca-se disfunção cerebral com atraso de desenvolvimento e deficiência de aprendizado e de memória, cuja fisiopatologia ainda não está esclarecida. Considerando-se o parco conhecimento a respeito dos mecanismos fisiopatológicos do dano cerebral apresentado por pacientes galactosêmicos, o presente trabalho avaliou o efeito da administração aguda de galactose sobre vias apoptóticas em cérebros de ratos jovens. Para tanto, vinte e quatro ratos machos da linhagem Wistar de 30 dias foram divididos em dois grupos: controle e galactosemia. Os animais do grupo galactosemia receberam uma única administração subcutânea de 5 μmol/g de peso corporal de galactose. Os animais do grupo controle receberam solução salina nos mesmos volumes por via subcutânea. Uma hora após a administração deste carboidrato, os animais sofreram eutanásia por decapitação com guilhotina e o córtex cerebral e o cerebelo foram isolados e limpos. Foram então determinados os imunoconteúdo de Bax, Bcl-2, AIF e p53, proteínas que fazem parte de vias de morte celular por apoptose, e a razão Bax/Bcl-2 nestes tecidos por western blotting. Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos nos conteúdos das proteínas avaliadas, bem como na razão entre Bax/Bcl-2 em nenhuma das estruturas cerebrais estudadas. Os resultados do presente trabalho sugerem que a administração aguda de galactose não altera os processos de morte celular por apoptose via proteínas Bax, Bcl-2, AIF e p53 em cérebro de ratos jovens.

Glioblastoma multiforme é o tipo mais frequente de tumor cerebral primário, sendo caracterizado por uma alta agressividade e um prognóstico bastante limitado. O ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA) é um inibidor específico de histonas desacetilases aprovado para o tratamento de linfoma cutâneo de células T, e em fase de crescente investigação clínica e pré-clínica em tumores sólidos. Neste estudo, avaliamos a eficácia do ácido hidroxâmico suberoilanilida em tratamento combinado com temozolomida, o agente alquilante já utilizado em glioblastomas. Através de testes de viabilidade e analises por citometria de fluxo em células tumorais das linhagens U251MG e C6, observamos que não houve sinergismo de potenciação entre temozolomida e ácido hidroxâmico suberoilanilida, apenas efeito sinergismo de adição O tratamento combinado inicialmente promoveu parada do ciclo celular em fase G2/M (≥48 h) ao passo que a apoptose foi detectada apenas em exposição prolongada (≥96 h) aos fármacos em estudo. Ainda, as células tratadas com TMZ/SAHA apresentaram fenótipo autofágico, como determinado por citometria de fluxo e imunodetecção de proteínas marcadoras de autofagia como LC3 e o p62/SQSTM1. A autofagia temporalmente precedeu a apoptose e exerceu função citoprotetora, uma vez que o bloqueio da terminação autofágica com cloroquina promoveu uma significante redução na viabilidade celular, a qual foi associada a um aumento de apoptose em células de glioma tratadas com TMZ/SAHA. Portanto, os dados apresentados neste trabalho demonstram que a autofagia é um processo que diminui a eficácia antiglioma do temozolomida e do ácido hidroxâmico suberoilanilida, e a inibição deste fenômeno pode ser uma estratégia para aperfeiçoar a terapia com esses fármacos. / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most frequent and aggressive type of primary brain tumor which has been associated with a dismal prognosis. In this study, we tested the efficacy of combining temozolomide (TMZ) with suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) - an inhibitor of HDACs 1, 2, 3, and 6 approved for the treatment of cutaneous T-cell lymphoma - in the viability of tumor cells. The data showed that potentiation synergism between TMZ e SAHA was not achieved due to activation of protective autophagy in vitro. The SAHA/TMZ treatment promoted arrest in the G2/M phase of the cell cycle as soon as 48 h after drug exposure whereas apoptosis was only detected after long-lasting exposure (≥96 h). In addition, SAHA and TMZ induced autophagy as detected by flow cytometry of acridine orange stained cells and immunodetection of the lipidated form of LC3 as well as decreases in p62/SQSTM1. Autophagy preceded apoptosis, and by blocking the termination step of autophagy with chloroquine promoted a significant reduction in the viability of glioma cells which was accompanied by increased apoptosis in SAHA/TMZ treatment. Overall, the herein presented data demonstrate that autophagy impairs the efficacy of combined TMZ/SAHA, and inhibiting this phenomenon could provide novel opportunities to improve the therapeutic potential of these compounds.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Natural products and their derivatives are currently the most important source of novel therapeutic agents and provide useful tools for studies in physiopathology and pharmacology. Snake venoms display a wide array of pharmacological properties due to their complex combinations of active substances, especially peptides and proteins, capable of interfering with physiological processes. Snakes of the genera Bothrops and Bothropoides accounted for 70% of snake bites reported in Brazil. The Bothropoides insularis (golden lancehead) is endemic to Queimada Grande, an island off the state of SÃo Paulo. Like the venom of other Bothrops species, the venom of B. insularis has coagulant, hemorrhagic and fibrinolytic properties and is known to cause kidney failure in vivo. The objective of the study was to evaluate of whole venom of B. insularis and its phospholipase A2 fraction in Madin-Darby canine kidney (MDCK) cell culture tubes. The cells were grown in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum in plastic vials with an atmosphere containing 5% CO2 at 37ÂC. Treatment with whole venom reduced cell viability at all the concentrations tested (200, 100, 50, 25, 12.5 and 6.25 mg/mL) and yielded an IC50 of 9 μg/mL. Cell membrane integrity during the process of cell death from whole venom was evaluated by LDH enzyme assay, indicating enzyme release at all concentrations. Flow cytometry with Annexin V-FITC and propidium iodide revealed that cell death at the lowest concentrations (18 and 36 μg/mL) of whole venom occurred predominantly by apoptosis. However, at the highest concentration (72 μg/mL), in addition to death by apoptosis, an increased number of cells in late apoptosis was observed.In the Rhodamine 123 assay the treatment with whole venom (36 μg/mL) induced significant depolarization of the mitochondrial membrane potential. The expression of genes involved in cell death by apoptosis did not show any significant results, when tested with whole venom in 24h. The phospholipase A2 fraction was also submitted to cell viability and membrane integrity assays at several concentrations (200, 100, 50, 25, 12.5 and 6.25 mg/mL), with no significant results in any of the experiments. Taken together, our results indicate that the venom of B. insularis is cytotoxic in MDCK cell culture and that cell death occurs predominantly by apoptosis. / Os produtos naturais e seus derivados tÃm sido as fontes mais comuns na obtenÃÃo de agentes terapÃuticas inovadores, alÃm de fornecerem ferramentas para estudos fisiopatolÃgicos e farmacolÃgicos. Os venenos de serpentes exibem uma infinidade de atividades farmacolÃgicas, por serem formados por uma mistura complexa de substÃncias ativas, principalmente peptÃdeos e proteÃnas, capazes de interferir com muitos processos fisiolÃgicos. As serpentes Bothrops e Bothropoides sÃo responsÃveis por 70% dos acidentes ofÃdicos ocorridos no Brasil. A serpente Bothropoides insularis (jarara ilhoa), Ã uma espÃcie endÃmica nativa da ilha de Queimada Grande na costa Sul do Estado de SÃo Paulo, seu veneno apresenta caracterÃsticas semelhantes aos das outras serpentes do gÃnero Bothrops, como atividade coagulante, hemorrÃgica, fibrinolÃtica e insuficiÃncia renal in vivo. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do veneno total da Bothropoides insularis e sua fraÃÃo fosfolipase A2 em culturas de cÃlulas tubulares renais do tipo MDCK (Madin-Darby canine kidney). CÃlulas MDCK foram cultivadas em garrafas plÃsticas a 37 ÂC em atmosfera de 5% de CO2, com meio RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal a 10%. O tratamento com veneno total da B.insularis causou diminuiÃÃo da viabilidade celular em todas as concentraÃÃes (200; 100; 50; 25; 12,5 e 6,25 mg/mL) estudadas com um IC50 de 9 μg /mL. A integridade da membrana celular foi avaliada pelo mÃtodo de determinaÃÃo da enzima lactato desidrogenase, e apÃs a exposiÃÃo das cÃlulas ao veneno houve um aumento significativo da enzima. Nos ensaios de citometria de fluxo com anexina V-FITC e iodeto de propÃdio foi observada a morte celular nas menores concentraÃÃes (18 e 36 μg/mL) estudadas com o veneno total e ocorreu predominantemente por apoptose. No entanto na maior concentraÃÃo (72μg/mL) estudada, foi observado alÃm da morte por apoptose, um aumento de cÃlulas em apoptose tardia. Nos ensaios com rodamina 123, o tratamento com o veneno total da B.insularis (36 μg/ mL) levou a despolarizaÃÃo significativa do potencial de membrana mitocondrial. NÃo houve expressÃo significativa de genes envolvidos na morte celular por apoptose. Ensaios de viabilidade celular e integridade de membrana foram realizados com a fraÃÃo fosfolipase A2 do veneno da B.insularis, em vÃrias concentraÃÃes (200; 100; 50; 25; 12,5 e 6,25 mg/mL), nÃo apresentado resultados significativos em nenhum dos experimentos. Esses resultados demonstram a citotoxicidade do veneno de B. insularis em culturas de cÃlulas tubulares renais (MDCK), e sugerem morte celular predominantemente por apoptose

Pacientes que sobrevivem a uma parada cardíaca ou a um AVE demonstram uma alta incidência de prejuízos neurológicos como resultado do dano neuronal isquêmico tardio. Uma intervenção farmacológica apropriada durante a janela terapêutica entre o recomeço do fluxo sanguíneo normal e o início do dano neuronal seria de grande benefício, porém as abordagens experimentais atuais são limitadas neste sentido. Ao longo da última década, dados provenientes de muitos estudos apoiam a ideia que estrógenos promovem efeitos neuroprotetores em uma variedade de doenças neurodegenerativas, incluindo a isquemia cerebral global. O potente hormônio feminino 17-β-estradiol (E2) é neuroprotetor em uma variedade de modelos celulares e animais de isquemia, contudo os paraefeitos inerentes a sua terapêutica não permitem seu uso em larga escala. Considerando a estrutura e mecanismo de ação similares dos fitoestrogênios no SNC, o objetivo deste estudo foi verificar os efeitos neuroprotetores de coumestrol, um potente isoflavonóide com alta afinidade de ligação por ambos os receptores de estrogênio (ERs) e alto potencial antioxidante, contra a neurodegeneração geralmente encontrada em eventos isquêmicos. Nós demonstramos aqui que coumestrol foi hábil em resgatar a morte neuronal na subárea CA1 hipocampal induzida pela isquemia global em ratas fêmeas em uma avaliação de sobrevivência celular, incluindo 24h pós-isquemia, e que esta neuroproteção parece ser mediada através dos ERs. Em um próximo passo, avaliamos se a pré-administração de coumestrol poderia reverter a atividade da bomba de Na+/K+-ATPase, cuja atividade se encontra prejudicada após insultos isquêmicos, e se sua ação seria igualmente efetiva quando administrado em ratos machos. A análise demonstrou que coumestrol foi eficiente em restaurar a atividade da Na+/K+-ATPase em todos os tempos avaliados, incluindo 24h pós-isquemia. A efetividade em prevenir a morte neuronal em ratos machos foi igualmente observada em todos os tempos de administração, incluindo 24h pós-isquemia. As correspondências neuroprotetoras no tempo de 24h na neuroproteção sugerem um possível mecanismo pelo qual coumestrol possa estar agindo para promover neuroproteção em longo prazo. Sabendo que a morte neuronal tardia na isquemia global está associada com a redução na expressão de GluR2 na região CA1 pouco antes do início da morte celular, examinamos o possível papel de coumestrol na expressão de GluR2 em camundongos machos em três diferentes tempos pós-isquemia. O evento isquêmico reduziu os níveis proteicos de GluR2 hipocampais em todos os tempos avaliados e o tratamento com coumestrol foi efetivo em prevenir essa redução. Adicionalmente, estando consciente que a excitotoxicidade é um dos mecanismos celulares ligados à neurodegeneração associada à isquemia, buscou-se determinar se coumestrol poderia promover neuroproteção in vitro, contra a excitotoxicidade induzida por NMDA em culturas neuronais hipocampais. Nós observamos que coumestrol promoveu neuroproteção, porém somente quando sua administração foi perto do evento excitotóxico. Atribuímos esta inabilidade em conferir neuroproteção em longo prazo devido à presença do inibidor de células gliais presente na cultura neuronal, que limita a proliferação glial em 10% ou menos, sugerindo o sistema glial como um importante coadjuvante no contexto da neuroproteção em longo prazo conferida por coumestrol. Estendendo nossa investigação para uma avaliação comportamental, examinamos se coumestrol poderia ser igualmente eficaz em prevenir os déficits de memória presentes após um insulto isquêmico. A análise histológica confirmou a neuroproteção promovida pela administração de coumestrol como esperado, e sua terapêutica foi bem sucedida em reverter os déficits de memória promovidos pela isquemia global. Portanto, esses resultados coletivos indicam que coumestrol desperta novas perspectivas dentro da terapêutica da isquemia global e abre novas possibilidades na investigação no contexto dos acidentes vasculares encefálicos. / Patients who survive cardiac arrest or stroke demonstrate a high incidence of neurological impairment as a result of delayed ischemic neuronal damage. Proper pharmacological intervention during the therapeutic window between the resumption of normal blood flow and the onset of neuronal damage would be of great benefit, but the current experimental approaches have yielded only limited success. Over the last decade, data from many studies support the idea that estrogens provide neuroprotective effects in a variety of neurodegenerative diseases, including cerebral global ischemia. The potent feminizing hormone 17-β-estradiol (E2) is neuroprotective in a host of cell and animal models of stroke, however the side effects inherent its therapeutics doesn’t allow its use in a large scale. Considering the similar structure of phytoestrogens and its similar actions within the CNS, the aim of this study was verify the neuroprotective effects of coumestrol, a potent isoflavonoid with high binding affinities for both estrogen receptors (ERs) and significant antioxidant activity, against neurodegeneration usually observed in global ischemic events. We demonstrate here that coumestrol was able to rescue neuronal death in the hippocampal CA1 subfield induced by global ischemia in female rats in a cell survival evaluation, including 24h after ischemia, and its neuroprotective actions seems to be through the ERs. In a next step, we evaluated if coumestrol pre-administration could rescue the Na+/K+-ATPase activity that is found severely impaired after ischemic insults, and if its administration would be equally neuroprotective in male rats. The analysis showed that coumestrol was able to reverse the Na+/K+-ATPase activity in all times of evaluation, including 24h after ischemia. The effectiveness in preventing neuronal death in male rats was also observed in all time-points evaluated, including 24h after ischemia. These two 24h correspondence in neuroprotection suggests one possible mechanism by which coumestrol could be acting to afford neuroprotection in a long term. Knowing that the delayed neuronal death in global ischemia is associated with a reduced GluR2 expression in CA1 hippocampal field just before the cell death onset, we examined the possible role of coumestrol at the level of GluR2 expression of male mice in three different time-points after ischemia. The ischemic event induced high suppression of GluR2 in all evaluated times and coumestrol pre-treatment was able in preventing this reduction. In addition, being aware that excitotoxicity is one of the cellular mechanisms linked to cerebral ischemic neurodegeneration, we sought to determine if coumestrol could be neuroprotective in vitro as well, against a NMDA-induced excitotoxicity in hippocampal neuronal culture. We observed that coumestrol was skilled to afford neuroprotection only when its administration was next to the excitotoxic event. We attribute this longest reach inability of neuroprotection due the glial inhibitor present in the neuronal culture, which limits the glial cells proliferation in 10% or less, suggesting the glial system as an important adjuvant in the context of the coumestrol longer therapeutic window. Extending our investigation in a behavior assessment, we examined if the coumestrol could be also virtuous in preventing the memory deficits present after an ischemic insult. The histological analysis confirmed the reduction in neuronal loss afforded by coumestrol administration as expected, and its pre ischemic administration was able to rescue the memory impairment promoted by the global ischemia. Therefore, our collective results indicate that coumestrol spread new perspectives in the context of global ischemia therapeutics and unlock new possibilities for the stroke investigation.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:05:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX) / As epilepsias do lobo temporal são as que apresentam maior refratariedade ao tratamento farmacológico e perfazem 2/3 das intervenções cirúrgicas de epilepsia, sendo portanto de grande custo social, econômico e psicológico. Assim, modelos animais de epilepsia do lobo temporal são de grande relevância não só para o entendimento das bases neurais dessa patologia, mas também para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas capazes de evitar a instalação da doença. Esses são os objetivos da presente dissertação de doutorado. Após um evento traumático (no caso deste trabalho, um estado de mal epiléptico), diversas alterações morfológicas e fisiológicas acontecem, caracterizando a gênese da síndrome epiléptico (epileptogênese). Dentre as alterações podemos destacar a intensa fosforilação de proteínas em resíduos de tirosina e a ativação de diferentes segundos mensageiros. Os dois primeiros capítulos desta tese descrevem a tentativa de bloquear os processos de epileptogênese por meio da inibição da fosforilação de resíduos de tirosma através do tratamento farmacológico com inibidores das tirosina cinases, a herbimicina A e o K-252a. O terceiro capítulo analisa eletrofisiologicamente o circuito neural do giro denteado em animais que apresentavam uma mutação em um sítio inibitório da proteína cálcio/calmodulina cinase do tipo II (CaMK1I). No primeiro capítulo, mostramos que o tratamento agudo com herbimicina A (348M, 5L, icv), é capaz de bloquear a potenciação duradoura (LTP) induzida por um estímulo tetânico bem como de atenuar (~40 por cento) a ativação neuronal (expressão de c-Fos) decorrente de um estado de mal epiléptico induzido pela administração sistêmica de pilocarpina (SE). Apesar dos significativos efeitos agudos, este tratamento mostrou-se incapaz de atenuar a freqüência de crises espontâneas, bem como o padrão de morte neuronal observado após o estado de mal epiléptico induzido pela pilocarpina. Entretanto, o tratamento com herbimicina A alterou o padrão de marcação de metais pesados (Zn+2) no hilo do giro denteado e na região de CA, do hipocampo, porém não apresentou efeito sobre o padrão de brotamento das fibras musgosas observado na camada molecular do giro denteado. No segundo capítulo, mostramos que a herbimicina e o K252a modificam a atividade epileptiforme induzida pela administração intra-hipocampal de ácido caínico, sem alterar o padrão de morte neuronal. Esses resultados sugerem que o tratamento com inibidores de proteínas tirosina cinases é capaz de modificar o padrão de ativação agudo do hipocampo após um estímulo (ie., o estado de mal epiléptico ou a LTP), porém sem qualquer efeito sobre o processo de epileptogênese. No terceiro capítulo, estudamos a excitabilidade e a plasticidade do giro denteado à estimulação da via perfurante (principal aferência da formação hipocampal) em animais que apresentam uma CaMKII geneticamente modificada. Essa proteína uma vez ativada não pode ser inibida. A caracterização eletrofisiológica demonstrou que esses animais apresentam potenciais de campo evocados no giro denteado aparentemente semelhante aos animais controle (wild-type), porém sua responsividade a padrões de estimulação em salvas e sua plasticidade apresentaram clara alteração. Essa modificação foi caracterizada por uma maior variabilidade nas respostas à trens de estimulação (freqüências de 1 e 2 Hz) e maior inibição do pulso pareado em trens de estimulação (para pulsos pareados aplicados a freqüência de 5 Hz). Além disso, conforme já descrito na literatura, mostramos que a susceptibilidade a atividade epileptiforme depende do padrão de estimulação utilizado para os diferentes animais (mutantes vs. wild-type). Assim, utilizando o modelo clássico do abrasamento demonstramos que a mutação não altera a evolução da epileptogênese. Entretanto, ao utilizarmos duas variantes de um padrão de estimulação similar à freqüência teta (5Hz, Intermittent vs. Continuous theta-burst stimulations), demonstramos a importância da mutação na manutenção da excitabilidade do giro denteado. Esses resultados destacam a importância da CaMKII na atividade epileptiforme além de sugerir novas abordagens experimentais (ie., sensibilidade à padrões de estimulação eletrofisiológica) no estudo da epiloptogênese. Em resumo, os resultados apresentados nessa tese contribuem para um melhor entendimento dos fenômenos subjacentes aos processos de plasticidade neuronal e da contribuição destes para o fenômeno de epiloptogênese, além de sugerir abordagens promissoras de intervenção e estratégias farmacológicas de relevância clínica. / Temporal lobe epilepsies are highly refractory to pharmacological treatment. Up to 70% of these patients undergo chirurgical resection of temporal region, procedure with important consequences for the social, economic and psychological spheres. Experimental animal models that mimic temporal lobe epilepsy provide an insightful approach to study the neural basis of epilepsy as well as create opportunities to test promising therapeutic drugs. The present thesis tests the antiepileptogenic activity of two protein tyrosine kinase inhibitors and the relevance of Ca+2/calmodulin kinase type II (CaMKII) mutants. Multiples morphological and physiological alterations take place after a traumatic brain injury (in this thesis, the status epilepticus) leading the animal to an epileptic conditions. During this period, the epileptogenesis process, there is strong tyrsine phosphorylation with the activation of many second messengers. The first two chapters of the thesis describe experiments in which herbimycin A and K-252a, two protein tyrosine kinase inhibitors, were used to attenuate synaptic plasticity and epileptogenesis. The third chapter, the dentate gyrus network was studied after angular bundle stimulation in animals presenting one punctual mutation at the autoinhibitory phosphorylation site of the CaMKII. In the first chapter, we showed that one single herbimycin A injection (348μM, 5μL, icv) was able to attenuate long-term potentiation (LTP) in the commissural CA3 neurons and also, to decrease status epilepticus- (SE-) induced neuronal activation (c-Fos expression) in almost 40%.Although markedly acute effects, the present herbimycin A treatment was not able to diminish spontaneous seizure frequency, cell death or aberrant mossy fiber sprouting observed after the pilocarpine-induced SE. Curiously, herbimycin-treated animals presented decreased neo-Timm staining in the hilus and CA3 region despite the epileptic condition. In the second chapter, we confirmed the ability of protein tyrosine kinase inhibitors to decrease SE-induced neuronal activation. Herbimycin A icv treatment altered the kainic acid-induced epileptiform profile in EEG recordings. Cell death pattern was not altered by any pharmacological treatment. These results suggest that protein tyrosine kinase inhibitiors are able to modify the acute neuronal activation and plasticity (ictogenesis or LTP) but is ineffective in attenuating the epileptogenesis process.In the third chapter, we studied the dentate gyrus excitability and plasticity after angular bundle stimulation in CaMKII mutant animals. Once in its self-sustained mode, this mutation does not allow the reduction of the catalytic activity of the kinase. These animals present normal electrophysiological profiles (similar to wild-type animals) but with reduced amplitude. Shortterm plasticity was clearly altered. Mutant animals presented increased variability in the responses to trains of stimulation at 1 and 2 Hz, and at at 5Hz stronger paired-pulse inhibition. Accordingly to the literature, we also showed that the epileptiform susceptibility depends on the stimulation pattern used in both animals (mutants vs. wild-type). Thus, although the mutation did not altered the behavior and the electrographic kindling evolution, we showed that mutant animals were prone to afterdischarges when stimulate by an intermittent theta-burst stimulation. On the other hand, the same animals needed more bursts to induce afterdischarges when the stimulation was set in the continuos mode.Taken together, the present results contribute to a better understanding of the protein tyrosine kinase and CaMKII function in neuronal plasticity underlying the epileptogenesis process and sum efforts in searching for a clinic antiepileptogenic drug. / FAPESP: 00/10826-3 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

A caracterização da morte neuronal após injúria neuronal aguda é um assunto muito discutido e que está sob constante investigação. O presente estudo tem por objetivo caracterizar a morte celular na camada de células piramidais da região CA1 do hipocampo após 10 minutos de isquemia e períodos precoces de reperfusão, utilizando a microscopia eletrônica da transmissão. O modelo animal empregado para produzir a isquemia prosencefálica foi o de oclusão dos 4 vasos com modificações (Netto et al, 1993). Após 3, 6, 12 e 24 h de reperfusão, os animais eram anestesiados e perfundidos transcardiacamente. Os encéfalos eram removidos e seccionados. Os cortes contendo o hipocampo eram desidratados, incluídos em resina, seccionados, observados no microscópio eletrônico de transmissão e eletromicrografados. As células piramidais da região CA1 do hipocampo de todos os grupos submetidos à isquemia apresentavam alterações morfológicas. Em tempos precoces de reperfusão as alterações eram menos expressivas quando comparadas a maiores tempos de reperfusão, e envolviam sinais de necrose apoptótica e necrose oncótica. Com 12 h de reperfusão, as células apresentavam uma aparente recuperação. Decorridas 24 h do insulto isquêmico, o dano neuronal era mais severo e incluía sinais de necrose oncótica, assim como, corpos apoptóticos, os quais caracterizam a morte celular por necrose apoptótica É possível que as células no período pós-isquemia passem por um processo conhecido como um continnum entre a apoptose e a necrose, ou, um processo denominado parapoptose. A aparente recuperação ocorrida com 12 h de reperfusão pode dever-se à influência das células gliais, em especial das células astrocitárias. Dessa forma, o presente estudo fornece evidências que a morte celular após evento isquêmico global transitório, em ratos Wistar adultos envolve características de necrose apoptótica e necrose oncótica.

NOGUEIRA JÚNIOR, F. A. Avaliação dos efeitos citotóxicos e renais promovidos pelo veneno da serpente Bothrops alternatus. 2017. 92 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-02-06T13:33:26Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_fanjúnior.pdf: 2220914 bytes, checksum: 2ae005cc60f798a2ddfb27a4320fef3f (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-02-06T13:33:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_fanjúnior.pdf: 2220914 bytes, checksum: 2ae005cc60f798a2ddfb27a4320fef3f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-06T13:33:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_fanjúnior.pdf: 2220914 bytes, checksum: 2ae005cc60f798a2ddfb27a4320fef3f (MD5) Previous issue date: 2017-01-18 / The snakes of the genus Bothrops sp. are responsible for the highest number of ophidian accidents in Brazil, according to the Ministry of Health. Acute kidney injury (AKI) is the severe complication most associated in these types of accidentes. The Bothrops alternatus snake is a species of medical importance responsible for ophidian accidents, predominantly in Southern Brazil. Thus, it was investigated renal changes induced by the total venom of Bothrops alternatus (Baltv) in isolated rat kidney system and kidney proximal tubule cells culture from LLC-MK2 (Monkey) and HK-2 (Human) lines. In the kidney perfusion system, Wistar rats (250 to 300 g) were used, with two experimental groups (1 μg/mL and 3 μg/mL vBalt; n = 6). There was a decrease in the perfusion pressure (PP) at the concentration of 1 μg/mL at 90 and 120 min and of 3 μg/mL at 60, 90 and 120 min. For both concentrations, renal vascular resistance (RVR) and urinary flow (UF) decreased at 90 and 120 minutes and the glomerular filtration rate (GFR) was reduced from 60 min. When the percentage of electrolyte transport was analyzed, it was observed that the tubular sodium transport (% TNa+) was reduced at 120 min in the concentration of 1 μg/mL, and at 90 and 120 min to 3 μg/ml; The tubular chloride transport (%TCl-) was also reduced at 120 min to 1μg/ml and at 60, 90 and 120 min for the concentration of 3 μg/mL; when the proximal tubular transport was analyzed, it was seen that the proximal tubular sodium transport (%TpNa+) and proximal tubular chloride transport (%TpCl-) decreased from 60 min until the end of the experiment to the concentration of 1 μg/mL, and at 60, 90 and 120 to 3 μg/mL. The histopathological analysis demonstrated the presence of significant microscopic morphological alterations, such as accumulation of proteins at the tubular and glomerular level, glomerular damage and hydropic degeneration at both concentrations studied. In the evaluation of the oxidative stress profile, it was observed that the levels of reduced glutathione (GSH) were decreased in concentrations: 1μg/mL (643.8 ± 36.31 μg/g tissue) and 3μg/mL (757.4 ± 126.7 μg/g tissue), with malondialdehyde levels (MDA) increased at concentrations of 1 μg/mL (16.42 ± 3.561 μg/g tissue) and 3 μg/mL (15.37 ± 2.237 mg /g tissue). Nitrite levels also increased in relation to the control: 1μg/mL (309.4 ± 25.29 nM /g tissue) and 3μg/mL (330.7 ± 29.19 nM/g tissue). In the culture of LLC-MK2 and HK-2 cells, the Baltv decreased cell viability at high concentrations (50, 100 and 200 μg / mL) only for LLC-MK2, on the other hand, in reduced concentrations (0,19, 0,39, 0,78, 1,56, 3,12, 6,25, 12,5, 25µg/mL), an increase in cell viability was observed, presenting an IC 50 of 221.3 μg/mL to the LLC-MK2 line. In the analysis of type of induced cell death, flow cytometry was used with Annexin V-PE and 7-AAD, and it was observed that cell death occurred predominantly due to necrosis. These results demonstrated that the venom of Bothrops alternatus altered all renal parameters and functions evaluated in the kidney perfusion model, demonstrating its direct nephrotoxic action and its cytotoxic effects in the studied cell cultures. / As serpentes do gênero Bothrops sp. são responsáveis pelo maior número de acidentes ofídicos no Brasil, de acordo com o Ministério da Saúde. A insuficiência renal aguda (IRA) é a complicação grave mais associada nestes tipos de acidentes. A serpente Bothrops alternatus (Rhinocerophis alternatus) é uma espécie de importância médica responsável por acidentes ofídicos, com predominância no Sul do Brasil. Desta forma, investigou-se alterações renais induzidas pelo veneno total de Bothrops alternatus (vBalt) em sistema de rim isolado de rato e em cultura de células de túbulo proximal renal das linhagens LLC-MK2 (Macaco) e HK-2 (Humanas). No sistema de perfusão renal, utilizou-se ratos Wistar (250 a 300g), com dois grupos experimentais (1µg/mL e 3 µg/mL de vBalt; n=6). Foi verificado diminuição na pressão de perfusão (PP) na concentração de 1 μg/mL aos 90 e 120 min e na de 3 μg/mL aos 60, 90 e 120 min. Para ambas as concentrações, a resistência vascular renal (RVR) e o fluxo urinário (FU) diminuíram aos 90 e 120 minutos e o ritmo de filtração glomerular (RFG) mostrou-se reduzido a partir dos 60 min. Quando se analisou o percentual de transporte de eletrólitos, observou-se que o transporte tubular de sódio (%TNa+) foi reduzido aos 120 min para concentração de 1 µg/mL, e aos 90 e 120 min para a de 3 µg/mL; o transporte tubular de cloreto (%TCl-) também foi reduzido aos 120 min para 1 µg/mL e aos 60, 90 e 120 min para a concentração de 3 µg/mL; quando analisou-se os transportes tubulares proximais foi visto que o transporte tubular proximal de sódio (%TpNa+) e o transporte tubular proximal de cloreto (%TpCl-) diminuíram a partir dos 60 min até o fim o experimento, para concentração de 1 µg/mL, e aos 60, 90 e 120 para a de 3 µg/mL. A análise histopatológica demonstrou presença de alterações morfológicas microscópicas significativas, tais como acúmulo de proteínas a nível tubular e glomerular, dano glomerular e degeneração hidrópica em ambas as concentrações estudadas. Na avaliação do perfil do estresse oxidativo, observou-se que os níveis de glutationa reduzida (GSH) encontravam-se diminuídas em ambas as concentrações: 1µg/mL (643,8 ± 36,31 µg/g de tecido) e 3µg/mL (757,4 ±126,7 µg/g de tecido), já os níveis de malondiáldeido (MDA) se encontravam aumentados em ambas as concentrações: 1µg/mL (16,42 ± 3,561 µg/g de tecido) e 3µg/mL (15,37±2,237 µg/g de tecido). Os níveis de nitrito também estavam aumentados em relação ao controle: 1µg/mL (309,4±25,29 nM/g de tecido) e 3µg/mL (330,7 ± 29,19 nM/g de tecido). No cultivo de células LLC-MK2 e HK-2, o vBalt diminuiu a viabilidade celular em altas concentrações (50, 100 e 200µg/mL) apenas para a LLC-MK2, por outro lado, nas concentrações reduzidas (0,19, 0,39, 0,78, 1,56, 3,12, 6,25, 12,5, 25µg/mL), observou-se um aumento na viabilidade celular, apresentando uma IC50 de 221,3μg/mL, para linhagem LLC-MK2. Na análise do tipo de morte celular induzida, utilizou-se a citometria de fluxo com Anexina V-PE e 7-AAD, foi observado que a morte celular ocorreu de forma predominante por necrose. Esses resultados demonstraram que o veneno de Bothrops alternatus alterou todos os parâmetros e funções renais avaliados no modelo de perfusão renal, demonstrando sua ação nefrotóxica direta e seus efeitos citotóxicos nos cultivos celulares estudados.

DAMASCENO, Samara Rodrigues Bonfim. Efeito antinecrótico das lectinas conA e conBr na lesão de células acinares pancreáticas induzidas por sais biliares, álcool e ácido palmitoléico : envolvimento do domínio letínico. 2015. 111 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-04-10T15:50:14Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_srbdamasceno.pdf: 2942338 bytes, checksum: 66ae1fead584d61c560cf24c2074e09f (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-04-10T15:51:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_srbdamasceno.pdf: 2942338 bytes, checksum: 66ae1fead584d61c560cf24c2074e09f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-10T15:51:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_srbdamasceno.pdf: 2942338 bytes, checksum: 66ae1fead584d61c560cf24c2074e09f (MD5) Previous issue date: 2015 / Acute pancreatitis is an inflammatory disease of the pancreas which involves a complex sequence of pathophysiological events, many of which are still unknown. Recent data give more importance to the events that happen within the pancreatic cell. The severity and duration of the stimulus applied to pancreatic acinar cells may lead to apoptosis or necrosis. A large number of studies have demonstrated that the lectin of Canavalia ensiformis (ConA) and Canavalia brasiliensis (ConBr) induce cell death by apoptosis in various cell types. However there are no studies on its anti-necrotic effects. Thus, we investigated the effects of ConA and ConBr concerning the death of pancreatic acinar cells, induced by the main triggers of acute pancreatitis. The acinar cells were isolated from the pancreas of male Swiss mice. The cells were pre-incubated with ConA and ConBr for 1h followed by the induction of cell damage by SATC, ethanol or APO administration for 30 min (room temperature, RT). To evaluate the role of the lectin domain of ConBr and ConA, the lectins were preincubated for 1h at 37°C with its alpha-methyl-mannoside (α-MM) ligand sugar, or with a nonbinding sugar, D-galactose, both at a concentration of 0.2M, prior to experimental protocols. All groups were incubated for 5 minutes with the nuclear marker Hoechst 33342 (50 µg/ml) and with the necrosis marker, propidium iodide (PI; 10 µg/ml). In another analysis, ConA and ConBr conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) were incubated for 1h (RT) with the acinar cells. To evaluate the effect of ConA and ConBr effect on mitochondrial membrane potential (ΔѰm) of pancreatic acinar cells under administration of SATC, ethanol or APO, the cells were stained with Hoechst 33342, and tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM, fluorescent dye that is readily sequestered by active mitochondria). All analyzes were performed using confocal microscope FluoViewTM 1000 - Olympus. The results showed that the SATC, ethanol and APO groups caused significant necrosis on cells compared to control groups, and pretreatment ConBr and ConA caused a significant protection against harmful necrosis caused by all three agents. When lectins were complexed to their α-MM ligand sugar, this protective effect was significantly reversed; not being changed, however, by no specific sugar D-galactose, suggesting a participation of the lectin domain in protective effect. Lectins conjugated with FITC showed a marking on acinar cells at the level of membrane, confirming its interaction with carbohydrates present on the surface of these cells. In the analysis of mitochondrial potential, SATC, ethanol and mainly APO triggered intense depolarization of ΔѰm of pancreatic acinar cells. Pretreatment with ConA prevented mitochondrial dysfunction in all injury models, however ConBr prevented this injury caused by a dysfunction in SATC and ethanol, without changing the dysfunction caused by APO. Given the above, Con A and Con Br protect pancreatic acinar cells against necrosis induced by sulfated taurolithocholic acid, ethanol and APO with its effects mediated by lectin domain, beyond of the maintenance the integrity of the mitochondrial membrane of pancreatic cell, determinant factor to prevent the course of necrosis in acute pancreatitis. / A pancreatite aguda é uma doença inflamatória do pâncreas que envolve uma sequência complexa de eventos fisiopatológicos, muitos dos quais ainda desconhecidos. Dados recentes atribuem maior importância aos eventos que aconteceriam no interior da célula pancreática. A gravidade e a duração do estímulo aplicado às células acinares pancreáticas podem levar à apoptose ou à necrose. Um grande número de estudos demonstraram que as lectinas de Canavalia ensiformis (ConA) e Canavalia brasiliensis (ConBr) induzem morte celular por apoptose em diversos tipos de células. Contudo não há estudos sobre seus efeitos anti-necróticos. Dessa forma, investigamos os efeitos de ConA e ConBr frente à morte de células acinares pancreáticas, induzida pelos principais desencadeadores da pancreatite aguda. As células acinares foram isoladas de pâncreas de camundongos Swiss machos. As células foram previamente incubadas durante 1h com ConA (200 µg/ml) e ConBr (200 µg/ml) seguido da indução das lesões celulares pela administração de SATC (500µM), etanol (850mM) ou APO (100 µM) durante 30 min (T.A). Para avaliar a participação do domínio lectínico de ConA e ConBr, as lectinas foram previamente incubadas, durante 1h a 37ºC, com seu açúcar ligante α-metil-manosídeo (α-MM), ou com um açúcar não ligante, D-galactose, ambos na concentração de 0,2M, antes dos protocolos experimentais. Todos os grupos foram incubados por 5 minutos com o marcador nuclear Hoechst 33342 (50 µg/ml) e com o marcador de necrose iodeto de propídeo (IP; 10 µg/ml). Em outra análise, ConA e ConBr conjugadas ao isotiocianato de fluoresceína (FITC) foram incubadas durante 1h (T.A), com as células acinares. Para a avaliação do efeito de ConA e ConBr no potencial de membrana mitocondrial (ΔѰm) de células acinares pancreáticas sob administração de SATC, etanol ou APO, as células foram marcadas com Hoechst 33342 e tetrametilrodamina-metiléster (TMRM, corante fluorescente que é prontamente sequestrado pela mitocôndria ativa). Todas as análises foram realizadas no microscópio confocal FluoViewTM 1000 – Olympus. Os resultados mostraram que os grupos SATC, etanol e APO causaram necrose significativa às células, quando comparado com os grupos controles e que o pré-tratamento de ConA e ConBr promoveu proteção significativa (p < 0,05) contra a necrose causada pelos três agentes lesivos. Quando as lectinas foram complexadas ao seu açúcar ligante, α-MM, este efeito protetor foi significativamente revertido (p < 0,05); não sendo alterado, porém, pelo açúcar não específico D-galactose, evidenciando a participação do domínio lectínico no seu efeito protetor. As lectinas conjugadas com FITC evidenciaram uma marcação nas células acinares a nível de membrana, confirmando a sua interação com carboidratos presentes na superfície dessas células. Na análise do potencial mitocondrial, SATC, etanol e principalmente APO desencadearam intensa despolarização do ΔѰm das células acinares pancreáticas. O pré-tratamento com ConA preveniu (p < 0,05) a disfunção mitocondrial em todos os modelos de lesão, contudo ConBr preveniu essa disfunção na lesão causada por SATC e etanol (p < 0,05), sem alterar a disfunção causada por APO. Diante do exposto, ConA e ConBr protegem células acinares pancreáticas contra a necrose induzida por ácido taurolitocólico sulfatado, etanol e APO, tendo seus efeitos mediados pelo domínio lectínico, além da manutenção da integridade da membrana mitocondrial da célula pancreática, fator determinante para evitar o curso da necrose na pancreatite aguda.

Pacientes que sobrevivem a uma parada cardíaca ou a um AVE demonstram uma alta incidência de prejuízos neurológicos como resultado do dano neuronal isquêmico tardio. Uma intervenção farmacológica apropriada durante a janela terapêutica entre o recomeço do fluxo sanguíneo normal e o início do dano neuronal seria de grande benefício, porém as abordagens experimentais atuais são limitadas neste sentido. Ao longo da última década, dados provenientes de muitos estudos apoiam a ideia que estrógenos promovem efeitos neuroprotetores em uma variedade de doenças neurodegenerativas, incluindo a isquemia cerebral global. O potente hormônio feminino 17-β-estradiol (E2) é neuroprotetor em uma variedade de modelos celulares e animais de isquemia, contudo os paraefeitos inerentes a sua terapêutica não permitem seu uso em larga escala. Considerando a estrutura e mecanismo de ação similares dos fitoestrogênios no SNC, o objetivo deste estudo foi verificar os efeitos neuroprotetores de coumestrol, um potente isoflavonóide com alta afinidade de ligação por ambos os receptores de estrogênio (ERs) e alto potencial antioxidante, contra a neurodegeneração geralmente encontrada em eventos isquêmicos. Nós demonstramos aqui que coumestrol foi hábil em resgatar a morte neuronal na subárea CA1 hipocampal induzida pela isquemia global em ratas fêmeas em uma avaliação de sobrevivência celular, incluindo 24h pós-isquemia, e que esta neuroproteção parece ser mediada através dos ERs. Em um próximo passo, avaliamos se a pré-administração de coumestrol poderia reverter a atividade da bomba de Na+/K+-ATPase, cuja atividade se encontra prejudicada após insultos isquêmicos, e se sua ação seria igualmente efetiva quando administrado em ratos machos. A análise demonstrou que coumestrol foi eficiente em restaurar a atividade da Na+/K+-ATPase em todos os tempos avaliados, incluindo 24h pós-isquemia. A efetividade em prevenir a morte neuronal em ratos machos foi igualmente observada em todos os tempos de administração, incluindo 24h pós-isquemia. As correspondências neuroprotetoras no tempo de 24h na neuroproteção sugerem um possível mecanismo pelo qual coumestrol possa estar agindo para promover neuroproteção em longo prazo. Sabendo que a morte neuronal tardia na isquemia global está associada com a redução na expressão de GluR2 na região CA1 pouco antes do início da morte celular, examinamos o possível papel de coumestrol na expressão de GluR2 em camundongos machos em três diferentes tempos pós-isquemia. O evento isquêmico reduziu os níveis proteicos de GluR2 hipocampais em todos os tempos avaliados e o tratamento com coumestrol foi efetivo em prevenir essa redução. Adicionalmente, estando consciente que a excitotoxicidade é um dos mecanismos celulares ligados à neurodegeneração associada à isquemia, buscou-se determinar se coumestrol poderia promover neuroproteção in vitro, contra a excitotoxicidade induzida por NMDA em culturas neuronais hipocampais. Nós observamos que coumestrol promoveu neuroproteção, porém somente quando sua administração foi perto do evento excitotóxico. Atribuímos esta inabilidade em conferir neuroproteção em longo prazo devido à presença do inibidor de células gliais presente na cultura neuronal, que limita a proliferação glial em 10% ou menos, sugerindo o sistema glial como um importante coadjuvante no contexto da neuroproteção em longo prazo conferida por coumestrol. Estendendo nossa investigação para uma avaliação comportamental, examinamos se coumestrol poderia ser igualmente eficaz em prevenir os déficits de memória presentes após um insulto isquêmico. A análise histológica confirmou a neuroproteção promovida pela administração de coumestrol como esperado, e sua terapêutica foi bem sucedida em reverter os déficits de memória promovidos pela isquemia global. Portanto, esses resultados coletivos indicam que coumestrol desperta novas perspectivas dentro da terapêutica da isquemia global e abre novas possibilidades na investigação no contexto dos acidentes vasculares encefálicos. / Patients who survive cardiac arrest or stroke demonstrate a high incidence of neurological impairment as a result of delayed ischemic neuronal damage. Proper pharmacological intervention during the therapeutic window between the resumption of normal blood flow and the onset of neuronal damage would be of great benefit, but the current experimental approaches have yielded only limited success. Over the last decade, data from many studies support the idea that estrogens provide neuroprotective effects in a variety of neurodegenerative diseases, including cerebral global ischemia. The potent feminizing hormone 17-β-estradiol (E2) is neuroprotective in a host of cell and animal models of stroke, however the side effects inherent its therapeutics doesn’t allow its use in a large scale. Considering the similar structure of phytoestrogens and its similar actions within the CNS, the aim of this study was verify the neuroprotective effects of coumestrol, a potent isoflavonoid with high binding affinities for both estrogen receptors (ERs) and significant antioxidant activity, against neurodegeneration usually observed in global ischemic events. We demonstrate here that coumestrol was able to rescue neuronal death in the hippocampal CA1 subfield induced by global ischemia in female rats in a cell survival evaluation, including 24h after ischemia, and its neuroprotective actions seems to be through the ERs. In a next step, we evaluated if coumestrol pre-administration could rescue the Na+/K+-ATPase activity that is found severely impaired after ischemic insults, and if its administration would be equally neuroprotective in male rats. The analysis showed that coumestrol was able to reverse the Na+/K+-ATPase activity in all times of evaluation, including 24h after ischemia. The effectiveness in preventing neuronal death in male rats was also observed in all time-points evaluated, including 24h after ischemia. These two 24h correspondence in neuroprotection suggests one possible mechanism by which coumestrol could be acting to afford neuroprotection in a long term. Knowing that the delayed neuronal death in global ischemia is associated with a reduced GluR2 expression in CA1 hippocampal field just before the cell death onset, we examined the possible role of coumestrol at the level of GluR2 expression of male mice in three different time-points after ischemia. The ischemic event induced high suppression of GluR2 in all evaluated times and coumestrol pre-treatment was able in preventing this reduction. In addition, being aware that excitotoxicity is one of the cellular mechanisms linked to cerebral ischemic neurodegeneration, we sought to determine if coumestrol could be neuroprotective in vitro as well, against a NMDA-induced excitotoxicity in hippocampal neuronal culture. We observed that coumestrol was skilled to afford neuroprotection only when its administration was next to the excitotoxic event. We attribute this longest reach inability of neuroprotection due the glial inhibitor present in the neuronal culture, which limits the glial cells proliferation in 10% or less, suggesting the glial system as an important adjuvant in the context of the coumestrol longer therapeutic window. Extending our investigation in a behavior assessment, we examined if the coumestrol could be also virtuous in preventing the memory deficits present after an ischemic insult. The histological analysis confirmed the reduction in neuronal loss afforded by coumestrol administration as expected, and its pre ischemic administration was able to rescue the memory impairment promoted by the global ischemia. Therefore, our collective results indicate that coumestrol spread new perspectives in the context of global ischemia therapeutics and unlock new possibilities for the stroke investigation.