Les mycotoxines sont des métabolites secondaires des moisissures qui contaminentnaturellement de nombreuses denrées alimentaires, notamment les céréales. Certainesmycotoxines présentent des effets toxiques potentiellement dangereux pour l’homme à desdoses extrêmement faibles. Les objectifs de ce travail étaient d’évaluer in vitro : (1) la toxicitéde trois mycotoxines qualifiées d’émergentes : la beauvericine, l’enniatine B et lamoniliformine ; (2) les effets de mycotoxines testées simultanément : déoxynivalénol etbeauvericine, déoxynivalénol et fumonisine B1, déoxynivalénol et zéaralénone,déoxynivalénol et toxine T-2, toxine T-2 et zéaralénone, beauvericine et enniatine B. Lesétudes ont été réalisées sur des cellules humaines d’origine hématopoïétique, en raison de leurforte sensibilité connue à certaines mycotoxines majeures. La myélotoxicité a été évaluée surles progéniteurs hématopoïétiques granulo-monocytaires, érythrocytaires et plaquettaires.L’immunotoxicité a été évaluée sur les cellules dendritiques et les macrophages.Un effet cytotoxique a été observé pour les progéniteurs hématopoïétiques exposésaux toxines émergentes. Une inhibition de la différenciation des progéniteurs érythroïdes a éténotée en présence d’enniatine B ou de moniliformine. Une cytotoxicité a été mise en évidencepour les cellules immunitaires exposées à la beauvericine ou à l’enniatine B. L’exposition à lamoniliformine a provoqué une inhibition de la différenciation des monocytes en cellulesdendritiques ou en macrophages. Une inhibition de la capacité de maturation des cellulesdendritiques a été mise en évidence en présence de beauvericine ou d’enniatine B. Les travauxmenés en co-exposition ont montré des effets cytotoxiques principalement additifs sur lesprogéniteurs hématopoïétiques et sur les cellules dendritiques. Une synergie a été observéepour les progéniteurs hématopoïétiques exposés au déoxynivalénol et à la beauvericine. Unantagonisme a été noté pour les progéniteurs et pour les cellules dendritiques exposéssimultanément au déoxynivalénol et à la fumonisine B1.Ces travaux réalisés in vitro suggèrent que les mycotoxines émergentes pourraientprovoquer chez l’homme une diminution du nombre et un dysfonctionnement des celluleshématopoïétiques, avec pour conséquence l’induction de troubles hématologiques etimmunologiques. La présence concomitante de mycotoxines pourrait augmenter le risque demyélotoxicité et d’immunotoxicité chez l’homme. Des études in vivo devraient être menéesafin de compléter ces travaux. / Mycotoxins are secondary metabolites of fungi that are natural contaminants ofseveral commodities, in particular cereals. The main objectives of the thesis were to assess thein vitro toxicity of: (1) emerging mycotoxins beauvericin, enniatin b and moniliformin; (2)combinations of fusariotoxins known to co-contaminate cereals or food commodities:deoxynivalenol and beauvericin, deoxynivalenol and fumonisin B1, deoxynivalenol andzearalenone, deoxynivalenol and T-2, T-2 and zearalenone, beauvericin and enniatin B.Experiences have been done using human hematopoietic cells. Myelotoxicity has beenevaluated using clonogenic assays on granulo-monocytic, erythroid and megakaryocyticprogenitors. Immunotoxicity has been assessed on dendritic cells and macrophages.Emerging mycotoxins were cytotoxic for hematopoietic progenitors. Inhibition oferythroid differentiation has been observed in the presence of enniatin b or moniliformin.Beauvericin and enniatin B were cytotoxic for dendritic cells and macrophages. Thedifferentiation process of monocytes into immature dendritic cells or into macrophages wasdisturbed in the presence of moniliformin. Beauvericin and enniatin B have been shown tointeract with dendritic cells maturation process. Additive myelotoxic and immunotoxic effectswere observed for combination of deoxynivalenol and zearalenone, deoxynivalenol and T-2,T-2 and zearalenone, beauvericin and enniatin B. Co-exposure of granulo-monocyticprogenitors to deoxynivalenol and beauvericin resulted in synergic effects. Combination ofdeoxynivalenol and fumonisin B1 showed antagonist myelotoxic and immunotoxic effects.These in vitro results suggested that emerging mycotoxins could be responsible forhematological and immunological troubles on human in case of consumption of contaminatedcommodities. Simultaneous presence of mycotoxins in food commodities and diet may bemore toxic than the presence of one mycotoxin alone. In vivo studies should be performed totest these hypotheses.

Plusieurs espèces fongiques dites « technologiques » jouent un rôle primordial, via leurs activités métaboliques, dans le développement des caractéristiques organoleptiques et la typicité des fromages. Cependant, malgré une utilisation et une consommation ancestrale, un manque de connaissances persiste que ce soit aux niveaux génétique ou fonctionnel concernant certaines de ces espèces, notamment Penicillium roqueforti. Principalement utilisé dans la production de fromages à pâte persillée, c’est lors de l’affinage que P. roqueforti participe au développement des qualités organoleptiques typiques de ces fromages via, entre autres, ses activités lipolytiques et protéolytiques. Cette espèce est également caractérisée par une diversité morphologique importante, largement révélée au cours de ces travaux, et ayant donné lieu à certaines dénominations technologiques distinctes par le passé conduisant à une interrogation sur la possible existence de plusieurs espèces au sein de l’entité P. roqueforti. Dans ce contexte, une étude phylogénétique basée sur le principe de concordance généalogique (GC-PSR) a été menée sur une vaste collection mondiale de P. roqueforti en utilisant 8 loci. Cette étude a montré l’existence d’une espèce unique. La diversité intraspécifique des isolats de P. roqueforti a ensuite été évaluée en utilisant 4 marqueurs microsatellites qui ont permis de révéler l’existence de 28 haplotypes répartis en 3 populations génétiquement différenciées et corrélées à différents types de fromages à pâte persillée. Sur la base de ces résultats, 55 isolats représentatifs ont par la suite été criblés afin d’évaluer la possible existence d’un caractère haplotype-dépendant concernant les activités protéolytiques, lipolytiques et la production de métabolites secondaires volatils et non-volatils. Cette étude a permis de mettre en évidence une diversité fonctionnelle relativement importante avec, entre autres, l’identification de 52 molécules volatiles, les méthyl-cétones étant majoritaires dans le volatilome des cultures de P. roqueforti, et des profils de production de mycotoxines parfois contrastés. Cependant, une bonne corrélation a été observée entre les groupes d’isolats issus de fromages AOP ou IGP et les métabolites produits. Suite à l’observation de niveaux de productions contrastées d’acide mycophénolique retrouvées chez P. roqueforti, le cluster de gènes impliqué dans sa biosynthèse a été identifié in silico chez P. roqueforti avant que des expériences d'ARN interférence ne soient réalisées sur le gène mpaC codant une polycétide synthase. La fonctionnalité de l’ensemble du cluster a pu être confirmée par différentes approches et des comparaisons de séquences entre différentes souches ayant des productions d’acide mycophénolique contrastées ont permis de mettre en évidence une délétion de 174 pb au niveau du gène mpaC limitant cette production à des niveaux non détectables chez certaines souches. Ce dernier résultat a ainsi apporté un premier élément de réponse quant à la nature a priori souche-dépendante de la production de ce métabolite. / Several « technological » fungal species play an important role in the development of organoleptic properties and typicity of cheeses via their metabolic activities. However, despite an ancestral use and consumption of cheeses, there is still a lack of knowledge about both genetic and functional traits of certain mold species, in particular Penicillium roqueforti. This species, mainly used in blue-veined cheese production, largely contributes to the specific organoleptic properties in the final product via its intense lipolytic and proteolytic activities during ripening. P. roqueforti is characterized by high morphological diversity, largely revealed during this study, and has been associated with different technological names in the past raising the question about several species within P. roqueforti. Consequently, a phylogenetic study based on genealogical concordance principle (GC-PSR) was performed using eight loci on a large worldwide P. roqueforti collection and confirmed the presence of one single species. Taking into account this result, P. roqueforti intraspecific diversity was then assessed using 4 microsatellite markers and 28 haplotypes were identified and distributed in three genetically differentiated populations linked to blue-veined cheese types. Based on these results, 55 representative isolates were further screened to determine potential haplotype-dependent traits related to proteolytic and lipolytic activities and volatile and non-volatile secondary metabolite production. This study highlighted the outstanding functional diversity among strains with, among others, 52 volatile molecules identified, mainly methyl-ketones, and contrasted mycotoxin production profiles. Noteworthy, a clear relationship between PDO/PGI group isolates and produced metabolites was observed. Following the contrasted production of mycophenolic acid among isolates, the mycophenolic acid biosynthetic gene cluster was identified in silico in P. roqueforti and RNA interference experiments targeting the mpaC gene, encoding a polyketide synthase, were performed. The cluster was shown to be fully functional in this species. Moreover, the entire mycophenolic acid cluster was compared between three strains characterized by contrasted mycophenolic acid production and a 174 bp deletion was detected in the mpaC gene of non-producing strains. This last result provided first insight into the a priori strain-dependent character for production.

La fusariose de l'épi est une des maladies les plus importantes du blé. Elle est causée par un complexe d'espèces dont les plus courantes sont F. graminearum, F. culmorum, F. poae, M. majus et M. nivale. Ces champignons infectent les épis de blé au moment de la floraison mais l'impact de contaminations tardives sur les grains est peu compris. De plus, deux ou trois espèces sont susceptibles de co-infecter un même épi, ce qui pourrait modifier leur développement et leur production de toxines dans l'épi. Pour étudier ces problématiques, plusieurs isolats appartenant aux espèces citées ont été caractérisés selon leurs traits de vie et leur agressivité sur épi. Nous avons ensuite étudié le développement de souches de Fusarium inoculées 3 jours avant ou 0, 8, 18 ou 28 jours après la sortie des premières anthères. Les niveaux de maladie et toxines se sont révélés maximum autour de la floraison. La date d'inoculation semble conditionner la sévérité de la maladie et influencer le développement des souches. Des contaminations précoces et tardives seraient malgré tout possibles avec des isolats agressifs, ce qui ouvre la possibilité de telles infections au champ. Dans une deuxième expérimentation, nous avons étudié la compétition entre F. graminearum et les autres espèces (F. culmorum, F. poae, M. majus et M. nivale). Les réponses se sont avérées variables ; néanmoins, les souches agressives ne sont pas influencées ou légèrement favorisées par la présence d'un compétiteur alors que les souches peu agressives sont défavorisées par la présence de souches agressives. La production de toxines est, dans la plupart des cas, restée stable ou a diminué en co-inoculations par rapport aux inoculations simples. Dans une dernière expérimentation nous avons étudié la compétition entre souches associée à leurs mouvements dans l'épi. Inoculés seuls, les champignons progressent dans la totalité de l'épi alors que la présence d'un second champignon empêche leur développement, ce qui suggère une interaction compétitive entre eux. Cette étude apporte de nouveaux éléments nécessaires à la compréhension de l'épidémiologie de ces agents pathogènes et des niveaux de contamination à l'échelle du champ.

53% du lait produit à Veracruz est utilisé pour la fabrication des fromages, mais ce lait n’est soumis à aucune analyse de la qualité, de sorte que le contenu des polluants tels que les pesticides et les mycotoxines pourraient se concentrer sur les fromages. Les pesticides, tels que les organochlorés (POC), peuvent augmenter l'incidence du cancer et jouer le rôle de perturbateur endocrinien ; tandis que les mycotoxines, telles que les aflatoxines (AF): l'aflatoxine M1 (AFM1) et l'aflatoxine M2 (AFM2), sont considérées comme cancérigènes. La consommation de fromage avec ces toxines peut mettre en danger la santé du consommateur, cependant, il y a peu de rapports sur la concentration de ces composés et la consommation de fromages par la population de Veracruz. L'objectif de ce travail était d'évaluer le risque pour la santé dû à la consommation de fromage (frais et Oaxaca) contaminé par les POC, AFM1 et AFM2. Pour atteindre cet objectif, des fromages frais et Oaxaca ont été échantillonnés au hasard dans 40 points de vente dans la ville de Veracruz, au cours de trois années différentes (2014, 2015 et 2016), couvrant les périodes sèches et pluvieuses. La concentration de POC (n = 20) a été quantifiée par CG-MS et celle des AF par HPLC. Pour obtenir des données sur la consommation de fromage, deux questionnaires ont été utilisés: un pour la fréquence d'achat (n = 100) et un journal alimentaire pour 7 jours (n = 309 pour chaque type de fromage). L'évaluation des risques par exposition de la population à l'AFM1 a été évaluée à l'aide de la combinaison des fonctions de densité de probabilité (PDF) de la concentration AF, de la consommation de fromage Oaxaca et du poids corporel (méthodologie probabiliste). Seulement dans 5% des échantillons de fromage Oaxaca, les POC ont été détectés mais dans des valeurs inférieures à la limite de quantification (LOQ = 0,01 mg kg-1), ce qui montre que l'exposition des consommateurs aux POC est faible. La consommation moyenne de fromage frais et Oaxaca était de 50,9 g personne-1 d-1 et 47,8 g personne-1 d-1, respectivement. Seulement dans 37% des échantillons de fromage Oaxaca, la concentration d'AFM1 et dans 10% pour l'AFM2, était supérieure à la valeur établie par la Commission européenne de 0,05 μg kg-1. L'exposition des enfants (5,9 ug de poids corporel AFM1 1 kg d-1 et 0,5 pg de poids corporel 1 AFM2 kg d-1) était supérieure à celle observée chez les adultes (2,32 g AFM1 kg de poids corporel -1 d-1 et 0,2 μg de AFM2 kg de poids corporel-1 d-1). La prise en compte d'un TDI de 1 ng kg-1 pc par jour-1 ,les résultats indiquent que la santé de 72,8% et 51% des enfants et des adultes respectivement population de la ville de Veracruz, est à risque de manger du fromage Oaxaca contaminés par l'AFM1 et environ 13% et 3% respectivement de la population des enfants et des adultes, en raison de la consommation de AFM2. La présente étude est la première enquête sur l'exposition de la population de Veracruz à des fromages contaminés par AFM1 et AFM2. / About 53 % of the milk produced in Veracruz is used for the manufacture of artisanal cheeses, however this milk is not subjected to any quality analysis, so the content of contaminants such as pesticides and mycotoxins could be found in cheeses. Pesticides, such as organochlorines (POCs), can increase the incidence of cancer and act as an endocrine disruptor; Additionally mycotoxins, such as aflatoxin M1 (AFM1) and aflatoxin M2 (AFM2), are considered carcinogenic. The consumption of cheese with these toxins can put the health of the consumer at risk; however, there are only reports on the concentration of these compounds in cheeses, and cheese data consumption by the population of Veracruz are not available. The objective of this work was to evaluate the health risk due to the consumption of contaminated cheese (fresh and Oaxaca) with POC's and AFM1. In order to attain this objective, fresh and Oaxaca cheeses were randomly sampled at 40 groceries in Veracruz city, in three different years (2014, 2015 and 2016), covering periods of drought and rain. The concentration of POC's (n= 20) was quantified by CG-MS and that of AFs by HPLC. Cheese intake data were obtained from a purchase frequency questionnaire (n = 100) and from a 7 days food diary questionnaire (n = 309 for each type cheese). The risk assessment for exposure of the population to AFM1 was calculated by the combination of probability density functions (PDF) of AFM1 concentration, Oaxaca cheese consumption and body weight (probabilistic methodology). POCs were detected only in 5 % of the samples at concentrations above the quantification limit (LOQ = 0.01 mg kg-1), which showst that consumer exposure is low. The average consumption of fresh and Oaxaca cheese was 50.9 g person-1 d-1 and 47.8 g person-1 d-1, respectively. Only in 37 % of Oaxaca cheese samples, the concentration of AFM1 and in the 10 samples of AFM2 was higher than the value established by the European Commission of 0.05 μg kg-1. The exposure of children (5.9 μg AFM1 kg body weight-1 d-1 and 0.5 μg AFM2 kg body weight-1 d-1) was higher than found in adults (2.32 μg AFM1 kg body weight-1 d-1 and 0.2 μg AFM2 kg body weight-1 d-1). Taking into account a TDI of 1 ng kg-1 pc d-1 the results indicated that health that the 72.8 % And 51% of the adult and child population, respectively, of the population of Veracruz city is at for consuming contaminated Oaxaca cheese with AFM1 and about 13% and 3% of the infant and adult population, respectively, due to the consumption of AFM2. The present study is the first research on the exposure of Veracruz population concerning contaminated cheeses with AFM1 and AFM2. / El 53 % de la leche producida en Veracruz se utiliza para fabricación de quesos artesanales, sin embargo esta leche no es sometida a ningún análisis de calidad, por lo que el contenido de contaminantes como plaguicidas y micotoxinas podrían concentrarse en los quesos. Los plaguicidas, como los organoclorados (POC’s), pueden aumentar la incidencia de cáncer y funcionar como disruptor endócrino; mientras que las micotoxinas, como las aflatoxinas (AFs): Aflatoxina M1 (AFM1) y Aflatoxina M2 (AFM2), son consideradas cancerígenas. El consumo de queso con estos tóxicos puede poner en riesgo la salud del consumidor, sin embargo, existen pocos reportes de la concentración de estos compuestos y el consumo de quesos por la población de Veracruz. El objetivo de este trabajo fue evaluar el riesgo a la salud por el consumo de queso (fresco y Oaxaca) contaminado con POC’s, AFM1 y AFM2. Para alcanzar este objetivo, se muestrearon aleatoriamente quesos fresco y Oaxaca en 40 puntos de venta de la ciudad de Veracruz, en tres años diferentes (2014, 2015 y 2016), abarcando periodos de secas y de lluvias. La concentración de POC’s (n = 20) se cuantificó por CG-MS y la de AFs por HPLC. Para la obtención de datos de ingesta de queso, se utilizaron dos cuestionarios: uno de frecuencia de compra (n = 100) y un diario de alimentos de 7 días (n = 309 para cada tipo de queso). La evaluación del riesgo por exposición de la población a AFM1 se evaluó a través de la combinación de las funciones de densidad de probabilidad (PDF) de la concentración de AFs, del consumo de queso Oaxaca y del peso corporal (metodología probabilística). Sólo en el 5 % de las muestras de queso Oaxaca se detectaron POC’s pero en valores inferiores al límite de cuantificación (LOQ = 0.01 mg kg-1), lo que muestra que la exposición del consumidor a los POC’s es baja. El consumo promedio de queso fresco y Oaxaca fue de 50.9 g persona-1 d-1 y 47.8 g persona-1 d-1, respectivamente. Sólo en el 37 % de las muestras de queso Oaxaca, la concentración de AFM1 y en el 10 % para la AFM2, fue mayor al valor establecido por la Comisión Europea de 0.05 μg kg-1. La exposición de los niños (5.9 μg de AFM1 kg de peso corporal-1 d-1 y 0.5 μg de AFM2 kg de peso corporal-1 d-1) fue mayor que la encontrada en adultos (2.32 μg de AFM1 kg de peso corporal-1 d-1 y 0.2 μg de AFM2 kg de peso corporal-1 d-1). Teniendo en cuenta una TDI de 1 ng kg-1 pc día-1 los resultados indicaron que la salud del 72.8 % y el 51 % de la población infantil y adulta, respectivamente, de la ciudad de Veracruz, está en riesgo por consumir queso Oaxaca contaminado con AFM1 y cerca del 13 % y 3 % de la población infantil y adulta respectivamente, debido al consumo de AFM2. El presente estudio es la primera investigación sobre la exposición de la población veracruzana a quesos contaminados con AFM1 y AFM2.

F. graminearum est l’une des espèces prédominantes en tant que pathogène des céréales en Europe et dans les régions tempérées du monde. Cette moisissure appartient au genre Fusarium qui est l’un des genres qui produit le plus de métabolites secondaires, dont de nombreuses mycotoxines. Cependant, les connaissances sur son génome laissent présager que F. graminearum produit une très grande variété de métabolites qui sont encore inconnus. C’est pourquoi l’objectif de cette thèse a été de caractériser le métabolome de cette moisissure en identifiant de nouveaux métabolites ainsi qu’en étudiant leur toxicité. Pour cela, une méthode analytique combinant la spectrométrie de masse de haute résolution et le marquage des métabolites secondaires avec des isotopes stables a été développée. Celle‐ci à tout d’abord était validée avec le métabolome bien connu d’Aspergillus fumigatus avant d’être appliquée au métabolome de F. graminearum. Cette méthode a permis d’identifier 37 nouveaux métabolites, dont les fusaristatines A, C et D qui on été détectées pour la première fois chez F. graminearum. Le deoxynivalenol (DON) est une mycotoxine majeure produite par F. graminearum, c’est pourquoi sa toxicité a été comparée in vivo sur un modèle porcin à celle d’un mélange de fusariotoxines. Les résultats de cette étude ont montré une toxicité bien différente du mélange par rapport au DON seul, que ce soit par rapport à la performance des animaux ou à leur réponse immunitaire. Ceci suggère que certaines des fusariotoxines présentes dans le mélange auraient des répercutions biologiques et donc que leur toxicité reste encore à être élucidée. De plus, l’importance de la caractérisation de la toxicité du métabolome de F. graminearum a été soulignée par les résultats obtenus dans une seconde étude, qui ont révélés une possible implication du DON dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin par l’intermédiaire des lymphocytes Th17. / F. graminearum is one of the most predominant cereal pathogen in Europe and temperate regions of the world. It belongs to the genera Fusarium, which is one of the most important in terms of the production of secondary metabolites, among which stand several mycotoxins. However, recent advances on the study of its genome suggest that only a small fraction of the secondary metabolites produced by F. graminearum have been identified so far. Therefore, the main objective of this thesis was to characterize the metabolome of this fungus by identifying new metabolites and by analyzing their toxicity. First, an analytical method combining high resolution mass spectrometry and isotopically labeled secondary metabolites was developed. The method was validated with the well known metabolome of Aspergillus fumigatus before it was applied to F. graminearum. As a result, 37 new metabolites were identified such as fusaristatin A, C and D, which were detected for the first time in the metabolome of F. graminearum. Deoxynivalenol (DON) is one of the major mycotoxins produced by this fungus. Therefore, its toxicity was compared to that of a blend of fusariotoxins in vivo in a pig model. The results of this study showed different effects of the blend compared to DON alone on animal performances and immune response. This suggests that some of the fusariotoxins present in the blend could be biologically active and their toxicity should be further investigated. Toxicity of the metabolome of F. graminearum has also been highlighted by the results of a second study which showed a possible implication of DON on the appearance of inflammatory bowel diseases by the action of Th17 lymphocytes.

La pourriture bleue causée par Penicillium expansum est l'une des maladies les plus dommageables des fruits pomaceae (pommes et poires). Outre des dégâts directs, cette maladie pose un problème de santé publique car l'agent pathogène produit des mycotoxines nocives pour l'homme et les animaux dont la plus sérieuse est la patuline. La croissance du champignon pathogène et la production de patuline requièrent des conditions physico-chimiques particulières. Les informations existantes à ce propos demeurent cependant modestes et insuffisantes pour envisager de développer des moyens de lutte contre l'apparition du champignon. Par ailleurs, la patuline reste avec l'ochratoxine A, les seules toxines dont la voie de biosynthèse n'a pas encore été complètement établie, tant sur le plan chimique que moléculaire. Cette étude apporte dans un premier temps des données complémentaires sur les facteurs physico-chimiques (température, pH….) qui conditionnent la croissance de P. expansum de même que sa capacité à produire la patuline. La connaissance de ces besoins et de ces conditions conduit en pratique à lutter et contrôler la contamination par la patuline tout le long de la chaine alimentaire. Dans un deuxième temps, cette thèse apporte des améliorations spectaculaires sur le plan fondamental, en termes d'élucidation de la voie de biosynthèse de la patuline. Le cluster des gènes impliqués dans la biosynthèse de cette mycotoxine chez l'espèce la plus préoccupante P. expansum a été entièrement identifié et caractérisé. Pour lever encore plus le voile sur la biosynthèse de cette mycotoxine, la caractérisation du facteur de régulation spécifique de cette voie (patL) a été également établie. Une perturbation de ce gène a provoqué une incapacité de production de patuline et une sévère diminution de l'expression des gènes Pat. De même, grâce à ce mutant déficient, il a été montré que la patuline pourrait agir comme facteur de virulence lors du développement de la moisissure dans les pommes. La caractérisation de la dernière étape de la voie de biosynthèse de la patuline a ensuite été entreprise par mutagenèse dirigée du gène patE du cluster de la patuline, chez la même espèce. Ce dernier code pour une Glucose méthanol Choline (GMC) oxydoréductase responsable de la conversion de l'ascladiol en patuline. L'ascladiol est également une molécule clé de la dégradation de la patuline par diverses espèces bactériennes ou de levures et plus particulièrement lors de la fermentation alcoolique. La non-toxicité de l'ascladiol accumulé chez le mutant ∆patE a été démontrée sur une lignée cellulaire intestinale humaine (Caco-2), suggérant que la patuline perd sa toxicité avec l'ouverture du deuxième cycle. Finalement, un système de détection et de quantification de P. expansum par PCR en temps réel a été développé en ciblant un gène hautement spécifique de la voie de biosynthèse de la patuline, patF. Cette approche préventive nous a ainsi permis d'avoir une estimation rapide de la contamination en patuline dans les pommes à partir de la quantification d'ADN de P. expansum. En conclusion, l'ensemble de ces travaux qui s'inscrivent dans le cadre de la gestion du risque « patuline » dans la filière fruit a permis d'amener des réponses tant sur le plan fondamental que sur le plan appliqué avec le séquençage du cluster, le développement d'un outil de diagnostic et la démonstration que l'ascladiol ne présentait aucune cytotoxicité. / Among diseases affecting apples, blue mold caused by Penicillium expansum is a major concern causing yield and quality losses due to the production of mycotoxins, of which patulin is the most alarming one. This mycotoxin was proven to be harmful for humans and animals. The pathogen growth and the patulin production occur under specific physico-chemical conditions (temperature, pH…). However, the description of these conditions in literature remains largely insufficient for the development of strategies to fight the development of the fungus. Furthermore, patulin remains, along with ochratoxin A, the only toxins for which the biosynthetic pathway is not fully established yet at both chemical and molecular levels. Firstly, this study provides supplementary data on the physico-chemical factors that modulate P. expansum growth and its ability to produce patulin. The acquaintance of these conditions leads, in practice, to the control of the patulin contamination along the food chain. Secondly, significant improvements were brought on the fundamental level, especially by elucidating the patulin biosynthetic pathway. The cluster of genes involved in the biosynthesis of this mycotoxin was fully identified and characterized in the species of greatest concern P. expansum. In order to reveal additional info on the biosynthesis of this mycotoxin, the specific factor of the pathway (patL) was characterized. The disruption of this gene has led to failure in patulin production and an important decrease in Pat genes expression. Furthermore, pathogenesis studies, using this same deficient strain showed that patulin potentially acts as a virulence factor during P. expansum development on apples. The last step of the patulin biosynthetic pathway was later characterized by site-directed mutagenesis of the patE gene in the same species. This gene encodes a Glucose Methanol Choline (GMC) oxidoreductase that is responsible for the conversion of ascladiol to patulin. Ascladiol is not only the last intermediate in the patulin pathway but also the main product of patulin degradation during the alcoholic fermentation of apple juice. The non-toxicity of ascladiol accumulated by the ΔpatE strain was proved against the human Caco-2 cell line. Finally a Real time PCR assay was developed to specifically detect and quantify P. expansum. This was done by targeting a highly specific gene from the patulin gene cluster in P. expansum, patF. This predictive approach allowed the quick estimation of the patulin content via the quantification of the P. expansum DNA in apples. To conclude, this thesis is part of the patulin's risk management study in the fruit sector; it provides significant improvements on both fundamental and practical levels. These advances are mainly characterized by the sequencing of the patulin gene cluster, the development of a molecular diagnostic tool and the demonstration of the non-cytotoxicity of ascladiol.

La fusariose est une des maladies les plus importantes altérant le blé en Bourgogne. L’espèce fongique Fusarium graminearum est l’un des agents principaux de la maladie. L’interaction hôte-pathogène peut entrainer la production de mycotoxines toxiques pour l’homme et l’animal.La seule alternative pour prévenir le développement de la maladie est de contrôler l’inoculum primaire dans son habitat naturel : les adventices, le sol et les résidus de culture. En raison de la tendance à la réduction du travail du sol, une attention particulière doit être portée au rôle des résidus de culture dans la survie et le développement de F. graminearum. Dans ce travail de thèse, deux approches ont été choisies pour mieux comprendre le développement saprotrophe du champignon et ses conséquences. La première, à travers un essai en champ dans le contexte pédoclimatique Bourguignon, avait pour but de définir la part relative des différentes sources d’inoculum dans le développement de la fusariose et l’accumulation des mycotoxines dans les grains. Cet essai devait en outre permettre de déterminer si des indicateurs précoces du développement de la maladie sur épi et de l’accumulation de mycotoxines pouvaient être identifiés. La seconde, à travers un essai en microcosmes, avait pour but de suivre le développement de F. graminearum dans le sol et les résidus.Ce travail a permis de souligner l’importance de la gestion des résidus de culture dans le développement de la fusariose du blé. Favoriser une décomposition biologique rapide des résidus de culture et/ou introduire des cultures intermédiaires assainissantes constituent des perspectives de recherche sur lesquelles doivent porter nos efforts / Fusarium Head Blight (FHB), mainly caused by the fungal species Fusarium graminearum, is one of the most important disease altering wheat crops in Burgundy. Moreover the plant-pathogen interaction leads to the production of mycotoxins potentially toxic for humans and animals.The only alternative to date to prevent the development of the disease is to control the saprotrophic development of F. graminearum in its natural habitat, i.e. weeds, soil and crops residues. Due to the trend of reduced tillage, special attention should be paid to the role of crop residues in the survival and development of F. graminearum.Two approaches were chosen to better understand the saprotrophic development of F. graminearum and its consequences towards FHB. i) The first through a field experiment in the Burgundian pedoclimatic context aimed at defining the relative importance of the different sources of inoculum in the development of FHB and the accumulation of mycotoxins in grains. The field experiment was also to determine whether early indicators of disease development on ears and accumulation of mycotoxins could be identified. ii) The second, through test microcosms, was to follow the development of F. graminearum in the soil and crop residues.This work highlighted the importance of crop residues management in the development of FHB and gave new understanding about the survival of the fungus on these residues. Improve the biological decomposition of crop residues at the soil surface or/and using suppressive intermediate crops could be the next prospective to investigate to limit the soil inoculum potential of saprotrophic F. graminearum

La fusariose de l’épi est une des maladies les plus importantes du blé. Elle est causée par un complexe d’espèces dont les plus courantes sont F. graminearum, F. culmorum, F. poae, M. majus et M. nivale. Ces champignons infectent les épis de blé au moment de la floraison mais l’impact de contaminations tardives sur les grains est peu compris. De plus, deux ou trois espèces sont susceptibles de co-infecter un même épi, ce qui pourrait modifier leur développement et leur production de toxines dans l’épi. Pour étudier ces problématiques, plusieurs isolats appartenant aux espèces citées ont été caractérisés selon leurs traits de vie et leur agressivité sur épi. Nous avons ensuite étudié le développement de souches de Fusarium inoculées 3 jours avant ou 0, 8, 18 ou 28 jours après la sortie des premières anthères. Les niveaux de maladie et toxines se sont révélés maximum autour de la floraison. La date d’inoculation semble conditionner la sévérité de la maladie et influencer le développement des souches. Des contaminations précoces et tardives seraient malgré tout possibles avec des isolats agressifs, ce qui ouvre la possibilité de telles infections au champ. Dans une deuxième expérimentation, nous avons étudié la compétition entre F. graminearum et les autres espèces (F. culmorum, F. poae, M. majus et M. nivale). Les réponses se sont avérées variables ; néanmoins, les souches agressives ne sont pas influencées ou légèrement favorisées par la présence d’un compétiteur alors que les souches peu agressives sont défavorisées par la présence de souches agressives. La production de toxines est, dans la plupart des cas, restée stable ou a diminué en co-inoculations par rapport aux inoculations simples. Dans une dernière expérimentation nous avons étudié la compétition entre souches associée à leurs mouvements dans l’épi. Inoculés seuls, les champignons progressent dans la totalité de l’épi alors que la présence d’un second champignon empêche leur développement, ce qui suggère une interaction compétitive entre eux. Cette étude apporte de nouveaux éléments nécessaires à la compréhension de l’épidémiologie de ces agents pathogènes et des niveaux de contamination à l’échelle du champ. / FHB is a potentially very damaging wheat disease, present in most wheat-growing areas and caused by a species complex from which F. graminearum, F. culmorum, F. poae, M. majus and M. nivale are the most common. These fungi may infect wheat spikes at flowering but infections at late stages of kernel development are poorly understood. Moreover, disease surveys have shown that co-infection of the same spike by two or three species is frequent and could modify their development in spikes. To investigate these questions, several isolates of the species cited above were characterised for their life traits and aggressiveness on spikes. We then investigated the development of Fusarium isolates inoculated on wheat spikes 3 days before or 0, 8, 18 and 28 days post anthers extrusion. The highest disease and toxin levels were found around anthesis. The inoculation date appeared to condition the disease severity and to influence the isolates development. Early or late contaminations were however possible with aggressive isolates, which suggest the possibility of such infections in field. In a second experiment, we studied the competition between F. graminearum and the other species (F. culmorum, F. poae, M. majus and M. nivale). The responses were variable; nevertheless, aggressive isolates were most of the time unchanged in their development or even promoted whereas less aggressive isolates were reduced against more aggressive ones. The toxin levels were generally unchanged or they decreased in co-inoculations compared to single inoculations. In a last experiment, we investigated the isolate competition and the movement of fungi in the spikes. Alone, isolates progressed in the whole spike whereas the presence of another fungus impaired their development, suggesting a competitive interaction. This study contributes to our understanding of these pathogens epidemiology and provides new elements for a better understanding of the contamination of wheat kernels at the field level.

Le déoxynivalénol (DON) est une mycotoxine qui contamine la plupart des cultures de céréales dans toutes les régions du monde. Capable de résister aux procédés de transformation subies par les céréales, le DON peut se retrouver alors, à l'état de contaminants dans les matières premières (céréales) ainsi que dans les denrées alimentaires transformées destinées à l'Homme (pâtes, pain, bières) et à l'animal (granulés) à des concentrations supérieures aux limites règlementaires. Malgré les efforts de recherche pour caractériser les multiples aspects de l'impact d'une contamination par le DON, les effets bactériologiques de cette mycotoxine n'étaient pas encore documentés chez l'Homme. L'Agence Nationale de Sécurité Sanitaire (Anses), dans le cadre de sa mission de protection du consommateur, a donc souhaité évaluer l'impact d'une contamination au DON sur le microbiote intestinal humain (MIH). Dans cette étude, nous avons d'abord évalué la cinétique du DON chez le porc et chez le rat, puis nous avons utilisé un modèle de rats à flore humanisée pour évaluer l'impact d'une exposition sub-chronique de la mycotoxine sur la composition du MIH. Le DON est un contaminant rapidement distribué et éliminé. Au sein du tractus digestif, il entraine des changements bactériologiques significatifs chez certains principaux groupes bactériens composant le MIH. Cette étude apporte des données complémentaires à l'analyse du risque lié à l'exposition du DON chez l'Homme et montre l'intérêt des modèles animaux étudiés dans des scénarii particuliers d'exposition au DON.

Les mycotoxines sont des molécules toxiques produites par de nombreuses espèces fongiques. Les seules mycotoxines avérées aujourd’hui cancérigènes pour l’homme sont les aflatoxines. Elles sont produites par le genre Aspergillus principalement et sont retrouvées tout au long de la chaine alimentaire (champs, stockage, transformation, etc.). A cause du réchauffement climatique, la France devient de plus en plus exposée à la présence de ces mycotoxines. Afin de limiter l’exposition des consommateurs, de nombreuses stratégies de prévention ou de décontamination sont développées. Dans ce contexte, nous avons recherché à mettre au point un système de lutte biologique permettant de prévenir la production d’aflatoxines sur le maïs au champ. Pour cela, nous avons choisi des bactéries issues du sol et déjà connues pour être commercialisées pour la lutte biologique, les actinomycètes. Nous avons étudié l’interaction in vitro sur boites de Pétri entre Aspergillus flavus, principal producteur d’aflatoxines, et certains actinomycètes. Nous avons démontré que l’interaction peut réduire la concentration en aflatoxines mesurée par HPLC. De plus, certains isolats bactériens sont aussi capables de réduire, en culture pure, la concentration d’aflatoxine B1 dans le milieu. Des premiers tests d’adsorption ont été réalisés pour comprendre la nature de ce mécanisme. Par ailleurs, une étude approfondie via RT-qPCR sur 6 souches bactériennes du genre Streptomyces sp. A montré que celles-ci étaient capables d’impacter l’expression de différents gènes impliqués dans la voie de biosynthèse chez A. flavus et A. parasiticus. Enfin, nous avons complété les données déjà existantes sur l’impact de facteurs environnementaux (température, disponibilité en eau et du temps d’incubation) sur la production d’aflatoxines. / Mycotoxins are toxic contaminants of foodstuffs produced by a wide range of fungal species. Aflatoxins are the only mycotoxins carcinogenic for humans. They are mainly produced by the Aspergillus genus and can be found at each step of the agrofood chain (e.g. field, storage, process). Due to climate changes, France is starting to be exposed to aflatoxins. In order to limit the consumer exposure, many prevention or decontamination techniques have been developed. To this aim, we started the development of a biocontrol against aflatoxins accumulation for maize field application. Actinomycetes, are soil-borne bacteria that has already been commercialized as biocontrol. In Petri dishes, we studied the in vitro interaction between some actinomycetes and Aspergillus flavus, the main aflatoxins producer. We revealed that the interaction reduced the aflatoxins content (monitored by HPLC). Moreover, some bacterial isolates were able to reduce pure-aflatoxin B1 added in the medium. To understand this mechanism, adsorption tests has been conducted. Otherwise, RT-qPCR methodology was used to study the impact of Streptomyces-Aspergillus sp. on aflatoxin gene expression. Finally, the current knowledge of the impact of environmental factors (temperature, water activity and incubation time) on aflatoxins production was supplemented.