Submitted by Claudia Rocha (claudia.rocha@udesc.br) on 2018-02-09T13:28:20Z No. of bitstreams: 1 PGCA15MA194.pdf: 586318 bytes, checksum: 3ad784366608195f04409160c5d88990 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-09T13:28:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA15MA194.pdf: 586318 bytes, checksum: 3ad784366608195f04409160c5d88990 (MD5) Previous issue date: 2015-12-10 / FUMDES / In order to investigate the prevalence of antibodies against N. caninum in beef cattle in the mountainous region of Santa Catarina, during the months of January 2013 to September 2015 were harvested 507 cattle blood samples from 16 of 18 counties affiliated with the Association of Municipalities of the Mountain Region (AMURES), for execution the Reaction of immunofluorescence (IFA) for the detection of antibodies (≥1:100) IgG against N. caninum. Data about sex, age and origin of the animals were obtained through the records in SISBOV (Brazilian Service of Production Chain Traceability of Cattle and Buffaloes), and were tabulated for statistical analysis (Exact Test Fisher and Chi-Square, P≤0.05) to correlate the serological results with the analyzed variables. The survey revealed that of the 507 samples tested, 70 were positive, which indicated a prevalence of 13.81%. The bonds were found 1:100 (16), 1:200 (22), 1:400 (17), 1:800 (nine), 1:1600 (four) and 1:3200 (two). Of the positive samples 32.86% (23/70) were males and 67.14 %% (47/70) female. Statistical analysis showed no significant difference regarding the variables gender (P=0.1072), age (P=0.4116) and county (P=0.6838). Correlation was observed (P<0.05) between serology and the gender and age when examined together. In 13 of the 16 municipalities at least one positive sample was observed and in all age groups assessed positive animals were identified. Although the seroprevalence observed in this study was relatively low, the infection by N. caninum in beef cattle is widespread in the region studied / Com o objetivo de pesquisar a prevalência de anticorpos contra N. caninum em bovinos de corte na Região Serrana de Santa Catarina, entre os meses de Janeiro de 2013 a Setembro de 2015 foram colhidas 507 amostras de sangue de bovinos, provenientes de 16 dos 18 municípios afiliados à Associação dos Municípios da Região Serrana (AMURES), para a realização da Reação da Imunofluorescência Indireta (RIFI) para a detecção de anticorpos (≥1:100) IgG contra N. caninum. Dados acerca do sexo, idade e procedência dos animais foram obtidos por meio dos registros no SISBOV (Serviço Brasileiro de Rastreabilidade da Cadeia Produtiva de Bovinos e Bubalinos), e foram tabulados para a análise estatística (Testes exato de Fisher e do Qui-Quadrado, P≤0,05) para correlacionar os resultados da sorologia com as varáveis analisadas. O exame revelou que das 507 amostras analisadas, 70 foram positivas, o que indicou uma prevalência de 13,81%. Os títulos encontrados foram de 1:100 (16), 1:200 (22), 1:400 (17), 1:800 (nove), 1:1600 (quatro) e 1:3200 (dois). Das amostras positivas 32,86% (23/70) foram de machos e 67,14%% (47/70) de fêmeas. A análise estatística não demonstrou diferença significativa com relação às variáveis sexo (P=0,1072), idade (P=0,4116) e município (P=0,6838). Foi observada correlação (P<0,05) entre a sorologia e as variáveis sexo e idade quando analisadas conjuntamente. Em 13 dos 16 municípios ao menos uma amostra positiva foi observada e em todas as faixas etárias avaliadas foram identificados animais positivos. Embora a soroprevalência observada no presente estudo foi relativamente baixa, a infecção por N. caninum em bovinos de corte está amplamente distribuída na região estudada

Submitted by Simone Souza (simonecgsouza@hotmail.com) on 2017-10-18T13:47:39Z No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Ricardo Vilas Boas.pdf: 6795713 bytes, checksum: 1ad10c8b43fdf390a1ec7efe5f9c145d (MD5) / Approved for entry into archive by Jordan (jordanbiblio@gmail.com) on 2017-11-07T15:53:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Ricardo Vilas Boas.pdf: 6795713 bytes, checksum: 1ad10c8b43fdf390a1ec7efe5f9c145d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-07T15:53:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Ricardo Vilas Boas.pdf: 6795713 bytes, checksum: 1ad10c8b43fdf390a1ec7efe5f9c145d (MD5) Previous issue date: 2014-02-28 / A neosporose é uma enfermidade parasitária considerada uma das principais causas de abortamento em bovinos em todo o mundo. Objetivou-se pesquisar a prevalência de anticorpos anti-Neospora caninum em fêmeas bovinas e possíveis fatores de risco para a infecção desses animais. Para isso, foram analisados 621 amostras de soro sanguíneo procedentes de 63 propriedades com rebanho leiteiro de agricultura familiar no município de Ji-Paraná, principal bacia leiteria do estado de Rondônia, as quais foram submetidas a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), sendo considerados bovinos positivos amostras com titulo 100 para N. caninum. Do total de amostras analisadas(66/621), encontrou-se uma prevalência de 10,61% (IC 95% 8,04-13,86%). Os títulos variaram de 100 a 1600, assim distribuídos: 22 (33,33%) amostras de soro apresentaram título de 100; 21 (31,82%) título de 200; 16 (24,24%) título de 400, três (4,55%) título de 800 e quatro (6,06%) amostras apresentaram título de 1600. A prevalência de anticorpos anti-N. caninum por propriedade foi de 60,31% (38/63), sendo que apenas as variáveis ocorrências de aborto e nascimento de bezerros fracos tiveram associação com a ocorrência de propriedades soropositivas para N. caninum. Conclui-se que as fêmeas bovinas leiteiras na região estão expostas à infecção por N. caninum e que a presença de determinados problemas reprodutivos, como aborto e nascimentos de bezerros fracos, estão associados à ocorrência de neosporose no rebanho da região. / The neosporosis is considered a parasitic disease leading cause of abortion in cattle worldwide. The aim of this study was to investigate the prevalence of antibodies anti- Neospora caninum of dairy cows and associate to possible risk factors infection. 621 serum samples taken from dairy cows on 63 familiar agriculture farms in the county of Ji-Paraná, in the main milk producing region of Rondônia, Brazil, were evaluated by means Immunofluorescence Assay (IFAT). Samples were considered positive with a titer 100. Among all the samples analyzed (66/621), the prevalence was 10.61% (IC 95% 8,04-13,86%). The titers of antibodies ranging between 100 and 1600, distributed as follows: 22 (33.33%) serum samples had titers of 100, 21 (31.82%) title 200; 16 (24.24%) title 400, three (4.55%) title 800 and of four (6.06%) samples had titers of 1600. The prevalence of anti-N. caninum in farms was 60.31% (38/63), It is concluded that the dairy cows in the area studied are exposed to infection by N. caninum and that the presence of reproductive problems, such as abortion, and weak calves born are associated with the occurrence of neosporosis in cattle in the county.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA10MA057.pdf: 284934 bytes, checksum: 412cd7a894dff7250bef856cd5965d43 (MD5) Previous issue date: 2010-07-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The neosporosis is a disease caused by protozoan Neospora caninum. Dogs, coyotes and dingos are definitive hosts and among livestock, the sheep is one of the intermediate host, wich may have mainly reproductive problems, and hence siginificant economic losses. Aiming to determine the prevalence of onfection by N. caninum in sheep in the city of Lages, Santa Catarina State, identify possible risk factors for infection in sheep and to correlate the prevalence of antibodies against N. caninum with risk factors assessed, blood was collected from 360 sheep on 13 farms. The samples, properly identified and packaged, were sent to the Laboratory of Parasitology and Parasitic Diseases of CAV/UDESC. The detection of LgG antibodies was performed by indirect fluorescent antibody test (IFAT). Sera were initially tested at 1:50 dilution and those positive were retested in serial dilutions of two basis until the maximum degree reactive. Information about the variables, age, sex, race, animal category, breeding system, diet, water source, contact with dogs and reproductive disorders were obtained through the application of questionnaires to the owners. The data were statiscally analyzed usinf Fisher s exact test and chi-square test (p&#8804;0.05).in 46.15% (6/13) of the farms had at least one positive animal. Variation of percentage of positive animals between properties was zero to 25.81%. positive reactions with titers &#8805; 1:50 were found in 21 sheep (5.83%). Titers ranged from 1:50 to 1:400, and five animals (23.81%) had a titer of 1:50; five (23.81%) at 1:100, six (28.57%) at 1:200 and five animals (23.81%) had a titer of 1:400. There were no association between positivity to N. caninum in sheep and the others variables. The results indicate that N. caninum is presente in siginificant percentages in sheep in the city of Lages, Santa Catarina State, Brazil / A neosporose é uma doença causada pelo protozoário Neospora caninum. Os cães, coiotes e dingos são hospedeiros definitivos e entre os animais de produção, a espécie ovina constituise em um dos hospedeiros intermediários, podendo apresentar principalmente problemas reprodutivos e, consequentemente, perdas econômicas significativas. Com os objetivos de determinar a prevalência da infecção por N. caninum em ovinos no município de Lages, Santa Catarina, identificar possíveis fatores de risco para a infecção nesses animais e correlacionar a prevalência de anticorpos contra N. caninum com os fatores de risco avaliados, foram realizadas coletas de sangue de 360 ovinos, em 13 propriedades rurais. As amostras, devidamente identificadas e acondicionadas, foram encaminhadas ao Laboratório de Parasitologia e Doenças Parasitárias do CAV/UDESC. A detecção de anticorpos da classe IgG foi realizada por meio da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI). Os soros foram testados inicialmente na diluição 1:50 e aqueles positivos foram reexaminados em diluições seriadas de base dois até a titulação máxima reativa. Dados referentes às variáveis, idade, sexo, raça, categoria animal, sistema de criação, dieta, fonte de água, contato com cães e transtornos reprodutivos foram obtidos por meio da aplicação de questionário aos proprietários. Os dados foram tabulados e analisados estatisticamente por meio dos testes exato de Fisher e de qui-quadrado (p&#8804;0,05). Em 46,15% (6/13) das propriedades havia ao menos um animal positivo. A variação de percentuais de animais positivos entre as propriedades foi de zero a 25,81%. Reações positivas com títulos &#8805; 1:50 foram encontradas em 21 ovinos (5,83%). Os títulos encontrados variaram de 1:50 a 1:400, sendo que cinco animais (23,81%) tiveram titulação de 1:50; cinco (23,81%) com 1:100; seis (28,57%) com 1:200 e cinco animais (23,81%) com titulação de 1:400. Não foi verificada associação entre positividade dos ovinos ao N. caninum e as variáveis analisadas. Os resultados indicam que N. caninum está presente em percentuais importantes nos ovinos do município de Lages, Santa Catarina, Brasil

Neospora caninum é um parasito intracelular obrigatório, formador de cistos, que acomete vários animais domésticos e silvestres, tendo maior importância nas espécies canina e bovina, nas quais causa problemas nervosos e reprodutivos. Os canídeos do gênero Canis são os únicos reconhecidos como hospedeiros definitivos do N. caninum até o momento, nos quais ocorre a fase sexuada de multiplicação, resultando na eliminação de oocistos pelas fezes. Toxoplasma gondii também é um coccídio responsável por uma das zoonoses de maior importância e ocorrência em todo o mundo. A fase assexuada de desenvolvimento do T. gondii ocorre nos mamíferos e aves (hospedeiros intermediários) com formação de cistos teciduais e a fase sexuada de desenvolvimento ocorre no intestino delgado dos hospedeiros definitivos, que são os membros da família Felidae. Este estudo teve por objetivo determinar a soroprevalência de anticorpos contra Neospora spp. e T. gondii em equídeos de diferentes regiões do Brasil e o isolamento e caracterização genética destes coccídios em amostras de tecidos de equídeos. A sorologia para T. gondii e Neospora spp. foi realizada em 453 amostras de soros por meio da Reação de Imunofluorescência Indireta com ponto de corte de 50 para Neospora spp e 64 para T. gondii. Deste total, oito (1,75%) amostras (sete de jumentos e um de cavalo) foram positivas para Neospora spp. e 129 (28,47%) amostras (82 jumentos, 32 cavalos e 15 mulas) para T. gondii. Para o isolamento do T. gondii foram realizados 29 bioensaios em camundongos, sendo 19 de animais soropositivos e 10 de pools de tecidos de cavalos soronegativos. Por meio dessa prova biológica, foi possível o isolamento em uma amostra de jumento (Equus asinus) de Mossoró, RN, ocorrendo a morte dos dois únicos camundongos infectados, no 16o e 17o dia pós-inoculação. A caracterização genotípica do isolado foi realizada pela PCR-RFLP utilizando 12 marcadores genotípicos. A genotipagem dessa amostra evidenciou o genótipo #60 TgCkBr220, já isolado em galinha do Arquipélago de Fernando de Noronha, PE, Brasil. O isolamento de Neospora spp em gerbilos não pode ser feito uma vez que não foi possível a obtenção de tecidos dos equídeos soropositivos. / Neospora caninum is an obligate intracellular parasite, forming cysts that affect many domestic and wild animals, having greater importance in canine and bovine species due neurological and reproductive problems. Canids of the genus Canis are recognized as the only definitive hosts of N. caninum until the moment in which sexual phase occurs multiplication, resulting in the elimination of oocysts in the feces. Toxoplasma gondii is also a coccidian parasite responsible for a zoonotic disease of great importance and occurrence around the world. The asexual developmental stage of T. gondii occurs in mammals and birds, the intermediate hosts, resulting in the formation of cysts and the sexual stage occurs in the small intestine of definitive hosts, which are the felids, occurring oocysts formation. This study aimed to determine the seroprevalence of antibodies against Neospora spp. and Toxoplasma gondii in equids from different regions of Brazil and the isolation and genetic characterization of these parasites from equids tissue. Serology for T. gondii and Neospora spp. was performed in 453 serum samples by Immunofluorescence Antibody Test (IFAT). Of this total, eight (1.75%) samples (seven of donkeys and one of horse) were positive to Neospora spp. antibodies and 129 (28.47%) samples (82 donkeys, 32 horses, 15 mules) were T. gondii seropositive. For the isolation of T. gondii, bioassay was performed in mice. A sample of one donkey (Equus asinus) from Mossoró, RN, was obtained with two of the 20 inoculated mouse infected. The mouse died at day 16th and 17th post inoculation. The genotypic characterization of the isolate was performed by PCR-RFLP using 12 genotypic markers. Genotyping showed the genotype #60 TgCkBr220, already described in chickens from Fernando de Noronha, PE, Brazil. Due the impossibility of acquisition of tissue from Neospora spp seropositive equids, isolation of this coccidian by gerbil bioassay was not possible to be done.

O Neospora caninum é um protozoário filogeneticamente relacionado a vários coccídeos de importância em medicina veterinária e humana, além de ser um parasita intracelular obrigatório capaz de causar abortamentos em bovinos e paralisia neuromuscular em cães. O estudo de antígenos e proteínas recombinantes de N. caninum gerou uma série de informações para um melhor diagnóstico e diferenciação deste protozoário e demais agentes a ele relacionados. No presente trabalho, propomos a expressão do clone do gene da proteína interna Nc56 de N. caninum em sistema procarioto (Escherichia coli), para avaliar sua antigenicidade frente a soros de bovinos imunoreativos contra Neospora caninum e Toxoplasma gondii. Para tanto, estabelecemos as condições ideais de expressão da proteína (indução por 4 horas e concentração de L-arabinose de 0,2%) e posteriormente avaliamos duas formas de purificação do produto recombinante (cromatografia de afinidade por metal imobilizado e eluição direta do gel de SDS-PAGE), constatando que a eluição de proteínas recombinantes diretamente do gel de SDS-PAGE mostrou-se o procedimento mais adequado para evitar a presença de proteínas contaminantes advindas do sistema procarioto de expressão. Foi selecionado um painel de soros bovinos (animais de campo), previamente testados pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI) para avaliar sua reatividade para Neospora caninum e Toxoplasma gondii. Utilizamos o soro de um bezerro macho da raça Holandesa recém-nascido, colhido antes da administração de colostro materno (mãe soronegativa pela RIFI-Nc e RIFI-Tg) como controle negativo. O controle positivo foi obtido do mesmo bezerro após inoculação experimental de taquizoítos viáveis de N. caninum, quando este animal já apresentava seis meses de idade. O ELISA indireto foi realizado com microplacas de poliestireno com 96 cavidades de fundo chato sensibilizadas com 10 &mu;g/mL de proteína recombinante purificada Nc56 e apresentou altas densidades ópticas tanto para soros bovinos positivos na RIFI para N. caninum quanto para T. gondii, quando comparadas com a densidade óptica do soro controle negativo. A proteína recombinante purificada e o extrato bruto de proteínas solúveis em tampão desnaturante foram submetidos ao teste de Western-blotting, para avaliação de antigenicidade frente a soros de animais positivos e negativos para N. caninum e T. gondii, previamente testados por RIFI. Os resultados apresentados nas duas técnicas (ELISA e Western-blotting) demonstram que a proteína recombinante purificada Nc56 de N. caninum possui reatividade cruzada entre os dois coccídeos, não se prestando, portanto, para uso em sorodiagnóstico da neosporose. / Neospora caninum, a protozoa phylogenetically related to other coccidea, is an obligatory intracellular parasite, able to cause abortions in bovine and neuromuscular paralysis in dogs. Researches with Neospora caninum antigens and recombinant proteins leads to numerous information to a better diagnosis and differentiation of several coccidea. The purposes of this study were expressing the Neospora caninum inner protein Nc56 in a prokaryotic system (Escherichia coli) and evaluate its antigenicity with i>Neospora caninum and Toxoplasma gondii positive bovine sera. It was established the ideal conditions to express the protein (4 hour induction and 0,2% L-arabinose concentration) and, after that, two protein purification systems were assayed (immobilized metal affinity chromatography and elution from polyacrylamide gel) resulting in a better protein recuperation the elution method. A panel of previous RIFI-tested bovine sera was selected to evaluate the immune reactivity of Nc56 protein with Neospora caninum and Toxoplasma gondii positive sera. The negative control was obtained from a Neospora caninum and Toxoplasma gondii negative newborn male bovine and the positive control was obtained from the same animal (6 month old), after the inoculation of live Neospora caninum tachyzoits. The indirect ELISA assay was performed in 96-wells microtiters plates, coated with purified Nc56 recombinant protein (10 µg/mL), resulting in higher optical densities for Neospora caninum and Toxoplasma gondii positive sera, when compared with negative control. The purified recombinant protein and the crude extract of soluble proteins in denaturing binding buffer were submitted to Western-blotting to evaluate its antigenicity with Neospora caninum and Toxoplasma gondii/i> positive sera. The results obtained in both techniques shown that Nc56 purified recombinant protein has cross reactivity between both coccidea, therefore, it is not indicated to be used as antigen in neosporosis serodiagnosis.

Neospora caninum e Hammondia heydorni são coccídeos formadores de cistos proximamente relacionados com outros organismos heteroxenos pertencentes ao filo Apicomplexa, como Toxoplasma gondii e Hammondia hammondi. Para saber se o cachorro-do-mato (Cerdocyon thous), um canídeo silvestre comumente encontrado do nordeste da Argentina ao nordeste da América do Sul, pode ser hospedeiro definitivo de N. caninum, exemplares de cachorro-do-mato foram alimentados com tecidos de bovinos e bubalinos naturalmente infectados por N. caninum. As fezes dos cachorros-do-mato foram colhidas e examinadas diariamente para pesquisa de oocistos. No primeiro experimento, masseter e cérebro (peça inteira dos dois órgãos) colhidos de dois bovinos de aproximadamente dois anos de idade, foram picados, misturados e fornecidos às quatro raposas em dois dias consecutivos. Duas raposas eliminaram oocistos sub-esféricos não esporulados medindo 10-13µm no oitavo e nono dias pós-infecção, respectivamente. Uma das raposas eliminou oocistos por cinco e a outra nove dias. Amostras de DNA extraída dos de oocistos de cada dia de eliminação foram analisadas por PCR com primers grupo-específicos PCR-ITS-1 e espécie-especificos Nc5-NPCR. Todas as amostras foram positivas por PCR-HSP-70 e PCR-ITS-1, mas negativas por Nc5-NPCR. A sequência de nucleotídeos PCR-ITS-1 revelou 100% de identidade com seqüências homólogas de H. Heydorni. Concluímos que H. heydorni também utiliza o cachorro-do-mato (Cerdocyon thous) como hospedeiro definitivo. O cachorro-do-mato é usualmente reportado em contato com rebanhos em diversas regiões do Brasil. Então, é razoável inferir que estes carnívoros possam exercer um importante papel nos ciclos silvestre e doméstico da infecção por H. heydorni. Em um segundo experimento, sete exemplares de cachorro-do-mato (Cerdocyon thous) foram alimentados com tecidos de 3 búfalos (Bubalus bubalis) naturalmente infectados por N. caninum. As fezes das raposas foram analisadas 30 dias antes e trinta depois da infecção experimental e nenhuma das raposas eliminou oocistos N. caninum-like nas fezes. Estes resultados sugerem que o cachorro-do-mato (Cerdocyon thous) não é hospedeiro definitivo de N. caninum, entretanto estudos adicionais são necessários. / Neospora caninum and Hammondia heydorni are two cyst forming coccidians closely related to other apicomplexans, such as Toxoplasma gondii and Hammondia hammondi with a two host life-cycle. To clarify whether crab-eating fox (Cerdocyon thous), a wild carnivore commonly found from northern Argentina to northern South America, can be final hosts of N. caninum, foxes were fed on tissues of cows and water buffaloes naturally infected with N. caninum. Faeces were examined from 30 days before to 30 days after infection. In experiment 1, the whole masseter muscle and brain from two-year old bovines are collected, minced and pooled together for the fox infection. The bovine pooled tissues were equally administered for four fox, in two consecutive days. Two foxes shed unsporulated oocysts subspherical in shape measuring 10-13µm, after eight and nine days post-infection, respectively. One of the foxes eliminated oocysts for five days, while the other fox shed oocysts for nine days. A DNA sample of oocysts detected at each day of oocyst elimination was tested by a PCR carried out employing primers directed to the common toxoplasmatiid 18S and 5.8S coding genes (PCR-ITS-1). These samples were also submitted to a N. caninum specific gene (Nc-5nPCR). All of them were positive by PCR-ITS-1 and negative by Nc-5nPCR. The PCR-ITS-1 nucleotide sequence revealed 100% identity with homologous sequences of H. heydorni. In conclusion, it is clear that H. heydorni also uses the crab-eating fox as a definitive host. The crab-eating fox is usually reported to live in close contact with livestock in several regions of Brazil. Therefore it is reasonable to infer that such carnivores may play an important role in the sylvatic and domestic cycles of H. heydorni infection. In experiment 2, seven fox consumed tissues from three N. caninum naturally infected water buffaloes. Feaces were examined from 30 days before to 30 days after infection and none fox shed N. caninum-like oocysts. These results suggest that the crab-eating fox cannot be definitive host of N. caninum; however additional studies will be necessary.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:31:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_francine_sinnott.pdf: 966836 bytes, checksum: 31b75fbc3400564832438403aff0c6e0 (MD5) Previous issue date: 2014-02-25 / Neosporosis is a disease caused by the obligate intracellular parasite Neospora caninum, causing reproductive disorders, such abortions and sltillbirths in several animals, being considered a major cause of abortion in cattle worldwide. The serological standard diagnosis is indirect fluorescent-antibody test (IFAT), but due to morphological and antigenic similarities of N. caninum with other protozoa of the phylum Apicomplexa, such as Toxoplasma gondii and Sarcocystis spp., false positive results may occur. To improve the diagnosis of this disease and reduce cross-reactions with other coccidian, the use of specific recombinant proteins of N. caninum has been described. The Nc-p43 surface protein encoded by the gene NcSRS2 is specific of the parasite and is present in tachyzoites and bradyzoites of N. caninum. Indirect ELISA format assays have been developed for the diagnosis of neosporosis, however the blocking ELISA may present additional level of specificity. In this context, the objective of this study was develop and standardize a blocking ELISA (b-ELISA) for the diagnosis of bovine neosporosis. To this end, NcSRS2 gene, previously cloned into plasmid vector, was used to produce the recombinant protein (rNc-p43) in prokaryotic expression system Escherichia coli. The purified protein was used to produce a polyclonal antibody (pAb/rNc-p43) in rabbit and this was further purified and characterized by indirect ELISA. For the development of the b-ELISA were used a total of 152 cattle sera (71 negative and 81 positive) and 10 positive cattle sera for toxoplasmosis, all previously confirmed by IFI. As controls, a pool of all positive sera and a pool of all negative sera were used, in addition to a normal calf serum, confirmed by IFAT, used with negative reference sera. The percent inhibition for each sample was determined by comparing the optical density (OD) mean of test sera to the OD mean of negative reference sera. The cut-off value was determined as the percent inhibition of negative pool. The results suggest that the b-ELISA is a tool that can be used for diagnosis of bovine neosporosis, with a sensitivity of 98.7% and specificity of 88.7% when compared with the IFAT. Antibodies against T. gondii present in positive samples for toxoplasmosis were not able to recognize the rNc-p43. The b-ELISA showed that serum samples positive for N. caninum is able to prevent the binding of pAb/rNc-p43, enabling detect different class of antibodies in a single assay. This technique is / Neosporose é a doença causada pelo parasito intracelular obrigatório Neospora caninum, causando problemas reprodutivos, como abortos e mortalidade neonatal em diversos animais, sendo considerada uma das principais causas de abortos em bovinos em todo o mundo. O diagnóstico sorológico padrão é a imunofluorescência indireta (IFI), porém devido a semelhanças morfológicas e antigênicas de N. caninum com outros protozoários do filo Apicomplexa, como Toxoplasma gondii e Sarcocystis spp., pode ocorrer resultados falsos positivos. Para melhorar o diagnóstico desta parasitose e diminuir as reações cruzadas com outros coccídeos, à utilização de proteínas recombinantes específicas de N. caninum vem sendo descrita. A proteína de superfície Nc-p43 codificada pelo gene NcSRS2 é específica do parasito e está presente em taquizoítos e bradizoítos de N. caninum. Ensaios no formato ELISA indireto vêm sendo desenvolvidos para o diagnóstico da neosporose, no entanto os ELISAs de bloqueio podem apresentar nível adicional de especificidade. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver e padronizar um ELISA no formato bloqueio (b-ELISA) para o diagnóstico da neosporose bovina. Para tal, o gene NcSRS2, previamente clonado em vetor plasmidial, foi utilizado para produzir a proteína recombinante (rNc-p43) em sistema de expressão procarioto Escherichia coli. A proteína purificada foi utilizada para produzir um anticorpo policlonal (pAb/rNc-p43) em coelho e este foi posteriormente purificado e caracterizado através de ELISA indireto. Para o desenvolvimento do b-ELISA foram utilizados um total de 152 soros bovinos (71 negativos e 81 positivos) e 10 soros bovinos positivos para toxoplasmose, todos previamente confirmados por IFI. Como controles, um pool de todos os soros positivos e um pool de todos os soros negativos foi utilizado, além de um soro normal de terneiro, confirmado através de IFI, utilizado como controle negativo referencial. O percentual de inibição de cada amostra foi determinado pela comparação da média da densidade óptica (DO) de cada soro teste com a média da DO do controle negativo referencial. O ponto de corte foi determinado pelo percentual de inibição do pool negativo. Os resultados obtidos sugerem que o b-ELISA é uma ferramenta que pode ser utilizada no diagnóstico da neosporose bovina, com sensibilidade de 98.7% e especificidade de 88.7%, quando comparado com a IFI. Os anticorpos contra T. gondii presentes nas amostras positivas para toxoplasmose não foram capazes de reconhecer a rNc-p43. O b-ELISA demonstrou que as amostras de soros positivas para N. caninum são capazes de impedir a ligação do pAb/rNc-p43, possibilitando a detecção de diferentes classes de anticorpos em um único ensaio. Esta técnica pode ser uma alternativa de triagem para a detecção de anticorpos contra N. caninum em populações de bovinos.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:31:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_diene_de_borba_pacheco.pdf: 1130271 bytes, checksum: e77a03d669b55e89749bb0d6922531eb (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 / Neosporosis is a disease caused by the apicomplexan parasite Neospora caninum, which is closely related to Toxoplasma gondii. N. caninum infection represents an important cause of reproductive failure in sheep, goats, horses, and cattle worldwide. The diagnosis of neosporosis is based on the detection of pathogen-specific antibodies in animal sera or the presence of tissue cysts. However, morphological similarities and serological cross-reactivity between N. caninum and T. gondii can result in the misdiagnosis. In this study, the N. caninum tachyzoite surface protein Ncp-43 was expressed in a recombinant form to elicit polyclonal antibodies (pAb) response. The pAb was purified and conjugated to horseradish peroxidase (HRP) or fluorescein isothiocyanate (FITC) to detect the recombinant and native Ncp-43 proteins, respectively. The pAb and pAb/HRP were able to recognize rNcp-43 by Dot blot and ELISA, and pAb/FITC immunolabeled the apical complex of tachyzoites. A blocking enzyme-linked immunosorbent assay (b-ELISA) was performed to evaluate pAb/HRP as a diagnostic tool. The mean percent inhibition for the positive and negative serum samples from cattle with neosporosis was significantly different (P < 0.0001). These results suggest that the pAb may bind to the same epitopes of Ncp-43 as anti-N. caninum antibodies in the positive samples tested. The b-ELISA using the pAb/HRP can facilitate diagnostic testing for neosporosis, since fewer steps are involved and cross-reactivity with secondary antibodies is avoided. In summary, this report describes the production of antibodies against N. caninum, and evaluates the potential of these tools for the development of new diagnostic tests for neosporosis. / Neosporose é a doença causada pelo parasito apicomplexa Neospora caninum, o qual é intimamente relacionado a Toxoplasma gondii. A infecção por N. caninum representa uma importante causa de falha reprodutiva em ovinos, caprinos, equinos e bovinos ao redor do mundo. O diagnóstico da neosporose é baseado na detecção de anticorpos específicos contra o patógeno em soros, ou a presença de cistos teciduais em animais. No entanto, as semelhanças morfológicas e a possível reatividade sorológica cruzada entre N. caninum e T. gondii pode resultar no diagnóstico errôneo. Neste estudo, a proteína de superfície Ncp-43 de taquizoítos de N. caninum, foi expressa de forma recombinante em Escherichia coli e utilizada para produção de anticorpos policlonais (pAb). O pAb foi purificado e conjugado a peroxidase (HRP) e isotiocianato de fluoresceína (FITC) para detectar as proteínas recombinantes e nativas Ncp-43, respectivamente. pAb e pAb/HRP foram capazes de reconhecer rNcp-43, o que foi avaliado pelas técnicas de Dot blot e ELISA enquanto pAb/FITC se mostrou eficiente na imunomarcação do complexo apical de taquizoítos. Um ensaio imunoenzimático de bloqueio (b-ELISA) foi realizado para avaliar a performance do pAb/HRP como ferramenta de diagnóstico. A porcentagem de inibição média para as amostras de pool de soros positivos e o pool de negativos de bovinos com neosporose foi significativamente diferente (P <0,0001). Estes resultados sugerem que o pAb pode ligar-se aos mesmos epítopos da Ncp-43 que os anticorpos anti-N. caninum de amostras positivas testadas. O b-ELISA utilizando o pAb/HRP representa uma opção interessante aos testes de diagnóstico disponíveis para a neosporose, uma vez que menos passos estão envolvidos na sua realização e seu formato evita a reatividade cruzada com anticorpos anti-espécie específicos. Em resumo, este trabalho descreve a produção de anticorpos contra N. caninum, e avalia o potencial dessas ferramentas para o desenvolvimento de novos testes diagnósticos para neosporose.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_alceu_santos_junior.pdf: 1787319 bytes, checksum: 33ba7f2289b9ac4a868e567f7462444a (MD5) Previous issue date: 2013-02-22 / The intracellular protozoan Neospora caninum, is considered the main causative agent of abortion in cattle. Infection occurs by ingestion of sporulated oocysts in the environment, first occurs systemic parasitemy characterizing acute phase of infection and subsequent chronic phase with formation of tissue cysts, thus persisting the infected and the asymptomatic host. Diagnosis is made by serologic tests. Currently, there are no data to ensure the effectiveness of commercial vaccine available for cattle. Apical complex antigens of the parasite are being studied, since they have an important role in infection. The rhoptries, secretory glands present in this region of the parasite N. caninum, play an important role in invasion and formation of parasitophago vacuoles, these properties have generated interest in its use in experimental vaccine formulations. Experimentally it showed partial results of protection in challenge, when fused to other proteins of this protozoan, the protection was increased, suggesting that antigens fusion is effective for protection against N. caninum. This work produced a new chimeric antigen, originated from the fusion of ROP² N. caninum with the B subunit of heat labile enterotoxin of Escherichia coli. The construction of the chimera was accomplished by cloning in sequence where ROP² gene was inserted directly into the N-terminus of LTB. The construction ROP²/LTB was expressed in E. coli strain BL 21 (DE3) StarTM where it presented a size of approximately 24kDa. The fusion antigen did not impair the antigenicity when tested against positive bovine serum by immunofluorescence, the Western blot technique, therefore, show great potential for use as a recombinant vaccine. / O protozoário intracelular Neospora caninum, é considerado principal agentes causadores de aborto em bovinos. A infecção ocorre pela ingestão de oocistos esporulados no ambiente, inicialmente ocorre parasitemia sistêmica caracterizando fase aguda da infecção e posteriormente fase crônica com formação de cistos teciduais, permanecendo assim o hospedeiro infectado e assintomático. O diagnóstico é feito através de provas sorológicas. Atualmente, não há dados que assegurem a eficácia da vacina comercial disponível para bovinos. Antígenos do complexo apical do parasito estão sendo estudados, pois apresentam papel importante na infecção. As roptrias, glândulas secretoras presente nesta região do parasito N. caninum, desempenham papel importante na invasão e formação do vacúolo parasitófago, essas propriedades produziram interesse na sua utilização em formulações de vacina experimentais. Experimentalmente apresentou resultados parciais de proteção ao desafio, quando fusionada a outras proteínas deste protozoário, aumentou a proteção, sugerindo que fusão de antígenos é eficiente para proteção contra N. caninum. O presente trabalho produziu um novo antígeno quimérico, originado da fusão entre ROP² de N. caninum com a subunidade B, da enterotoxina termolábil de Escherichia coli. A construção da quimera foi realizada por clonagem em sequência, onde gene ROP² foi inserido diretamente na porção N-terminal da LTB. A construção, ROP²/LTB, foi expressa em cepa E. coli BL 21 (DE3) StarTM onde apresentou tamanho de aproximadamente 24kDa. A fusão de antígeno não prejudicou a antigenicidade quando testado frente a soro bovino positivo por Imunofluorescência, na técnica de Western blot, portanto, apresentando grande potencial para ser utilizado como vacina recombinante.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_cintia_lidiane_guidoti_aguiar_cunha.pdf: 517290 bytes, checksum: 54cdb2ba4dc72f12759c702f6b1b7cda (MD5) Previous issue date: 2013-07-31 / Neospora caninum is an obligate intracellular protozoan, causes neosporosis and resembles formation by Toxoplasma gondii tissue cysts in their hosts. Humans are not considered intermediate hosts for N. caninum, but its zoonotic potential is questionable, because of the close phylogenetic relationship with T. gondii and the report of a study, which fetuses of nonhuman primates, Rhesus, (Macaca mulatta) infected artificially with lesions similar to those caused by congenital toxoplasmosis. The present study aimed to verify the occurrence of antibodies to N. caninum in humans and its possible association with HIV infection and other risk factors. The presence of antibodies to N. caninum was determined from a sample of 156 HIV-positive patients and 100 HIV-negative individuals of Pelotas, Rio Grande do Sul, Brazil, through the reaction of Indirect Immunofluorescence Assay (IFA), with initial dilution of 1:25. Antibody titers found by IFA ranged between 25 and 800. Samples of 256 human sera analyzed, 47 (18.3%) were positive for N. caninum. Since antibodies to this protozoan were found in 36 HIV-positive patients (23.1%) and in 11 HIV-negative individuals (11%). Multivariate analysis showed that HIV-positive patients who have CD4+ T-lymphocyte count ≤ 350 cells/mm3 have 2.4 times more likely to be seropositive for N. caninum. HIV-negative individuals who have seropositivity for T. gondii have 4.71 times more likely to have antibodies to the agent studied. The results indicate the exposure of humans to N. caninum, with higher prevalence in immunocompromised individuals. / Neospora caninum é um protozoário intracelular obrigatório, causador da neosporose e assemelha-se a Toxoplasma gondii pela formação de cistos teciduais em seus hospedeiros. Os humanos não são considerados hospedeiros intermediários para N. caninum, mas seu potencial zoonótico é discutível, em virtude da proximidade filogenética com T. gondii e do relato de um estudo, onde fetos de primatas não humanos, Rhesus, (Macaca mulatta) infectados artificialmente, apresentaram lesões semelhantes às causadas por toxoplasmose congênita. O presente estudo teve por objetivo verificar a ocorrência de anticorpos para N. caninum em humanos e sua possível associação com a infecção por HIV e outros fatores de risco. A ocorrência de anticorpos para N. caninum foi determinada a partir de uma amostra de 156 pacientes HIV-positivos e 100 de indivíduos HIV-negativos do município de Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil, por meio da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), com a diluição inicial de 1:25. Os títulos de anticorpos encontrados através da RIFI variaram entre 25 e 800. Das 256 amostras de soros humanos analisadas, 47 (18,3%) foram positivas para N. caninum. Sendo que anticorpos para esse coccídio foram encontrados em 36 pacientes HIV-positivos (23,1%) e em 11 indivíduos HIV-negativos (11%). A análise multivariada demonstrou que pacientes HIV-positivos que possuem contagem de linfócitos T-CD4+ ≤ 350 células/mm3 possuem 2,4 vezes mais chances de serem soropositivos para N. caninum. Indivíduos HIV-negativos que apresentam soropositividade para T. gondii possuem 4,71 vezes mais chances de apresentarem anticorpos para o agente estudado. Os resultados obtidos indicam a exposição de seres humanos a N. caninum, com prevalência mais elevada em indivíduos imunocomprometidos.