Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2015-12-04T16:57:41Z No. of bitstreams: 1 cynthiaelainedeoliveira.pdf: 2251347 bytes, checksum: 0237faa67ec7e2daece33f180b29cd01 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2015-12-07T03:22:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cynthiaelainedeoliveira.pdf: 2251347 bytes, checksum: 0237faa67ec7e2daece33f180b29cd01 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-07T03:22:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cynthiaelainedeoliveira.pdf: 2251347 bytes, checksum: 0237faa67ec7e2daece33f180b29cd01 (MD5) Previous issue date: 2015-05-07 / O teste de Allium cepa L. tem sido rotineiramente empregado para a avaliação de ecotoxicologia e prospecção de efeitos biológicos. A estratégia mais comum associada ao teste é a análise de parâmetros citogenéticos, tais como índice mitótico e percentual de alterações cromossômicas. O uso da citometria de fluxo para a análise de citogenotoxidade e mutagênese em A. cepa ainda é um aspecto pouco explorado. Diante disto, o presente trabalho teve como objetivo estabelecer parâmetros de citometria de fluxo para a análise de citogenotoxidade em A. cepa, utilizando como agente mutagênico o cloreto de sódio. Bulbos de A. cepa foram expostos em água destilada por um período mínimo de 24 horas e em seguida submetidos às concentrações de cloreto de sódio (0; 31,25; 62,5; 125; 250 e 500mM) por 2, 4, 8, 12 e 24 horas. O cloreto de sódio foi utilizado por ser conhecido na literatura como indutor de morte celular em plantas. Os parâmetros considerados na citometria de fluxo foram: intensidade de fluorescência, FSC (tamanho nuclear) e SSC (complexidade nuclear). Já na análise citogenética, os parâmetros avaliados foram índice mitótico (IM) e alterações cromossômicas. Foi realizado ensaio cometa nos tratamentos expostos por 24 horas para a averiguação de fragmentação do DNA. Células controle foram caracterizadas quanto ao tamanho nuclear, por meio de técnicas citogenéticas e pela citometria de fluxo. Houve redução no IM com o aumento da concentração e tempo de exposição aos tratamentos. Da mesma forma, os resultados de citometria de fluxo indicaram uma diminuição gradual significativa no percentual de células em G1, S e S + G2. Nos tratamentos com índice mitótico próximo ou igual a zero foram observadas características de morte celular, como condensação do núcleo (diminuição do FSC e intensidade de fluorescência) e fragmentação do material genético (aumento de sub-G1 e coeficiente de variação); esta fragmentação também foi observada no ensaio cometa. Os resultados da análise de complexidade interna (SSC) foram inversamente proporcionais aos dados de tamanho nuclear (FSC), indicando que a condensação da cromatina ocorre de maneira irregular. Diante dos resultados, pode-se identificar que estes parâmetros de citometria de fluxo podem ser utilizados com segurança na avaliação de morte celular em A. cepa, considerando as características de condensação do núcleo e fragmentação do DNA. Curiosamente, em todas as análises a concentração 62,5mM de NaCl se destacou por apresentar um elevado percentual de c-metáfases e algumas metáfases poliploidizadas. Esta mesma concentração foi testada quanto à capacidade de induzir c-metáfases em células de alface e tomate e os resultados sugerem o cloreto de sódio como potencial agente antimitótico. / Allium cepa L. assay has been routinely used for the evaluation of ecotoxicology and prospecting of biological effects. The most common strategy associated with this test is the analysis of cytogenetic parameters such as mitotic index and percentage of chromosomal abnormalities. The use of flow cytometry for cytogenotoxicity and mutagenesis analysis in A. cepa is still an unexplored aspect. The present work aims to establish parameters from flow cytometry for cytogenotoxicity analysis in the Allium cepa test using with mutagen, sodium chloride. A. cepa bulbs were exposed in distilled water for a minimum of 24 hours and then exposed to the concentrations of sodium chloride (0, 31.25, 62.5, 125, 250, and 500mM) for 2, 4, 8, 12 and 24 hours. The sodium chloride was used because it is known in the literature as an inducer of cell death in plants. The parameters considered in flow cytometry were: fluorescence intensity, FSC (nuclear diameter) and SSC (nuclear complexity). In the cytogenetic analysis, the parameters evaluated were: mitotic index (MI) and chromosomal alterations. Comet assay was carried out in treatments exposed for 24 hours to the investigation of DNA fragmentation. Control cells were characterized by nuclear size, either by cytogenetic as by flow cytometry. A decrease in the percentage of dividing cells was observed in a dose-time dependent. Likewise, the results of flow cytometry showed significant decrease in the percentage of cells in G1, S and S + G2. In the treatments with mitotic index equal or close to zero features of cell death were observed as nuclei condensation (decrease of the FSC and fluorescence intensity) and fragmentation of genetic material (increased sub-G1 and coefficient of variation); this fragmentation was also viewed by comet assay. The results of analysis of internal complexity (SSC) were inversely proportional to the FSC data indicating that chromatin condensation occurs irregularly in the nuclear membrane. From the results, you can identify those parameters that flow cytometry can be used safely in assessing cell death in A. cepa, considering the characteristics of the nucleus condensation and DNA fragmentation. Interestingly, in all analyzes the NaCl concentration 62,5mM stood out with a high percentage of c-metaphase and some polyploid metaphase. This same concentration was tested for ability to induce c-metaphases lettuce and tomato cells and the results suggest the potential sodium chloride as antimitotic agent.

Mitochondria are central players in cell metabolism, responsible for the vast majority of ATP production in most cells. Although originally thought to be passive organelles focused only in keeping cellular ATP at adequate levels, complex interplay between mitochondrial function and cell signaling has been largely recognized over the last decades. Not surprisingly, given their role, changes in nutritional status promoted by chronic interventions like caloric restriction or short-term situations like fasting in animals or nutrient deprivation in cultured cells are one of the main factors that can activate those signaling mechanisms. One particular way in which this mitochondria-cell crosstalk can occur is through mitochondrial Ca2+ handling, a process in which Ca2+ signals generated by the cell are able to translate into elevations in mitochondrial matrix [Ca2+] due to the presence of the mitochondrial Ca2+ uniporter in the organelle. While the impact of mitochondrial Ca2+ handling on cellular function has been widely studied, the conditions which can modulate the process of mitochondrial Ca2+ handling itself are still not well characterized. In this work, we sought to test the effects of different interventions linked to nutritional status on mitochondrial Ca2+ handling. We found that caloric restriction, physiological fasting and modulations of mitochondrial dynamics resulted in modulation of mitochondrial Ca2+ handling through changes in their maximal Ca2+ retention capacity or Ca2+ uptake rates. These changes were, measured by following mitochondrial Ca2+ uptake using different strategies, employing the fluorescent Ca2+ probe Ca2+ Green 5N for experiments in isolated mitochondria and permeabilized cells and the cytosolic probe Fura2-AM in intact cells. Caloric restriction resulted in higher calcium uptake and retention in liver mitochondria, protecting against pathological conditions of Ca2+ overload during ischemia/reperfusion. On the other hand, overnight and short term fasting resulted in lower mitochondrial Ca2+ retention and oxidative phosphorylation capacity in the liver. Modulating mitochondrial morpholoy in C2C12 myoblasts showed that more fragmented mitochondria were less capable of taking up Ca2+, while more fusioned mitochondria showed the opposite phenotype. This modulation in Ca2+ handling through changes in mitochondrial morphology interfered with the process of Store-Operated Ca2+ entry in the cells, showing that these modulations can have impacts in physiological contexts as well. Overall, this work both establishes novel mechanisms of modulation of mitochondrial Ca2+ handling and demonstrates their relevance both in pathology and normal cellular physiology. / Mitocôndrias possuem um papel central no metabolismo das células, sendo responsáveis pela maioria da produção de ATP na maioria dos tipos celulares. Embora originalmente se pensasse nas mitocôndrias como organelas estáticas, focadas somente em manter os níveis adequados de ATP na célula, a interação entre a função mitocondrial e a sinalização celular tem sido fortemente reconhecida nas ultimas décadas. Dado este papel, não é surpreendente que mudanças no estado nutricional, tanto crônicas como na restrição calórica quanto em situações como o jejum em animais e a privação de nutrientes em cultura de células foram demonstradas como sendo um dos principais fatores que podem ativar estes mecanismos de sinalização. Uma das formas em que esta interação entre a mitocôndria e a célula ocorre é através do manejo de Ca2+ mitocondrial, um processo em que sinais de Ca2+ gerados pela célula podem resultar em aumentos na [Ca2+] na matriz mitocondrial devido à presença do uniportador de Ca2+ mitocondrial na organelaEmbora o impacto do manejo de Ca2+ mitocondrial na função da célula tenha sido amplamente estudado, a regulação do processo de manejo de Ca2+ mitocondrial em si não é bem conhecida. Neste trabalho, nós nos propusemos a testar os efeitos de diferentes intervenções ligadas ao estado nutricional no manejo de Ca2+ mitocondrial e o possível impacto destas modulações nacapacidade de retenção e na taxa de captação de Ca2+ mitochondrial. As intervenções estudadas foram a restrição calórica, jejum e mudanças na dinâmica mitocondrial, e todas elas resultando em mudanças no manejo de Ca2+ mitocondrial, que foram medidos acompanhando a captação de Ca2+ em mitocôndrias isoladas ou células permeabilizadas utilizando a sonda Ca2+ Green 5N e em células intactas utilizando a sonda de Ca2+ citosólica Fura2-AM. Enquanto a restrição calórica resultou em uma maior capacidade de retenção de Ca2+ e em maiores taxas de captação, protegendo contra as condições patológicas de desregulação de Ca2+ observadas durante a isquemia/reperfusão, o jejum curto ou pela duração da noite resultou em uma diminuição na capacidade de retenção de Ca2+ e na oxidação fosforilativa mitocondriais. As mudanças observadas modulando a dinâmica mitocôndria (feitas utilizando-se mioblastos da linhagem C2C12) revelaram que mitocôndrias mais fragmentadas são menos capazes de captar Ca2+, enquanto mitocôndrias mais fusionadas possuem o fenótipo oposto. Essas mudanças no manejo de Ca2+ mitocondrial interferem com o processo de Store-Operated Ca2+ entry nestas células, demonstrando que essas modulações da captação de Ca2+ mitocondrial também podem ser relevantes em contextos fisiológicos. Em resumo, este trabalho ajudou a estabelecer novos mecanismos de modulação do manejo de Ca2+ mitocondrial que podem ser relevantes tanto em condições patológicas quanto na fisiologia normal das células.

Orientador: Tereza Cristina Cardoso da Silva / Resumo: Coronavirus são RNA vírus sentido positivo, envelopados, comumente associados a infecções brandas em aves e mamíferos. A infecção por CCoV é comum em cães jovens, principalmente em animais que vivem em canis e abrigos, associada à ocorrência de diarreia branda e autolimitante, causada pela infecção das células das vilosidades do intestino delgado. São conhecidos dois genótipos: CCoV-I e CCoV-II, o qual é subdividido em CCoV-IIa e CCoV-IIb. O CCoV-IIa, é uma variante altamente patogênica associada à doença sistêmica e acentuada linfopenia. Diferentemente de outros CCoV realiza viremia e, assim, determina a disseminação do vírus para diversos órgãos, incluindo tecidos linfóides. Nesse sentido, o envolvimento da infecção de macrófagos correlacionada à gravidade da doença e linfopenia, vem sendo sugerido. Este trabalho teve por objetivo promover a infecção de macrófagos caninos derivados de monócitos sanguíneos e avaliar a replicação viral, despolarização da membrana mitocondrial e os complexos da cadeia respiratória mitocondrial às 6, 12, 18 e 24 horas pós-infecção. A estatística descritiva incluiu média ± desvio padrão (s.d.). As médias foram comparadas através da análise de variância, ANOVA. Foi possível observar que a infecção por CCoV induziu a liberação de novas partículas virais entre 18 e 24 horas pós-infecção. Ainda, a infecção viral esteve associada à despolarização e disfunção da membrana mitocondrial, afetando o complexo III da cadeia respiratória. Desse modo, acredit... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Coronaviruses are enveloped positive-sense RNA viruses commonly associated with mild infections in birds and mammals. CCoV infection is common in young dogs, especially kennel and shelter animals, associated with the occurrence of mild, self-limiting diarrhea caused by infection of small intestinal villus cells. Two genotypes are known: CCoV-I and CCoV-II, which is subdivided into CCoV-IIa and CCoV-IIb. CCoV-IIa is a highly pathogenic variant associated with systemic disease and marked lymphopenia. Unlike other CCoV it carries viremia and thus determines the spread of the virus to various organs including lymphoid tissues. In this sense, the involvement of macrophage infection correlated with disease severity and lymphopenia has been suggested. This study aimed to promote the infection of canine macrophages derived from blood monocytes and to evaluate viral replication, mitochondrial membrane depolarization and mitochondrial respiratory chain complexes at 6, 12, 18 and 24 hours post-infection. Descriptive statistics included mean ± standard deviation (s.d.). Means were compared by analysis of variance, ANOVA. It was observed that CCoV infection induced the release of new viral particles between 18 and 24 hours after infection. Moreover, viral infection was associated with depolarization and mitochondrial membrane dysfunction, affecting respiratory chain complex III. Thus, CCoV is believed to induce mitochondrial bioenergetic failure, acting as a decoupler of the respiratory c... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

O óxido nítrico (NO) é um mensageiro biológico que tem importância vital em muitos processos fisiológicos, tais como o controle cardiovascular, sinalização neural e defesa contra microrganismos e tumores. No entanto, a formação de outras espécies reativas, resultantes de reações químicas do NO com o ambiente biológico, impõe limites para o entendimento dos mecanismos celulares envolvidos em possíveis respostas biológicas. Devido ao potencial farmacológico e aos benefícios do NO, é de interesse o desenvolvimento de compostos que, quando estimulados, possam liberar esta molécula de forma controlada. Uma das possibilidades envolve complexos rutênionitrosilo termodinamicamente estáveis, mas que possam ser ativos sob estimulação. Este trabalho apresenta observações recentes de complexos rutênio-nitrosilo como agentes liberadores de NO e seus efeitos sobre linhagens de células B16-F10, L929 e Jukart. Para entender melhor o efeito NO como agente anticancerígeno o complexo [Ru(NO)(bdqi)(terpy)]Cl3 foi utilizado como agente doador de NO. O efeito biológico do composto, bem como o do seu produto após liberação de NO - [Ru(H2O)(bdqi)(terpy)]2+- foi avaliado pelos aspectos químicos e fotoquímicos. Os resultados mostraram que o NO, oriundo deste sistema, apresentou baixa citotoxicidade em células B16-F10. A atividade citotóxica foi maior quando o complexo foi encapsulado em nanopartículas lipídicas sólidas, diminuindo a viabilidade celular para cerca de 50 %. Além disso, sugere-se um efeito sinérgico da espécie aquo-rutênio, cuja viabilidade celular foi diminuída para 25% após 24 horas de incubação com este complexo. O efeito sinérgico do oxigênio singleto e NO foi também avaliado mediante a possibilidade de aplicação em terapia clínica. A produção de espécies radicalares de oxigênio tem sido utilizada para o tratamento do câncer, numa técnica conhecida como terapia fotodinâmica (TFD). O sucesso dessa terapia depende da concentração de oxigênio, e quando em hipóxia, geralmente culmina na formação reduzida de espécies reativas de oxigênio e consequente limitação clínica da TFD. Um dos objetivos deste trabalho é a avaliação do efeito sinérgico entre oxigênio singleto e NO. Para fins destes estudos, a espécie trinuclear [{Ru(NO)(bpy2)}2RuPc(pz)2](PF6)6 (I) foi sintetizada e proposta como fotogeradora de oxigênio singleto e NO. Ensaios fotobiológicos utilizando (I) a 0,4 ?M, em células B16-F10, resultaram na diminuição da viabilidade celular para 30% sob irradiação luminosa em 660 nm, ao final de 4 horas. Por outro lado, sem fotoestímulo e na mesma concentração do composto (I), a viabilidade celular foi de 90%. Estudos relacionados ao mecanismo de morte celular em consequência da ação do oxigênio singleto e NO gerados pelo composto (I) também foram discutidos neste trabalho. A possibilidade de aplicação de um sistema como o descrito em (I) no tratamento contra o câncer pode ser considerado interessante na terapia fotodinâmica / Nitric oxide (NO) is a biological messenger that has vital importance in many physiological processes, such as cardiovascular control, the neural signaling and defense against microorganisms and tumors. However, the formation of other reactive species, resulting from chemical reactions of NO with the biological environment, imposes limits on the understanding of the possible cellular mechanisms involved in biological responses. Due to potential pharmacological and benefits of NO, there is a need for development of compounds that can stabilize the NO until it\'s released. One possibility involves nitrosyl ruthenium complexes thermodynamically stable but actived under stimulation. In this work, the focus is on our recent investigations of nitrosyl ruthenium complexes as NO-delivery agents and their effects on B16-F10, L929 and Jukart cell lines. The high affinity of ruthenium for NO is a marked feature of its chemistry. To better understand the NO effect as anticancer agent it was used [Ru(NO)(bdqi)(terpy)]Cl3 complex as NO delivery agent. The biological effect of that nitrosyl compound and its subproduct after NO release - [Ru(H2O)(bdqi)(terpy)]2+- was evaluated as well as their chemical and photochemical studies. The results lead to the conclusion that NO released from [Ru(NO)(bdqi)(terpy)]3+ has low cytotoxicity effect in B16-F10 cell line but, when it is entrapped in solid lipid nanoparticles, this system is improved and cell viability decreases to 50 %. This effect seems to be dependent on cellular uptake of nitrosyl ruthenium complex. It is also suggested the synergistic activity of the aquoruthenium species once its cell viability decreases to around 25 % after 24 h of incubation with this complex. Synergistic effect of NO and singlet oxygen was also evaluated as a possibility to clinical therapy. Radical oxygen species generation has been used for cancer treatment in clinical therapy known as Photodynamic Therapy (PDT). The success of this therapy depends on oxygen concentration, and hypoxia usually culminates in diminished formation of reactive oxygen species triggering clinical failure of PDT. One of the aims of this thesis is propose synergistic effect of singlet oxygen and NO since it displays antitumor character depending on the NO concentration as an attempt to improve PDT. To this end, the trinuclear species [2RuPc(pz)2](PF6)6 (I) was synthesized and it has been proposed as NO and singlet oxygen photogenerator. Photobiological assays using (I) at 0,4 ?M in B16F10 cell line decreases cell viability to around 30 % under light irradiation at 660 nm, while at the same concentration of compound, without light (I) shows 90 % of cell viability. Studies concerning to cell death mechanism of this compound is also discussed in this work. The potential application of a system like (I) in clinical therapy against cancer must be considered an upgrade for photodynamic therapy.

Diversos tipos celulares nas mais variadas condições têm sido usados como doadores de núcleo para a TN. Ainda não está claro se o estado fisiológico destas células afeta o posterior desenvolvimento dos embriões. Neste trabalho, testou-se a hipóese que fibroblastos bovinos em processo de MCP podem ser reprogramados na transferência nuclear. Fibroblastos foram cultivados até atingirem 60% de confluência, sincronizados por restrição de soro durante 24h e em seguida a MCP foi analisada por citometria de fluxo com a ténica da Anexina V/Iodeto de propídeo. Células Anexina positivas (MCP) e Anexinanegativas (Vivas) foram separadas por citometria de fluxo e utilizadas para a TNS. Céulas não coradas e não separadas no citômetro serviram como controle (Controle). Os embriões reconstruídos foram avaliados quanto à fusão, clivagem (2º dia de cultivo), blastocisto (7º dia) e prenhez (D30, D60 e nascimento). O índice de MCP dos blastocistos obtidos foi determinado. Os resultados foram analisados pela ANOVA ou teste de X2 com nível de significância de 5%. Não houve efeito nas taxas de fusão (p>0,05). Embriões reconstruídos com células MCP tiveram menor taxa de clivagem e formação de blastocistos (72,7% e 18,8%, respectivamente) em comparação ao grupo reconstruído com células Vivas (83,4% e 34,7%, respectivamente; p<0,05), não diferindo dos embriões Controle (77,3% e 27,3%, respectivamente; p>0,05). O índice de MCP do grupo de embriões MCP foi similar aos índices dos embriões clonados a partir de células Vivas e Controle (p>0,05). Após a transferência para receptoras, os grupos MCP, Vivas e Controle não diferiram com relação à taxa de prenhez aos 30d (18,1%, 13,3% e 27,5%, respectivamente; p>0,05). Entretanto aos 60d, a perda gestacional no grupo MCP (25%) foi inferior a do grupo Vivas (100%) e Controle (62,5%). Somente um nascimento, do grupo MCP (4,5% dos embriões transferidos), foi obtido no experimento. Conclui-se que células em processo de MCP, podem ser reprogramadas quando utilizadas como doadoras de núcleo na técnica de transferência nuclear, podendo estabelecer gestações e nascimentos, entretanto houve um efeito prejudicial nas taxas de desenvolvimento embrionário até o estádio de blastocisto assim como houve aumento do índice de MCP nos embriões reconstruídos. / It is not clear if the physiological status of the cells can affect further embryonic development in NT. We hypothesized that adult bovine fibroblasts in PCD can be reprogrammed when used as nuclear donors for cloning. Fibroblasts were cultivated until 60% confluency, synchronized by serum starvation for 24 h and stained with Annexin V and Propidium iodide (PI) by flow citometry. Annexin positive cells (PCD cells) and Annexin negative cells (Live cells) were sorted and used for NT. Unsorted, unstained cells were used as control (Control cells). After reconstruction, fusion, cleavage (day 2 of culture), blastocyst (day 7) and pregnancy rates (day 30, 60 and birth) were recorded. Apoptotic index of the embryos was determined by TUNEL. Data were analyzed with ANOVA and Chi-square test with 5% of significance level. There was no effect on fusion rates (p>0.05). Embryos reconstructed with PCD cells had lower cleavage and blastocyst rates (72.7 and 18.8%, respectively) compared with embryos reconstructed with Live cells (83.4 and 34.7%, respectively; p<0.05). Apoptotic index in embryos produced from cells in PCD was similar compared to embryos produced from Live and Control cells (p>0.05). Pregnancy rates were similar between cloned groups on day 30 after embryo transfer (p>0.05). However it was observed a reduced pregnancy loss in PCD group on day 60 (25%) compared with Control (62.5%) and Live (100%) groups. Only one calf, from PCD cells (4.5% of the transferred embryos), has been obtained in this experiment. In conclusion, it was showed that cells in PCD process can be reprogrammed when used as nuclear donors after NT producing even live animals. However, a negative effect on embryonic development and an increase in the apoptotic index of these embryos was observed.

Peptídeos intracelulares são constantemente produzidos pelo sistema ubiquitina proteassomo e muitos são provavelmente funcionais. Aqui, um nonapeptídio derivado da ciclina-D2, específica da transição G1/S, chamado \"pep5\" mostrou um aumento específico durante a fase S do ciclo celular em células HeLa. O pep5 (50-100 &mu;M) induziu a morte celular em células HeLa e em várias outras células tumorais, mas isso só ocorreu quando o pep5 foi sintetizado acoplado ao peptídeo penetrador de células (pep5-cpp). In vivo, o pep5-cpp reduziu o volume do glioblastoma C6 de ratos Wistar em cerca de 50%. A acetilação reduziu a potência do pep5-cpp, enquanto substituições Leu-Ala aboliram totalmente a atividade deste peptídeo. Os resultados de caracterização inicial do mecanismo de morte celular indizida pelo pep5 incluem ativação de caspases 3/7 e 9, inibição da fosforilação Akt2 e inibição da atividade do proteassomo. Esses dados colaboram com a hipótese da função de peptídeos intracelulares na sinalização. / Intracellular peptides are constantly produced by the ubiquitinproteasome system and many are probably functional. Here, a nonapeptide of G1/S-specific cyclin-D2 named pep5 showed a specific increase during the S phase of HeLa cell cycle. Pep5 (50-100 &mu;M) induced cell death in HeLa and in several other tumor cells, only when it was fused to a cell penetrating peptide (pep5-cpp). In vivo, the pep5-cpp reduced the volume of the rat C6 glioblastoma by almost 50%. Acetylation reduced the potency of the pep5-cpp while Leu-Ala substitutions totally abolished the pep5 activity. Findings from the initial characterization of the cell death mechanism of pep5 include caspase 3/7 and 9 activation, inhibition of Akt2 phosphorylation and inhibition of proteasome activity. These data further support the intracellular function of peptides.

A luz solar apresenta ondas eletromagnéticas em ampla faixa espectral, incluindo as regiões do ultravioleta (UV-C, UV-B, UV-A), visível e infravermelho. Cada região interage com a pele de forma dependente da fotofísica e da fotoquímica dos seus respectivos compostos absorvedores. A luz UV-A causa a geração de espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio (EROs e ERNs) através da fotossensibilização de moléculas endógenas (co-enzimas de flavina, porfirinas, melaninas). Quando fotossensibilizadores produzem quantidades de EROs e ERNs maiores do que a capacidade celular de supressão destas espécies, caracteriza-se um quadro de desbalanço redox, que causa lesão em biomoléculas como os ácidos nucleicos, lipídeos e as proteínas. Essas lesões podem levar à morte celular ou a outras transformações fenotípicas e genotípicas e também estimulam a liberação de citocinas pró-inflamatórias. Com a finalidade de melhor compreender a dinâmica dos mecanismos de resposta celular após exposição ao UV-A e ao visível, nós caracterizamos inicialmente as propriedades fotofísicas da melanina e detectamos a produção de oxigênio singlete (1O2) pela fotossensibilização no visível e a supressão desta espécie excitada pela reação do oxigênio singlete com a dupla ligação reativa dos grupos indóis presentes na melanina. Estes processos também foram observados no cabelo e levaram-nos a propor um modelo que explica o efeito da luz visível na estrutura e cor dos cabelos. Demonstramos também que a feomelanina produz mais (30%) 1O2 do que a eumelanina, que sofre maior modificação na sua estrutura por fotodegradação. O efeito destes processos na pele foi estudado a nível celular. Demonstramos que células epiteliais com maior teor de melanina apresentaram maior geração de 1O2 que causa lesão no DNA e morte necro-apoptótica após irradiação com luz visível. A foto-oxidação da melanina pela luz visível nos motivou a estudar um pigmento que fosse foto-protetor não somente contra luz UV-B mas também contra luz visível. A pigmentação com Acetil-Tirosina se mostrou atóxica e protetora contra luz UV-B e visível ao contrário do pigmento com tirosina, que se mostrou protetor do UV-B mas tóxico no visível. Este efeito foi relacionado com a localização celular do polímero e não com a estrutura do mesmo. A luz UV-A, por sua vez, promove o acúmulo de lipofuscina dentro dos vacúolos autofágicos de queratinócitos da pele e que também ativa a fototoxicidade pela luz visível. A lipofuscina dentro dos vacúolos autofágicos é foto-oxidada pela luz visível, causando lesão no DNA e morte celular programada tipo II. Doses UV-A que desencadeiam a liberação de citocinas também foram caracterizados. / Sunlight presents electromagnetic radiation over a wide spectral range, including the regions of ultraviolet (UV-C, UV-B, UV-A), visible and infrared. Each region interacts with skin dependending on the photophysics and photochemistry of the respective absorbing compounds. UV-A light causes the generation of reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS) by photosensitization of endogenous molecules (flavin coenzymes, porphyrins, melanins). When photosensitizers produce amounts of ROS and RNS larger than the cell capacity to suppress these species, a set of redox imbalance, which damages biomolecules such as nucleic acids, lipids and proteins. This damage cause cell death and to other phenotypic and genotypic changes and also stimulates the release of proinflammatory cytokines. In order to better understand the dynamics of the mechanisms of cellular responses after exposure to UV-A and visible light, we initially characterized the photophysical properties of melanin and detected the production of singlet oxygen (1O2) by photosensitization in the visible, as well as the suppression of these excited species by reaction of singlet oxygen with the double bonds of the reactive groups presented in the melanin indols. These processes were also observed in hair and led us to propose a model that explains the effects of visible light on the structure and color of hair. We also demonstrated that pheomelanin produces more (30%) 1O2 than eumelanin, which undergoes a quick change on its structure by photodegradation. The effect of these processes in the skin was studied at the cellular level. We demonstrated that epithelial cells with larger melanin content have stronger generation of 1O2, which causes DNA damage and necro-apoptotic death after irradiation with visible light. The photo-oxidation of melanin by visible light has motivated us to study a pigment that was not only able to protect against UV-B but also against visible. Pigmentation with Acetyl-Tyrosine proved nontoxic and protective against UV-B and visible light instead of pigmentation with Tyrosine, which shielded against UV-B but showed toxicity in the visible. This effect was associated with the polymer, cell location and not with its structure. UV-A light, in turn, promotes the accumulation of lipofuscin, within autophagic vacuoles of keratinocytes also enabling phototoxicity in the visible light. The lipofuscin within the autophagic vacuoles is fotooxidized by visible light, causing DNA damage and programmed cell death type II. Linear dose of UV-A that trigger the release of cytokines were also characterized.

Após a resposta imune, a expansão dos linfócitos T CD4 é seguida de uma fase de retração chamada Morte Celular induzida por Ativação (AICD), para que a homeostasia seja reestabelecida. Nosso grupo demonstrou que DCs estimuladas com LPS produzem PGE2 que inibe a expressão de FASL e bloqueia a AICD dos linfócitos T CD4. Nossa hipótese é que a apresentação de antígenos em contexto de infecção tenha um impacto na expressão de FASL e na sobrevivência das células T CD4, de maneira dependente de TLRPGE2. Para comprovar nossa hipótese nós estudamos a apresentação de OVA in vitro e in vivo. Observamos que a adição de LPS durante a apresentação de OVA aumenta a ativação e proliferação das células T CD4 específicas. O pré-tratamento dos camundongos com Indometacina, um inibidor da enzima COX, reduz a frequência das células específicas através do aumento na expressão de FASL e da apoptose, mas sem interferir com a proliferação. Nós sugerimos que a PGE2 produzida em resposta ao LPS regule a sobrevivência dos linfócitos T CD4 durante a persistência do estímulo antigênico. / After immune response, expansion of antigen-specific CD4 T cells is followed by a contraction phase due to Activation-Induced Cell Death (AICD) to reestablish homeostasis. Our group demonstrated that LPS stimulated-DCs produce PGE2 that protects CD4 T cells from AICD by preventing TCR/CD3-mediated FASL upregulation. Our hypothesis is that antigen presentation in the context of infection impacts on FASL expression and survival of CD4 T cells, dependently on TLR-mediated PGE2 release. To approach our hypothesis we studied OVA presentation in vitro and in vivo. We observed that the addition of LPS during OVA presentation increased specific CD4+ T cells activation and proliferation. Pretreatment of mice with indomethacin, an inhibitor of COX enzyme, reduces the frequency of specific T cells by increasing FASL expression and apoptosis, but did not interfere with proliferation. We suggest that PGE2 produced in response to LPS regulates the survival of CD4 T lymphocytes during persistent antigen stimulation.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma técnica para tratamento de câncer que usa um fotossensibilizador (FS) que na presença de luz e oxigênio molecular gera espécies altamente reativas de oxigênio (EROs) que levam as células tumorais à morte por apoptose ou necrose. Os FSs do tipo clorina apresentam problemas de agregação reduzindo sua eficácia fotodinâmica. O objetivo deste estudo foi sintetizar, caracterizar e testar novas clorinas não agregáveis em meio fisiológico e determinar sua ação fotodinâmica em células tumorais (HEp-2 e HeLa) e não tumorais (Vero). As moléculas 10-a e 10-b foram obtidas com rendimentos de 68% e as moléculas 11-a e 11-b com 64% de rendimento. Foram caracterizadas por RMN 1H, 13C, UV-Vis e espectrometria de massas de alta resolução (HRMS). Os valores de rendimento quântico de oxigênio singleto (&Phi;0) das clorinas foram comparáveis a uma molécula comercial análoga usada em TFD, a verteporfina (Visudyne&reg;). As clorinas sintetizadas apresentaram valores de rendimento quântico de fluorescência (&Phi;f) maiores que o Visudyne&reg;, além de uma baixa fotodegradação. O coeficiente de absorção molar (&epsilon;) das clorinas 10a-b e 11a-b exibiram valores maiores em meio aquoso apresentando uma auto-agregação menor que o Visudyne&reg;. O coeficiente de partição (Log P) obtido para a verteporfina (1.61 ± 0.10) foi maior que das clorinas 10a-b e 11a-b (1,20 ± 0,04 e 1,40 ± 0,03) respectivamente, evidenciando uma maior lipofilicidade e dificuldade de solubilização em meio aquoso em relação às clorinas. Os valores de Concentração Inibitória Média (IC50) das clorinas 10-a e 10-b nas linhagens celulares HEp-2 e HeLa foram menores que os determinados para a verteporfina pelo método de MTT, estas clorinas foram três e duas vezes mais potentes do que Visudyne&reg; respectivamente. As análises por microscopia de fluorescência mostraram que as quatro clorinas sintetizadas levam à morte celular predominantemente por apoptose nas duas linhagens tumorais. A acumulação intracelular determinada por microscopia confocal mostrou que as clorinas 10a-b exibiram uma maior penetração em relação às clorinas 11a-b através da membrana citoplasmática nas células tumorais, assim como, nas não tumorais. Dessa forma, as clorinas sintetizadas mostraram-se mais fotoestáveis, mais fototóxicas e mais solúveis em meio fisiológico do que o Visudyne&reg;, vantagens consideráveis para o uso como fotossensibilizadores para TFD. / Photodynamic Therapy (PDT) is a technique for the treatment of cancer that uses a photosensitizer (PS) that in the presence of light and molecular oxygen generates highly reactive oxygen species (ROS) that lead tumor cells to death by apoptosis or necrosis. Chlorine-like PSs exhibit aggregation, reducing its photodynamic efficacy in PDT. Thus, the objective of this study was to synthesize, characterize and test new chlorins sterically-prevented for self-aggregation in physiological medium, as well as determining their photodynamic response in tumor cells (HEp-2 and HeLa) and non-tumor cells (Vero). The chlorins designated 10-a and 10-b (yield: 68%), 11-a and 11-b (yield: 64%) were characterized by 1H, 13C, UV-Vis, and high resolution mass spectrometry (HRMS). The singlet oxygen quantum yield (&Phi;0) values of the chlorins were comparable to an analogous commercial molecule used in PDT, verteporfin (Visudyne&reg;). The synthesized chlorins shown fluorescence quantum yield values (&oslash;f) higher than Visudyne&reg;, in addition to low photodegradation. The molar absorption coefficient (&epsilon;) of chlorins 10a-b and 11a-b exhibited higher values in aqueous medium showing less self-aggregation than Visudyne&reg;. The partition coefficient (Log P) obtained for verteporfin (1.61 ± 0.10) was higher than that of chlorins 10a-b and 11a-b (1.20 ± 0.04 and 1.40 ± 0.03), respectively, indicating a greater lipophilicity and difficulty of solubilization in aqueous medium comparing to chlorins. The half-maximal inhibitory concentration (IC50) values of 10-a and 10-b chlorins in HEp-2 and HeLa cell lines were lower than those determined for verteporfin by the MTT method. These chlorins were three and two times more potent than Visudyne&reg; respectively. Fluorescence microscopy analyzes displayed that the four synthesized chlorins lead to cell death predominantly by apoptosis in the two tumor cells. Intracellular accumulation determined by confocal microscopy showed that chlorinas 10a-b exhibited a greater penetration with respect to chlorins 11a-b through the cytoplasmic membrane in tumor cells, as well as in non-tumor cells. Thus, the chlorins synthesized in this study showed to be more phototoxic and more soluble in physiological medium than Visudyne&reg;, considerable advantages for the use as photosensitizers for PDT.

A transição materno-embrionária é um fenômeno complexo caracterizado pela iniciação da transcrição no embrião e a substituição do mRNA materno pelo mRNA embrionário. O mRNA e as proteínas estocadas no oócito são utilizados nas primeiras clivagens e, posteriormente, o embrião deve iniciar a transcrição dos genes necessários ao seu desenvolvimento, que ocorre no estádio de oito células em embriões bovinos. Nesta etapa, podem ser observados embriões competentes a continuar o desenvolvimento, enquanto embriões incompetentes sofrem bloqueio. Pelo fato do bloqueio ocorrer na fase de ativação do genoma embrionário, formulou-se a hipótese de que o bloqueio estaria associado a genes transcritos neste momento, contrariamente à hipótese mais aceita de bloqueio passivo. O objetivo deste trabalho foi de identificar, categorizar e avaliar transcritos diferencialmente expressos entre embriões bovinos de desenvolvimento rápido e lento, além de elucidar possíveis vias de sinalização de morte ou sobrevivência celular. Para isso, foi feita uma hibridação em membrana de macro arranjo contendo genes humanos relacionados a ciclo celular, hibridada com aRNA marcado radioativamente oriundo de embriões bovinos produzidos in vitro de acordo com sua velocidade de desenvolvimento, seguido por RT-PCR e análise de vias de sinalização para validação da hibridação. A média de similaridade entre estes genes humanos e bovinos de 89,3%. Pelas membranas de macro arranjos foram identificados 120 genes com modulação diferencial entre embriões lentos e rápidos, sendo 100 genes com regulação superior nos embriões lentos. Entre os genes com modulação positiva nos embriões rápidos, 40% foram primariamente identificados como ligantes a proteínas e 25% têm atividade catalítica, com resultados similares no grupo de genes com modulação positiva nos embriões lentos. Por um lado, as diferenças de transcrição entre embriões de desenvolvimento rápido e lento não foram confirmadas pelo RTPCR. Mas os genes diferencialmente modulados estão associados e constitutivamente presentes em algumas vias de sinalização para morte celular. Os resultados sugerem que a ativação do genoma embrionário é necessária para a sinalização de vias de sobrevivência ou morte celular programada. Assim, o bloqueio do desenvolvimento não é um processo passivo, mas sim um processo ativo de transcrição de genes, ativando tanto a cascata de sobrevivência quanto a cascata de morte em embriões com baixo potencial de desenvolvimento. / Maternal-zygotic transition is a complex phenomenon characterized by the initiation of transcription in the embryo and the transition of maternal mRNA with embryonic mRNA. It is believed that the mRNAs and proteins synthethized by the oocyte during its growth and final maturation allow the zygote to develop during the early stages of embryo development up to the 8 cell-stage, the moment when the bovine embryo acquires transcriptional competence. Competent embryos are able to develop until blastocyst, while incompetent embryos block. Since the blockage occurs during embryo genome activation, we developed the hypothesis that gene transcription in incompetent embryos is associated with the blockage, instead of passive blockage. The aim of this work was to identify, categorize and analyze gene expression differences between fast cleavage and slow cleavage embryos, and discover possible signaling pathways to cell death or cell survival. We used a macroarray membrane spotted with human genes related to cell cycle and hybridizated with a radioactive labeled aRNA from fast or slow in vitro produced embryos. Real-time PCR and signaling pathways analysis were designed for further validation of the array. The mean similarity between human and bovine genes was 89,3%. According to the array membranes, it was possible to identify 120 genes differentially expressed between slow and fast cleavage embryos. Hence, the majority of the genes were more expressed in slow embryos (100 genes versus 20 genes in fast group). Among genes more expressed at fast embryos, 40% were identified as protein binding and 25% have catalytic activity, with similar results in slow embryos. In one hand, differences between fast and slow embryos transcripts were not confirmed by real-time PCR analysis. But on the other hand, the differentially expressed genes are somehow related to and constitutively present in some recognized death pathways. Together, these results presented herein suggest that embryonic genome activation is necessary for survival or cell death signaling. Moreover, developmental block is not a passive pathway, but rather a very active transcriptional pathway, leading to activation of cell survival genes prior to genes related to death in slow-developing embryos.