Orientador: Osmar Malaspina / Coorientador: Roberta Cornélio Ferreira Nocelli / Banca: Maria Aparecida Marin Morales / Banca: Elaine Cristina Mathias da Silva Zacarin / Banca: Monica Jones Costa / Banca: Thaisa Cristina Roat Fabri / Resumo: As abelhas Apis mellifera são importantes polinizadores de plantas nativas ou cultivadas, porém o contato com os agroecossistemas pode expor esses insetos à substâncias tóxicas, como o inseticida imidacloprido. A sistemicidade desse composto pode levar a contaminação não só das abelhas forrageiras, mas também dos outros indivíduos da colônia, inclusive, das larvas por meio do consumo de pólen e néctar contendo resíduos de imidacloprido. Assim, a primeira etapa desse trabalho determinou a toxicidade do imidacloprido para larvas e abelhas adultas do híbrido A. mellifera africanizada. Os resultados mostraram que as larvas são mais tolerantes ao imidacloprido do que as abelhas recém-emergidas e que alterações no desenvolvimento larval só foram observadas em concentração oito vezes maior do que a concentração letal média estabelecida para as abelhas adultas. Visto que não só os inseticidas, como também as parasitoses, como a nosemose, podem enfraquecer as colônias e comprometer a viabilidade destas, este trabalho visou avaliar, ainda, os efeitos da exposição de operárias de A. mellifera africanizada ao inseticida imidacloprido e/ou da infecção das abelhas por Nosema ceranae e compreender como esses fatores atuam isolados e em conjunto sobre o organismo desses insetos. A sobrevivência das abelhas diminuiu quando estas foram expostas ao inseticida e/ou infectadas pelo parasita, sendo que a combinação destes dois estressores comprometeu ainda mais a longevidade delas. Tanto a N. ceranae quanto o imidacloprido, isolados ou em combinação levaram às células do intestino médio das abelhas ao estresse, evidenciado pela imunomarcação da chaperona HSP 70 e a morte celular, provavelmente por macroautofagia, indicada pela intensa vacuolização e pela diminuição na expressão gênica da caspase-3. No intestino, ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Apis mellifera honeybees are importants pollinators both for native and cultivated plants. However, the contact with the agroecosystems may expose these insects to toxic substances, such as imidacloprid insecticide. Compound systemicity may lead to the contamination not only of forager honeybees, but also of other colony individuals, including larvae, through both pollen and nectar consumption containing imidacloprid residues. Thus, the first stage of this work evaluated the imidacloprid toxicity to both larvae and adult honeybees of hybrid Africanized A. mellifera. Results showed that larvae are more tolerant to imidacloprid than newly emerged honeybees, and alterations in larvae development were only observed at concentrations eight times higher than the average lethal concentration established for adult honeybees. Since not only insecticides, but also diseases such as nosemosis may weaken colonies and compromise its viability, the second stage of this work was the evaluation of the exposure effects of Africanized A. mellifera workers to imidacloprid insecticide and/or to honeybees infection by Nosema ceranae in order to understand how these factors act both isolated and together on organism of these insects. Honeybees survival decreased when they were exposed to insecticide and/or infected by parasite, and the combinations of these two stressors further compromised their longevity. Both N. cenarae as imidacloprid, either alone or in combination, led midgut cells of honeybees to stress, evidenced by HSP 70 chaperone immunostaining, and to cell death, probably by macroautophagy, as indicated by genic expression decrease of caspase-3. In the midgut, glutathione-S-transferase tissue activity was not altered, probably due to damage found on the epithelium that may affect both metabolization and biotransformation function. Once midgut was compromised, probably more quantity of insecticide ... (Complete abstract electronic access below) / Doutor

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2018. / A nanobiotecnologia, que aplica técnicas, princípios biológicos e nanotecnológicos para melhorar a compreensão e transformação dos biossistemas, é oferecida como proposta de inovação tecnológica para tratamento do câncer. Dentre os avanços da nanobiotecnologia nos diversos setores do campo da saúde, destacam-se aqueles aplicados à terapia fotodinâmica (TFD), modalidade terapêutica minimamente invasiva e cujo uso é clinicamente aprovado para o tratamento de diferentes tipos de doenças oncológicas e não oncológicas. A TFD é capaz não apenas de destruir o tumor devido à sua toxicidade direta às células cancerosas, mas também de causar infarto do tecido canceroso por destruir a microvasculatura tumoral, bem como por ativar o sistema imunitário contra antígenos tumorais. Diante disso, o objetivo principal deste estudo foi avaliar a indução de morte celular imunogênica (MCI) causada pela TFD mediada por nanoemulsão com cloreto de alumínio-ftalocianina (TFD-NE-AlFtCl) em células de câncer de mama murino in vitro e in vivo. Para tanto, foi realizada a produção de um novo lote da NE-AlFtCl, que foi caracterizado e teve a estabilidade para suas prorpiedades coloidais, fotofísicas e físico-química avaliada. Concomitantemente aos testes de estabilidade, a NE-AlFtCL foi utilizada para avaliação do perfil de internalização pelas células 4T1, bem como para a avaliação de qual via de endocitose estava sendo utilizada para internalização, além da investigação de sua colocalização subcelular. Após a avaliação dos perfis de internalização, da via endocítica e da colocalização, as células 4T1 foram submetidas a diferentes protocolos da TFD-NE-AlFtCl, variando os tempos e doses de energia (J/cm²). As células 4T1 foram avaliadas quanto à via de morte desencadeada pela exposição a TFD-NE-AlFtCl. Foi verificada também a emissão de padrões moleculares associados a dano (DAMP) —HSP70, HSP90, Calreticulina, HMGB1 e IL-1β—, fator-chave para a indução de morte celular imunogênica (MCI). Por fim, após a avaliação dos perfis de liberação desses DAMP, as células pré-tratadas com TFD-NE-AlFtCl foram utilizadas como vacina em camundongos da espécie Balb-C a fim de verificar a ativação de uma resposta antitumoral. Para tanto, após as vacinações, os animais foram submetidos ao enxerto de células 4T1 viáveis, e monitorados quanto ao surgimento de tumor, volume tumoral e sobrevida durante todo experimento. O tempo de 15 minutos foi suficiente para identificação do FS AlFtCl dentro das células 4T1 e essa internalização foi dependente de caveolinas. Os resultados obtidos quanto à internalização e à colocalização subcelular do FS AlFtCl nas organelas núcleo, lisossomos, mitocôndrias e no retículo endoplasmático (RE) demonstraram diferenças na retenção do FS AlFtCl. Sendo que, os tempos de 15, 30 e 45 minutos apresentaram uma maior quantidade de FS AlFtCl nas organelas supracitadas, quando comparados como os tempos de 60, 120 e 240 minutos. Os diferentes protocolos da TFD-NE-AlFtCl aplicados nas células foram eficazes quanto à diminuição da viabilidade das células 4T1. Vale ressaltar ainda que à medida em que o tempo e a dose de energia foram variados, houve variação do perfil de morte e da via de morte ocasionada (apoptose/necrose). Os tratamentos com TFD-NE-AlFtCl 9,01 nM 25 J/cm² apresentaram maior perfil de apoptose, o que refletiu numa maior emissão de DAMP: HSP70, HSP90, Calreticulina, HMGB1 e IL-1β, quando comparados com os demais protocolos. Esses resultados apresentados pelo tratamento com TFD-NE-AlFtCl 9,01 nM 25 J/cm² se refletiram também, na avaliação in vivo, sendo verificada uma maior resistência dos animais quanto ao surgimento do tumor, a apresentação de menores volumes tumorais e maior sobrevida. Contudo, o presente estudo conclui que os diferentes protocolos de TFD-NE-AlFtCl aplicados às células 4T1 foram capazes de fazer a emissão dos DAMP — sendo esse requisito chave para ação de uma ativação de MCI e uma ativação antitumoral — porém, essas emissões ocorreram de formas diferentes mediante as alterações de tempo de dose de energia. Conclui-se também que a aplicação da TFD-NE-AlFtCl 9,01 nM 25 J/cm² mais branda demonstrou melhores resultados quanto ao surgimento e desenvolvimento do tumor, além de apresentaremm uma maior taxa de sobrevida. / Nanobiotechnology, which applies techniques, biological principles and nanotechnologies that improve the understanding and transformation of biosystems, is offered as a proposal of technological innovation for the treatment of cancer. Among the advances in nanobiotechnology in the various sectors of the health field, the most important are those applied to photodynamic therapy (PDT), a minimally invasive therapeutic modality and whose use is clinically approved for the treatment of different types of oncological and non-oncological diseases. PDT is capable not only of destroying the tumor due to its direct toxicity to the cancer cells but also by causing infarction of the cancerous tissue by destroying the tumor microvasculature as well as by activating the immune system against tumor antigens. Therefore, the main objective of these studies was to evaluate the induction of immunogenic cell death (ICD) of nanoemulsion-mediated PDT with aluminum chloride-phthalocyanine (PDT-NE-AlFtCl) in murine breast cancer cells in vitro and in vivo. For this, the production of a new batch of NE-AlFtCl was carried out, which was characterized and had its stability for its colloidal, photophysical and physicochemical properties evaluated. In parallel to the stability tests, NE-AlFtCL was used to evaluate the internalization profile by 4T1 cells, as well as to evaluate which pathway of endocytosis was being used for internalization, and to evaluate its subcellular colocalization. After the evaluation of the internalization profiles, the endocytic pathway and colocalization, the 4T1 cells were submitted to different protocols of the PDT-NE-AlFtCl, varying the time and energy doses (J/cm²). 4T1 cells were evaluated for the path of death triggered by exposure to PDT-NE-AlFtCl. DAMPs—HSP70, HSP90, Calreticulin, HMGB1 and IL-1β—, a key factor for the induction of immunogenic cell death (ICD), were also verified. Finally, after evaluation of the release profiles of these DAMPs, cells that we pretreated with PDT-NE-AlFtCl were used as vaccine in mice of the Balb-C species in order to verify the activation of an antitumor response. To do this, after the vaccinations, the animals were submitted to the grafting of viable 4T1 cells and monitored for appearance of tumor, tumor volume and survival throughout the experiment. The time of 15 minutes was sufficient for identification of the FS AlFtCl within the 4T1 cells and this internalization was dependent on caveolinas. The results obtained on the internalization and the subcellular colocalization of FS AlFtCl in the nucleus, lysosomes, mitochondria and in the endoplasmic reticulum (ER) showed differences in the retention of FS AlFtCl. The times of 15, 30 and 45 minutes showed a higher amount of FS AlFtCl in the aforementioned organelles when compared with the times of 60, 120 and 240 minutes. The different protocols of PDT-NE-AlFtCl applied in cells were effective in decreasing the viability of the 4T1 cells. It is worth noting that as time and energy dose were varied, there was variation of the death profile and of the way of death (apoptosis / necrosis). Treatments with 9.01 nM PDT-25 J/cm² had a higher apoptosis profile, which reflected in a higher emission of DAMPs: HSP70, HSP90, Calreticulin, HMGB1 and IL-1β, when compared to the other protocols. These results presented by the treatment with PDT-NE-AlFtCl 9.01 nM 25 J /cm2 also reflected in the in vivo evaluation, which demonstrated a greater resistance of the animals regarding the appearance of the tumor, the presentation of smaller tumor volumes and greater survival rates. However, the present study concludes that the different PDT-NE-AlFtCl protocols applied to the 4T1 cells were able to make the DAMPs emission — this being a key requirement for the action of ICD activation and antitumor activation —; it is worth mentioning that these emissions occurred in different ways regarding modification in time and energy doses. It was also concluded that the application of the milder 9,01 nM 25 J / cm2 PDT-NE-AlFtCl demonstrated better results regarding the occurrence and development of the tumor, besides presenting better survival rates.

Orientador: Tiago Rodrigues / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2014

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-08-19Bitstream added on 2014-06-13T20:07:23Z : No. of bitstreams: 1 pietrobon_tao_dr_rcla.pdf: 1539030 bytes, checksum: e0afbbf1e01319cce93f6e55e70f4326 (MD5) / A espécie Polistes versicolor tem se mostrado um excelente modelo para o estudo com vespas eussociais primitivas neotropicais, pela distribuição ampla, número de trabalhos já realizados com ela, tipo de organização social e por pertencer a um gênero considerado chave na compreensão da evolução do comportamento social. O presente trabalho apresenta os resultados do estudo comportamental, associado à análise histoquímica da glândula ectomandibular e à descrição do processo de morte celular programada desta glândula. Apresenta também nota a respeito de infecção viral nas células epiteliais próximas à glândula ectomandibular desta vespa. Polistes versicolor apresenta colônia monogínica, em qualquer fase do desenvolvimento colonial. As subordinadas apresentam especialização momentânea, sendo que todos os indivíduos são capazes de desenvolver qualquer atividade, independente de idade ou casta. Os machos apresentam comportamentos de cuidado com a prole e manutenção do ninho, porém em freqüências bastante baixas. Os indivíduos de uma colônia podem ser divididos em 3 grupos de acordo com a função que desempenham. Estes grupos são variáveis de acordo com a fase do desenvolvimento da colônia. A glândula ectomandibular de P. versicolor apresenta proteínas, lipídios e glicoconjugados neutros, tanto em sua constituição, quanto no produto sintetizado, porém em concentrações que variavam individualmente, de acordo com a fase do desenvolvimento da colônia. A variação dos compostos da secreção pode estar relacionada a 2 densidade populacional no ninho, de adultas e/ou imaturos. Esta glândula apresenta sinais de início do processo de morte celular em indivíduos entre 20 e 25 dias de idade, apesar de observar-se muitas variações, indicando não haver um ciclo etário rígido. A morte celular programada desta glândula apresenta características apoptóticas... . / The species Polistes versicolor is known as an excellent model for the study of neotropical wasps because of its wide distribution, number of papers on it, kind of social organization and also because the genus Polistes is considered essential to the understanding of the evolution of the social behaviour. This work shows the results of behavioural study, associated to histochemical analysis of the ectal mandibular gland and the description of its programmed cell death process. It also presents a note on a viral infection found in the epithelial cells of this wasp. In any phase of its colonial development, P. versicolor, shows monoginic colonies. The subordinates present momentary specialization, being all individuals able to develop any activity, independently of their age or caste. The males extend a care behaviour towards the progeny and the nest, however this behaviour is not so frequent. Copulation between possible siblings were observed. The histochemical pattern of ectal mandibular gland evidenced the presence of proteins, lipids and neutral glicoconjugates in concentrations that vary according to the colony development. The variation in the secretion compounds may be related to the population density of adults and/or immature individuals in the nest. Signs of the programmed cell death process were observed in individuals among 20 and 25 days old, although many variations were observed, indicating that there was not a strict age cycle. The programmed cell death characteristic found in this gland renders apoptotical and non-apoptotical features, like observed in different adult insects. Finally, a case of viral infection by Nucleopolyhedrovirus in epithelial 4 cells, near the ectal mandibular gland, and haemocytes, probably derived from its preys, was described with a discussion about probable infection ways.

Resumo:Em humanos, a imunossupressão que ocorre em pacientes urêmicos está associada com a disfunção dos neutrófilos causada pelas toxinas urêmicas. O p-cresol se acumula no sangue de pacientes com insuficiência renal crônica (IRC) promovendo a inibição do metabolismo oxidativo dos neutrófilos. O presente trabalho teve como objetivo mensurar as concentrações plasmáticas de p-cresol em cães hígidos e com IRC e testar a hipótese de que o p-cresol livre causa disfunção neutrofílica. Para tal, foi quantificada a concentração plasmática de p-cresol por cromatografia de fase líquida (HPLC) em cães hígidos e com IRC no estágio IV. Também foi avaliado in vitro o efeito específico do p-cresol sobre o metabolismo oxidativo e a taxa de apoptose de neutrófilos de cães hígidos, considerando-se a maior concentração plasmática desta toxina observada in vivo em cães com IRC. Neutrófilos isolados de 20 cães saudáveis foram incubadas em meio de RPMI puro ou enriquecido com p-cresol e com plasma de cães com IRC. O metabolismo oxidativo dos neutrófilos foi avaliado por citometria de fluxo capilar utilizando as sondas hidroetidina e 2′,7′- diacetato de diclorofluoresceína com ou sem estímulos de acetato miristato de forbol e n-formil-metionil-leucilfenilalanina. A apoptose e a viabilidade dos neutrófilos foi quantificada em citômetro de fluxo capilar utilizando sistema Anexina V-PE, com ou sem estímulo de camptotecina. Cães com IRC apresentaram in vivo o quadro de estresse oxidativo e aumento do p-cresol plasmático. A maior concentração do p-cresol causou disfunção neutrofílica in vitro. Conclui-se que p-cresol pode estar envolvido com quadro de estresse oxidativo in vivo e que sua alta concentração diminua a viabilidade e leve a uma redução da produção de espécies reativas de oxigênio / Abstract:In humans, the immunosuppression observed in uremic patients is associated with the neutrophil dysfunction caused by uremic toxins. P-cresol accumulates in the blood of patients with chronic renal failure (CRF) promoting the inhibition of neutrophil oxidative metabolism. This study aimed to measure the plasma concentrations of p-cresol in dogs with CRF and test the hypothesis that free p-cresol causes neutrophil dysfunction. To this end, plasma concentration of p-cresol was determined using high pressure liquid chromatography (HPLC) in dogs presenting stage IV of CRF. The in vitro specific effect of p-cresol on the oxidative metabolism and apoptosis rate of neutrophils from healthy dogs was also evaluated, considering the highest plasma concentration of this toxin observed on the in vivo measurement of dogs with CRF. Isolated neutrophils from 20 healthy dogs were incubated in RPMI medium alone, supplemented with p-cresol or plasma from dogs with CRF. Neutrophil oxidative metabolism was assessed by capillary flow cytometry using the probes hydroethidine and 2',7'- dichlorofluorescein diacetate with or without stimulus with phorbol myristate acetate and N-formyl-methionyl-leucylphenylalanine. Apoptosis and viability of neutrophils were quantified also in capillary flow cytometry using Annexin V-PE system with or without stimulus with camptothecin. Dogs with CRF presented oxidative stress and increased plasma levels of p-cresol, the higher concentration of p-cresol caused in vitro neutrophil dysfunction. It can be concluded that p-cresol may be involved with in vivo oxidative stress that its higher concentration decreases the viability and lead to a reduced production of reactive oxygen species / Orientador:Paulo Cesar Ciarlini / Banca:Wagner Luis Ferreira / Banca:Alvaro José dos Santos Neto / Mestre

Orientador: Paola Castro Moraes / Coorientador: Sérgio Britto Garcia / Coorientador: Andrigo Barboza De Nardi / Resumo: A síndrome do intestino curto (SIC) representa condição clínica grave na medicina, caracterizada pela deficiente absorção intestinal de nutrientes, causada pela perda extensa do intestino delgado, culminando em altas taxas de mortalidade tanto em pacientes humanos quanto veterinários. Os tratamentos disponíveis não possuem, até então, resultados satisfatórios para resolução desta importante afecção e consistem em terapias paliativas. Diversos estudos demostraram que o método de desnervação intestinal intrínseca, com utilização do Cloreto de Benzalcônio (CB), consiste em promissora esperança na busca de terapias menos invasivas e eficazes no tratamento da SIC, permitindo melhora nas condições pós-cirúrgicas e prognóstico dos pacientes, por aumentar a área absortiva do intestino. Objetivou-se, com esse trabalho, avaliar a capacidade do CB induzir desnervação química intrínseca, por meio de aplicações intramurais em íleo de ratos Wistar e aprofundar o conhecimento sobre a evolução da lesão neuronal causada neste processo. Foram utilizados 40 ratos, distribuídos em dois grupos (controle- GC e benzalcônio- GB) de 20 animais cada, subdivididos em quatro subgrupos de acordo com o tempo de avaliação pós-operatória de 24, 48 horas, 30 e 90 dias. Os animais foram submetidos à microinjeções intramurais de solução salina estéril 0,9% (GC) ou de cloreto de benzalcônio (GB) em porção ileal, e posterior análise histopatológica e imuno-histoquímica, para avaliação da lesão neuronal. Houve di... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Short bowel syndrome (SBS) represents a serious clinical condition in medicine, characterized by deficient intestinal absorption of nutrients, caused by extensive loss of the small intestine, culminating in high mortality rates in both human and veterinary patients. The available treatments do not have, until then, satisfactory results to solve this important affection and consist of palliative therapies. Several studies have shown that the intrinsic intestinal denervation method, using Benzalkonium Chloride (BC), is a promising hope in the search for less invasive and effective therapies in the treatment of SBS, allowing improvement in the post-surgical conditions and prognosis of the patients, by increasing the absorptive area of the intestine. The aim of this study was to evaluate the ability of BC to induce intrinsic chemical denervation through intramural applications in the ileum of Wistar rats and to deepen the knowledge about the mechanism of action of the neuronal injury caused in this process. A total of 40 rats were divided into two groups (GC-control and benzalkonium-GB) of 20 animals each, subdivided into four subgroups according to the postoperative evaluation time of 24, 48 hours, 30 and 90 days. The animals were submitted to intramural microinjections of sterile saline solution 0,9% (GC) or benzalkonium chloride (GB) in the ileal portion, and later histopathological and immunohistochemical analysis, to evaluate the neuronal lesion. There was a significant decrease (p <0.05) in the myenteric neuronal count in GB2, GB3 and GB4 groups. Positive specific immunoblotting for H2AX and Caspase-3 confirmed the results obtained in the histopathological evaluation, denoting the onset of irreversible cell damage, with DNA double strand break, at 24 and 48 hours, as assessed by the positivity of H2AX immunostaining, progr... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O Transtorno de Humor Bipolar (THB) é uma doença psiquiátrica crônica e grave que tem sido relacionada com várias disfunções celulares, tais como uma resposta prejudicada ao estresse do retículo endoplasmático (RE). O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta ao estresse do RE (Unfolded Protein Response - UPR) e a morte celular induzida por este processo celular em linfócitos de pacientes com THB e indivíduos saudáveis, avaliando sua relação com os estágios da doença. Linfócitos de 30 pacientes bipolares e 32 controles pareados por sexo e idade foram tratados com tunicamicina, um indutor do estresse do RE, por 12h ou 24h, com o objetivo de mensurar os níveis de proteínas relacionadas à UPR (GRP78, eIF2α-P e CHOP) por citometria de fluxo, e por 48h para analisar a morte celular induzida pelo estresse do RE. O efeito de lítio sobre estes parâmetros na cultura celular também foi avaliado. No grupo controle, observamos a indução de GRP78 e eIF2α-P pela tunicamicina após 12h e 24h e de CHOP após 24h. O aumento induzido por tunicamicina dos níveis de proteínas relacionadas com a UPR não foram encontrados no grupo de pacientes. Entre os pacientes eutímicos, aqueles em estágio inicial da doença tiveram uma melhor resposta ao estresse do RE quando comparados aos pacientes em estágios avançados, apresentando níveis de GRP78 e eIF2α-P semelhantes aos controles após 12h de tratamento com tunicamicina. A morte celular induzida por tunicamicina foi maior nos pacientes bipolares em relação aos controles. O lítio não induziu diferenças na expressão das proteínas avaliadas e não reverteu a morte celular induzida pelo estresse do RE, entretanto levou a uma diminuição pequena, mas estatisticamente significativa, neste último parâmetro. Este estudo em cultura primária de linfócitos de pacientes bipolares reforça os resultados anteriores sobre a disfunção na resposta ao estresse do RE no THB. Essa disfunção no RE pode estar associada com a diminuição da resiliência celular nos pacientes, contribuindo, em última análise, para a progressão da doença. / Bipolar disorder (BD) is a severe chronic psychiatric disorder that has been related to several cellular dysfunctions, such as an impaired endoplasmic reticulum (ER) stress response. We aimed to evaluate the unfolded protein response (UPR) and the outcome of this cellular process in cultured lymphocytes from patients with BD and healthy subjects, assessing its relationship to the stage of the disorder. Lymphocytes from 30 BD patients and 32 age- and sex-matched controls were treated with tunicamycin, an ER stressor, for 12h or 24h in order to measure levels of UPR-related proteins (GRP78, eIF2α-P and CHOP) by flow cytometry, and for 48h to analyze ER stress-induced cell death. The effect of lithium on these parameters in cultured lymphocytes was also evaluated. In the control group, inductions of GRP78 and eIF2α-P by tunicamycin after 12h and 24h and of CHOP after 24h were observed. Tunicamycin-induced increases in UPR-related proteins were not found in the BD group. Among euthymic patients, those at an early stage of disorder had a better response to ER stress when compared to patients in advanced stages, with GRP78 and eIF2α-P levels similar to controls after 12h of treatment with tunicamycin. Tunicamycin-induced cell death was higher in BD patients compared to controls. Lithium did not induce differences in the expression of the evaluated proteins and did not reverse tunicamicin-induced cell death, but led to a small yet statistically significant decrease in this parameter. This study extends earlier findings about impaired ER stress response in primary cultures of lymphocytes from BD patients. ER dysfunction may be associated with decreased cellular resilience in BD, ultimately contributing to the progression of the disorder.

A caracterização de vias de sinalização alteradas em células tumorais, e a validação de fármacos inibidores de transdução de sinal que interajam com as mesmas de modo a atuar como terapia principal ou adjuvante no tratamento de neoplasias sólidas e hematopoiéticas, é um campo de grande interesse em oncologia. A necessidade da caracterização de novos alvos moleculares advém da incidência considerável de recidivas, quadros de quimiorresistência e efeitos adversos associados ao tratamento com os agentes antitumorais clássicos. Nesta tese, desenvolvemos a hipótese de que o fator de transcrição NFκB poderia estar envolvido com processos de proliferação, antiapoptose e quimiorresistência em células neoplásicas, caracterizando-se como um potencial alvo para interferência farmacológica. Para isso, avaliamos: i) o papel de NFκB na resposta celular a ERO e no controle da decisão entre morte e proliferação celular; ii) o estado de ativação de NFκB em modelos tumorais in vitro e in vivo; iii) o potencial citotóxico e seletividade dos inibidores de NFκB, seus mecanismos de ação, atividade em células neoplásicas e em linhagens quimiorresistentes. Para isso, foram utilizadas abordagens in vitro (cultivos celulares), in vivo (modelo animal de implante tumoral), e análises de bancos de expressão gênica através de ferramentas de biologia de sistemas. Os resultados demonstraram que NFκB está superestimulado em linhagens de leucemia e de glioblastoma quando comparado com leucócitos e astrócitos não-transformados. O tratamento com inibidores farmacológicos de NFκB causou morte celular programada em um mecanismo seletivo para células tumorais, potenciando os efeitos de antitumorais clássicos tanto em linhagens selvagens quanto em células quimiorresistentes. Além disso, os inibidores BAY117082 e curcumina apresentaram atividade in vivo em modelo animal de glioma sem evidência de citotoxicidade aguda. Em suma, os dados aqui apresentados sugerem que o fator de NFκB constitui-se um potencial alvo para inibição farmacológica no tratamento de neoplasias. Neste contexto, a diversidade da expressão de NFκB em diferentes tipos tumorais e a segurança associada ao uso clínico de seus inibidores permanece por ser avaliada. / Characterization of new molecular targets is one of the most important challenges in oncology. In this context, there is a growing interest in characterization of deregulated cell signaling pathways in solid and hematopoietic cancer cells in order to leverage the development of specific cell signaling inhibitors to act as principal or adjuvant therapy, and to circumvent the frequently observed chemoresistance and relapse in cancer patients. In this study, we hypothesized that the transcription factor NFκB could be involved on proliferation, antiapoptosis response and chemoresistance in cancer cells thus being a potential target for pharmacological interference. Attempting to test this, we evaluated: i) the role of NFκB in cell response against reactive oxygen species and in control of cell death and proliferation signaling; ii) NFκB activation status in cancer and noncancerous cells in vitro and in vivo; iii) cytotoxicity, selectivity and mechanisms of action of NFκB inhibitors in glioma and leukemia cells besides its biological activity against chemotherapy-resistant cell lines. Experiments were performed based on in vitro (cancer cell lines and primary cultures) and in vivo (tumor implants) models of cell growth. Moreover, in some experiments, bench-directed analysis of public gene expression databases followed by bioinformatic approach was used to ensure the significance and reliability of experimental data. Our findings showed an overstimulation of NFκB in leukemic and glioblastoma cell lines compared to healthy leucocytes and non-transformed astrocytes, respectively. Treatment with pharmacological inhibitors of NFκB induced programmed cell death in a cancer cells selective manner and potentiated the effects of classical anticancer drugs in both wild-type and chemoresistant cell lines. Indeed, the pharmacological NFκB inhibitors BAY117082 and curcumin showed significant anticancer efficacy in a model of brain-implanted gliomas without evidence of acute toxicity. Overall, the herein presented data suggest that NFκB is a potential target for cell death induction in leukemia and glioblastomas. Evaluation of its expression profile in different type of cancers beyond testing efficacy and safety of NFκB pharmacological inhibitors for clinical usefulness remains to be investigated.

A isquemia cerebral está entre as principais causas de mortalidade e morbidade em países industrializados e, apesar dos estudos constantes, ainda não existe um tratamento eficaz. Nesse estudo, investigamos o efeito neuroprotetor da boldina, um alcalóide presente nas folhas e casca de Peumus boldus Molina, sobre os danos causados pela isquemia cerebral. Para isso, foi utilizado um modelo in vitro de privação de oxigênio e glicose (POG) em culturas organotípicas de hipocampo de rato. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com boldina nas concentrações de 120 µM e 250 µM diminuiu significativamente a morte celular induzida pela POG de 36% para 20 e 11%, respectivamente. A boldina não apresentou efeito tóxico em condições basais em nenhuma das concentrações testadas. O efeito neuroprotetor da boldina ocorreu apenas quando ela estava presente durante o período de POG, não havendo diferença quando ela foi utilizada somente durante o período de 24 horas de recuperação. O tratamento com boldina durante a POG foi capaz de induzir ativação microglial observada 24 horas após o tratamento através da marcação com isolectina B4. Ela também causou um aumento considerável na produção de espécies reativas, o que pode ser causa ou conseqüência da ativação da microglia. Não foram observadas diferenças na fosforilação das proteínas Akt e GSK-3ß 24 horas após o tratamento e, portanto, alterações nessas proteínas não parecem estar envolvidas com a neuroproteção causada pela boldina. Em conjunto, os resultados sugerem um efeito neuroprotetor promissor da boldina contra os danos causados pela POG, sendo que os mecanismos que desencadeiam esse efeito devem ser melhor elucidados. / Ischemic stroke is among the major causes of mortality and morbidity in industrialized countries and, in spite of several studies, no efficient treatment is available to the patients. In this work, we investigated the neuroprotective effect of boldine, an alkaloid present in leaves and bark of Peumus boldus Molina, against the damage caused by an in vitro lesion that mimics ischemic stroke. For these experiments, we used an in vitro model of oxygen and glucose deprivation (OGD) in rat organotypic hippocampal slice cultures. Our results showed that the treatment with boldine in the concentrations of 120 µM and 250 µM caused a significant reduction in cellular death after OGD from 36%, observed in OGDvehicle exposed cultures, to 20% and 11%, respectively. Boldine was not cytotoxic in basal conditions in any of the tested concentrations. The neuroprotective effect of boldine was observed when it was present during the period of OGD, showing no difference when it was used only during the recovery period of 24 hours. To elucidate a possible mechanism by which boldine exerts its neuroprotective effect we investigated the microglial activation, production of reactive species and the phosphorylation of Akt and GSK-3b proteins involved in PI3K cell signaling pathway. Our results showed that, when used during the OGD period, boldine 250 µM induced a marked microglial activation, as shown by isolectin B4 binding, increased reactive species production, as shown by DCF-DA oxidation and had no effect on Akt and GSK-3ß phosphorylation. Taken together, the results presented here suggest a promising neuroprotective effect of boldine against the damage caused by OGD, but the mechanism of action of this compound must be better elucidated.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-03-28T18:52:12Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2058567 bytes, checksum: a9054d3d3fe5556e202af07cd80f55f6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-28T18:52:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2058567 bytes, checksum: a9054d3d3fe5556e202af07cd80f55f6 (MD5) Previous issue date: 2013-05-20 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A proteína BiP demonstra participar da imunidade inata e atenuar eventos de morte cellular induzido por estresse do retículo endoplasmático (RE) e osmótico. Plantas transgências com níveis elevados de BiP foram utilizadas para avaliar se BiP controla o desenvolvimento e morte culular porgramada (PCD) hipersensitiva. Sob condições normais, o transcriptoma induzido por BIP revelou uma robusta regulação negativa de genes envolvidos em PCD hipersensitiva e uma regulação positiva de genes relacionados a patógenos. A superexpressão de BIP atrasou a senescência foliar e acelerou a PCD hipersensitiva disparada por Pseudomonas syringae pv. tomato em plantas de soja e tabaco monitoradas por marcadores de PCD em plantas. O atraso da senescência foliar mediada por BiP correlacionou com a atenuação do sinal de morte celular mediada por proteínas ricas em asparagina (NRP) e inibição da ativação da resposta a proteínas mal dobradas (UPR). Além disso, sob ativação biológica da sinalização ácido salicílico (SA) e PCD hipersensitiva, a superexpressão de BiP inibiu antagonicamente a via UPR. Assim a indução de sinais de morte celular induzidas por NRP e mediadas por AS ocorre por uma via distinta da UPR. Os dados indicam que durante a PCD hipersensitiva, BiP regula positivamente a sinalização de morte celular mediada por NRP por meio de um mecanismo indefinido que é ativado por sinalização de AS e relacionado ao funcionamento do RE. Em contraste, a regulação negativa de BiP durante a senescência foliar pode ser ligada a capacidade de mediar a ativação de UPR e sinais de morte celular mediada por NRP. Assim, BiP pode funcionar como regulador positivo ou negativo de eventos de morte ceular. / The binding protein (BiP) has been demonstrated to participate in innate immunity and attenuate ER- and osmotic-stress-induced cell death. Here, we employed transgenic plants with manipulated levels of BiP to assess whether BiP also controlled developmental and hypersensitive programmed cell death (PCD). Under normal conditions, the BiP-induced transcriptome revealed a robust down-regulation of the genes involved in developmental PCD and an up-regulation of the genes involved in hypersensitive PCD triggered by non-host- pathogen interactions. Accordingly, BiP overexpression delayed leaf senescence and accelerated the hypersensitive PCD triggered by Pseudomonas syringae pv. tomato in soybeans and tobacco, as monitored by measuring hallmarks of PCD in plants. The BiP- mediated delay of leaf senescence correlated with the attenuation of N-rich protein (NRP)- mediated cell death signaling and the inhibition of the senescence-associated activation of the unfolded protein response (UPR). In contrast, under biological activation of SA signaling and hypersensitive PCD, BiP overexpression further induced NRP-mediated cell death signaling and antagonistically inhibited the UPR. Thus, the SA-mediated induction of NRP cell-death signaling occurs via a pathway distinct from UPR. Our data indicate that during the hypersensitive PCD, BiP positively regulates the NRP cell-death signaling through a yet undefined mechanism that is activated by SA signaling and related to ER functioning. In contrast, BiP’s negative regulation of leaf senescence may be linked to the its capacity to mediate the UPR activation and NRP cell death signaling. Therefore, BiP can function either as a negative or positive regulator of PCD events. / Tese enviada pela secretaria do curso por e-mail, em 28-03-17