Avaliamos o efeito da RCIU induzida por glicocorticoides sobre a regulação da expressão de miRNAs no fígado de ratos albinos. Animais expostos intrauterinamente à dexametasona apresentaram menor peso ao nascer, fígados relativamente menores dos que os observados em animais controle e menores concentrações hepáticas de PCNA. Em longo prazo, os animais DEX desenvolveram distúrbios metabólicos caracterizados por intolerância à glicose e maior potencial gliconeogênico no desmame e na vida adulta. Ao avaliarmos o perfil de miRNAs no fígado, detectamos aumento da expressão de todo o cluster do miR-322 no período perinatal, com menor conteúdo de alvos preditos desses transcritos (AKT3, CCND1 e INSR). A superexposição ao miR-322-5P reduz a taxa de proliferação em linhagens celulares de hepatocarcinoma e a expressão dos alvos observados no fígado dos animais estudados. Propomos um link entre a expressão aberrante do miR-322-5P e a reduzida taxa de proliferação detectada no tecido hepático em desenvolvimento, contribuindo para o estabelecimento do fenótipo em longo prazo. / We evaluated the effects of glucocorticoid induced IUGR on the expression of miRNA on Wistar rat livers. Dexamethasone (DEX) treated animals were lighter and had smaller liver weight:body weight ratio when compared to control animals. Furthermore, liver PCNA expression was downregulated, sugesting a reduction on cell proliferation rate. In the long term, DEX animals developed metabolic disturbances such as glucose intolerance e increased gluconeogenesis rate in a fast state. The analysis of miRNA expression profile showed an upregulation of miR-322 cluster on perinatal period, together with a downregulation of three putative targets: Akt3, CCND1 and INSR. Later, we used in vitro studies to prove that overexpression of miR-322-5P arrests cell cycle and impairs proliferation of HEPG2 cells as well as it downregulates the predicted targets. Based on this data, we suggest a link between overexpression of miR-322-5P and impaired proliferation rate on the developing liver, which affects the phenotype in the long term.

O desenvolvimento dos sistemas de produção de embriões por fecundação in vitro (FIV) ou transferência nuclear com células somáticas (TNCS) em diversas espécies animais, em especial a bovina, acarretou na manifestação de anormalidades de desenvolvimento in vivo, com a placenta sendo considerada o fator determinante no aparecimento destes distúrbios durante a gestação. A hipótese geral deste trabalho é de que alterações na formação da placenta, decorrentes das manipulações embrionárias in vitro, resultam em elevadas perdas no terço inicial e em anormalidades fetais e placentárias no terço final da gestação, incluindo um crescimento compensatório dos fetos por uma perda da capacidade de regulação da restrição placentária, elevando o fluxo total de nutrientes no sentido materno-fetal. Sendo assim, este estudo foi dividido em Capítulos, buscando-se avaliar os efeitos de algumas variáveis biológicas e técnicas na produção de embriões in vitro por TNCS, e de comparar o desenvolvimento de prenhezes estabelecidas com embriões produzidos in vivo (Controle), in vitro por fecundação (FIV) e in vitro por transferência nuclear (TNCS), pela avaliação de dados morfométricos, morfológicos e bioquímicos coletados em distintos momentos da gestação. No Capítulo 1, o desenvolvimento in vitro de embriões clonados foi comparado entre células somáticas de duas fêmeas geneticamente distintas (Nelore vs. Crioula Lageana), e entre três intervalos de confluência celular, estabelecidos previamente ao procedimento de clonagem, do mesmo animal. As melhores taxas foram obtidas com a utilização de células da fêmea Nelore, e da utilização de células com elevada confluência em cultivo. No Capítulo 2, comparou-se o efeito de dois intervalos de fusão-ativação e da agregação ou não de embriões no momento do cultivo, no desenvolvimento in vitro e in vivo destes embriões clonados. A agregação dos embriões e um maior intervalo entre fusão-ativação promoveram um incremento na produção de blastocistos. Contudo, estes não se apresentaram mais desenvolvidos ou com melhor qualidade, e também não influenciaram nas taxas de prenhez ou de manutenção das mesmas. No Capítulo 3, prenhezes dos grupos Controle, FIV e TNCS foram comparadas pela avaliação de dados morfométricos e bioquímicos coletados em distintos momentos da gestação. Este experimento demonstrou que as diferenças entre os grupos experimentais ocorreram desde as análises iniciais, com os grupos in vitro apresentando menores taxas de prenhez, e com o grupo TNCS tendo as maiores perdas gestacionais. As imagens obtidas por ultrasonografia aos 51 dias revelaram conceptos in vitro retardados em seu desenvolvimento, mas com um crescimento compensatório posterior, já que as prenhezes produzidas in vitro, e especialmente as do grupo TNCS, sustentaram não só maiores conceptos e com maiores anormalidades aos 225 dias de gestação, como também apresentaram um maior acúmulo de substratos energéticos no sistema fetal, particularmente de frutose no alantóide. No Capítulo 4, foram comparados os resultados de produção de embriões clonados e do estabelecimento de prenhezes em um período de produção de 28 meses, divididos em três momentos. A compilação dos períodos de rotinas de trabalho em clonagem bovina demonstrou o efeito da experiência e da aquisição de competência técnica sobre os resultados de produção in vitro de embriões por TNCS, com repercussão direta no desenvolvimento in vivo posterior. / The in vitro production (IVP) of embryos by in vitro fertilization (IVF) or somatic cell nuclear transfer (SCNT) in many species, especially in cattle, is usually associated with abnormalities during in vivo development, with the placenta being implicated as the determining factor in the appearance of the disturbances during gestation. The general hypothesis of this study is that alterations in placenta formation, as a consequence of early in vitro embryo manipulations, results in high gestation losses during the first trimester and fetal and placental abnormalities in the last trimester of gestation, including the occurrence of a compensatory fetal growth due to a reduced placental-fetal growth-restricting effect, which increases the total materno-fetal nutrient flux in late pregnancy. This study aimed to evaluate some of the biological and technical effects on the IVP of embryos by SCNT, and also to compare the development of pregnancies established with embryos produced either in vivo (Control), or in vitro by in vitro fertilization (IVF) or by nuclear transfer (SCNT), by the evaluation of morphometric, morphologic and biochemical data collected at distinct time points in gestation. In Chapter 1, the in vitro development of cloned embryos was compared between somatic cells of two genetically different females (Nelore vs. Crioula Lageana), and between three cell confluence intervals, established prior to the cloning procedure of the same animal. The best results were achieved using cells from the Nelore female and also with cells on the highest confluence level on culture. In Chapter 2, the effects of two fusion-activation intervals and the use or not of embryo aggregation during in vitro culture were compared by evaluating the in vitro and in vivo developmental potential of resulting embryos. The embryo aggregation and a higher fusion-activation interval promoted an improvement in blastocyst yield. However, those embryos were neither more advanced in development nor better in morphological quality, having no influence on subsequent pregnancy rates or pregnancy losses. In Chapter 3, Control, IVF and SCNT pregnancies were compared by the evaluation of morphometric and biochemical data collected at distinct moments in gestation. This experiment demonstrated that differences occurred between the three groups of embryos from the beginning of the analyses; the in vitro-produced groups had lower pregnancy rates, with the SCNT group showing the highest pregnancy losses. The analyses of the sonograms on Day 51 of pregnancy revealed a growth retardation pattern for the in vitro concepti, having a compensatory development up to late pregnancy, as in vitro-derived pregnancies, special in the SCNT group, sustained heavier concepti with a wider spectrum of abnormalities on day 225 of gestation. In addition, the SCNT pregnancies demonstrated a greater accumulation of substrates in the fetal system, particularly fructose on the allantoic fluid. Finally, in Chapter 4, results obtained from a retrospective analysis of bovine embryo production by cloning and subsequent pregnancy rates were compared between three equal periods within a range of 28 months. The comparison of the bovine cloning procedures during the three time periods demonstrated the impact of the technical skills and competence on the overall efficiency of in vitro embryo production by SCNT, and subsequent in vivo development.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), causada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), é uma das epidemias mais impactantes do milênio e, desde o início, o número de mulheres jovens infectadas vem aumentando vertiginosamente, principalmente nos países em desenvolvimento onde muitas destas engravidam precocemente. Apesar da grande maioria dos casos de AIDS pediátrico no mundo resultar da transmissão vertical, aproximadamente dois terços dos neonatos expostos ao HIV durante a vida fetal não são contaminados. Neste sentido, seguindo as recomendações do consenso brasileiro (Ministério da Saúde), toda criança cuja transmissão vertical tenha sido descartada laboratorialmente não necessita de acompanhamento ambulatorial particularizado. Entretanto, resultados anteriores obtidos pelo nosso grupo demonstraram que, gestantes infectadas pelo HIV-1 que não controlam a carga viral plasmática (CVP), apresentam níveis elevados de citocinas inflamatórias e, no presente estudo, resultados revelam que neonatos não-infectados nascidos dessas gestantes apresentam anormalidades imunofuncionais no compartimento das células T do cordão umbilical quando expostos in vitro a ativadores policlonais, mas não aos antígenos do HIV-1. Ademais, quando comparada a neonatos não expostos, a ativação in vitro das células T de neonatos expostos ao HIV-1 com anti-CD3/anti-CD28 induziu a produção de níveis elevados de IL-17 e reduzidos de IL-10. Interessantemente, essa tendência das células T em secretar IL-17 parece estar relacionada à liberação de níveis elevados de IL-23 pelas células dendríticas derivadas de monócitos do sangue do cordão umbilical estimuladas com lipopolissacarídeo bacteriano. Uma ausência de sensibilização uterina aos antígenos do HIV-1 sugere que essas alterações possam traduzir um efeito adverso da produção elevada de citocinas inflamatórias maternas sobre o sistema imune do neonato, o que pode desequilibrar os eventos envolvidos na maturação e homeostasia imune fetal e neonatal, favorecendo o predomínio de fenótipos Th anômalos, tal como Th17. Essa hiper-responsividade das células Th17 pode vir a comprometer não apenas a capacidade da criança em responder de forma adequada a diferentes estímulos antigênicos ao longo de sua vida, como também pode torná-la mais suscetível a desordens imunomediadas / The acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), caused by human immunodeficiency virus (HIV), is one of the most impelling epidemic in the world, and the HIV-infection in young women has been increasing fast in the recent times, mainly in developing countries where most of them become pregnant precociously. Although the great majority of the pediatric AIDS cases all over the world results from vertical transmission, approximately, two thirds of the children exposed to HIV during fetal life are not contaminated. In this context, following brazilian consensus recommendations (Health Ministry), every child whom vertical transmission had been laboratorialy discarded does not need a specific ambulatorial follow up. However, our previous results demonstrated that HIV-1-infected pregnant women who did not control their plasma viral load presented elevated levels of inflammatory cytokines, and in the present study our results revealed that non-infected neonates, born from these pregnant women display immune functional abnormalities in umbilical cord T cells compartment when exposed in vitro to policlonal activators, but not to HIV-1 antigens. Furthermore, when compared to non-exposed neonates, T cell in vitro activation with anti-CD3/anti-CD28 from neonates exposed to HIV-1 induced production of high IL-17 levels and decreased of IL-10. Interestingly, this T cell bias in secreting IL-17 seem to be related to liberation of high IL-23 levels by dendritic cells derived from umbilical cord blood monocytes following stimulation with bacterial lipopolysacharide (LPS). The lack of uterine sensitization to HIV-1 antigens suggests that, these alterations, may translate an adverse effect of a high level maternal inflammatory cytokines production on neonates immune system, which may unbalance events related to neonatal and fetal immune maturation and homeostasis, favoring Th anomalous phenotypes predominance, such as Th17. This Th17 hyper-responsiveness may then compromise not only the childs capacity to respond in an adequate way to different antigenic stimuli through life, as well as becoming them more susceptible to immune-mediated disorders

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), causada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), é uma das epidemias mais impactantes do milênio e, desde o início, o número de mulheres jovens infectadas vem aumentando vertiginosamente, principalmente nos países em desenvolvimento onde muitas destas engravidam precocemente. Apesar da grande maioria dos casos de AIDS pediátrico no mundo resultar da transmissão vertical, aproximadamente dois terços dos neonatos expostos ao HIV durante a vida fetal não são contaminados. Neste sentido, seguindo as recomendações do consenso brasileiro (Ministério da Saúde), toda criança cuja transmissão vertical tenha sido descartada laboratorialmente não necessita de acompanhamento ambulatorial particularizado. Entretanto, resultados anteriores obtidos pelo nosso grupo demonstraram que, gestantes infectadas pelo HIV-1 que não controlam a carga viral plasmática (CVP), apresentam níveis elevados de citocinas inflamatórias e, no presente estudo, resultados revelam que neonatos não-infectados nascidos dessas gestantes apresentam anormalidades imunofuncionais no compartimento das células T do cordão umbilical quando expostos in vitro a ativadores policlonais, mas não aos antígenos do HIV-1. Ademais, quando comparada a neonatos não expostos, a ativação in vitro das células T de neonatos expostos ao HIV-1 com anti-CD3/anti-CD28 induziu a produção de níveis elevados de IL-17 e reduzidos de IL-10. Interessantemente, essa tendência das células T em secretar IL-17 parece estar relacionada à liberação de níveis elevados de IL-23 pelas células dendríticas derivadas de monócitos do sangue do cordão umbilical estimuladas com lipopolissacarídeo bacteriano. Uma ausência de sensibilização uterina aos antígenos do HIV-1 sugere que essas alterações possam traduzir um efeito adverso da produção elevada de citocinas inflamatórias maternas sobre o sistema imune do neonato, o que pode desequilibrar os eventos envolvidos na maturação e homeostasia imune fetal e neonatal, favorecendo o predomínio de fenótipos Th anômalos, tal como Th17. Essa hiper-responsividade das células Th17 pode vir a comprometer não apenas a capacidade da criança em responder de forma adequada a diferentes estímulos antigênicos ao longo de sua vida, como também pode torná-la mais suscetível a desordens imunomediadas / The acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), caused by human immunodeficiency virus (HIV), is one of the most impelling epidemic in the world, and the HIV-infection in young women has been increasing fast in the recent times, mainly in developing countries where most of them become pregnant precociously. Although the great majority of the pediatric AIDS cases all over the world results from vertical transmission, approximately, two thirds of the children exposed to HIV during fetal life are not contaminated. In this context, following brazilian consensus recommendations (Health Ministry), every child whom vertical transmission had been laboratorialy discarded does not need a specific ambulatorial follow up. However, our previous results demonstrated that HIV-1-infected pregnant women who did not control their plasma viral load presented elevated levels of inflammatory cytokines, and in the present study our results revealed that non-infected neonates, born from these pregnant women display immune functional abnormalities in umbilical cord T cells compartment when exposed in vitro to policlonal activators, but not to HIV-1 antigens. Furthermore, when compared to non-exposed neonates, T cell in vitro activation with anti-CD3/anti-CD28 from neonates exposed to HIV-1 induced production of high IL-17 levels and decreased of IL-10. Interestingly, this T cell bias in secreting IL-17 seem to be related to liberation of high IL-23 levels by dendritic cells derived from umbilical cord blood monocytes following stimulation with bacterial lipopolysacharide (LPS). The lack of uterine sensitization to HIV-1 antigens suggests that, these alterations, may translate an adverse effect of a high level maternal inflammatory cytokines production on neonates immune system, which may unbalance events related to neonatal and fetal immune maturation and homeostasis, favoring Th anomalous phenotypes predominance, such as Th17. This Th17 hyper-responsiveness may then compromise not only the childs capacity to respond in an adequate way to different antigenic stimuli through life, as well as becoming them more susceptible to immune-mediated disorders

Avaliamos o efeito da RCIU induzida por glicocorticoides sobre a regulação da expressão de miRNAs no fígado de ratos albinos. Animais expostos intrauterinamente à dexametasona apresentaram menor peso ao nascer, fígados relativamente menores dos que os observados em animais controle e menores concentrações hepáticas de PCNA. Em longo prazo, os animais DEX desenvolveram distúrbios metabólicos caracterizados por intolerância à glicose e maior potencial gliconeogênico no desmame e na vida adulta. Ao avaliarmos o perfil de miRNAs no fígado, detectamos aumento da expressão de todo o cluster do miR-322 no período perinatal, com menor conteúdo de alvos preditos desses transcritos (AKT3, CCND1 e INSR). A superexposição ao miR-322-5P reduz a taxa de proliferação em linhagens celulares de hepatocarcinoma e a expressão dos alvos observados no fígado dos animais estudados. Propomos um link entre a expressão aberrante do miR-322-5P e a reduzida taxa de proliferação detectada no tecido hepático em desenvolvimento, contribuindo para o estabelecimento do fenótipo em longo prazo. / We evaluated the effects of glucocorticoid induced IUGR on the expression of miRNA on Wistar rat livers. Dexamethasone (DEX) treated animals were lighter and had smaller liver weight:body weight ratio when compared to control animals. Furthermore, liver PCNA expression was downregulated, sugesting a reduction on cell proliferation rate. In the long term, DEX animals developed metabolic disturbances such as glucose intolerance e increased gluconeogenesis rate in a fast state. The analysis of miRNA expression profile showed an upregulation of miR-322 cluster on perinatal period, together with a downregulation of three putative targets: Akt3, CCND1 and INSR. Later, we used in vitro studies to prove that overexpression of miR-322-5P arrests cell cycle and impairs proliferation of HEPG2 cells as well as it downregulates the predicted targets. Based on this data, we suggest a link between overexpression of miR-322-5P and impaired proliferation rate on the developing liver, which affects the phenotype in the long term.

A zinco protoporfirina (ZPP) eritrocitária é um metabólito formado pela adição do zinco no sítio do ferro durante a formação da molécula de hemoglobina, quando este último está total ou parcialmente indisponível. O objetivo deste trabalho foi realizar a padronização dos valores da ZPP eritrocitária em bezerros sadios com até um mês de vida, assim como a validade da ZPP como previsora da ocorrência de anemia ferropriva em bezerros neonatos, em comparação com outros métodos. Para tanto foram utilizados 134 bezerros da raça Holandesa, com idades variando do nascimento até 30 dias de vida, provenientes de fazendas produtoras de leite localizadas no Estado de São Paulo, classificados como sadios (67 animais) e anêmicos (67 animais). Os animais foram monitorados por meio de exames físico e complementares (hemograma e reticulocitometria, teores de ferro sérico (FT) e capacidade total de ligação do ferro (CTLF), teores de bilirrubinas e de uréia séricas, e concentrações da ZPP). Durante a padronização do exame, os valores médios encontrados foram: concentração de ZPP eritrocitária das amostras de hemácias não lavadas em até 3 horas após a colheita de sangue de 30 animais sadios - 80,90 &#181;mol ZPP/mol heme; concentração de ZPP eritrocitária, após a lavagem de hemácias, determinadas até 3 horas e 12 horas após colheita de sangue do mesmo grupo - 61,40 &#181;mol ZPP/mol heme e 61,03 &#181;mol ZPP/mol heme, respectivamente. Com base nos resultados obtidos, foi possível concluir que as amostras de sangue colhidas para a mensuração da ZPP podem ser armazenadas, sob refrigeração a 4°C, por até 12 horas após a colheita, sem alterações significativas dos seus valores, sendo recomendável a lavagem das hemácias antes da mensuração dos valores da ZPP eritrocitária devido à presença de substâncias interferentes no plasma do animal. Foi encontrada diferença significativa nas concentrações da ZPP e de todos os componentes do eritrograma, assim como nos teores do metabolismo de ferro entre os animais anêmicos e sadios. As concentrações de bilirrubinas e ureia séricas apresentaram-se no intervalo fisiológico de variação, não interferindo na mensuração da ZPP nos eritrócitos dos bezerros com ou sem anemia. A correlação entre os valores encontrados dos teores de ferro sérico e da capacidade total de ligação do ferro com as concentrações de ZPP foram: rs = - 0,45, p < 0,001 (ZPP x FT) e rs = 0,51, p < 0,001 (ZPP x CTLF), respectivamente, demonstrando que quanto menores os teores de ferro, maiores serão as concentrações de ZPP. Portanto, a utilização da ZPP como previsora dos quadros de anemia ferropriva em bezerros neonatos com até um mês de vida se mostrou válida e, considerando que a hematofluorometria é um método rápido e não oneroso, pode ser recomendado como exame complementar de rotina. / The zinc protoporphyrin (ZPP) is a metabolic originated by zinc addition in the iron site during the synthesis of hemoglobin molecule, when iron is total or partially unavailable. The aim of this study was to standardize the values of zinc protoporphyrin (ZPP) in erythrocyte of healthy calves until one month of life, and to evaluate this determination as a predictor of the occurrence of iron deficiency anemia in newborn calves, compared with other methods. Therefore, 134 Holstein calves were used, aged from birth to 30 days of life, from dairy farms located in the São Paulo State, splitted into two groups, classified as healthies (67 animals), and anemics (67 animals). The animals were monitored by physical examination and laboratory assessments (complete blood cell count and reticulocytes, serum iron (SI) and total iron binding capacity (TIBC), levels of serum bilirubin and urea, and ZPP levels). During the exam standardization, the mean values found were: erythrocyte ZPP of unwashed erythrocytes within 3 hours after blood sampling of 30 healthy animals - 80.9 &#181;mol ZPP/mol heme; erythrocyte ZPP after washing of red blood cells, determined by 3 hours and 12 hours after blood collection, from the same group were 61.40 &#181;mol ZPP/mol heme and 61.03 &#181;mol ZPP/mol heme, respectively. Based on these results, it was concluded that blood samples taken for measurement of ZPP may be stored under refrigeration at 4 °C for up to 12 hours, without significant changes of the values of erythrocyte ZPP, and it is also advisable to wash the red cells before erythrocyte ZPP values measuring, due to the presence of interfering substances in the animal plasma. A significant difference was found in the ZPP levels and in all erythrogram components, as well as on the levels of iron metabolism between anemic and healthy animals. The bilirubin and serum urea levels remained within physiological variation, does not interfering with the measurement of erythrocyte ZPP of calves with or without anemia. The correlation values between SI and TIBC with ZPP levels were: rs = - 0.45, p < 0.001 (ZPP x SI) and rs = 0.51, p < 0.001 (ZPP x TIBC), respectively, i.e. decreasing biochemical levels of iron metabolism will increase levels of ZPP. Therefore, the use of ZPP as an iron deficiency anemia predictor in newborn calves up to one month of life has proven its validity, and considering hematofluorometry as a quick and inexpensive method, it might be recommended as a routine exam.

O desenvolvimento dos sistemas de produção de embriões por fecundação in vitro (FIV) ou transferência nuclear com células somáticas (TNCS) em diversas espécies animais, em especial a bovina, acarretou na manifestação de anormalidades de desenvolvimento in vivo, com a placenta sendo considerada o fator determinante no aparecimento destes distúrbios durante a gestação. A hipótese geral deste trabalho é de que alterações na formação da placenta, decorrentes das manipulações embrionárias in vitro, resultam em elevadas perdas no terço inicial e em anormalidades fetais e placentárias no terço final da gestação, incluindo um crescimento compensatório dos fetos por uma perda da capacidade de regulação da restrição placentária, elevando o fluxo total de nutrientes no sentido materno-fetal. Sendo assim, este estudo foi dividido em Capítulos, buscando-se avaliar os efeitos de algumas variáveis biológicas e técnicas na produção de embriões in vitro por TNCS, e de comparar o desenvolvimento de prenhezes estabelecidas com embriões produzidos in vivo (Controle), in vitro por fecundação (FIV) e in vitro por transferência nuclear (TNCS), pela avaliação de dados morfométricos, morfológicos e bioquímicos coletados em distintos momentos da gestação. No Capítulo 1, o desenvolvimento in vitro de embriões clonados foi comparado entre células somáticas de duas fêmeas geneticamente distintas (Nelore vs. Crioula Lageana), e entre três intervalos de confluência celular, estabelecidos previamente ao procedimento de clonagem, do mesmo animal. As melhores taxas foram obtidas com a utilização de células da fêmea Nelore, e da utilização de células com elevada confluência em cultivo. No Capítulo 2, comparou-se o efeito de dois intervalos de fusão-ativação e da agregação ou não de embriões no momento do cultivo, no desenvolvimento in vitro e in vivo destes embriões clonados. A agregação dos embriões e um maior intervalo entre fusão-ativação promoveram um incremento na produção de blastocistos. Contudo, estes não se apresentaram mais desenvolvidos ou com melhor qualidade, e também não influenciaram nas taxas de prenhez ou de manutenção das mesmas. No Capítulo 3, prenhezes dos grupos Controle, FIV e TNCS foram comparadas pela avaliação de dados morfométricos e bioquímicos coletados em distintos momentos da gestação. Este experimento demonstrou que as diferenças entre os grupos experimentais ocorreram desde as análises iniciais, com os grupos in vitro apresentando menores taxas de prenhez, e com o grupo TNCS tendo as maiores perdas gestacionais. As imagens obtidas por ultrasonografia aos 51 dias revelaram conceptos in vitro retardados em seu desenvolvimento, mas com um crescimento compensatório posterior, já que as prenhezes produzidas in vitro, e especialmente as do grupo TNCS, sustentaram não só maiores conceptos e com maiores anormalidades aos 225 dias de gestação, como também apresentaram um maior acúmulo de substratos energéticos no sistema fetal, particularmente de frutose no alantóide. No Capítulo 4, foram comparados os resultados de produção de embriões clonados e do estabelecimento de prenhezes em um período de produção de 28 meses, divididos em três momentos. A compilação dos períodos de rotinas de trabalho em clonagem bovina demonstrou o efeito da experiência e da aquisição de competência técnica sobre os resultados de produção in vitro de embriões por TNCS, com repercussão direta no desenvolvimento in vivo posterior. / The in vitro production (IVP) of embryos by in vitro fertilization (IVF) or somatic cell nuclear transfer (SCNT) in many species, especially in cattle, is usually associated with abnormalities during in vivo development, with the placenta being implicated as the determining factor in the appearance of the disturbances during gestation. The general hypothesis of this study is that alterations in placenta formation, as a consequence of early in vitro embryo manipulations, results in high gestation losses during the first trimester and fetal and placental abnormalities in the last trimester of gestation, including the occurrence of a compensatory fetal growth due to a reduced placental-fetal growth-restricting effect, which increases the total materno-fetal nutrient flux in late pregnancy. This study aimed to evaluate some of the biological and technical effects on the IVP of embryos by SCNT, and also to compare the development of pregnancies established with embryos produced either in vivo (Control), or in vitro by in vitro fertilization (IVF) or by nuclear transfer (SCNT), by the evaluation of morphometric, morphologic and biochemical data collected at distinct time points in gestation. In Chapter 1, the in vitro development of cloned embryos was compared between somatic cells of two genetically different females (Nelore vs. Crioula Lageana), and between three cell confluence intervals, established prior to the cloning procedure of the same animal. The best results were achieved using cells from the Nelore female and also with cells on the highest confluence level on culture. In Chapter 2, the effects of two fusion-activation intervals and the use or not of embryo aggregation during in vitro culture were compared by evaluating the in vitro and in vivo developmental potential of resulting embryos. The embryo aggregation and a higher fusion-activation interval promoted an improvement in blastocyst yield. However, those embryos were neither more advanced in development nor better in morphological quality, having no influence on subsequent pregnancy rates or pregnancy losses. In Chapter 3, Control, IVF and SCNT pregnancies were compared by the evaluation of morphometric and biochemical data collected at distinct moments in gestation. This experiment demonstrated that differences occurred between the three groups of embryos from the beginning of the analyses; the in vitro-produced groups had lower pregnancy rates, with the SCNT group showing the highest pregnancy losses. The analyses of the sonograms on Day 51 of pregnancy revealed a growth retardation pattern for the in vitro concepti, having a compensatory development up to late pregnancy, as in vitro-derived pregnancies, special in the SCNT group, sustained heavier concepti with a wider spectrum of abnormalities on day 225 of gestation. In addition, the SCNT pregnancies demonstrated a greater accumulation of substrates in the fetal system, particularly fructose on the allantoic fluid. Finally, in Chapter 4, results obtained from a retrospective analysis of bovine embryo production by cloning and subsequent pregnancy rates were compared between three equal periods within a range of 28 months. The comparison of the bovine cloning procedures during the three time periods demonstrated the impact of the technical skills and competence on the overall efficiency of in vitro embryo production by SCNT, and subsequent in vivo development.

As proteínas de classe 3 são candidatas na preparação de uma vacina contra a doença meningocócica. O objetivo deste estudo é determinar a imunogenicidade da proteína de classe 3 purificada da cepa de Neisseria meningitidis do sorogrupo B juntamente com a capacidade adjuvante de whole cells de Bordetella pertussis. Foram imunizados camundongos BALB/c neonatos em um intervalo de 3 a 12 dias entre 1 e 4 doses da proteína de classe 3 mais adjuvante, pela via intranasal e no 21º dia pela via intramuscular com a proteína de classe 3 emulsificada com hidróxido de alumínio. Os resultados demonstraram que após 2 doses pela via intranasal e 1 dose pela via intramuscular houve rápido estímulo das células imunes nos camundongos adultos BALB/c e neonatos BALB/c e outbred. Todos os soros foram analisados por ELISA e immunoblot. O adjuvante B. pertussis administrado pelas vias intranasal ou intramuscular, aumentou a resposta imune comparada com os controles. Anticorpos bactericidas e de alta afinidade foram produzidos. / Proteins of class 3 sound candidates in the preparation of vaccine against meningococcal illness. The aim of this study was to determine the immunogenicity of class 3 proteins purified of Neisseria meningitidis of the serogroup B along with whole cells of Bordetella pertussis as adjuvant. BALB/c and outbred neonate mice between 3 and 12 days old were immunized with 1 to 4 doses of the purified class 3 proteins with or without adjuvant given by the intranasal route, and on the 21st day the animals received an intramuscular dose of the class 3 proteins with or without aluminum hydroxide. The results demonstrated that after 2 doses by the intranasal route and 1 dose intramuscular there was a rapid stimulation of the immune cells in BALB/c adult mice as well as BALB/c and outbred neonates mice. All sera were analyzed by ELISA and immunoblot. The adjuvant B. pertussis used in the present investigation and given via the intranasal or intramuscular route increased the immune response compared with the controls. High affinity and bactericidal antibodies were produced.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA12MA106.pdf: 7444114 bytes, checksum: 2547058845886ef40cf92c5b6a4e6867 (MD5) Previous issue date: 2012-03-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Newborn calves derived from in vitro fertilization (IVF) procedures often have difficulties to adapt to life ex utero, with high birth weights usually associated with high plasma fructose levels in some in vitro-produced calves. We hypothesize that the fructose metabolic pathway is active at birth, with the fructosemia levels being either detrimental or beneficial to animal survival depending on the respiratory function in the neonate. To investigate this hypothesis, four and five newborn calves derived from in vitro- and in vivo-produced embryos were evaluated for morpho-physiological and clinical normality at birth, and for subsequent signs adaptation to life ex utero in the first 24 h of life. At birth, animals were subjected to gene expression analyses for key enzymes in the fructose metabolic pathway and to the collection of fetal fluids and urine for fructose analysis. In addition, during the period between birth and 24 h of life, animals were evaluated for clinical signs, plasma concentrations of metabolic substrates, blood chemistry, hemogasometry, and hematologic parameters. Neonatal physical, clinical, and behavioral traits were compared with physiological, biochemical, metabolic, and molecular findings observed at birth and in the first 24 h of life for the determination of physiological alterations and relationships of biological significance between the experimental groups. In vitro-derived newborn calves were heavier and larger at birth, having lower respiratory rate and thermoregulatory response than in vivo-derived controls, with no significant differences in fructose, glucose and lactate levels between groups. Nevertheless, physiological and metabolic findings at birth, in general, were widely similar and normal between groups. However, during the first 24 h of life, IVF-derived calves showed physiological, metabolic, biochemical, hemogasometric, and hematologic features indicative of a lower adaptation to life ex utero, particularly in the first 4 to 6 h of life. The main differences indicated that larger animals, mainly the IVF-derived calves, had more difficulties to maintain plasma oxygen levels, likely due to a less efficient hematosis, with evidence of a metabolic shift and elevation of metabolic substrates (mostly lactate), and a trend for acidosis followed by a compensatory normalization of the acid-base balance, predominantly in the first 6 h of life. The physiological and metabolic role of fructose was apparent, but not conclusive / Neonatos bovinos derivados de fecundação in vitro (FIV) frequentemente apresentam dificuldades de adaptação à vida ex utero, estando o excesso de peso ao nascer associado a elevadas concentrações plasmáticas de frutose em alguns bezerros de FIV. A hipótese deste trabalho é que a via metabólica da frutose é ativa ao nascimento, podendo ser benéfica ou prejudicial à sobrevivência neonatal, dependendo da função respiratória do neonato. Para investigar esta hipótese, quatro neonatos bovinos derivados de embriões produzidos in vitro e cinco de embriões in vivo foram avaliados quanto à normalidade morfo-fisiológica e clínica ao nascimento, e quanto a sinais de adaptação ao ambiente extrauterino nas primeiras 24 h de vida. Ao nascimento, os animais foram submetidos à análise de expressão gênica de enzimas da via metabólica da frutose e à coleta de fluídos fetais e de urina para mensuração da frutose. Durante o período do parto até as 24 h de vida, foram avaliados os sinais clínicos, as concentrações plasmáticas de substratos metabólicos, a bioquímica sanguínea, a hemogasometria e o hemograma. As características físicas, clínicas e comportamentais dos neonatos foram comparadas aos parâmetros fisiológicos, bioquímicos, metabólicos e moleculares avaliados ao parto e nas primeiras 24 h de vida para a determinação de alterações fisiológicas e inter-relações de significância biológica entre os grupos experimentais. Os neonatos bovinos derivados de FIV foram mais pesados e maiores ao nascimento, apresentando uma menor frequência respiratória e uma menor resposta termoregulatória que animais SOV, não havendo diferenças nos níveis de frutose, glicose e lactato entre os grupos. Não obstante, os parâmetros fisiológicos e metabólicos ao nascimento foram, em geral, amplamente similares e normais entre os grupos experimentais. Porém, ao longo das primeiras 24 h, os neonatos de FIV apresentaram características fisiológicas, metabólicas, bioquímicas, hemogasométricas, e hematológicas indicativas de uma maior dificuldade de adaptação à vida ex utero, em especial nas primeiras 4 a 6 h após de vida. As principais diferenças indicaram que animais maiores, em especial os de FIV, apresentaram maior dificuldade para a manutenção da normóxia, por uma hematose menos eficiente, mudanças metabólicas e uma elevação de substratos metabólicos (principalmente o lactato), e uma tendência à acidose com normalização compensatória do balanço ácido-base, principalmente nas primeiras 6 h de vida. O papel fisiológico e metabólico da frutose foi aparente, mas não conclusivo

nÃo hà / Neonatos internados em unidade de terapia intensiva neonatal (UTIN) sÃo expostos a uma grande variedade de medicamentos, a maioria sem dados de seguranÃa e eficÃcia. Descrever o perfil de uso de medicamentos em neonatos em UTIN de um hospital pÃblico no Brasil de acordo com dados de registro do medicamento e potencial nocivo destes, foi o objetivo do trabalho. Trata-se de um estudo descritivo retrospectivo sobre uso de medicamentos em UTIN, envolvendo neonatos internados por mais de 24 horas e dados de prescriÃÃo coletados em prontuÃrio eletrÃnico durante o perÃodo de janeiro a junho do ano de 2012. InformaÃÃes sobre os medicamentos, com base nas bulas, foram comparadas com o British National Formulary for Children 2012-2013 e a base de dados Thomson Micromedex. O potencial nocivo de medicamentos e excipientes foi avaliado conforme a literatura. Neonatos foram categorizados em grupos de idade gestacional (IG). Os dados foram submetidos à anÃlise descritiva e testes de distribuiÃÃo (ANOVA, Teste U de Mann-Whitney, Kruskal-Wallis, qui-quadrado de Pearson) por IG com o nÃvel de significÃncia de p < 0,05. IncluÃram-se 192 neonatos, a maioria prÃ-termo, com mediana de 33 semanas de IG, totalizando 3.617 neonatos-dia. Registraram-se 3.290 prescriÃÃes, mÃdia 17,1 prescriÃÃes/neonato (DP  17,9) e 8,8 medicamentos/neonato (DP  5,9), maiores em neonatos mais imaturos (p < 0,05). Anti-infecciosos de uso sistÃmico, medicamentos para o sangue e ÃrgÃos formadores do sangue, trato alimentar e metabolismo apresentaram maior utilizaÃÃo, variando conforme a IG. Neonatos apresentaram maior exposiÃÃo a gentamicina seguido por ampicilina, heparina e fitomenadiona. A maioria dos neonatos (99,5%) foi exposta a medicamentos nÃo licenciados (NL) e de uso nÃo padronizado (NP), mais frequentes em neonatos com IG < 28 semanas (p < 0,05). Mais de 70% dos RN estiveram expostos a algum medicamento potencialmente perigoso (MPP), com maior frequÃncia em neonatos com IG < 31 semanas (p < 0,05). Praticamente todos os neonatos estiveram expostos a excipientes nocivos (EN) e potencialmente nocivos, sendo maior o nÃmero de formulaÃÃes prescritas a neonatos mais imaturos. Metilparabeno, propilparabeno e polissorbato 80 foram os EN aos quais os neonatos estiveram mais expostos, principalmente nas formulaÃÃes de domperidona soluÃÃo oral, polivitamÃnicos soluÃÃo oral e fentanila soluÃÃo injetÃvel. Neonatos em UTIN no Brasil, tal como em outras realidades, estÃo expostos a uma variedade de medicamentos NL, NP e com potencial nocivo, uma situaÃÃo preocupante. Alternativas seguras e estudos sÃo necessÃrios sobre esse tema. / Neonates admitted to neonatal intensive care unit (NICU) are exposed to a wide variety of drugs most without data on safety and efficacy. To describe the drug use profile of neonates in NICU of a public hospital in Brazil according to the drugs records and harmful potential of drugs and pharmaceutical excipients. Descriptive and retrospective study of drug use in NICU, with neonate inpatients for over 24 hours and prescription data from electronic medical records over the period from January to June, 2012. Drug information found in the package leaflets were compared with information in the British National Formulary for Children 2012-2013 and in the Thomson Micromedex database. The drug and excipients harmful potential was evaluated according to the literature. Neonates were categorized into groups of gestational age (GA). The data were analyzed using descriptive analysis and Distribution tests tests (ANOVA Mann-Whitney U, Kruskal-Wallis and Pearson's chi-squared) by GA, with a significance level of p <0.05. Were included 192 neonates, most preterm with median 33 weeks of GA and a total of 3.617 neonates-day. Were registered 3,290 prescriptions, average 17.1 prescriptions/neonate (SD  17.9) and 8.8 drugs/neonate (SD  5.9), higher in most immature neonates (p < 0.05). The anti-infectives for systemic use, blood and blood forming organs, alimentary tract and metabolism drugs groups showed increased use among the neonates, varying according to the GA. Neonates had higher exposure to gentamicin followed by ampicillin, heparin and phytomenadione. Most neonates (99.5%) were exposed to unlicensed drugs (UL) and off label use (OL), more frequently those with GA < 28 weeks (p < 0.05). More than 70% of the neonates were exposed to any high-alert medications, with higher frequency among neonates with GA < 31 weeks (p < 0.05). Almost all neonates were exposed to harmful and potentially harmful excipients, being greater the number of formulations prescribed to more immature neonates. Gentamicin (sulfate) injectable Solution 10 mg/mL (1 mL), fentanyl solution injectable 0.05 mg/mL (10 mL) and sodium heparin injectable solution were the containing harmful excipients formulations to which neonates were most exposed. Neonates in Brazilian NICU, as in other settings, are exposed to a variety of OL, UL and potentially harmful drugs and harmful excipients, an alarming situation. Safety alternatives and more studies are needed on this topic.