Les Escherichia coli entérohémorragiques (EHEC) sont des pathogènes majeurs pour l’homme responsables de toxi-infections alimentaires pouvant évoluer vers des complications potentiellement mortelles. La pathogénicité de ces souches est essentiellement due à la production de Shiga-toxines (Stx), même si d’autres facteurs semblent jouer un rôle important dans la virulence, comme des facteurs d’adhésion. La survie et la régulation des facteurs de virulence des EHEC dans l’environnement digestif humain sont des facteurs clés dans la pathogénicité bactérienne, mais restent à ce jour mal décrits, essentiellement en raison d’un manque de modèles d’étude adaptés. De plus, l’absence de traitement spécifique a conduit à s’intéresser à des moyens préventifs et/ou curatifs alternatifs, comme l’utilisation de probiotiques. L’objectif de ce travail de thèse est (i) de mieux comprendre le comportement de la souche de référence EHEC O157:H7 EDL933 dans l’environnement digestif humain simulé, et en particulier ses interactions avec le microbiote résident et l’épithélium intestinal, et (ii) d’évaluer l’effet antagoniste d’une souche de levure probiotique vis-à-vis de la survie, la virulence et l’interaction du pathogène avec l’épithélium intestinal, à l’aide d’approches in vitro et in vivo complémentaires. En modèles digestifs in vitro, la souche EHEC survit dans l’estomac, voire se multiplie dans les parties distales de l’intestin grêle, alors qu’elle ne se maintient pas dans l’environnement colique. Les gènes de virulence codant les Stx et des adhésines majeurs (intimine et « Long Polar Fimbriae » ou Lpf) sont surexprimés dès les parties hautes du tractus digestifs, et ce, même en absence de cellules épithéliales. Les conditions rencontrées dans le tractus digestif supérieur de l’enfant, comparativement à celui de l’adulte, conduisent à une survie et un niveau d’expression des gènes codant les Stx et les Lpf plus élevés chez l’enfant, ce qui peut contribuer à expliquer la grande sensibilité de cette population aux infections à EHEC. Enfin, les Lpf semblent jouent un rôle clé dans le ciblage spécifique des cellules M et le tropisme des EHEC pour les plaques de Peyer, et ce, à la fois in vitro (cellules M en culture) et in vivo (anses iléales murines). Même si elle ne modifie pas la survie du pathogène dans l’environnement colique, la levure probiotique S. cerevisiae CNCM I-3856 a montré des propriétés antagonistes intéressantes vis-à-vis d’EHEC O157:H7 en (i) modulant favorablement l’activité fermentaire du microbiote intestinal, (ii) diminuant significativement l’expression des gènes codant les Stx et (iii) inhibant la translocation bactérienne au travers des plaques de Peyer et les lésions hémorragiques associées. Par ailleurs, l’effet du pathogène et des probiotiques sur le microbiote colique est individu dépendant, confortant l’hypothèse que des facteurs associés à l’hôte, comme le microbiote, pourraient conditionner l’évolution clinique des infections à EHEC et l’efficacité d’une stratégie probiotique.Ce travail de thèse contribue à une meilleure compréhension du comportement des EHEC dans l’environnement digestif humain et confirme l’intérêt d’une stratégie probiotique dans la lutte contre le pathogène. Une étude plus approfondie du transcriptome du pathogène dans l’environnement digestif et une analyse par des méthodes haut débit du microbiote intestinal permettraient de continuer à mieux décrire la physiopathologie des infections à EHEC et comprendre les mécanismes associés à l’effet antagoniste des probiotiques. / The enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) are major zoonotic pathogens responsible for food-borne infectionwhich leads to life-threatening complications in humans. The main virulence determinant of EHEC is the production of Shigatoxins (Stx), even if other factors seem to play an important role in virulence, such as adhesion factors. Survival and virulenceof EHEC strains in the human digestive environment are a key factor in bacterial pathogenesis but remains unclear owing tolack of relevant model. Moreover, no specific treatment has led to interest in preventative and / or curative alternatives, suchas using probiotics. The objective of this study is to better understand the behavior of the reference strain EHEC O157:H7EDL933 in the entire digestive tract, and in particular its interaction with the resident microbiota and the intestinal epithelium,and to evaluate the antagonistic effect of the probiotic yeast, Saccharomyces cerevisiae CNCM I-3856, using in vitro and in vivo complementary approaches.In vitro, bacterial mortality was noticed in the stomach, whereas bacterial growth resumption was observed in thedistal parts of the small intestine and the pathogen was not able to maintain in the human colonic conditions. Virulence genesencoding Stx and adhesins (intimin and “Long polar fimbriae”) are upregulated in the upper parts of the digestive tract. A ten-time higher amount of cells was found in the ileal effluents of infant compared to adult. stx genes were over-expressed (up to25-fold) in infant conditions compared to the adult ones. This results show that differences in digestive physicochemicalparameters of the upper gastrointestinal tract may partially explain why infants are more susceptible to EHEC infection thanadults. And finally, Lpf seem to play a key role in the interactions of EHEC with murine Peyer’s patches and are needed for anactive translocation of the pathogen across M cells, and both in vitro (M cells culture) and in vivo (murine ileal loops).S. cerevisiae had not effect on EHEC survival in the colonic environment but (i) favorably influenced gut microbiotaactivity through beneficial modulation of short chain fatty acid production, (ii) leading to significantly decrease stx expressionand (iii) significantly reduced EHEC translocation through M cells and inhibited in vivo interactions of the pathogen withPeyer’s patches and the associated hemorrhagic lesions. Probiotic had donor-dependent effect on the gut microbiota strengthenthe hypothesis that host-associated factors such as microbiota could influence the clinical evolution of EHEC infection and theeffectiveness of a probiotic strategy.This work contributes to a better understanding of the behavior of EHEC in the human digestive environment andconfirms the interest of probiotic strategy in controlling EHEC infections. Further transcriptome studies are warranted for thepathogen in the human digestive environment, with or without probiotics for the better understanding of the pathophysiologyof EHEC and so on the mechanisms involved in the antagonistic effect of probiotics.

Desinfektionsmittel sind ein elementarer Bestandteil der Tierseuchenbekämpfung und damit auch der Lebensmittelsicherheit. Die Prüfung chemischer Desinfektionsmittel ist Voraussetzung für deren zuverlässige Wirksamkeit und zielgerichteten Einsatz. In Deutschland geschieht dies nach den Richtlinien der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft e.V. (DVG). Seit der ersten Fassung sind die Richtlinien einem ständigen Anpassungsprozess unterworfen. Im Zuge der europäischen Harmonisierung gilt es nun, sich gesamteuropäischen Richtlinien, verfasst durch das europäische Komitee für Normung (Comité Européen de Normalisation) (CEN) anzupassen. Das Thema dieser Arbeit entwickelte sich im Kontext der derzeitigen Diskussion über Verbesserungsvorschläge zu den bestehenden Richtlinien und deren Anpassung an die europäischen Normen. Es wurden je zwei Testviren für die Bereiche Tierhaltung und tierärztliche Praxis ausgewählt, um sie auf Eignung für die Viruzidieprüfung zu testen und gegebenenfalls zu etablieren. Des Weiteren wurde in einem zweiten Teil, in Anlehnung an die Forderungen der europäischen Normen die Prüfung zu vereinfachen, ein alternatives Zellkulturnachweissystem für das Newcastle-Disease-Virus (NDV) geprüft. Die Prüfung der viruziden Wirksamkeit erfolgte mit fünf verschiedenen Grundsubstanzen, gewählt um ein möglichst breites Spektrum an Desinfektionsmittelwirkstoffen abzudecken. Es wurden Glutaraldehyd, Ethanol, Natronlauge, Natriumhypochlorit und Peressigsäure verwendet. Die Versuche wurden mit einer niedrigen Eiweißbelastung und bei einer Temperatur von 20°C durchgeführt. Um eine praxisnahe Situation zu simulieren wurde auf, bereits in den DVG-Richtlinien, verankerten Stahl- und Holzkeimträgertests zurückgegriffen. Als mögliche Prüfviren für die Tierhaltung wurden das Equine Arteritis-Virus (EAV) und das Bovine Virus Diarrhoe Virus verwendet. Bei beiden Viren handelt es sich um weit verbreitete Tierseuchenerreger mit einer großen epidemiologischen Bedeutung. Die Untersuchung von fünf verschiedenen Desinfektionsmitteln erfolgte im Keimträgertest auf Holz. Sowohl EAV als auch BVD stellen ein weniger geeignetes Prüfvirus dar, da beide Viren enorme Titerverluste im Trocknungsvorgang der Holzkeimträger zeigten. Die Viren ließen sich zwar leicht vermehren, aber die erzielten Ausgangstiter reichten nicht aus um die Trocknungsverluste zu kompensieren und aussagekräftige Ergebnisse zu produzieren. Für den Bereich tierärztliche Praxis wurden das Feline Coronavirus (FCoV) und das Murine Parvovirus (MPV) genutzt. FCoV ist ein weltweit in Hauskatzenpopulationen vorkommendes Virus mit einer hohen Seroprävalenz und wurde daher ausgewählt. MPV wurde als Stellvertreter für die, in der Praxis häufig vorkommenden Parvovirusinfektionen gewählt. Es schien ein ideales Modellvirus aufgrund seiner weiten Verbreitung in der Forschung zu sein. Bei beiden Viren erfolgte die Prüfung auf Stahlkeimträgern. Unter Laborbedingungen konnte FCoV ohne Probleme zu hohen Titern vermehrt werden. Es gab keine nennenswerten Trocknungsverluste. FCoV erwies sich als geeignetes Prüfvirus. MPV hingegen ist bedingt durch die langen Versuchszeiten und schwierig auszuwertenden Zellkulturen, sowie wegen der niedrigen Ausgangstiter weniger geeignet als Modellvirus für die Desinfektionsmittelprüfung. Die Anzucht von NDV in Allantoisflüssigkeit von SPF Hühnereiern erschien sehr aufwendig und mit hohem Eiweißfehler belastet. In den Versuchen konnte ein deutlich höherer Eiweißgehalt als in den vergleichend geprüften, in Zellkultur angezogenen Viren nachgewiesen werden. Infolge der Probleme mit der Kultivierung der LMH-Zelllinie und den damit verbundenen langen Wartezeiten bis zur eigentlichen Versuchsdurchführung kann nur eine teilweise Empfehlung, von auf Zellkultur vermehrtem NDV (NDV (ZK)) gegeben werden. Nach Behebung dieser Probleme ist durchaus eine Ablösung, von in Allantoisflüssigkeit angezüchtetem NDV durch NDV (ZK) zu empfehlen. Die Verfälschung der Ergebnisse durch die höheren Eiweißgehalte bei Desinfektionsmitteln mit deutlichem Eiweißfehler könnten so vermieden werden.

Le potassium (K+) est impliqué dans la régulation de l’excitabilité cellulaire, la régulation du cycle cellulaire, la viabilité cellulaire, la neuroprotection et le maintien des fonctions microgliales et oligodendrocytaires. Le dysfonctionnement des canaux potassiques, décrit dans plusieurs maladies neurodégénératives comme la Maladie d’Alzheimer (MA), la sclérose en plaques (SEP), la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington, pourrait être une potentiel cible thérapeutique. Les mécanismes toxiques sous-jacents de ces pathologies neurodégénératives impliquent des oxystérols, dérivés oxydés du cholestérol, et des acides gras en relation avec le métabolisme peroxysomal. Le 7-cétocholestérol (7KC), le 24S-hydroxycholestérol (24S-OHC) et l'acide tétracosanoïque (C24: 0), souvent trouvés à des taux élevés au niveau du cerveau et dans le plasma de patients atteints de maladies neurodégénératives (MA, maladie de Nieman-Pick, SEP, maladie de Parkinson, maladie de Huntington et X-ALD conduisent une rupture de l’équilibre Redox qui aboutirait à la neurodégénérescence. Dans ce contexte, il est intéressant de déterminer l’éventuelle connexion entre environnement lipidique et homéostasie potassique. L’étude in vitro a été réalisée sur des olygodendrocytes murins 158N et les cellules microgliale BV-2. Nous avons montré que la lipotoxicité du 7KC, 24S-OHC et C24:0 implique une rétention du K+ faisant intervenir les canaux potassium voltage dépendant (Kv). Ces résultats ont montré que l'inhibition des canaux Kv conduisant à une augmentation la [K+]i contribue à la cytotoxicité du 7KC, 24S-OHC et C24:0. Nous nous sommes focalisés sur le canal Kv3.1b. La retention du K+ induite par les oxystérols (7KC et 24S-OHC) serait sous le contrôle de Kv3.1b. L’étude clinique réalisée sur du plasma de MA a révélé une corrélation négative entre le taux d’acide docosahexaénoïque (DHA) et la concentration de K+. Chez les souris transgéniques J20, modèle de la MA, l’étude de la topographie d’expression de Kv3.1b et d’Abcd3, au niveau de l’hippocampe et du cortex, a montré une baisse de l’expression de ces deux marqueurs. Dans leur ensemble, les résultats obtenus ont établi des relations entre lipotoxicité, métabolisme peroxysomal et altération de l’homéostasie potassique dans la neurodégénérescence et suggèrent une possible modulation de l’expression et de l’activité de kv3.1b dans la physiopathologie des maladies neurodégénératives. / Potassium (K+) is involved in the regulation of cellular excitability, cell cycle regulation, cell viability, neuroprotection and maintenance of microglial and oligodendrocytic functions. Potassium dysfunction, described in several neurodegenerative diseases such as Alzheimer's Disease (AD), multiple sclerosis (MS), Parkinson's disease and Huntington's disease, may be a potential therapeutic target. The underlying toxic mechanisms of these neurodegenerative pathologies involve oxysterols, which are oxidized cholesterol derivatives, and fatty acids including those associated with peroxisomal metabolism. 7-ketocholesterol (7KC), 24S-hydroxycholesterol (24S-OHC) and tetracosanoic acid (C24:0), often found at increased levels in the brain and plasma of patients with neurodegenerative diseases (Nieman-Pick disease, MS, Parkinson's disease, Huntington's disease and X-ALD) lead to a breakdown of the redox equilibrium leading to neurodegeneration. In this context, it is interesting to determine the possible connection between the lipid environment and potassium homeostasis The in vitro study was carried out on 158N murine oligodendrocytes and microglial BV-2 cells. We have shown that the lipotoxicity of 7KC, 24S-OHC and C24:0 implies retention of K+ involving the voltage dependent potassium channels (Kv). These results have shown that inhibition of Kv channels lead to an increase in [K +] i contributing to the cytotoxicity of 7KC, 24S-OHC and C24:0. The retention of K+ induced by oxysterols (7KC and 24S-OHC) would be under the control of Kv3.1b. A clinical study, on plasma of patients with Alzheimer’s disease, revealed a negative correlation between docosahexaenoic acid (DHA) and K+ concentration. In the J20 mice, a transgenic model of Alzheimer’s disease, the expression of Kv3.1b and Abcd3 was decreased in the hippocampus and cortex. Overall, the results obtained established relationships between lipotoxicity, peroxisomal metabolism and potassium homeostasis in neurodegeneration and suggest a possible modulation of the expression and activity of kv3.1b in the pathophysiology of neurodegenerative diseases. So, modulation of Kv3.1 could constitute a new therapeuthic approach against some neurodegenerative diseases.

Einleitung: Ziel dieser Arbeit war es, das RENCA-Nierenzell-Karzinommodell anhand der Hypoxie-induzierten Nekrosen, der Makrophageninfitration sowie der iNOS-Expression und –aktivität zu charakterisieren. Methoden: Für die Erzeugung lokaler Tumoren, wurden Balb/c-Mäusen in vitro kultivierte RENCA-Zellen subkutan appliziert. Die Quantifizierung des Makrophageninfiltrates sowie die Charakterisierung der Hypoxie im Tumorgewebe erfolgten mittels immunhistochemischer Färbungen. Für die Darstellung der Stickstoffmonoxid-Aktivität kamen neben der Immunhistochemie die Reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zur Anwendung. Der Nitrit-Gehalt der Tumorproben wurde mittels Griess-Reaktion bestimmt. Ergebnisse: Spontan hypoxische Tumornekrosen sind assoziiert mit einer signifikant geringeren Gefäßdichte. Das Ausmaß der Nekrosen korreliert mit dem Alter der Tumoren. Alte Tumoren (28 Tage) zeigen eine höhere Makrophageninfiltration als junge Tumoren (12 bis 19 Tage). Obwohl die iNOS-Expression auf Proteinebene keinen signifikanten Unterschied zwischen alten und jungen Tumoren ergab, findet sich auf mRNA-Ebene eine signifikant erhöhte iNOS-Expression in alten Tumoren. Hinsichtlich der αActinin-4-Expression konnte kein signifikanter Unterschied gesehen werden. Schlussfolgerung: Bei annähernd gleicher iNOS- und αActinin-4-Expression beziehungsweise erhöhter iNOS-mRNA-Expression ist die Konzentration an Nitrit in Tumoren mit hypoxischer Nekrose reduziert. Daraus kann man schließen, dass die Aktivität der NO-Synthase unter hypoxischen Bedingungen reduziert ist. Dies stützt wiederum die Vermutung, einer die iNOS-Aktivität steuernden normoxie-abhängigen Assoziation von αActinin-4 und iNOS. Die Aktivitätsinhibierung der iNOS könnte somit ein Mechanismus sein, durch den Hypoxie die Zytotoxizität von TAM inhibiert. Die abnehmende Gefäßdichte mit zunehmendem Tumoralter könnte möglicherweise auf eine Regression der Tumorgefäße zurückzuführen sein. Denkbar wäre, dass die Gefäßregression durch makrophagenabhängige Zytokine begünstigt wird.

Desinfektionsmittel sind ein elementarer Bestandteil der Tierseuchenbekämpfung und damit auch der Lebensmittelsicherheit. Die Prüfung chemischer Desinfektionsmittel ist Voraussetzung für deren zuverlässige Wirksamkeit und zielgerichteten Einsatz. In Deutschland geschieht dies nach den Richtlinien der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft e.V. (DVG). Seit der ersten Fassung sind die Richtlinien einem ständigen Anpassungsprozess unterworfen. Im Zuge der europäischen Harmonisierung gilt es nun, sich gesamteuropäischen Richtlinien, verfasst durch das europäische Komitee für Normung (Comité Européen de Normalisation) (CEN) anzupassen. Das Thema dieser Arbeit entwickelte sich im Kontext der derzeitigen Diskussion über Verbesserungsvorschläge zu den bestehenden Richtlinien und deren Anpassung an die europäischen Normen. Es wurden je zwei Testviren für die Bereiche Tierhaltung und tierärztliche Praxis ausgewählt, um sie auf Eignung für die Viruzidieprüfung zu testen und gegebenenfalls zu etablieren. Des Weiteren wurde in einem zweiten Teil, in Anlehnung an die Forderungen der europäischen Normen die Prüfung zu vereinfachen, ein alternatives Zellkulturnachweissystem für das Newcastle-Disease-Virus (NDV) geprüft. Die Prüfung der viruziden Wirksamkeit erfolgte mit fünf verschiedenen Grundsubstanzen, gewählt um ein möglichst breites Spektrum an Desinfektionsmittelwirkstoffen abzudecken. Es wurden Glutaraldehyd, Ethanol, Natronlauge, Natriumhypochlorit und Peressigsäure verwendet. Die Versuche wurden mit einer niedrigen Eiweißbelastung und bei einer Temperatur von 20°C durchgeführt. Um eine praxisnahe Situation zu simulieren wurde auf, bereits in den DVG-Richtlinien, verankerten Stahl- und Holzkeimträgertests zurückgegriffen. Als mögliche Prüfviren für die Tierhaltung wurden das Equine Arteritis-Virus (EAV) und das Bovine Virus Diarrhoe Virus verwendet. Bei beiden Viren handelt es sich um weit verbreitete Tierseuchenerreger mit einer großen epidemiologischen Bedeutung. Die Untersuchung von fünf verschiedenen Desinfektionsmitteln erfolgte im Keimträgertest auf Holz. Sowohl EAV als auch BVD stellen ein weniger geeignetes Prüfvirus dar, da beide Viren enorme Titerverluste im Trocknungsvorgang der Holzkeimträger zeigten. Die Viren ließen sich zwar leicht vermehren, aber die erzielten Ausgangstiter reichten nicht aus um die Trocknungsverluste zu kompensieren und aussagekräftige Ergebnisse zu produzieren. Für den Bereich tierärztliche Praxis wurden das Feline Coronavirus (FCoV) und das Murine Parvovirus (MPV) genutzt. FCoV ist ein weltweit in Hauskatzenpopulationen vorkommendes Virus mit einer hohen Seroprävalenz und wurde daher ausgewählt. MPV wurde als Stellvertreter für die, in der Praxis häufig vorkommenden Parvovirusinfektionen gewählt. Es schien ein ideales Modellvirus aufgrund seiner weiten Verbreitung in der Forschung zu sein. Bei beiden Viren erfolgte die Prüfung auf Stahlkeimträgern. Unter Laborbedingungen konnte FCoV ohne Probleme zu hohen Titern vermehrt werden. Es gab keine nennenswerten Trocknungsverluste. FCoV erwies sich als geeignetes Prüfvirus. MPV hingegen ist bedingt durch die langen Versuchszeiten und schwierig auszuwertenden Zellkulturen, sowie wegen der niedrigen Ausgangstiter weniger geeignet als Modellvirus für die Desinfektionsmittelprüfung. Die Anzucht von NDV in Allantoisflüssigkeit von SPF Hühnereiern erschien sehr aufwendig und mit hohem Eiweißfehler belastet. In den Versuchen konnte ein deutlich höherer Eiweißgehalt als in den vergleichend geprüften, in Zellkultur angezogenen Viren nachgewiesen werden. Infolge der Probleme mit der Kultivierung der LMH-Zelllinie und den damit verbundenen langen Wartezeiten bis zur eigentlichen Versuchsdurchführung kann nur eine teilweise Empfehlung, von auf Zellkultur vermehrtem NDV (NDV (ZK)) gegeben werden. Nach Behebung dieser Probleme ist durchaus eine Ablösung, von in Allantoisflüssigkeit angezüchtetem NDV durch NDV (ZK) zu empfehlen. Die Verfälschung der Ergebnisse durch die höheren Eiweißgehalte bei Desinfektionsmitteln mit deutlichem Eiweißfehler könnten so vermieden werden.

Das humane Zytomegalievirus, ist ein ubiquitäres Pathogen, welches akute und persistierende Infektionen verursacht. Bei immunsupprimierten Patienten kann das Virus zu schweren Erkrankungen, wie Hepatitis, Pneumonie und bei kongenitaler Infektion außerdem zu Schädigungen des ZNS führen. HCMV blockiert die Zellproliferation durch einen Arrest am G1/S-Übergang des Zellzyklus, andererseits wird aber gleichzeitig die Expression S-Phase spezifischer Gene aktiviert. Teilweise lässt sich dies durch eine Virus vermittelte spezifische Inhibition der zellulären DNA-Repliaktion sowie durch eine massive Deregulation Zyklin-assozzierter Kinasen erklären. Zellkulturexperimente deuten darauf hin, dass die Zellzyklusalterationen wichtige Voraussetzungen für eine erfolgreiche Virusreplikation darstellen. Es ist hingegen nicht bekannt, welche Relevanz sie für die Virusvermehrung in vivo und das pathologische Erscheinungsbild im erkrankten Organismus besitzen. Diese Frage kann nur in einem Tiermodell sinnvoll angegangen werden. Aufgrund der Wirtsspezifität der Zytomegalieviren, ist man dabei auf die Verwendung der jeweiligen artspezifischen CMV angewiesen. Murines CMV (MCMV) und Ratten-CMV (RCMV) sind dabei die bislang bestuntersuchtesten Systeme. Das Anliegen dieser Arbeit war es zu prüfen, inwieweit die für HCMV beschriebenen Zellzyklusregulationen in MCMV und RCMV auf Zellkulturbasis konserviert sind. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl RCMV als auch MCMV einen antiproliferativen Effekt auf infizierte Zellen besitzen und ebenso wie HCMV zu einem Zellzyklusarrest führen. Nager-Zytomegalieviren können Zellen auch in der G2-Phase arretieren und in dieser Zellzyklusphase auch effizient replizieren können. Die Infektion mit Nager-CMV führt außerdem auf breiter Basis zur Veränderung Zyklin-assoziierter Kinaseaktivitäten. Allen Zytomegalieviren ist die Hemmung der zellulären DNA-Synthese am G1/S-Übergang durch die Inhibition des replication licensing, dem Beginn der DNA-Synthese gemein. Durch diese vergleichende Studie wird einerseits deutlich, dass wesentliche funktionelle Schritte der Zellzyklusregulation zwischen den Zytomegalieviren konserviert sind, aber andererseits die zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen zum Teil deutlich variieren. / Human Cytomegalovirus (HCMV) is an ubiquitous, species-specific beta-herpesvirus that, like other herpesviruses, can establish lifelong latency following primary infection. HCMV infection becomes virulent only in immunocompromised patients such as premature infants, transplant recipients and AIDS patients where the virus causes severe disease like hepatitis, pneumonitis and retinitis. Congenital infection produces birth defects, most commonly hearing loss. To develop rational-based strategies for prevention and treatment of HCMV infection, it is crucial to understand the interactions between the virus and its host cell that support the establishment and progression of the virus replicative cycle. In general, herpesviruses are known to replicate most efficiently in the absence of cellular DNA synthesis. What is more, they have evolved mechanisms to avoid the cell´s DNA replication phase by blocking cell cycle progression outside S phase. HCMV has been shown to specifically inhibit the onset of cellular DNA synthesis resulting in cells arrested with a G1 DNA content. Towards a better understanding of CMV-mediated cell cycle alterations in vivo, we tested murine and rat CMV (MCMV/RCMV), being common animal models for CMV infection, for their influence on the host cell cycle. It was found that both MCMV and RCMV exhibit a strong anti-proliferative capacity on immortalised and primary embryonic fibroblasts after lytic infection. This results from specific cell cycle blocks in G1 and G2 as demonstrated by flow cytometry analysis. The G1 arrest is at least in part caused by a specific inhibition of cellular DNA synthesis and involves both the formation and activation of the cells’ DNA replication machinery. Interestingly, and in contrast to HCMV, the replicative cycle of rodent CMVs started from G2 as efficiently as from G1. Whilst the cell cycle arrest is accompanied by a broad induction of cyclin-cdk2 and cyclin-cdk1 activity, cyclin D1-cdk4/6 activity is selectively suppressed in MCMV and RCMV infected cells. Thus, given that both rodent and human CMVs are anti-proliferative and arrest cell cycle progression we found a surprising divergence of some of the underlying mechanisms. Therefore, any question put forward to a rodent CMV model involving cell cycle regulation has to be well defined in order to extrapolate meaningful information for the human system.

CAR-T-Zell-Therapie ist eine vielversprechende neuartige Behandlungsform für Patienten mit aggressiven B-Zell Non-Hodgkin-Lymphomen (B-NHL). In dieser Arbeit wurde die anti-CXCR5 CAR-T-Zell-Therapie als Alternative zur anti-CD19 CAR-T-Zell-Therapie für die Behandlung von reifen B-NHLs untersucht. CXCR5 ist ein B-Zell-homing Rezeptor, der von reifen B Zellen und follikulären T-Helferzellen (TFH Zellen) exprimiert wird. TFH Zellen wurden als tumor-unterstützend in chronisch lymphatischer Leukämie (CLL) und im follikulären Lymphom (FL) beschrieben. Dieses Expressionsmuster erlaubt es, auf einzigartige Weise zeitgleich die malignen Zellen und die tumorunterstützende Mikroumgebung mithilfe von CAR-T-Zell-Therapie gerichtet gegen einen Chemokinrezeptor anzugreifen. Die wichtigsten Ergebnisse dieser Arbeit waren, dass (1) die anti-CXCR5 CAR T-Zellen zielgerichtet CXCR5 positive reife B-NHL Zelllinien und Patientenproben in vitro eliminierten und eine starke anti-Tumor Reaktivität in einem immundefizienten Xenotransplantationsmausmodell zeigten, (2) die anti-CXCR5 CAR T-Zellen zielgerichtet die tumorunterstützenden TFH Zellen in CLL und FL Patientenproben in vitro erkannten und dass (3) CXCR5 ein sicheres Expressionsprofil zeigte. CXCR5 war stark und häufig auf B-NHL exprimiert und die Expression auf gesundem Gewebe war auf lymphoide Zellen beschränkt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die anti-CXCR5 CAR-T-Zell-Therapie eine neue Behandlungsmöglichkeit für Patienten mit reifen B-NHL darstellt, indem durch die anti-CXCR5 CAR-T Zellen sowohl der Tumor als auch ein Anteil der tumorunterstützende Mikroumgebung eliminiert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das Eμ-Tcl1 murine CLL Lymphommodell genutzt um die Auswirkung der Lymphomentwicklung auf die CXCR5+ T Zellen zu untersuchen. Mittels RNA-Einzelzell-Sequenzierung konnte ein profunder Einfluss des Lymphomwachstums auf das T Zell-Kompartiment der Mäuse, denen Eμ-Tcl1 Zellen gespritzt wurden, gezeigt werden. / CAR T cell therapy is a promising new treatment option for patients suffering from aggressive B non-Hodgkin lymphomas (NHLs). In CAR T cell therapy, patient-derived T cells are genetically modified to express a chimeric receptor commonly directed towards a surface antigen expressed by neoplastic cells. In this thesis, anti-CXCR5 CAR T cell therapy was investigated as an alternative to anti-CD19 CAR T cell therapy for the treatment of mature B-NHLs. CXCR5 is a B cell homing receptor expressed by mature B cells and follicular helper T (TFH) cells. TFH cells were described to support the tumor cells in chronic lymphocytic leukemia (CLL) and follicular lymphoma (FL). This expression pattern allows simultaneous targeting of the malignant cells and the tumor-supporting microenvironment by CAR T cell therapy against a chemokine receptor in an unprecedented manner. Main findings included that (1) anti-CXCR5 CAR T cells targeted specifically CXCR5 expressing mature B-NHL cell lines and patient samples in vitro and showed strong in vivo anti-tumor reactivity in an immunodeficient xenograft mouse model, (2) anti-CXCR5 CAR T cells targeted tumor-supportive TFH cells derived from CLL and FL patient samples in vitro and (3) CXCR5 showed a safe expression profile. CXCR5 was strongly and frequently expressed by B-NHLs and its expression on healthy tissue was restricted to lymphoid cells. In summary, anti-CXCR5 CAR T cell therapy presents a novel treatment option for patients suffering from mature B-NHLs by eliminating the tumor and part of the tumor-supportive microenvironment. The second part of the project, the Eμ-Tcl1 murine lymphoma model, which mimics human CLL, was used to study the impact of lymphomagenesis on CXCR5+ T cells. Using single cell RNA sequencing, a profound influence of lymphoma growth on the T cell compartment in Eμ-Tcl1 tumor-challenged mice could be shown.