Les séquences non-codantes régulatrices de l’expression des gènes sont tout aussi importantes pour le phénotype d’un individu que les séquences codantes. De nombreux travaux se sont attachés à identifier les forces influençant l’évolution de ces séquences non-codantes. Ici, nous théorisons une nouvelle force sélective influençant potentiellement l’évolution de certaines séquences régulatrices. En utilisant des modèles multi-locus, nous montrons que les promoteurs génétiques les plus forts (activateurs de la transcription) gagnent un avantage à voir la copie du gène qui leur est associée (située sur le même chromosome) davantage exprimée que la copie homologue, contrôlée par un promoteur homologue moins fort. La surexpression des copies associées aboutit à une meilleure purge des mutations délétères chez ces copies, et ainsi à une association génétique entre promoteurs forts et contexte génétique favorable. Si la recombinaison entre le gène et le promoteur est suffisamment faible pour que cette association persiste, la force des promoteurs est sélectionnée pour augmenter. L’escalade des forces des promoteurs ne conduit pas forcément à une surproduction de protéines : d’autres régulateurs peuvent co-évoluer pour maintenir un niveau d’expression optimal, à condition que la sélection stabilisante tolère des niveaux d’expression transitoirement sub-optimaux. En variant les modes de reproduction, nous avons montré que ce nouveau processus sélectif ne menait pas nécessairement à une escalade de la force des promoteurs. Lorsque les chromosomes sont suffisamment isolés génétiquement (peu de recombinaison, peu de fécondation croisée), la sélection pour des associations génétiques favorables mène à une divergence des chromosomes : un chromosome accumule des promoteurs forts et possède des copies viables du gène, tandis que le chromosome homologue accumule des promoteurs faibles et des mutations délétères sur le gène. Dans le cas de lignées clonales peu ou pas recombinantes, on s’attend ainsi à observer une haploïdisation de l’expression des gènes : une copie de chaque gène concerné est éteinte et dégénère. Cette divergence s’applique aussi à des chromosomes sexuels ayant cessé de recombiner : on a pu montrer que la divergence des chromosomes menait à une extinction et une dégénérescence des gènes situés sur les chromosomes Y, et à une surexpression des gènes situés sur le chromosome X. En utilisant notre modèle, on propose ainsi une nouvelle théorie pour expliquer l’évolution des chromosomes sexuels non-recombinants. Enfin, on a utilisé des données de divergence entre Mus musculus et Rattus norvegicus pour isoler un signal ne pouvant être expliqué que par une sélection positive pour des promoteurs proximaux plus forts. Ce signal est faible, mais détectable, nous permettant d’apporter une première confirmation empirique du processus d’escalade des forces des promoteurs. / Non-coding sequences, that regulate gene expression, are as important as coding sequences to determine phenotypes. Many studies have identified the main forces affecting regulatory sequence evolution. Here, we theoretically identify a new selective force that may also play a role in this matter. Using multi-locus models, we show that stronger (activating more transcription) enhancers gain some benefit in having its associated gene copy more expressed than the homolog gene copy, controlled by a weaker homolog enhancer. Overexpressed gene copies are better purged from deleterious mutations, such that stronger enhancers get associated with a better genetic background. If recombination between the gene and the enhancer is low enough for this association to persist, enhancer strength selectively increases. Enhancer strength escalation does not necessarily lead to protein overproduction. Other regulators may indeed co-evolve to maintain optimal expression levels, provided that stabilizing selection allows for transitory sub-optimal expression levels. Implementing in the models different reproductive systems, we show that this new selective process does not necessarily lead to an enhancer strength escalation. When chromosomes are genetically isolated enough (little recombination, little outcrossing, selection for favorable genetic associations leads to chromosome divergence: one accumulates stronger enhancers and viable gene alleles, while the other accumulates weaker enhancers and deleterious gene mutations. For non-recombining clonal lineages, we expect gene expression to become haploid: for each gene, one copy is shut down and degenerates. Such divergence also applies to non-recombining sex chromosomes. We show that in such case, chromosome divergence leads to a shut down and degeneration of Y chromosome genes, and to an overexpression of genes located on X chromosomes. With our model, we propose a new theory to explain sex chromosome evolution after they stop recombining. Finally, we used divergence data between Mus musculus and Rattus norvegicus to find a signal that can only be explained by positive selection for stronger proximal enhancers. This signal is weak, but significant: this is the first empirical confirmation of enhancer strength escalation process we studied here.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-03-27T11:47:52Z No. of bitstreams: 1 Nelson Bernardi Lima.pdf: 1199005 bytes, checksum: e9e20cedc57b8c67aeeb8980dcfd13fb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-27T11:47:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nelson Bernardi Lima.pdf: 1199005 bytes, checksum: e9e20cedc57b8c67aeeb8980dcfd13fb (MD5) Previous issue date: 2013-02-20 / Colletotrichum species are the most important and widespread form of decay affecting mango fruit worldwide. In this study, Colletotrichum species associated with fruit anthracnose isolated from mango in northeastern Brazil were subject to molecular and morphological analyses, epidemiology and sensitivity to fungicide. The partial sequence of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GPDH) gene of 143 Colletotrichum isolates was amplified, as an initial measure of genetic diversity. A subset of 47 isolates, selected to represent the range of genetic diversity and geographic origin, were further sequenced using the partial actin (ACT), β-tubulin (TUB2), calmodulin (CAL), glutamine synthetase (GS) genes and rDNA-ITS (ITS) region. Multilocus sequence analysis, together with a critical examination of the phenotypic characters, revealed four previously described species (Colletotrichum asianum, C. fructicola, C. tropicale and C. karstii) and one new species. The new species is introduced as Colletotrichum dianesii and formally described, illustrated and compared with similar taxa. Only C. asianum and C. karstii have previously been reported from mango, while the other species represent the first report associated with the mango fruits worldwide. In general, mango cultivars were susceptible to Colletotrichum species, although C. karstii did not infect the cultivars Keith and Palmer. The highest virulence of Colletotrichum species was observed in the cultivar Tommy Atkins. All Colletotrichum species were pathogenic to host range (mango, papaya, banana, guava and sweet pepper), which deserves attention in view of the existence of constant potential inoculum source. For all Colletotrichum species temperatures between 25 and 30° C provided the highest lesions, however it was found that the species have different thermal requirements for expressing the maximum virulence in fruits. All Colletotrichum species had reduced mycelial growth in the presence of fungicides methyl thiophanate and difenoconazole an azoxystrobin, regardless of the active principle. The sensitivity response varied with the fungicide and Colletotrichum species. / A antracnose causada por espécies de Colletotrichum é uma das doenças mais importantes da cultura da mangueira em todo o mundo. Neste estudo, espécies de Colletotrichum associadas à antracnose em frutas de mangueira, no nordeste do Brasil, foram coletadas e caracterizadas a partir de marcadores moleculares, morfologia, epidemiologia e sensibilidade a fungicidas. As sequências do gene gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GPDH), de 143 isolados de Colletotrichum, foram analisadas como uma primeira medida de diversidade genética. Um subgrupo de 47 isolados, selecionados para representar a gama de diversidade genética e origem geográfica, foram sequenciados usando os genes parcial actina (ACT), β-tubulina (TUB2), calmodulina (CAL), glutamina sintetase (GS) e genes rDNA- região ITS (ITS). A análise multilocus das sequências, juntamente com um exame crítico dos caracteres fenotípicos, revelou quatro espécies descritas anteriormente (Colletotrichum asianum, C. fructicola, C. tropicale e C. karstii) e uma nova espécie. A nova espécie foi introduzida como Colletotrichum dianesii e formalmente descrita e ilustrada. Apenas C. asianum e C. karstii tinham sido relatadas a partir de manga, enquanto as outras espécies representam o primeiro relato associado à antracnose em frutos de mangueira no mundo. De modo geral, as cultivares Tommy Atkins, Palmer e Keith foram suscetíveis as espécies de Colleotrichum. A menor virulência da maioria das espécies de Colletotrichum foi observada na cultivar Tommy Atkins. Todas as espécies de Colletotrichum foram patogênicas à gama de hospedeiros inoculada (manga, mamão, banana, goiaba e pimentão). Para todas as espécies de Colletotrichum as temperaturas entre 25 e 30°C proporcionaram lesões maiores, entretanto, foi comprovado que as espécies têm exigências térmicas diferentes para expressarem a máxima virulência em frutos. Todas as espécies de Colletotrichum apresentaram o crescimento micelial reduzido na presença dos fungicidas tiofanato metílico, difenoconazole e azoxistrobina. A resposta de sensibilidade variou de acordo com o fungicida e a espécie de Colletotrichum.

Os fitoplasmas são organismos procariotos sem parede celular, que habitam as células do floema das plantas e são transmitidos, principalmente, por cigarrinhas sugadoras de floema. Este patógeno é responsável por causar doenças em diversas espécies vegetais, provocando a expressão de diversos sintomas, entre os quais podem ser destacados a redução do tamanho foliar, amarelecimento das folhas, superbrotamento de ramos e enfezamento da planta hospedeira. Entre os anos de 2013 e 2014, plantas de três espécies vegetais com sintomas característicos de infecção causada por fitoplasmas foram observadas no estado de São Paulo. O DNA total foi extraído a partir de plantas de couve-flor com sintomas de nanismo, malformação da inflorescência e necrose dos vasos do floema; de plantas da ornamental conhecida por árvore-da-felicidade com sintomas amarelecimento e redução do limbo foliar; e de plantas de Alho-poró com sintomas de enfezamento. Por meio do teste de PCR conduzido em sua maioria com os primers P1A/16S-SR foi possível detectar fitoplasmas nas três espécies vegetais testadas. Os fragmentos genômicos correspondentes ao 16S rRNA dos fitoplasmas foram sequenciados e identificados. Nas plantas de couve-flor e da árvore-da-felicidade foram identificados fitoplasmas afilados ao grupo 16SrVII-B, através da análise virtual de RFLP, cálculo do coeficientes de similaridade (F) e análise filogenética. Para ambas as espécies, este é o primeiro relato da ocorrência de representantes deste grupo, nas condições brasileiras. Nas plantas de Alho-poró foram identificados fitoplasmas afiliados ao subgrupo 16SrIII-J e ao grupo 16SrXIII, com base na análise dos genes 16S rRNA, SecY e proteína ribossomal, conduzidas através de análise virtual de RFLP, valores de coeficientes de similaridade e análise filogenética. Para o fitoplasma membro do grupo 16SrXIII foram identificadas quatro estirpes, uma delas afiliada ao subgrupo 16SrXIII-E e as demais como prováveis representantes de novos subgrupos. O presente estudo se constitui em uma contribuição ao conhecimento de novos patossistemas envolvendo fitoplasmas, bem como à caracterização molecular de fitoplasmas baseadas em diferentes genes marcadores, atualmente usados para a classificação de representantes deste grupo emergente de agentes causais de doenças de plantas. / The phytoplasmas are prokaryotic organisms without cell walls, which inhabit the phloem cells of plants and are transmitted mainly by leafhoppers sucking the phloem. This pathogen is responsible for causing diseases in various plant species, leading to expression of many symptoms, among which can be highlighted the reduction of leaf size, leaf yellowing, shoots proliferation and stunting of the plant host. Between the years 2013 and 2014, three plant species with characteristic symptoms of infection caused by phytoplasma were observed in São Paulo. Total DNA was extracted from cauliflower plants with symptoms of stunting, malformation of the inflorescence and necrosis of the phloem; ornamental plants known for Ming Aralia with symptoms yellowing and little leaves; and leek plants with symptoms of stunting. Through the PCR test conducted mostly with the primers P1A/16S-SR was possible to detect phytoplasmas in the three species of plants. The genomic fragments corresponding of 16S rRNA gene of the phytoplasma were sequenced and identified. In plants of cauliflower and Ming Aralia were identified phytoplasmas belonging to 16SrVII-B group through virtual RFLP analysis, calculation of similarity coefficients (F) and phylogenetic analysis. For both species, this is the first report of the occurrence of representatives of this group, in Brazilian conditions. In leek plants were identified phytoplasmas affiliated with 16SrIII-J subgroup, and the 16SrXIII group, based on the analysis of the 16S rRNA, SecY and ribosomal protein genes, conducted through virtual analysis of RFLP, similarity coefficient values and phylogenetic analysis. For the phytoplasma member of group 16SrXIII were identified four strains, one affiliated with 16SrXIII-E subgroup and the others as probable representatives of new subgroups. This study constitutes a contribution to knowledge of new pathosystems involving phytoplasmas and the molecular characterization of phytoplasma based on different marker genes, currently used for the classification of representatives of this emerging group of plant pathogens.

Colletotrichum species are considered one of the most economically important plant pathogens. They cause many losses in tropical, subtropical and temperate regions affecting a wide range of plant species. In tropical and subtropical regions C. gloeosporioides and C. acutatum are associated with significant losses on pre and post-harvest anthracnoses. There are still many features to understand about Colletotrichum biology and its systematics. The accurate identification of species involved with each anthracnose is of high relevance to establish management strategies to control the disease. Although the great advances on Colletotrichum systematics, species complex such as C. gloeosporioides and C. acutatum are used in a broad sense in Brazil. These complexes were recently investigated and showed to be highly genetic and geographic variable. In this study multigene analysis were carried out based on ITS, GAPDH, CHS-1, TUB2 and CAL or HIS3 partial sequences for strains of C. gloesporioides and C. acutatum complexes collected from fruit crops in Brazil. Strains from different countries and exepitypes and others sequences available on GenBank from the species accepted on both complexes were added on dataset. Six strains from C. gloeosporiodes complex and five for C. acutatum were selected based on multigene phylogeny to investigate the pathogenicity through inoculations on detached fruit. The multigene phylogenies showed the occurrence of species in Brazil related to those complexes with a high genetic variability among them. The phylogeny of Brazilian strains belonging to the C. gloeosporioides complex showed that C. siamense represents the most genetically and host-specific variable clade. In contrast, C. asianum clade grouped only strains isolated from mango. The strains from this clade used on pathogenic test were not able to infect avocado and one of the strains caused symptoms only on mango. All strains from Brazil grouped in one subclade within the C. fructicola clade and seem to represent a genetically distinct group. C. theobromicola is first reported causing anthracnose on acerola fruit. Three new species (C. polyphialidicum, C. paranaense and C. pruni) belonging to the C. acutatum complex were recognized and their morphologic descriptions were provided. The pathogenic test for the strains in the C. acutatum complex showed their cross infection ability, but in some cases the larger lesions were produced on the original host. Most brazilian strains from C. acutatum complex grouped in one subclade within the C. nymphaeae clade and seem to be genetically distinct. / Fungos do gênero Colletotrichum são considerados um dos mais importantes economicamente na Fitopatologia. Espécies desse gênero são encontradas amplamente disseminadas e estão associadas a diversas espécies de plantas hospedeiras. Em regiões tropicais e subtropicais, espécies dos complexos C. gloeosporioides e C. acutatum são a principal causa das antracnoses em pré e póscolheita de frutos e consequentemente causam significantivas perdas. Ainda há muitos aspectos a serem compreendidos sobre o gênero Colletotrichum, como a biologia e a sistemática. A acurada identificação das espécies associadas a antracnoses é de suma importância para o estabelecimento de estratégias de controle. No entanto, apesar dos grandes avanços na sistemática desse gênero, complexos de espécies como aquelas citadas acima são tratados de modo genérico no Brasil. Estes complexos de espécies foram recentemente estudados e considerados geneticamente e geograficamente variáveis. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar isolados de Colletotrichum spp. associados a diferentes frutos e regiões do Brasil por meio de análise filogenética. Para análise multilocus, foram utilizadas sequências parciais dos genes ITS, GAPDH, CHS-1, TUB2 and CAL ou HIS3. Sequências de espécies-tipos disponíveis no GenBank e de isolados de diferentes países foram adicionadas ao conjunto de dados. Com base nos resultados obtidos por meio de filogenia multilocus, seis isolados do complexo C. gloeosporiodes e cinco do complexo C. acutatum foram escolhidos para testes de patogenicidade cruzada. A espécie C. siamense, pertencente ao complexo C. gloeosporioides, foi a mais variável geneticamente e quanto ao hospedeiro de origem. Diferentemente, apenas isolados obtidos de manga se agruparam no clado C. asianum. Isolados agrupados neste clado não infectaram abacate e um dos isolados (CPC 20969) causou sintomas apenas em manga. No clado C. fructicola, isolados coletados no Brasil se agruparam em um subclado e parecem representar um grupo geneticamente distinto. A espécie C. theobromicola é relatada pela primeira vez em acerola. Foram identificadas três novas espécies, C. polyphialidicum, C. paranaense e C. pruni, pertencentes ao complexo C. acutatum. Isolados brasileiros agrupados no clado C. nymphaeae parecem representar um grupo geneticamente distinto, todos se agruparam em um subclado. Isolados do complexo C. acutatum utilizados no teste de patogenicidade provocaram sintomas nos hospedeiros testados, porém, em algumas inoculações, as lesões foram maiores no hospedeiro de origem.

La génétique des populations est l’étude de l’évolution des fréquences alléliques au sein d’une population et de l’influence des pressions évolutives sur ces fréquences. Au sein de cette discipline, des modèles de population et des mesures génétiques sont développés pour pouvoir expliquer et prédire les données génétiques. Toutefois, au fur et à mesure des avancées technologiques, de nouveaux types de données sont disponibles, et il devient primordial de développer de nouveaux modèles et de nouvelles mesures pour pouvoir expliquer ces nouvelles données génétiques, plus denses et plus riches en marqueurs génétiques grâce à l’avènement de techniques comme la Next Generation Sequencing. Pour ce faire, nous proposons dans cette thèse de développer de nouvelles mesures avec une approche dite multilocus, qui considère le génome comme un tout plutôt que comme un agglomérat de locus indépendants. Dans un premier temps, nous avons tenté de construire une base théorique de l’approche multilocus en génétique des populations. Ensuite, nous avons illustré une telle approche à travers l’étude de l’identité par descendance, des graphes de recombinaison ancestraux et des autocorrélogrammes dans les modèles de génétique des populations. À travers ces différentes études de cas, nous avons tenté d’identifier les principaux enjeux et questions que soulève la génétique des populations multilocus. / Population genetics is the study of the evolution of allelic frequencies within a population and the influence of evolutionary pressures on these frequencies. Within this field, one could develop population models and measures to explain and predict genetic data. However, as technologie evolves new types of data are available, and it becomes essential to develop new models and new measures to reflect these new genetic marker data, increasingly richer and denser thanks to the advent of new techniques such as the Next Generation Sequencing. To this end, we propose in this thesis to develop new measures with the so-called multilocus approach, which considers the genome as a whole rather than an agglomerate of independent loci. We have first tried to build a theoretical basis for the multilocus approach in population genetics. Then, we have illustrated this multilocus approach with the case studies of identity by descent, ancestral recombination graphs and autocorrelograms in population genetics models. Through these different studies, we tried to identify the main issues and questions that the multilocus population genetics raises.

O gênero Neoscytalidium está crescentemente sendo associado às infecções superficiais e profundas causadas em pacientes imunocomprometidos e imunocompetentes. O fungo filamentoso Neoscytalidium dimidiatum é um microrganismo saprofítico e fitopatogênico, encontrado no solo e vegetação de regiões de clima tropical e subtropical. N. dimidiatum var. hyalinum e N. dimidiatum estão envolvidos em infecções superficiais de pele e unha sendo que a espécie produtora de melanina, N. dimidiatum, está associado preferencialmente a infecções profundas sugerindo que a espécie variante não produtora de melanina, N. dimidiatum var. hyalinum, pode ser menos virulenta que a pigmentada. Pouco é descrito na literatura sobre as variedades em questão tanto em relação à sensibilidade a drogas antifúngicas e ao tratamento fotodinâmico antimicrobiano (TFDA), bem como a características fisiológicas referentes à tolerância a variações de temperatura e pH. Assim, o presente trabalho teve como objetivo o estudo de isolados clínicos de N. dimidiatum e N. dimidiatum var. hyalinum obtidos de infecções de pele e unha. Neste estudo foram realizadas a identificação molecular, a filogenia multilocus, a verificação in vitro do desenvolvimento em diferentes temperaturas e pHs e a caracterização in vitro do perfil de susceptibilidade a antifúngicos e TFDA com fotossensibilizadores (FSs) fenotiazínicos, bem como os efeitos do TFDA nas biomoléculas dos artroconídios das variedades estudadas. A filogenia multilocus foi realizada pelo sequenciamento de sete diferentes loci onde foi evidenciado polimorfismo na região Internal Transcribed Spacer (ITS) 1 e nos genes ?-Tubulina (TUB), Fator de Alongamento de cadeia 1? (EF1) e Histona H3 (HH3). O agrupamento dos isolados clínicos deste estudo em genótipos distintos permitiu a separação em 6 tipos de sequência (TSs), sendo que o TS5 foi composto apenas pela espécie variante N. dimidiatum var. hyalinum. A análise de desenvolvimento em diferentes temperaturas e pHs demonstrou um tamanho de colônia reduzido para todos os isolados de N. dimidiatum var. hyalinum. Anfotericina B, voriconazol e terbinafina foram os antifúngicos mais eficientes para ambas variedades. Os valores das concentrações inibitórias mínimas (CIMs) encontrados para os derivados azólicos foram baixos para todos os isolados clínicos de N. dimidiatum var. hyalinum. Os isolados clínicos de N. dimidiatum mostraram ser menos sensível ao TFDA com os FSs azul de metileno (MB), novo azul de metileno N (NMBN), azul de toluidina O (TBO) e novo derivado sintético (S137) quando comparado à variedade hialina. NMBN e S137 mostraram maior eficiência para inativação de Neoscytalidium spp. Adicionalmente, no TFDA todos os FSs apresentaram efeito de permeabilidade de membrana plasmática, embora somente NMBN e S137 apresentaram a produção de Malondialdeido (MDA), isto é, causaram a peroxidação lipídica nos artroconídios de N. dimidiatum e da variedade hialina / Neoscytalidium sp. is increasingly being associated with superficial and deep infections in immunocompromised and immunocompetent patients. The filamentous fungus Neoscytalidium dimidiatum is a saprophytic and plant pathogenic microorganism that is found in soil and vegetation of tropical and subtropical regions. N. dimidiatum var. hyalinum and N. dimidiatum are involved in superficial skin and nail infections. The melanin producer N. dimidiatum is preferably associated with deep infections suggesting that the clinical isolate without melanin, N. dimidiatum var. hyalinum, may be less virulent than the pigmented variety. Little is described in the literature regarding the varieties N. dimidiatum and N. dimidiatum var. hyalinum about the sensitivity to antifungal drugs and photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT), and the physiological characteristics related to the growth at different temperature and pH. Therefore, the present study aimed to investigate clinical isolates of N. dimidiatum and N. dimidiatum var. hyalinum obtained from skin and nail infections. Here in this study were performed the molecular identification, multilocus phylogeny, the in vitro characterization of development at different temperatures and pHs, and the characterization of in vitro susceptibility to antifungal agents and PACT with phenotiazinium photosensitizers (PSs), as well the PACT effects on the biomolecules of the Neoscytalidium spp. arthroconidia. The multilocus phylogeny was performed by sequencing seven different loci where polymorphism were identified in the Internal Transcribed Spacer (ITS) 1 region of rDNA and in the genes ?-tubulin (TUB), elongation factor 1? (EF1) and Histone H3 (HH3). The grouping of the clinical isolates from this study in different genotypes allowed the clustering in 6 sequence types (ST), in which the ST5 was composed exclusively by all N dimidiatum var. hyalinum isolates from this study. The analysis of development at different temperatures and pHs showed a reduced colony size for all N. dimidiatum var. hyalinum isolates. Amphotericin B, voriconazole and terbinafine were the most effective antifungal for both varieties. The minimal inhibitory concentrations (MICs) values found for the azoles derivatives were low for all N. dimidiatum var. hyalinum isolates. N. dimidiatum clinical isolates have shown to be less sensitive to PACT with the PS methylene blue (MB), new methylene blue (NMBN), toluidine blue O (TBO) and new synthetic derivative (S137) when compared to hyaline variety. NMBN and S137 have shown more effectiveness for the inactivation of Neoscytalidium spp. Additionally, all PS in PACT have caused plasma membrane permeability, although only NMBN and S137 showed the production of malondialdehyde (MDA), i.e., caused lipid peroxidation in both N. dimidiatum and hyaline variety

A diversidade genética dos isolados de Chromobacterium sp. foi avaliada por Multilocus sequence analysis com base nas análises dos genes conservados rpoA, lepA, gyrB, fusA e rRNA 16S. A análise do gene rRNA 16S e MLSA agrupou os isolados no gênero Chromobacterium, entretanto, cinco dos isolados estão distantes filogeneticamente das linhagens tipo, C. violaceum e C. subtsugae, sugerindo duas novas espécies. Os extratos brutos, obtidos por soxhlet, dos isolados de Chromobacterium sp., testados em ensaios in vitro em células tumorais humanas, apresentaram atividades antitumorais potenciais e seletivas para determinadas linhagens celulares. Os extratos brutos e frações foram analisados por HPLC-DAD para avaliação da presença ou ausência da violaceína. Além disso, outros metábólitos secundários que não a violaceína podem estar relacionados à atividade antitumoral. / The genetic diversity of strains of Chromobacterium sp was evaluated by Multilocus sequence analysis (MLSA) based on the analysis of conserved genes rpoA, recA, lepA, gyrB, fusA and rRNA 16S. The analysis of 16S ribosomal RNA gene grouped all isolates in the genus Chromobacterium, however, the five isolates are phylogenetically distant of type strain C. violaceum and C. subtsugae, suggesting new species. The crude extracts of the isolates from Chromobacterium sp., obtained by soxlhlet, evaluated in vitro tests on human tumor cells, showed potential and selective antitumor activities for certain cell lines. In addition, other secondary metabolites than violacein may be related with antitumor activity.

Infecções causadas por Candida tropicalis (C. tropicalis) são associados à elevada morbi-mortalidade, e foram consideradas como importantes causas de infecção de corrente sanguínea no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP) de março de 1998 a março de 2001. Adicionalmente, são responsáveis pelo aumento do tempo e dos custos de hospitalização e necessidade de cuidados intensivos. Esse estudo tem como objetivo a caracterização molecular e perfil de sensibilidade de 61 isolados de C. tropicalis a partir de candidemias no HCFMUSP e Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), através das técnicas de amplificação aleatória do DNA polimórfico (RAPD), eletroforese em campo pulsátil (PFGE), tipagem de sequências de múltiplos locus gênicos (MLST) e antifungigrama por microdiluição pelos métodos propostos, Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) e European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing (EUCAST). A análise filogenética por RAPD evidenciou que os iniciadores P1 e P2 mostraram maior capacidade de discriminação que P3. Na análise por PFGE com enzimas de restrição SfiI, SmaI, BssHII e NaeI, a enzima BssHII mostrou maior poder discriminatório. MLST contribuiu com 36 novas diploid sequence type (DSTs) e 23 novos alelos, de acordo com o banco de dados oficial do MLST (http://pubmlst.org/ctropicalis/), representando o primeiro estudo que caracterizaram isolados sequenciais na América do Sul. Entre os isolados sequenciais de um mesmo paciente, as microvariações foram mais frequentes no fragmento de gene XYR1 em 8 pacientes e macrovariações ocorreram em quatro pacientes com mais de um isolado, destacando-se três que apresentaram diferença nos seis alelos estudados. A análise comparativa entre os métodos evidenciou diferenças entre os isolados múltiplos dos pacientes 3, 7 e 11, considerados diferentes pelos três métodos. O poder discriminatório foi de 83,47% para RAPD, 82,18% para PFGE e 97,4 % para MLST. Os resultados do antifungigrana mostraram concordância entre os métodos CLSI e EUCAST de 73,8% para o fluconazol, 67,2% para o itraconazol e 80,3% para o voriconazol. Do total de 61 isolados estudados, 3 isolados de diferentes pacientes foram resistentes ao fluconazol, com MIC de 64 g/mL. O fenômeno de trailing foi observado em 50% das amostras testadas frente ao fluconazol, 23% ao voriconazol e 21,3% ao itraconazol. O uso de pH 5,0 para re-análise do CLSI frente ao fluconazol revelou-se como uma ferramenta útil para esclarecer o perfil de sensibilidade de isolados que apresentaram o fenômeno de trailing. Não houve correlação entre perfil genético gerado pelas técnicas de caracterização molecular estudadas e o perfil fenotípico através do teste de sensibilidade aos antifúngicos / Infections caused by Candida tropicalis (C. tropicalis) have been characterized as important causes of candidemia at the Hospital of the Medical school, University of São Paulo (HCFMUSP) from March 1998 to March 2001 and are associated with high morbidity and mortality. Additionally, they have been related to higher hospitalization costs because of longer hospitalization times and intensive care needs. This study aims to analyze the molecular typing and antifungal susceptibility profile of 61 isolates of C. tropicalis from 41 patients with candidemia in HCFMUSP and University of Campinas (UNICAMP), through Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), Multilocus Sequence Typing (MLST) and broth microdilution antifungal susceptibility methodologies proposed by Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) and European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing (EUCAST). Phylogenetic analysis showed higher discriminatory power index of P1 and P2 primers than P3 by RAPD analysis. PFGE was performed with restriction enzymes SfiI, SmaI, NaeI and BssHII) and the enzyme BssHII presented the best performance. MLST analyses revealed 36 new diploid sequence type (DSTs) and 23 new alleles according to the C. tropicalis MLST database (http://pubmlst.org/ctropicalis/), representing the first study to characterize the sequential isolates of C. tropicalis candidemia in South America. Microvariation in a single gene was found in the sequential isolates from 8 patients. The main polymorphisms occurred in the alleles of the XYR1 gene. Macrovariation was detected in isolates from four patients, where 3 patients presented polimorphisms in six gene fragments. The comparative analysis revealed differences among sequential isolates from patients 3, 7 and 11, considered by three different methods. The discriminatory power was 83.47% for RAPD, 82.18% for PFGE and 97.4% for MLST. The agreement between the CLSI and EUCAST methods was 73.8% to fluconazole susceptibility, 67.2% to itraconazole and 80.3% to voriconazole. Of the 61 isolates tested, 3 isolates from different patients were resistant to fluconazole, MIC of 64 mg/mL. The trailing phenomenon was observed in 50% to fluconazole, 23% to voriconazole and 21.3% to itraconazole. Among the isolates studied, the use of pH 5.0 facilitated the determination of minimum inhibitory concentrations (MICs) for the re-analysis of fluconazole by CLSI, proving to be an important tool for the trailing phenomenon. No correlation was observed between genetic profile generated by the techniques of molecular characterization and phenotypic profile determined by susceptibility tests to antifungal drugs

Infecções causadas por Candida tropicalis (C. tropicalis) são associados à elevada morbi-mortalidade, e foram consideradas como importantes causas de infecção de corrente sanguínea no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP) de março de 1998 a março de 2001. Adicionalmente, são responsáveis pelo aumento do tempo e dos custos de hospitalização e necessidade de cuidados intensivos. Esse estudo tem como objetivo a caracterização molecular e perfil de sensibilidade de 61 isolados de C. tropicalis a partir de candidemias no HCFMUSP e Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), através das técnicas de amplificação aleatória do DNA polimórfico (RAPD), eletroforese em campo pulsátil (PFGE), tipagem de sequências de múltiplos locus gênicos (MLST) e antifungigrama por microdiluição pelos métodos propostos, Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) e European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing (EUCAST). A análise filogenética por RAPD evidenciou que os iniciadores P1 e P2 mostraram maior capacidade de discriminação que P3. Na análise por PFGE com enzimas de restrição SfiI, SmaI, BssHII e NaeI, a enzima BssHII mostrou maior poder discriminatório. MLST contribuiu com 36 novas diploid sequence type (DSTs) e 23 novos alelos, de acordo com o banco de dados oficial do MLST (http://pubmlst.org/ctropicalis/), representando o primeiro estudo que caracterizaram isolados sequenciais na América do Sul. Entre os isolados sequenciais de um mesmo paciente, as microvariações foram mais frequentes no fragmento de gene XYR1 em 8 pacientes e macrovariações ocorreram em quatro pacientes com mais de um isolado, destacando-se três que apresentaram diferença nos seis alelos estudados. A análise comparativa entre os métodos evidenciou diferenças entre os isolados múltiplos dos pacientes 3, 7 e 11, considerados diferentes pelos três métodos. O poder discriminatório foi de 83,47% para RAPD, 82,18% para PFGE e 97,4 % para MLST. Os resultados do antifungigrana mostraram concordância entre os métodos CLSI e EUCAST de 73,8% para o fluconazol, 67,2% para o itraconazol e 80,3% para o voriconazol. Do total de 61 isolados estudados, 3 isolados de diferentes pacientes foram resistentes ao fluconazol, com MIC de 64 g/mL. O fenômeno de trailing foi observado em 50% das amostras testadas frente ao fluconazol, 23% ao voriconazol e 21,3% ao itraconazol. O uso de pH 5,0 para re-análise do CLSI frente ao fluconazol revelou-se como uma ferramenta útil para esclarecer o perfil de sensibilidade de isolados que apresentaram o fenômeno de trailing. Não houve correlação entre perfil genético gerado pelas técnicas de caracterização molecular estudadas e o perfil fenotípico através do teste de sensibilidade aos antifúngicos / Infections caused by Candida tropicalis (C. tropicalis) have been characterized as important causes of candidemia at the Hospital of the Medical school, University of São Paulo (HCFMUSP) from March 1998 to March 2001 and are associated with high morbidity and mortality. Additionally, they have been related to higher hospitalization costs because of longer hospitalization times and intensive care needs. This study aims to analyze the molecular typing and antifungal susceptibility profile of 61 isolates of C. tropicalis from 41 patients with candidemia in HCFMUSP and University of Campinas (UNICAMP), through Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), Multilocus Sequence Typing (MLST) and broth microdilution antifungal susceptibility methodologies proposed by Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) and European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing (EUCAST). Phylogenetic analysis showed higher discriminatory power index of P1 and P2 primers than P3 by RAPD analysis. PFGE was performed with restriction enzymes SfiI, SmaI, NaeI and BssHII) and the enzyme BssHII presented the best performance. MLST analyses revealed 36 new diploid sequence type (DSTs) and 23 new alleles according to the C. tropicalis MLST database (http://pubmlst.org/ctropicalis/), representing the first study to characterize the sequential isolates of C. tropicalis candidemia in South America. Microvariation in a single gene was found in the sequential isolates from 8 patients. The main polymorphisms occurred in the alleles of the XYR1 gene. Macrovariation was detected in isolates from four patients, where 3 patients presented polimorphisms in six gene fragments. The comparative analysis revealed differences among sequential isolates from patients 3, 7 and 11, considered by three different methods. The discriminatory power was 83.47% for RAPD, 82.18% for PFGE and 97.4% for MLST. The agreement between the CLSI and EUCAST methods was 73.8% to fluconazole susceptibility, 67.2% to itraconazole and 80.3% to voriconazole. Of the 61 isolates tested, 3 isolates from different patients were resistant to fluconazole, MIC of 64 mg/mL. The trailing phenomenon was observed in 50% to fluconazole, 23% to voriconazole and 21.3% to itraconazole. Among the isolates studied, the use of pH 5.0 facilitated the determination of minimum inhibitory concentrations (MICs) for the re-analysis of fluconazole by CLSI, proving to be an important tool for the trailing phenomenon. No correlation was observed between genetic profile generated by the techniques of molecular characterization and phenotypic profile determined by susceptibility tests to antifungal drugs

The soybean crop is one of the main agricultural crops, with high global economic relevance. The large area under soybean cultivation in Brazil, including the incorporation of new areas in the northern and midwestern regions, mostly under monoculture and non-tillage system, has been affected the prevalence and the intensity of diseases. Among these, one of most prominent is anthracnose, mainly associated with the fungal species Colletotrichum truncatum. Knowledge of the genetic structure of plant pathogen populations can be used to infer their life histories and the evolutionary processes that shape populations in the agroecosystems, which can help to implement effective disease management strategies. However, the genetic structure of C. truncatum populations associated with soybean remains unknown. We collected C. truncatum isolates from 10 sites representing two of main areas of soybean producing in Brazil and used microsatellite markers and whole-genome sequencing to investigate the population biology and evolutionary history of this important pathogen. The multilocus microsatellite typing of 237 isolates revealed high gene and haplotypic diversity within populations, as well low genetic differentiation and sharing of multilocus haplotypes among populations and regions. In addition, three distinct genetic clusters were detected, coexisting in syntopy in the soybean fields, without evidence of admixture between them. Such finding suggesting that Brazilian C. truncatum populations resulted from at least three founder events, which led to three genetic lineages that spread throughout the country. However, the genetic makeup of these lineages remains unknow, and their extreme geographic proximity raises the question of the maintenance of their genetic integrity in the face of admixture. In order to gain insights into the evolutionary history of C. truncatum lineages and to investigate in more details the possibility of a lack of genetic exchanges between them, we employed a population genomic approach. For that, we produced a draft genome sequence of a typical strain of the species associated with soybean anthracnose, which was used as the reference genome. Eighteen representative C. truncatum isolates from the three lineages were submitted to whole genome sequencing, aligned against the reference genome, and variants were identified. Our population genomic analyzes revealed that the genetic structure of C. truncatum pathogen causing soybean anthracnose is formed by three deeply divergent lineages with levels of genetic diversity consistent with repeated introduction events for each lineage. We also found evidence for sexual recombination within and between lineages, with multiples isolates displaying signatures of admixture. Our findings support a scenario in which the three lineages initially diverged in allopatry before experiencing hybridization following secondary contact. Monitoring of the pathogen\'s diversity over time is needed to reveal whether these lineages maintain or fuse, which can impact the disease control methods currently employed. / A soja é uma das principais culturas agrícolas, com alta relevância econômica global. A grande área sob cultivo de soja no Brasil, incluindo a incorporação de novas áreas nas regiões norte e centro-oeste, principalmente sob monocultura e plantio direto, tem afetado a prevalência e a intensidade das doenças. Entre elas, uma das mais proeminentes é a antracnose, principalmente associada à espécie fúngica Colletotrichum truncatum. O conhecimento da estrutura genética das populações de patógenos de plantas pode ser usado para inferir suas histórias de vida e os processos evolutivos que moldam as populações nos agroecossistemas, o que pode ajudar a implementar estratégias eficazes de manejo da doença. No entanto, a estrutura genética das populações de C. truncatum associadas à soja permanece desconhecida. Coletamos isolados de C. truncatum em 10 áreas, representando duas principais regiões produtoras de soja no Brasil. Utilizamos marcadores microssatélites e sequenciamento do genoma completo para investigar a biologia populacional e a história evolutiva desse importante patógeno. A tipagem de microssatélites multilocus de 237 isolados revelou alta diversidade genética e haplotípica nas populações, bem como baixa diferenciação genética e compartilhamento de haplótipos entre populações e regiões. Além disso, foram detectados três grupos genéticos distintos, coexistindo nas mesmas áreas, sem evidência de mistura entre eles. Isto sugere que as populações C. truncatum no Brasil resultaram de pelo menos três eventos fundadores, o que levou á formação das três linhagens genéticas que se espalharam pelo país. No entanto, a composição genética dessas linhagens permanece desconhecida, e sua extrema proximidade geográfica levanta a questão sobre a manutenção de sua integridade genética em face a mistura entre elas. A fim de analisar a história evolutiva das linhagens de C. truncatum e investigar a possibilidade de ausência de trocas genéticas entre elas, empregamos uma abordagem genômica populacional. Para isso, produzimos uma versão preliminar do genoma completo de um isolado típico da espécie, o qual foi utilizado como genoma de referência. Dezoito isolados representativos das três linhagens foram submetidos ao sequenciamento completo, alinhados ao genoma de referência, e variantes foram identificados. Nossas análises genômicas populacionais revelaram que a estrutura genética do patógeno é formada por três linhagens profundamente divergentes, com níveis de diversidade consistentes com repetidos eventos de introdução para cada linhagem. Também encontramos evidências de recombinação sexual dentro e entre linhagens, com múltiplos isolados apresentando assinaturas de mistura. Nossas descobertas sugerem um cenário no qual as três linhagens divergiram inicialmente em alopatria antes de experimentar hibridação, após contato secundário. O monitoramento da diversidade do patógeno ao longo do tempo é necessário para revelar se essas linhagens se mantêm geneticamente separadas ou se fundem, o que pode afetar os métodos de controle da doença atualmente empregados.