LIMA, Magda Laiara Bezerra de. Análise ultraestrutural e molecular do desenvolvimento do integumento interno de sementes de Jatropha curcas L. 2017. 102 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-05-02T19:58:45Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_mlblima.pdf: 7882259 bytes, checksum: 57d42e334a50ab63d28f9035b1d8229b (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-05-17T18:58:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_mlblima.pdf: 7882259 bytes, checksum: 57d42e334a50ab63d28f9035b1d8229b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-17T18:58:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_mlblima.pdf: 7882259 bytes, checksum: 57d42e334a50ab63d28f9035b1d8229b (MD5) Previous issue date: 2017 / Jatropha curcas L. is a species of oleaginous plant that arouses economic interest because it is an alternative source for biodiesel production although little is known about the biology of the development of this plant organism. This knowledge can serve as a basis for the domestication of this species and the discovery of probable solutions for seed toxicity due to the presence of the phorbol esters in the seeds, for example. J. curcas seeds are made up by the embryo, endosperm as well as the surrounding seed coat. The latter is derived from the development of both outer (oi) and inner (ii) integuments. It is known that the ii may act as a transient storage tissue providing carbon and nitrogen sources for the development of the filial tissues, endosperm and embryo. Scientific reports indicate that during ii development the cells undergo programmed cell death (PCD). The aimed at observing the changes in the ultrastructure of the ii during its development and confirm the PCD characteristics by assessing the gene expression pattern for seven different hydrolases (arabinofuranosidase, glucanase, peptidase cysteine tailed RDEL, peptidase cysteine tailed KDEL, aspartic peptidase, serine peptidase and subtilisin) and two inhibitors (inhibitor peptidase cysteine and serpin). The stages used in this study (ovule and seeds at 5, 10 and 25 DAP) were selected based on the morphological changes in the ii observed in light microscopy. The vacuolization and cell expansion were the most conspicuous characteristics observed in the early development of the ii. Furthermore, the first related morphological changes related to PCD were observed at 5 DAP, including rising the periplasmic spaces and ricinossomos and collapse of tonoplasto. In later stages, at 10 and 25 DAP, it was observed enlargement of the cell volume, followed by less dense cytoplasm, presence of peroxisomes, lobed nucleus, condensed chromatin, invaginations and disruption of the plasma membrane and finally cell wall breakdown as well as the rising of gerontoplasts (25 DAP). In the early stages (ovule, 5 and 10 DAP) the expression pattern of genes encoding cysteine peptidase tailed KDEL, serine peptidase and subtilisin it was higher at 10 DAP if compared to the calibrator (ovule). In the ii proximal region of seeds with 25 DAP the expression of all peptidases (other than aspartic peptidase), the arabinofuranosidase and glucanase was statistically superior when compared to the distal region. The correlation of the ultrastructural findings and the transcriptional expression pattern indicates that the occurrence of CCM in the internal integument can act in the supply of carbon and nitrogen sources for the development of the embryo and endosperm. / Jatropha curcas L. é uma espécie de planta oleaginosa que desperta interesse econômico por ser uma fonte alternativa para a produção de biodiesel muito embora, pouco se sabe sobre a biologia do desenvolvimento desse organismo vegetal. Esses conhecimentos podem servir de base para a domesticação desta espécie e a descoberta de prováveis soluções para toxicidade das sementes devido a presença dos ésteres de forbol nas sementes, por exemplo. As sementes de J. curcas são constituídas pelo embrião e endosperma, ambos envolvidos pela testa e o tegma. Estes últimos são provenientes do desenvolvimento dos integumentos externo (ie) e interno (ii). É sabido que o ii pode atuar como tecido de armazenamento transeunte de fontes de carbono e nitrogênio para o desenvolvimento dos tecidos filiais, endosperma e embrião. Relatos científicos indicam que durante o desenvolvimento do ii as células sofrem morte celular programada (MCP). Buscou-se observar as modificações na ultraestrutura do ii em decorrência do seu desenvolvimento; além de validar as características da MCP por meio da avaliação do padrão de expressão de sete hidrolases (arabinofuranosidase, glucanase, peptidase cisteínica com cauda RDEL, peptidase cisteínica com cauda KDEL, peptidase aspártica, peptidase serínica e subtilisina) e dois inibidores de peptidase (inibidor de peptidase cisteínica e serpina). Além do óvulo, os estágios utilizados neste estudo (sementes aos 5, 10 e 25 DAP) foram selecionados com base nas modificações morfológicas do ii obtidas através da análise histológica. A vacuolização e a expansão celular foram as características mais conspícuas observadas no início do desenvolvimento do ii. Além disso, as primeiras mudanças morfológicas relacionadas a MCP foram observadas aos 5 DAP, incluindo, surgimento dos espaços periplasmáticos, aparecimento dos ricinossomos, e colapso do tonoplasto. A sequência do processo degradativo foi observada nos estágios mais avançados (10 e 25 DAP) com expansão do volume celular, acompanhado de citoplasma menos denso, presença de peroxissomos, núcleo lobado, cromatina condensada, invaginações e ruptura da membrana plasmática e, finalmente a ruptura da parede celular, além do surgimento dos gerontoplastos (25 DAP). Nos estágios iniciais (óvulo, 5 e 10 DAP) o padrão de expressão relativa dos genes que codificam para peptidase cisteínica KDEL, peptidase serínica e subtilisina foi maior aos 10 DAP quando comparados com o óvulo. Na região proximal do ii das sementes com 25 DAP a expressão de todas as peptidases (exceto peptidase aspártica), a arabinofuranosidase e glucanase foi estatisticamente superior quando comparada à região distal desse mesmo estágio. A correlação dos achados ultraestruturais e o padrão de expressão transcricional indica que a ocorrência da MCP no integumento interno pode atuar no fornecimento de fontes de carbono e nitrogênio para o desenvolvimento do embrião e endosperma.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-05-24T17:31:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337737.pdf: 3559818 bytes, checksum: 1d2c11521cf08f96d624d537bd15d4ba (MD5) Previous issue date: 2015 / O hepatopâncreas é um órgão digestivo presente nos crustáceos, como os camarões Macrobrachium olfersi e possui papel fundamental nos sistemas metabólicos, bem como na resposta imunológica e nos processos de maturação gonadal e reprodução, além de apresentar alta sensibilidade às mudanças ambientais. Tendo em vista as alterações celulares causadas pela radiação e que estudos analisando os efeitos da radiação UV-B no hepatopâncreas ainda não estão disponíveis na literatura, o objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade da radiação UV-B sobre a organização e dinâmica do epitélio dos túbulos do hepatopâncreas de juvenis de M. olfersi. Os juvenis foram expostos à radiação UV-B simulada e a organização e distribuição das células epiteliais do hepatopâncreas foram analisadas, assim como a presença celular de polissacarídeos e lipídios através de análises histoquímicas; o perfil de proliferação e morte nos túbulos do hepatopâncreas por imuno-histoquímica; a integridade de membranas e organelas celulares, por análises ultraestruturais. O epitélio do hepatopâncreas dos grupos controle e tratado apresentaram quatro tipos celulares (células E, R, F e B) e, ainda, um quinto tipo, a célula M. A célula fonte do epitélio, a célula E, mostrou a capacidade de se dividir nas três zonas do túbulo do hepatopâncreas. A radiação UV-B induziu à alteração do perfil de proliferação das células epiteliais do hepatopâncreas e levou ao aumento da expressão da caspase-3, desorganização epitelial do hepatopâncreas, diminuição da homogeneidade citoplasmática, aumento da presença de vacúolos e maior frequência e volume das células B. A produção e armazenamento de polissacarídeos aumentaram, já as dos lipídios diminuíram. Ocorreram alterações ultraestruturais nas células R e F, como: condensação da heterocromatina próxima ao envelope nuclear, perda das cristas mitocondriais, diminuição dos ribossomos associados ao retículo endoplasmático rugoso, dilatação das cisternas do complexo de Golgi, aumento de componentes autofágicos e, ainda, alteração na estrutura das microvilosidades. Diante dessas observações, foi analisada a expressão das proteínas Drp1 e PCNA, relacionadas com estresse celular. Os resultados mostraram que a radiação UV-B induziu o aumento da expressão dessas proteínas, indicando o comprometimento da dinâmica mitocondrial, das funções celulares e prejudicando a viabilidade celular. Os dados obtidos mostraram que o hepatopâncreas é um órgão adequado para estudos sobre os efeitos da radiação UV-B e que o estresse causado nas organelas das células epiteliais pela irradiação levou à formação de componentes autofágicos e à morte celular, alterando as diversas funções celulares do epitélio do hepatopâncreas.<br> / Abstract : The hepatopancreas is a digestive organ present in crustaceans such, as the prawn Macrobrachium olfersi, and have key role in various metabolic systems, as well as in the immune response and gonadal maturation and reproductive processes, showing high sensitivity to environmental changes. Considering the major changes to radiation in cells and that no studies available in the literature has verified the effects of UV-B radiation in the hepatopancreas, the objective of this work was to evaluate the toxicity of UV-B radiation on the organization and dynamics of the hepatopancreas tubules epithelium of juvenile M. olfersi. The juveniles were exposed to simulated UV-B irradiation and the organization and distribution of the epithelial cells were analyzed, as well as cellular presence of polysaccharides and lipids by histochemical analysis; regions of proliferation and death in the tubules of the hepatopancreas by immuno-histochemistry; integrity of membranes and organelles by ultrastructural analysis. The four cell types (E, R, F, and B-cell) as well as a fifth cell type, the M cell, were identified in the hepatopancreas' epithelium of control and treated groups. It was also observed that the cell source of the epithelium, the E cell, can divide itself into the three zones of the hepatopancreas tubule. UV-B radiation induced change in the profile of the epithelial cells proliferation of hepatopancreas and induced increased caspase-3 expression; epithelial disorganization of hepatopancreas; cells showed a decrease in cytoplasmic homogeneity, increased presence of vacuoles and increased frequency and volume of B cells. The production and storage of polysaccharides increased while the lipids decreased. Ultrastructural changes occurred in R and F cells, such as: heterochromatin condensation near to the nuclear envelope, loss of mitochondrial crests, and reduction of ribosomes associated with the rough endoplasmic reticulum, dilation of the Golgi cisterns, increased autophagic components and, furthermore change in the structure of the microvilli. In face of these observations, was analyzed the expression of Drp1 and PCNA, proteins related to cell stress. Results showed that UV-B radiation induced the increased expression of these proteins, indicating impairment of mitochondrial dynamics, cell functions and impairing cell viability. Data obtained in this study showed that the hepatopancreas is a suitable organ for studies on the effects of UV-B radiation and that the stress caused in the organelles of epithelial cells by irradiation led to the formation of autophagic components and cell death, impairing various cellular functions in the hepatopancreas epithelium.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-05T22:37:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 320786.pdf: 11215479 bytes, checksum: c543f1d30292131c60ef33cf1f56d3e8 (MD5) Previous issue date: 2013 / Mundialmente, o câncer de pulmão é um dos principais responsáveis pela alta taxa de mortalidade atribuída ao câncer, tornando necessária a busca por novos agentes no combate a esta malignidade. Cucurbitacinas (CUCs) são compostos triterpênicos tetracíclicos encontrados, principalmente, em espécies da família Cucurbitaceae, conhecidas por seu amargor e toxicidade. Nos últimos anos, vários estudos confirmaram a potencial atividade citotóxica e antitumoral de algumas cucurbitacinas. Neste trabalho, foi realizada a triagem citotóxica de uma série de 51 cucurbitacinas naturais e derivados semissintéticos, através do ensaio colorimétrico do MTT, seguida da elucidação do mecanismo de morte celular provocada pelas cucurbitacinas mais ativas, com destaque para as CUCs 18 e 37. A CUC 18, uma cucurbitacina natural inédita, isolada de Wilbrandia ebracteata (taiuiá), induziu apoptose em células A549, bloqueou-as na fase G2/M do ciclo celular, e provocou desestruturação do citoesqueleto. Esses efeitos foram atribuídos à inibição das vias de sinalização STAT3 e AKT, o que acarretou na baixa expressão de genes antiapoptóticos. A CUC 37, um novo derivado semissintético da cucurbitacina B, também induziu apoptose, bloqueio na fase G2/M do ciclo celular, e desestruturação do citoesqueleto de células A549, porém em concentrações 30 vezes mais baixas do que a CUC 18. A CUC 37 atuou diretamente sobre os receptores do fator de crescimento epidermal (EGFR), causando a redução da expressão de vias de sinalização localizadas abaixo deste receptor (ERK, PI3K/AKT e STAT3) e, consequentemente, reduzindo a transcrição dos genes alvos das mesmas. Além disso, a CUC 37 apresentou seletividade em relação a linhagens oncogênicas (NIH3T3/v-RAF e NIH3T3/k-RAS), quando comparada aos fibroblastos saudáveis (NIH3T3). Finalmente, o efeito antitumoral da CUC 37 foi confirmado em um modelo animal de tumor de pulmão, utilizando-se camundongos geneticamente modificados (c-RAF-1-BxB). Em conjunto, estes resultados sugerem que a CUC 37 é um candidato promissor a ser desenvolvido como fármaco para o tratamento de câncer de pulmão. <br> / Abstract : Lung cancer is one of the leading causes of death by cancer worldwide, which stimulates the search for new agents for the treatment of this malignancy. Cucurbitacins (CUCs) are a group of tetracyclic triterpenoid compounds found mainly in species of the Cucurbitaceae family, known for their bitterness and toxicity. In the past years, many reports confirmed the cytotoxic and antitumor activities of some cucurbitacins. In the present work a cytotoxic screening with 51 cucurbitacins and their semisynthetic derivatives was performed by MTT colorimetric assay, and then, the mechanism of cell death was investigated for the most active ones, with an emphasis on CUC 18 and CUC 37. The CUC 18, a novel cucurbitacin isolated from Wilbrandia ebracteata (taiuiá), induced apoptosis on A549 cells, arrested the cell cycle at G2/M phase and led to a disruption of the actin cytoskeleton. These effects were attributed to inhibition of STAT3 and AKT signaling pathways, which led to down regulation of antiapoptotic genes transcription. The CUC 37, a novel semisynthetic derivative of cucurbitacin B, also induced apoptosis, cell cycle arrest at G2/M phase, and actin cytoskeleton disruption, however with concentrations about 30 times lower than the CUC 18. The CUC 37 targeted directly the epidermal growth factor receptors (EGFR), leading to a down regulation of the downstream signaling pathways of this receptor (ERK, PI3K/AKT, and STAT3) and, consequently, their antiapoptotic target genes. Besides, the CUC 37 showed more selectivity towards NIH3T3/v-RAF and NIH3T3/k-RAS cells, when compared to non-transformed cells (NIH3T3 wild type cells). Finally, the antitumor effect of CUC 37 was confirmed in an in vivo lung tumor model, employing transgenic mice (c-RAF-1-BxB). Taken together, these findings strongly suggest that CUC 37 is a promising drug candidate for the treatment of lung cancer.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T12:53:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337737.pdf: 3559818 bytes, checksum: 1d2c11521cf08f96d624d537bd15d4ba (MD5) Previous issue date: 2015 / O hepatopâncreas é um órgão digestivo presente nos crustáceos, como os camarões Macrobrachium olfersi e possui papel fundamental nos sistemas metabólicos, bem como na resposta imunológica e nos processos de maturação gonadal e reprodução, além de apresentar alta sensibilidade às mudanças ambientais. Tendo em vista as alterações celulares causadas pela radiação e que estudos analisando os efeitos da radiação UV-B no hepatopâncreas ainda não estão disponíveis na literatura, o objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade da radiação UV-B sobre a organização e dinâmica do epitélio dos túbulos do hepatopâncreas de juvenis de M. olfersi. Os juvenis foram expostos à radiação UV-B simulada e a organização e distribuição das células epiteliais do hepatopâncreas foram analisadas, assim como a presença celular de polissacarídeos e lipídios através de análises histoquímicas; o perfil de proliferação e morte nos túbulos do hepatopâncreas por imuno-histoquímica; a integridade de membranas e organelas celulares, por análises ultraestruturais. O epitélio do hepatopâncreas dos grupos controle e tratado apresentaram quatro tipos celulares (células E, R, F e B) e, ainda, um quinto tipo, a célula M. A célula fonte do epitélio, a célula E, mostrou a capacidade de se dividir nas três zonas do túbulo do hepatopâncreas. A radiação UV-B induziu à alteração do perfil de proliferação das células epiteliais do hepatopâncreas e levou ao aumento da expressão da caspase-3, desorganização epitelial do hepatopâncreas, diminuição da homogeneidade citoplasmática, aumento da presença de vacúolos e maior frequência e volume das células B. A produção e armazenamento de polissacarídeos aumentaram, já as dos lipídios diminuíram. Ocorreram alterações ultraestruturais nas células R e F, como: condensação da heterocromatina próxima ao envelope nuclear, perda das cristas mitocondriais, diminuição dos ribossomos associados ao retículo endoplasmático rugoso, dilatação das cisternas do complexo de Golgi, aumento de componentes autofágicos e, ainda, alteração na estrutura das microvilosidades. Diante dessas observações, foi analisada a expressão das proteínas Drp1 e PCNA, relacionadas com estresse celular. Os resultados mostraram que a radiação UV-B induziu o aumento da expressão dessas proteínas, indicando o comprometimento da dinâmica mitocondrial, das funções celulares e prejudicando a viabilidade celular. Os dados obtidos mostraram que o hepatopâncreas é um órgão adequado para estudos sobre os efeitos da radiação UV-B e que o estresse causado nas organelas das células epiteliais pela irradiação levou à formação de componentes autofágicos e à morte celular, alterando as diversas funções celulares do epitélio do hepatopâncreas.<br> / Abstract : The hepatopancreas is a digestive organ present in crustaceans such, as the prawn Macrobrachium olfersi, and have key role in various metabolic systems, as well as in the immune response and gonadal maturation and reproductive processes, showing high sensitivity to environmental changes. Considering the major changes to radiation in cells and that no studies available in the literature has verified the effects of UV-B radiation in the hepatopancreas, the objective of this work was to evaluate the toxicity of UV-B radiation on the organization and dynamics of the hepatopancreas tubules epithelium of juvenile M. olfersi. The juveniles were exposed to simulated UV-B irradiation and the organization and distribution of the epithelial cells were analyzed, as well as cellular presence of polysaccharides and lipids by histochemical analysis; regions of proliferation and death in the tubules of the hepatopancreas by immuno-histochemistry; integrity of membranes and organelles by ultrastructural analysis. The four cell types (E, R, F, and B-cell) as well as a fifth cell type, the M cell, were identified in the hepatopancreas' epithelium of control and treated groups. It was also observed that the cell source of the epithelium, the E cell, can divide itself into the three zones of the hepatopancreas tubule. UV-B radiation induced change in the profile of the epithelial cells proliferation of hepatopancreas and induced increased caspase-3 expression; epithelial disorganization of hepatopancreas; cells showed a decrease in cytoplasmic homogeneity, increased presence of vacuoles and increased frequency and volume of B cells. The production and storage of polysaccharides increased while the lipids decreased. Ultrastructural changes occurred in R and F cells, such as: heterochromatin condensation near to the nuclear envelope, loss of mitochondrial crests, and reduction of ribosomes associated with the rough endoplasmic reticulum, dilation of the Golgi cisterns, increased autophagic components and, furthermore change in the structure of the microvilli. In face of these observations, was analyzed the expression of Drp1 and PCNA, proteins related to cell stress. Results showed that UV-B radiation induced the increased expression of these proteins, indicating impairment of mitochondrial dynamics, cell functions and impairing cell viability. Data obtained in this study showed that the hepatopancreas is a suitable organ for studies on the effects of UV-B radiation and that the stress caused in the organelles of epithelial cells by irradiation led to the formation of autophagic components and cell death, impairing various cellular functions in the hepatopancreas epithelium.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:13:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 339054.pdf: 1298700 bytes, checksum: 58ce48b4d8a780863e42ff7b9368aadc (MD5) Previous issue date: 2015 / Glioblastomas multiformes (GBM) são tumores sólidos de origem glial classificados como nível IV pela OMS, considerados altamente invasivos e possuem alta taxa proliferativa. Células de glioma possuem metabolismo energético diferencial que consiste na tendência em utilizar a glicose para formação de ATP via glicólise anaeróbica, mesmo em presença de oxigênio, característica conhecida como efeito Warburg. A preferência pela quebra da glicose como fonte energética se caracteriza como uma adaptação metabólica que pode beneficiar o crescimento e expansão do tumor. As células de gliomas podem liberar glutamato em altas concentrações. A diminuição da oferta de glicose pode sensibilizar as células de gliomas, pois muitos tumores não possuem mecanismos protetores eficientes para metabolização de substratos alternativos. A Carmustina (BCNU) e a Temozolomida (TMZ) fazem parte de uma classe de fármacos citotóxicos conhecidos como alquilantes de ADN, e são substâncias utilizadas em quimioterapia para tumores cerebrais. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do tratamento de restrição de glicose conjugado ao uso de quimioterápicos na indução de morte celular, formação de EROs, liberação de glutamato, migração e morfologia celular em células de linhagem primária de GBM in vitro, derivadas de ressecção cirúrgica e nomeadas GBM1 pelo grupo de pesquisa. O tratamento de restrição teve duração de 24 horas, e após esse período foram aplicados os quimioterápicos TMZ e BCNU na concentração de 400 µM, por mais 24 horas. Os dados obtidos mostraram que a privação de glicose diminui a viabilidade destas células e, quando em conjunto com os quimioterápicos, foi possível notar uma sensibilização das células à ação dos fármacos. A formação de EROs no tratamento de 48 horas acompanha a diminuição da viabilidade e, nas primeiras horas (2, 4 e 6 horas),foi verificada diminuição nas concentrações de espécies reativas nos tratamentos de restrição em conjunto com BCNU. As taxas de liberação de glutamato não apresentaram modificações importantes. O tratamento diminuiu a migração celular e mostrou modificações na morfologia celular. A privação de glicose é uma possibilidade de tratamento alternativo não tóxico, e mostrou ter ação positiva contra as células GBM1.<br> / Abstract : Glioblastoma multiforme (GBM) are solid tumors of glial origin classified as level IV by WHO, considered highly invasive and with high proliferative rate. Glioma cells exhibit differential energy metabolism, with tendency to use glucose for ATP production through glycolysis, even in the presence of oxygen, a characteristic known as the Warburg Effect. This metabolic adaptation benefits the tumor growth and expansion. Glioma cells also have the characteristic of releasing high concentrations of glutamate. Decreased of glucose energy can sensitize gliomas cells because many tumors have no effective protective mechanisms for metabolizing alternative substrates. Carmustine (BCNU) and Temozolomide (TMZ) are cytotoxic drugs known as DNA alkylating agents, usually used in chemotherapy for brain tumors. The objective of this study was to evaluate the treatment effect of glucose restriction combined to chemotherapy in the induction of cell death, ROS formation, glutamate release, migration and cell morphology in primary cell line GBM vitro derived resection surgical and named GBM1 by the research group. Restriction treatment lasted for 24 hours and, after this period, TMZ and BCNU were applied at a concentration of 400 µM, for 24 hours. Data showed that glucose deprivation decreases cell viability and, with chemotherapy, was possible to notice a sensitizing cells to the drugs. ROS formation after 48 hour treatment follow viability?s decline. After early hours (2, 4 and 6 hours), was observed decrease in concentrations of reactive species in restriction combination with BCNU treatment. Glutamate release rates showed no significant changes. Treatment decreased cell migration and showed cells morphology changes. Glucose deprivation is a possibility of non-toxic and alternative treatment, capable to increase cellular sensitivity to the chemotherapy and shown to have positive action against GBM1 cells.

Made available in DSpace on 2015-10-06T13:02:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-03-21. Added 1 bitstream(s) on 2015-10-06T13:19:28Z : No. of bitstreams: 1 000848868.pdf: 401988 bytes, checksum: 08ca73724d8938b9b116d34fb50815a0 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / In humans, the immunosuppression observed in uremic patients is associated with the neutrophil dysfunction caused by uremic toxins. P-cresol accumulates in the blood of patients with chronic renal failure (CRF) promoting the inhibition of neutrophil oxidative metabolism. This study aimed to measure the plasma concentrations of p-cresol in dogs with CRF and test the hypothesis that free p-cresol causes neutrophil dysfunction. To this end, plasma concentration of p-cresol was determined using high pressure liquid chromatography (HPLC) in dogs presenting stage IV of CRF. The in vitro specific effect of p-cresol on the oxidative metabolism and apoptosis rate of neutrophils from healthy dogs was also evaluated, considering the highest plasma concentration of this toxin observed on the in vivo measurement of dogs with CRF. Isolated neutrophils from 20 healthy dogs were incubated in RPMI medium alone, supplemented with p-cresol or plasma from dogs with CRF. Neutrophil oxidative metabolism was assessed by capillary flow cytometry using the probes hydroethidine and 2',7'- dichlorofluorescein diacetate with or without stimulus with phorbol myristate acetate and N-formyl-methionyl-leucylphenylalanine. Apoptosis and viability of neutrophils were quantified also in capillary flow cytometry using Annexin V-PE system with or without stimulus with camptothecin. Dogs with CRF presented oxidative stress and increased plasma levels of p-cresol, the higher concentration of p-cresol caused in vitro neutrophil dysfunction. It can be concluded that p-cresol may be involved with in vivo oxidative stress that its higher concentration decreases the viability and lead to a reduced production of reactive oxygen species

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:10:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-03-03. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:26:02Z : No. of bitstreams: 1 000843974.pdf: 2232932 bytes, checksum: d71102c081901322bd4ba52e2d8d373f (MD5) / O fipronil é um inseticida de amplo-espectro de ação utilizado extensivamente para o controle de pragas. Existem relatos descritos na literatura de intoxicação em animais e humanos provocada pelo composto, causando até a morte. Assim, torna-se bastante relevante elucidar os mecanismos de hepatotoxicidade do inseticida para o auxílio no tratamento em caso de intoxicação por parte dos mamíferos. O objetivo desse estudo foi caracterizar o mecanismo de toxicidade do fipronil em hepatócitos isolados de rato e o efeito da biotransformação sobre o seu potencial toxicológico. As concentração do fipronil utilizada foi de 5, 10, 15 e 25 μM em células permeabilizadas com digitonina e de 25, 50, 75 e 100 μM nas não permeabilizadas. A toxicidade do fipronil aos hepatócitos foi avaliada pelo consumo de oxigênio, potencial de membrana mitocondrial, concentração intracelular de ATP hepatócitos isolados de ratos normais ou previamente tratados com proadifen, homeostase intracelular do Ca 2+ e viabilidade celular. A viabilidade celular foi avaliada por meio da exclusão do azul de tripan em hepatócitos isolados de ratos normais e atividade das enzimas alanina transaminase (ALT) e aspartato transaminase (AST) em hepatócitos isolados de ratos normais ou previamente tratados com proadifen, um inibidor do citocromo P450. O fipronil reduziu a respiração mitocondrial em células energizadas com glutamato mais malato de maneira dose dependente, e diminuiu o potencial de membrana mitocondrial e esses efeitos foram acompanhados pela redução da concentração celular de ATP e pelo rompimento da homeostase intracelular do Ca 2+ . A viabilidade celular foi afetada pelo fipronil com maior potência nos hepatócitos isolados de ratos normais, indicando que os metabólitos do inseticida aumenta seu potencial toxicológico. Os resultados deste estudo indicam que a toxicidade do fipronil aos hepatócitos está... / Fipronil is an insecticide of broad-spectrum action used extensively for pest control. There are reports in the literature of animals and humans poisoning caused by the compound, ocacioning. Thus, it becomes quite important to elucidate the mechanisms of hepatotoxicity of the insecticide for treatment in case of intoxication by mammals. The aim of this study was to characterize the mechanism of toxicity of fipronil in isolated rat hepatocytes and the effect of biotransformation on its toxicological potential. The toxicity of fipronil was assessed by monitoring oxygen consumption and mitochondrial membrane potential, intracellular ATP concentration, Ca 2+ homeostasis and cell viability. The cell viability was evaluated by the tripan blue exclusion in hepatocytes isolated from normal rats and the activity of the enzyme alanine transaminase (ALT) and aspartate transaminase (AST) in hepatocytes isolated from normal rats or rats pretreated with proadifen, a cytochrome P450 inhibitor. Fipronil reduced mitochondrial respiration in cells energized with glutamate plus malate in a dose- dependent manner, and dissipated the mitochondrial membrane potential accompanied by reductions in ATP concentration and a disruption of intracellular Ca 2+ homeostasis. Cell viability was affected by fipronil with higher potency in hepatocytes isolated from normal rats, indicating that the metabolism of insecticide increases its toxicological potential. The results of this study indicate that the toxicity of fipronil to the hepatocytes is related to the inhibition of mitochondrial activity, leading to a decreased ATP synthesis and consequent alteration in intracellular Ca 2+ homeostasis, resulting in cell death

A isquemia cerebral está entre as principais causas de mortalidade e morbidade em países industrializados e, apesar dos estudos constantes, ainda não existe um tratamento eficaz. Nesse estudo, investigamos o efeito neuroprotetor da boldina, um alcalóide presente nas folhas e casca de Peumus boldus Molina, sobre os danos causados pela isquemia cerebral. Para isso, foi utilizado um modelo in vitro de privação de oxigênio e glicose (POG) em culturas organotípicas de hipocampo de rato. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com boldina nas concentrações de 120 µM e 250 µM diminuiu significativamente a morte celular induzida pela POG de 36% para 20 e 11%, respectivamente. A boldina não apresentou efeito tóxico em condições basais em nenhuma das concentrações testadas. O efeito neuroprotetor da boldina ocorreu apenas quando ela estava presente durante o período de POG, não havendo diferença quando ela foi utilizada somente durante o período de 24 horas de recuperação. O tratamento com boldina durante a POG foi capaz de induzir ativação microglial observada 24 horas após o tratamento através da marcação com isolectina B4. Ela também causou um aumento considerável na produção de espécies reativas, o que pode ser causa ou conseqüência da ativação da microglia. Não foram observadas diferenças na fosforilação das proteínas Akt e GSK-3ß 24 horas após o tratamento e, portanto, alterações nessas proteínas não parecem estar envolvidas com a neuroproteção causada pela boldina. Em conjunto, os resultados sugerem um efeito neuroprotetor promissor da boldina contra os danos causados pela POG, sendo que os mecanismos que desencadeiam esse efeito devem ser melhor elucidados. / Ischemic stroke is among the major causes of mortality and morbidity in industrialized countries and, in spite of several studies, no efficient treatment is available to the patients. In this work, we investigated the neuroprotective effect of boldine, an alkaloid present in leaves and bark of Peumus boldus Molina, against the damage caused by an in vitro lesion that mimics ischemic stroke. For these experiments, we used an in vitro model of oxygen and glucose deprivation (OGD) in rat organotypic hippocampal slice cultures. Our results showed that the treatment with boldine in the concentrations of 120 µM and 250 µM caused a significant reduction in cellular death after OGD from 36%, observed in OGDvehicle exposed cultures, to 20% and 11%, respectively. Boldine was not cytotoxic in basal conditions in any of the tested concentrations. The neuroprotective effect of boldine was observed when it was present during the period of OGD, showing no difference when it was used only during the recovery period of 24 hours. To elucidate a possible mechanism by which boldine exerts its neuroprotective effect we investigated the microglial activation, production of reactive species and the phosphorylation of Akt and GSK-3b proteins involved in PI3K cell signaling pathway. Our results showed that, when used during the OGD period, boldine 250 µM induced a marked microglial activation, as shown by isolectin B4 binding, increased reactive species production, as shown by DCF-DA oxidation and had no effect on Akt and GSK-3ß phosphorylation. Taken together, the results presented here suggest a promising neuroprotective effect of boldine against the damage caused by OGD, but the mechanism of action of this compound must be better elucidated.

Orientador: Fábio Erminio Mingatto / Banca: Flavia Thomas Verechia Pereira / Banca: Ana Angélica Henrique Fernandes / Resumo: O fipronil é um inseticida de amplo-espectro de ação utilizado extensivamente para o controle de pragas. Existem relatos descritos na literatura de intoxicação em animais e humanos provocada pelo composto, causando até a morte. Assim, torna-se bastante relevante elucidar os mecanismos de hepatotoxicidade do inseticida para o auxílio no tratamento em caso de intoxicação por parte dos mamíferos. O objetivo desse estudo foi caracterizar o mecanismo de toxicidade do fipronil em hepatócitos isolados de rato e o efeito da biotransformação sobre o seu potencial toxicológico. As concentração do fipronil utilizada foi de 5, 10, 15 e 25 μM em células permeabilizadas com digitonina e de 25, 50, 75 e 100 μM nas não permeabilizadas. A toxicidade do fipronil aos hepatócitos foi avaliada pelo consumo de oxigênio, potencial de membrana mitocondrial, concentração intracelular de ATP hepatócitos isolados de ratos normais ou previamente tratados com proadifen, homeostase intracelular do Ca 2+ e viabilidade celular. A viabilidade celular foi avaliada por meio da exclusão do azul de tripan em hepatócitos isolados de ratos normais e atividade das enzimas alanina transaminase (ALT) e aspartato transaminase (AST) em hepatócitos isolados de ratos normais ou previamente tratados com proadifen, um inibidor do citocromo P450. O fipronil reduziu a respiração mitocondrial em células energizadas com glutamato mais malato de maneira dose dependente, e diminuiu o potencial de membrana mitocondrial e esses efeitos foram acompanhados pela redução da concentração celular de ATP e pelo rompimento da homeostase intracelular do Ca 2+ . A viabilidade celular foi afetada pelo fipronil com maior potência nos hepatócitos isolados de ratos normais, indicando que os metabólitos do inseticida aumenta seu potencial toxicológico. Os resultados deste estudo indicam que a toxicidade do fipronil aos hepatócitos está... / Abstract: Fipronil is an insecticide of broad-spectrum action used extensively for pest control. There are reports in the literature of animals and humans poisoning caused by the compound, ocacioning. Thus, it becomes quite important to elucidate the mechanisms of hepatotoxicity of the insecticide for treatment in case of intoxication by mammals. The aim of this study was to characterize the mechanism of toxicity of fipronil in isolated rat hepatocytes and the effect of biotransformation on its toxicological potential. The toxicity of fipronil was assessed by monitoring oxygen consumption and mitochondrial membrane potential, intracellular ATP concentration, Ca 2+ homeostasis and cell viability. The cell viability was evaluated by the tripan blue exclusion in hepatocytes isolated from normal rats and the activity of the enzyme alanine transaminase (ALT) and aspartate transaminase (AST) in hepatocytes isolated from normal rats or rats pretreated with proadifen, a cytochrome P450 inhibitor. Fipronil reduced mitochondrial respiration in cells energized with glutamate plus malate in a dose- dependent manner, and dissipated the mitochondrial membrane potential accompanied by reductions in ATP concentration and a disruption of intracellular Ca 2+ homeostasis. Cell viability was affected by fipronil with higher potency in hepatocytes isolated from normal rats, indicating that the metabolism of insecticide increases its toxicological potential. The results of this study indicate that the toxicity of fipronil to the hepatocytes is related to the inhibition of mitochondrial activity, leading to a decreased ATP synthesis and consequent alteration in intracellular Ca 2+ homeostasis, resulting in cell death / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-02-22Bitstream added on 2014-06-13T19:08:38Z : No. of bitstreams: 1 nunes_et_me_rcla.pdf: 1014029 bytes, checksum: 950755006ea9299ef56aac556c21f073 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As glândulas salivares dos carrapatos são órgãos importantes na transmissão de patógenos a seus hospedeiros, entretanto, o conhecimento das mudanças morfofisiológicas que nelas ocorrem durante o período de alimentação são limitados. Neste trabalho estudou-se as glândulas salivares de fêmeas de carrapatos Rhipicephalus (Boophilus) microplus por meio de técnicas de morfologia, histoquímica e citoquímica de luz e ultra-estrutural em fêmeas em dois diferentes estágios de alimentação (inicial: 24 a 48 horas de infestação, peso inferior a 0,03g e semiingurgitado: 4 a 5 dias de infestação, peso entre 0,13g e 0,25g), de modo a verificar as mudanças que ocorreriam no tecido glandular neste período e identificar quando teria início o processo de degeneração, além de estabelecer que tipo de morte celular estaria envolvida. As glândulas salivares das fêmeas em início de alimentação mostraram suas células fortemente positivas para ATPase e eficientes na exclusão de corante vital, estando portanto, ativas ou apenas em início de degeneração. Os núcleos, de maneira geral, apresentaram-se preservados, sendo assim, descartada a ocorrência de morte celular neste estágio. A localização da fosfatase ácida demonstrou a participação desta enzima na atividade metabólica destes órgãos, regulando o processo secretor e degradando proteínas. Fêmeas no estágio semiingurgitado apresentaram glândulas com características de degeneração, como perda das especializações de membrana, presença de figuras mielínicas, vacúolos autofágicos, lisossomos, além de alterações nucleares como condensação e marginalização cromatínica, formação de blebs e chegando à fragmentação nuclear. À medida que o processo de alimentação avançou, houve aumento da enzima fosfatase ácida, entretanto, os ácinos mantiveram-se fortemente ATPase positivos. / The ticks salivary glands are important organs to the pathogens transmission to their hosts, however, the knowledge regarding the morphophysiological changes which occur in these structures during the feeding period are limited. In this work, the salivary glands of the Rhipicephalus (Boophilus) microplus female ticks were studied, using morphological,histochemical and ultrastructural citochemistry techniques in individuals at two different feeding stages (initial: 24-48 hours of attachment; weigh lower than 0.03g, and semi-engorged : 4-5 days of attachment; weigh around 0.13 and 0.25g ), in attempt to verifying the changes that would occur in the glandular tissue at this feeding period and identifying when the degeneration process would start, besides establishing which cell death type would be involved. The salivary glands from females at beginning of feeding showed their cells strongly positive to ATPase and efficient for the vital stain exclusion, being thus, active or at initial stages of degeneration. The nuclei, in a general way, present themselves preserved, being thus discarded the signs of the apoptosis occurrence in this stage. The acid phosphatase localization demonstrated this enzyme participation in the metabolic activity of these organs, regulating the secretory process and degrading proteins. Females at semi-engorged stage showed glands with degenerative characteristics, as loss of membrane especialization, presence of mielinic figures, autophagic vacuoles, lysosomes, besides nuclear alterations as chromatin condensation and marginalization, blebs formation and nuclear fragmentation. As the feeding process progressed, there was a acid phosphatase enzyme increase, however, the acini maintained strongly ATPase- positive. The results here obtained showed that the R. (B.) microplus salivary glands in females at... (Complete abstract, click electronic access below)