Foram colhidas, de março a junho de 2004, amostras de sangue de 108 carneiros e 920 matrizes de 32 propriedades comerciais de ovinos do Distrito Federal, totalizando 1028 amostras. Os soros foram submetidos à reação de imunofluorescência indireta (RIFI), utilizando-se as diluições 1:64 e 1:50 como ponto de corte para, respectivamente, T. gondii e N. caninum. A prevalência observada para T. gondii foi de 38,22% (26,81% < IC 0,95 < 49,62%). Os títulos variaram de 64 a 65536, e o título com maior freqüência foi 2048 (21,15%). Para N. caninum, a prevalência foi de 8,81% (7,08% < IC 0,95 < 10,53%), com títulos variando de 50 a 51200, sendo o título mais freqüente 50 (21,11%). Ovinos reagentes a ambos os parasitas corresponderam a 4,67%. A análise dos possíveis fatores de risco não foi possível, pois todas as propriedades possuíam ao menos um animal positivo para T. gondii e a maioria (87,50%) das propriedades foram positivas para N. caninum. A prevalência para T. gondii foi significativamente maior entre os machos que entre as fêmeas. Utilizando-se reação em cadeia pela polimerase e enzimas de restrição para o locus SAG2, em uma amostra de cérebro dentre 11 colhidas em um abatedouro da região foi identificado T. gondii tipo I. Os resultados demonstram que as infecções pelos dois parasitas estão presentes e disseminadas no rebanho ovino do Distrito Federal. / From March to June 2004, serum samples from 108 rams and 920 ewes were collected from 32 herds within Distrito Federal, Brazil. The samples were tested by Immunofluorescent Antibody Test, using sera diluted 1:64 and 1: 50 as cut-off values for the detection of antibodies against Toxoplasma gondii and Neospora caninum, respectively. The observed prevalence for T. gondii infection was 38.22% (26.81%<IC 0,95<49.62%). The titers encountered ranged from 64 to 65536, with the most prevalent titer being 2048 (21.15%). The observed prevalence for N. caninum infection was 8.81% (7.08%<IC 0,95<10,53%). The titers ranged from 50 to 51200, being 50 the most frequent titer value (21.11%). The reactant sera to both pathogens corresponded to 4.67% of the samples. The risk factors for T. gondii and N. caninum infections were not determined because of the absence of negative herds for T. gondii infection and the high proportion of herds positive for N. caninum infection (87.50%). The prevalence for T. gondii infection was significantly higher among males than in females. By using the polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism of locus SAG2 on 11 brain samples collected in a regional slaughterhouse, only one sample was positive and proved to be archetype I. The results show that infection by both parasites is widespread in the ovine population from Distrito Federal.

Neospora caninum é um protozoário parasita de grande importância em todo o mundo, sendo considerado a principal causa de abortamento bovino em algumas localidades. Enquanto a implicação deste parasita em distúrbios reprodutivos na espécie bovina seja conhecida, as informações disponíveis com a espécie bubalina são escassas. Este estudo avaliou e comparou as consequências da infecção experimental por N. caninum em búfalas e vacas, no estágio inicial da gestação, o de maior importância no que se refere à ocorrência de morte fetal. Protocolos de inseminação artificial em tempo fixo foram utilizados para maior controle da fecundação. Foram utilizados para inoculação dois isolados distintos, Nc-Bahia e Nc-1, possibilitando a comparação entre o isolado nacional e o isolado padrão. Todos os animais foram inoculados com 5 x 108 taquizoítos, pela via endovenosa, no 70º dia de gestação. Três búfalas e cinco vacas foram infectadas com o isolado Nc-Bahia, sendo detectado abortamento 42 dias pós-infecção (DPI) em somente uma das vacas inoculadas. Três búfalas e duas vacas foram inoculadas com o isolado Nc-1 e morte fetal foi detectada 35 DPI em todas as búfalas e vacas. Uma búfala e uma vaca permaneceram como controles negativos, sem infecção. A transmissão vertical foi verificada por semi-nested PCR nos animais infectados com Nc-Bahia e Nc-1. Diferentes graus de inflamação não-supurativa foram detectados em tecidos maternos, fetais e placentários. Todas as fêmeas inoculadas apresentaram resposta humoral frente à infecção. Embora a infecção estivesse mais disseminada pelo organismo das búfalas (p<0,05), a resposta humoral foi menor (p<0,05) e as lesões histológicas foram menos frequentes (p<0,05), indicando haver maior adaptação entre N. caninum e as búfalas, em comparação com os resultados obtidos nas vacas. O isolado Nc-Bahia foi menos patogênico que o Nc-1, por causar menos abortamentos (p<0,05) e menor frequência de lesões histológicas (p<0,05). A patogenicidade do agente na espécie bubalina foi confirmada, consideradas as lesões encontradas na análise histopatológica e a detecção da presença do agente por semi-nested PCR nos diversos tecidos estudados, além da positividade por imunoistoquímica em placenta e cérebro fetal bubalino. Esta é a primeira detecção de abortamento causado por N. caninum na espécie bubalina, em fêmeas infectadas experimentalmente com o protozoário, confirmando que problemas reprodutivos podem ser causados pelo N. caninum em búfalas. / Neospora caninum is a protozoan parasite with big importance all over the world, being considered the main cause of bovine abortion in some locations. While the implication of this parasite in bovine reproductive disorders is known, the available information within the buffalo species is scarce. This study evaluated and compared the consequences of experimental infection with N. caninum in buffaloes and cows on the initial stage of pregnancy, the most important regarding to the occurrence of fetal death. Protocols for fixed-time artificial insemination were used for greater control of fertilization. Two different isolates, Nc-Bahia and Nc-1, were utilized for inoculation, allowing the comparison between the national isolate and the standard isolate. All animals were inoculated with 5 x 108 tachyzoites, by endovenous route, at the 70th day of pregnancy. Three buffaloes and five cows were infected with the isolate Nc-Bahia and abortion was detected 42 days post-infection (DPI) in only one inoculated cow. Three buffaloes and two cows were inoculated with the isolate Nc-1 and fetal death was detected 35 DPI in all buffaloes and cows. A buffalo and a cow remained as negative controls, without infection. Vertical transmission was verified by semi-nested PCR in animals infected with Nc-Bahia and Nc-1. Different degrees of nonsuppurative inflamation were detected in maternal, foetal and placental tissues. All inoculated females showed humoral response against the infection. Although the infection was more disseminated withn the body of buffaloes (p <0.05), the humoral response was lower (p <0.05) and histological lesions were less frequent (p <0.05), indicating bigger adaptation between N. caninum and the buffaloes, in comparison with the results obtained in cows. Nc-Bahia isolate was less pathogenic than the Nc- 1, as it caused less abortions (p <0.05) and lower frequency of histological lesions (p<0.05). The pathogenicity of the agent in the bubaline species was confirmed, considering the lesions found on histopathology analysis and the detection of the agent´s presence by semi-nested PCR in the different studied tissues, in addition to the positivity by immunohistochemistry test in bubaline placenta and foetal brain. This is the first detection of abortion caused by N. caninum in buffalo species, in females experimentally infected with the protozoan, confirming that reproductive disorders can be caused by N. caninum in buffaloes.

Neospora caninum é um protozoário Apicomplexa, parasita intracelular obrigatório que possui o cão como hospedeiro definitivo e principalmente os bovinos como hospedeiros intermediários, causando nos primeiros encefalopatia e nos últimos abortos com perda da fertilidade, o que acarreta prejuízos significativos na pecuária mundial. O parasita necessita multiplicar de modo intra-celular, utilizando a descarga de proteínas contidas em organelas filo-específicas, como as micronemas que liberam proteínas relacionadas a adesão e invasão ativa, além das roptrias e os grânulos densos. Este trabalho foi realizado sobre um tipo de proteína micronêmica denominada proteína Anônima Relacionada à Trombospondina (TRAP), relacionada à adesão e ligação com o motor intracelular, responsável pelo processo ativo de invasão. TRAP 1 já havia sido descrita pela literatura e o objetivo deste trabalho foi a caracterização molecular do até então desconhecido homólogo TRAP 2, com expressão de suas formas recombinantes e o uso de seus respectivos anti-soros para ensaios funcionais e localização da proteína nativa. Com base em banco dados de ESTs e genômicos de N. caninum e fazendo uso de RLM-RACE (Reação mediada por RNA ligase- amplificação rápida dos términos de cDNA-RNA,) foi possível a obtenção da sequencia completa do gene NcTrap 2, que possui quatro éxons separados por três íntrons. Sua forma protéica, como seu homológo, é formado por um peptídeo sinal, uma integrina, cinco trombospondinas, uma região transmembrana e a cauda citoplasmática. A integrina e as trombospondinas são motivos relacionados à adesão para início do processo invasivo e foram os alvos deste trabalho. Foram expressos dois recombinantes a partir deste cerne funcional (integrina e trombospondinas), com 52 e 78 kDa, e seus respectivos anti-soros foram obtidos. Estes foram utilizados em western blots 1D e 2D para localização da forma nativa de NcTRAP 2 de aproximadamente 80 kDa no extrato total e de sua forma processada no ESA (extrato secretado, simulando o momento invasivo do taquizoíta) com 70 kDa. O soro contra o recombinante 1 teve a capacidade de inibir o processo invasivo em valores de 53 a 61%, dependendo do método utilizado (contagem manual ou real time PCR). NcTRAP 2 foi encontrada no complexo apical parasitário do taquizoíta por imunofluorêscencia confocal, evidenciando sua provável localização nas micronemas. A nova molécula, NcTRAP 2 possui características que a diferencia de NcTRAP 1 o suficiente para ser considerada homóloga. O soro contra sua forma recombinante detectou as formas nativas integral e secretada e demonstrou que NcTRAP 2 possui capacidade de inibir a invasão dos taquizoítas, o que a torna um interessante alvo vacinal. / Neospora caninum is an Apicomplexan protozoan, obligatory intracellular parasite that has the dog as definitive host and especially cattle as intermediate hosts, causing in the first ones encephalopathy and in the last ones abortion with fertility losses. Such facts lead to significant losses to livestock worldwide. The parasite must invade the cells for its development, using the discharge of proteins contained in phylum-specific organelles, like the micronemes proteins related with adhesion and active invasion, besides the proteins from rhoptries and dense granules. This work was performed on a type of micronemic protein, a thrombospondin-related anonymous protein (TRAP), related with adhesion and connection with the intracellular motor responsible for the active process of invasion. Based on the homologue previously described in the literature, TRAP 1, the aim of this study was the characterization of the undescribed TRAP 2 homologue, the expression of its recombinant forms, the use of its anti-sera for functional assays, and detection of its native form. Based on ESTs and genomic data from N. caninum, and using the RLM-RACE (ligase mediated rapid amplification of cDNA ends) technique, the complete sequence of NcTRAP 2 was obtained, which had four exons separated by three introns. As NcTRAP 1, the protein sequence is composed of a signal peptide, an integrin, five thrombospondin, a transmembrane region and a cytoplasmatic tail. The integrin and thrombospondin motifs are related to adhesion for initiation of the invasive process and were the targets of this work. We expressed two recombinant fragments from the functional core (thrombospondin and integrin), with 52 and 78 kDa, which were utilized for antisera production. The anti-sera localized the native form NcTRAP 2 which had approximately 80 kDa, and its processed form in ESA (Excreted/Secreted Antigen) with 70 kDa, both in western blot 1D and 2D. The serum against recombinant 1 had the ability to inhibit the invasive process from 53 to 61%, depending on the experimental method used (manual counting or real time PCR). NcTRAP 2 was localized at the apical complex of the parasite of the tachyzoites by confocal immunofluorescence, pointing towards its micronemal localization. The new molecule, NcTRAP 2, holds features that differentiates it from NcTRAP 1 in a substantial way to be considered homologue. The serum against the recombinant form detected the native full length and secreted forms of NcTRAP 2 and demonstrated that NcTRAP 2 has the ability to inhibit the invasion of tachyzoites, turning it into an interesting vaccine target to be investigated.

O protozoário intracelular Neospora caninum é um parasito importante em bovinos, nos quais pode causar abortamentos e infecção congênita. Os cães e alguns outros canídeos são os hospedeiros definitivos e vários pontos na cadeia epidemiológica ainda são pouco conhecidos. Esta tese tem por objetivos estudar aspectos da epidemiologia do N. caninum em bovinos leiteiros de rebanhos do Vale do Paraíba Paulista, São Paulo, Brasil. Para tanto um estudo prospectivo, com duração de dois anos e nove colheitas de sangue de todos os bovinos de três propriedades, foi realizado. Dados sobre: ocorrência de anticorpos anti- N .caninum, ocorrência e períodos de abortamentos, intervalo entre partos e número de serviços foram avaliados. Associação entre o estatus sorológico dos pares mães-filhas, bem como variação dos títulos de anticorpos durante a gestação em vacas positivas foi estudada. Um último estudo avaliou a permanência dos anticorpos anti-N. caninum, adquiridos passivamente através do colostro, em bezerros nascidos negativos. Os estudos permitiram concluir que a ocorrência de anticorpos anti-N. caninum variou entre os rebanhos e dentro de cada rebanho nas diferentes colheitas; resultados sorológicos transitórios, não caracterizando soroconversão, foram observados; altas taxas de transmissão vertical e baixas taxas de transmissão horizontal foram encontradas; risco relativo de abortamentos em vacas soropositivas em relação às negativas foi observado em algumas ocasiões; dentre os índices reprodutivos avaliados somente os abortamentos foram significativos; anticorpos colostrais foram detectados nos bezerros até a 21ª semana pós-nascimento e vacas gestantes apresentaram variação nos títulos de anticorpos, com mais altos níveis no 2º e 3º trimestre de gestação, sem associação com abortamentos. Este foi o primeiro estudo prospectivo sobre aspectos epidemiológicos do N. caninum em bovinos no Brasil / The intracellular protozoan parasite Neospora caninum is an important parasite in cattle, in which can cause miscarriages and congenital infection. Dogs and some other canids are the definitive hosts and various points in the epidemiology of this parasite are still obscure. This thesis aims to study aspects of the epidemiology of N. caninum in dairy cattle from herds in the Vale do Paraíba Paulista, São Paulo, Brazil. Therefore, a prospective study lasting two years and nine blood samples of all cattle from three farms was conducted and data from existence of anti-N. caninum antibodies in the herds, occurrence and periods of miscarriages, calving interval and number of services were assessed. Association between the serological status of the mother-daughter pairs, and variation in antibody titers during pregnancy in positive cows was studied. A final study evaluated the persistence of anti-N. caninum antibodies, passively acquired through colostrum, in calves born negative. The studies showed that the occurrence of anti-N. caninum antibodies ranged between herds and within herds in the different groups; transient serological results, not characterizing seroconversion, were observed; high vertical and low horizontal rates of transmission were found; relative risk of abortion in seropositive cows in relation to negative was observed in some occasions; among the reproductive indices evaluated only abortions were analised as significant; colostral antibodies were detected in calves until weeks 21 post-birth, and pregnant cows showed variation in antibody titers, with highest levels in the 2nd and 3rd trimester or the pregnancy and this found was not associated with miscarriages. This was the first prospective study on epidemiology of N. caninum in cattle in Brazil

Neospora caninum é um parasita Apicomplexa que causa doença neuromuscular em cães e abortamento em bovinos. Cães e coiotes são as únicas espécies reconhecidas como hospedeiros definitivos, nas quais ocorre a fase sexuada do ciclo evolutivo do N. caninum, com eliminação de oocistos através das fezes, os quais esporulam no ambiente e tornam-se infectantes. Apesar da importância dos oocistos como fonte de infecção para várias espécies de hospedeiros, a viabilidade e resistência desses oocistos a tratamentos físicos e químicos ainda são desconhecidas. Este estudo teve por objetivo avaliar a viabilidade de oocistos esporulados de N. caninum após tratamentos com diferentes desinfetantes, temperaturas e tempos de exposição. Três cães foram alimentados com tecido cerebral de búfalos soropositivos para anticorpos anti-N.caninum pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI 100) para a obtenção de oocistos. Desses, somente um cão eliminou oocistos tipo Neospora-Hammondia sendo confirmado serem de N. caninum por bioensaio em gerbilos e por métodos moleculares (PCR-RFLP). Os oocistos esporulados foram purificados e 11 alíquotas contendo aproximadamente 3000 oocistos por alíquota constituíram cada um dos tratamentos, sendo estes: Formol 10% por 1h; Amônia 10% por 1h; Álcool 70% por 1h; Álcool absoluto por 1h; Iodo 2% por 1h; Hipoclorito de sódio 10% por 1h; Temperatura ambiente, controle; -20ºC por 6h; 4ºC por 6h; 60ºC por 1m e 100ºC por 1m. Os tratamentos químicos foram todos realizados à temperatura ambiente. Após tratamento os oocistos foram divididos em alíquotas com 1000 oocistos cada e estas foram administradas, via oral, a gerbilos (1000 oocistos por gerbilo) sendo cada grupo experimental constituídos por três animais. Depois de 63 dias os gerbilos foram sacrificados e colheu-se sangue para a pesquisa de anticorpos anti-N. caninum (RIFI e western blotting) e tecidos para a pesquisa de cistos em esfregaço direto de cérebro e DNA do parasito (PCR em tempo real), além de pesquisa do agente por técnicas histopatológicas e imuno-histoquímica. Considerou-se eficaz o tratamento que confirmou a inviabilidade dos oocistos por resultados negativos em todas as cinco provas realizadas. Dos tratamentos realizados mostrou-se eficaz o uso de calor a 100ºC por 1 minuto e do hipoclorito de sódio a 10% por 1 hora, podendo ser estes indicados para o controle dessas formas no ambiente. / Neospora caninum is an Apicomplexan parasite that causes neuromuscular disorders in dogs and abortion in cattle. Dogs and coyotes are the only species identified as definitive hosts. The sexual phase of the N. caninum life cycle occurs within the host, and results in the shedding of oocysts in the feces that will sporulate in the environment and become infective. Despite their relevance as a source of infection for a number of different hosts, the resistance and viability of such oocysts to physical and chemical treatments are yet to be known. The purpose of this study was to assess the viability of N. caninum sporulated oocysts after exposure to treatments using different disinfectants, temperatures and periods of time. For acquisition of the oocysts, three dogs were fed brain tissue from buffaloes positive for antibodies to N. caninum by an indirect fluorescent antibody test (IFAT 100). Only one of the dogs excreted Neospora-Hammondia type oocysts. Such oocysts were confirmed to be N. caninum by bioassay in gerbils and molecular methods (PCR-RFLP). The sporulated oocysts were purified and 11 doses with approximately 3,000 oocysts each were treated as follows: 10% formaldehyde (formol) for 1 h; 10% ammonia for 1 h; 70% alcohol for 1 h; absolute alcohol for 1 h; 2% iodine for 1 h; 10% sodium hypochlorite for 1 h; Room temperature, control; -20ºC for 6 h; 4ºC for 6 h; 60ºC for 1 min, and 100ºC for 1 min. All chemical treatments were performed at room temperature. After treatment, the oocysts were divided into doses of 1,000 oocysts each and administered into three gerbils (Meriones unguiculatus) orally (1,000 oocysts per gerbil) per treatment. The gerbils were euthanized after 63 days. Blood samples were taken to be tested for the presence of N. caninum antibodies (IFAT and Western blotting analysis), and tissues samples to be tested for the presence of cysts by brain smear technique and detection of the parasite DNA (real-time PCR), and the identification of the parasite by immunohistochemical and histopathological examinations. In order to be considered an effective treatment, negative results should be observed in the gerbils of all five evaluations conducted. Out of the treatments carried out in this study, exposures to a temperature of 100ºC for 1 min and to a 10% sodium hypochlorite solution for 1 h were effective.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:31:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_gizele_lima_de_sa.pdf: 488608 bytes, checksum: fe16f7b595024fb9112b8c23f5da90ca (MD5) Previous issue date: 2012-02-14 / Neosporosis is considered a disease of worldwide distribution. It is caused by the apicomplexa protozoan Neospora caninum, responsible for neuromuscular disorders in dogs and abortions in bovines, which makes it an important pathogen in cattle breeding. The diagnosis of this disease can be accomplished by identifying the parasites by histological sections or by detection of specific antibodies. However, serological methods can be hampered by cross-reactivity with other apicomplexa parasites, such as Toxoplasma gondii. Parasite-specific antigens used for detection of antibodies or in the production of antiserum for the detection of tachyzoites can improve the specificity and sensitivity of diagnostic tests and studies of the biology of the parasite. Among specific antigens of Neospora genus, NcSRS2 (Nc-p43) which is an immunodominant surface protein stands out. It is present in tachyzoites as well as bradyzoites. In this study, Nc-p43 protein was produced in its recombinant form (rNcp43), by inserting the gene NcSRS2 in the cloning vector pET100/DTOPO, which was used to transform Escherichia coli BL21 Star. rNc-p43 protein was evaluated for reactivity with immune sera from naturally infected bovine, ovine and canine species, and used to immunize BALB/c mice for the production of a polyclonal antibody (pAb). rNc-p43 (pAb/rNc-p43) antibody was conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) and the reactivity with the native protein on the surface of the parasite was evaluated by immunofluorescence. rNc-p43 protein was recognized by anti N. caninum present in immune sera by ELISA and dot blot and it was able to generate antibodies against the p43 antigen. The pAb/rNc-p43 reacted with the rNc-p43 protein in indirect ELISA and Western blotting, detecting N. caninum tachyzoites in direct and indirect immunofluorescence, with a fluorescence pattern only in the apical complex of the parasite, maintaining affinity even after conjugation with FITC. pAb/rNc-p43 showed no cross-reactivity with T. gondii. The results of this study suggest that the rNc-p43 obtained and the pAb produced can be useful in developing diagnostic tests based on the detection of specific antibodies and the antigen present on the surface of the parasite. / A neosporose é considerada uma doença de distribuição mundial, causada pelo protozoário apicomplexa Neospora caninum, causador de desordens neuromusculares em cães e abortos em bovinos, o que o torna um patógeno de relevância na bovinocultura. O diagnóstico desta enfermidade pode ser realizado através da identificação do parasito em cortes histológicos ou pela detecção de anticorpos específicos. No entanto, os métodos sorológicos aplicados podem ser dificultados por reações cruzadas com outros parasitos apicomplexas, como Toxoplasma gondii. Antígenos específicos do parasito utilizados para detecção de anticorpos ou na produção de insumos biológicos para a detecção de taquizoítos podem melhorar a especificidade e a sensibilidade dos testes de diagnóstico e de estudos da biologia do parasito. Entre os antígenos específicos de Neospora, destaca-se a proteína de superfície imunodominante NcSRS2 (Nc-p43), presente tanto em taquizoítos quanto em bradizoítos. Neste estudo, a proteína Nc-p43 foi produzida em sua forma recombinante (rNc-p43), através da inserção do gene NcSRS2 no vetor de clonagem pET100/DTOPO, o qual foi utilizado para transformar a bactéria Escherichia coli BL21 Star. A proteína rNc-p43 foi avaliada quanto a reatividade com soros imunes de animais naturalmente infectados das espécies bovina, ovina e canina; e utilizada para imunizar camundongos da linhagem BALB/c para a produção de um anticorpo policlonal (pAb). O anticorpo anti rNc-p43 (pAb/rNc-p43) foi conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) e avaliado quanto a reação com a proteína nativa na superfície do parasito por imunofluorescência. A proteína rNc-p43 foi reconhecida por anticorpos anti N. caninum presente nos soros imunes, através de ELISA e Dot blot e foi capaz de gerar anticorpos contra o antígeno rNc-p43. O pAb/rNc-p43 reagiu com a proteína rNc-p43 em ELISA indireto e Western blotting, detectou taquizoítos de N. caninum em imunofluorescência indireta e direta, apresentando um padrão de fluorescência somente no complexo apical do parasito, mantendo sua afinidade mesmo após sua conjugação com FITC. O pAb/rNc-p43 não apresentou reação cruzada com T. gondii. Os resultados deste estudo sugerem que a rNc-p43 obtida e o pAb gerado podem ser úteis no desenvolvimento de testes de diagnóstico baseados na detecção de anticorpos específicos e do antígeno presente na superfície do parasito.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:31:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_nilton_cunha_filho.pdf: 562698 bytes, checksum: 8ecca8a95ee4af63a3925be6db47b247 (MD5) Previous issue date: 2007-06-29 / Neospora caninum is a protozoan parasite that causes neurological problems in dogs. It has been shown that it may act as definitive hosts of the parasite. There is a need for more information on the occurrences of N. caninum in due to the wide range of its incidence in several Brazilian states, and the lack of animals diagnosed serum positive in Rio Grande do Sul. Rural dogs from (meat and dairy producers) and urban areas from the city of Pelotas were examined. Serum samples of 339 dogs were tested for the detection of antibodies against N. caninum by indirect immunofluorescence (RIFI ≥1:50). Antibodies for N. caninum were found in 53 (15,6%) of the dogs serum samples. The occurrence in the urban area was 5,5%, among the rural dogs 14,1% (18 dogs) belonged to dairy and 28,4% (29 dogs) from cattle farms. Dogs over three years old present the higher levels of serum positively and its presence increased with age. The dogs antibody titers were 1:50 (12 dogs), 1:100 (07 dogs), 1:200 (08 dogs), 1:400 (19 dogs), 1:800 (05 dogs) and 1:1600 (02 dogs). None of the dogs examined presented clinical signs of neosporosis when the blood was collected. The study of the variables (risk factors for N. caninum) in the logistic regression between the rural and urban environment has shown that older animals are 3,75 times more likely to get infected by the N. caninum then the younger ones. Also in farms where the carcasses of dead animals are not removed there is a risk 2,67 times greater (IC 95% = 1,31 5,42) of a N. caninum infection. In the rural environment, dogs from cattle raising farms have a chance 2,24 times greater of being infected by N. caninum then dogs from dairy farms. In addition, the risk of having serum positive dogs in farms where the carcasses are not removed was more significant (OR = 6,11 IC 95% = 1,00 37,17). The data suggest that Neospora caninum is present in the southern region of Rio Grande do Sul and afflicts both rural and urban dogs. The probability of serum positive dogs in the rural area is grater, possibly by the easy access they have to infected material and the canine/bovine contact, which is characteristic of the cattle raising in the region. The main form of infection by N. caninum among the dogs studied is the horizontal (post natal), suggested by the fact that serum prevalence increase with the age. / Neospora caninum é um protozoário parasito que causa problemas neurológicos em cães. Foi demonstrado que os cães podem atuar como hospedeiros definitivos do parasito. Devido às diferenças entre as ocorrências e prevalências de N. caninum nos diversos estados brasileiros, e a falta de diagnóstico de animais soropositivos no Rio Grande do Sul, revelam a necessidade de maiores informações a respeito de ocorrências do N. caninum em cães no sul do Rio Grande do Sul. Cães provenientes do Município de Pelotas, de diferentes ambientes, rural (corte e leite) e urbanos domiciliados foram examinados. Amostras de soro de 339 cães foram testadas para a detecção de anticorpos para N. caninum mediante a reação de imunofluorescência indireta (RIFI ≥1: 50). Anticorpos para N. caninum foram encontrados em 53 (15,6%) amostras de soro dos cães. Na área urbana a ocorrência foi de 5,5%, entre os cães rurais, 14,1% (18 cães) eram de propriedades de criação de gado de leite e 28,4% (29 cães) de propriedade de corte. Foi observado que cães acima de três anos de idade são mais soropositivos para N. caninum e a soropositividade dos cães aumentou conforme aumentou a idade. Os títulos de anticorpos dos cães foram 1:50 (12 cães), 1:100 (07 cães), 1:200 (08 cães), 1:400 (19 cães), 1:800 (05 cães) e 1:1600 (02 cães). Nenhum dos cães examinados apresentou sinais clínicos de neosporose no momento da coleta de sangue. O estudo das variáveis (fatores de risco para N. caninum) na regressão logística feita entre o ambiente urbano e rural demonstrou que nos ambientes estudados, animais mais velhos tem 3,75 vezes mais chances de se infectarem com N. caninum do que animais jovens, até três anos de idade. Em propriedades que os proprietários não recolhem carcaças de animais mortos do campo representou um risco 2,67 vezes maior (IC 95% = 1,31- 5,42) de infecção por N. caninum. Quando analisou-se em separado o ambiente rural (leite e corte) observou-se que, cães provenientes de propriedades de criação de gado de corte tem 2,24 vezes mais chance de serem infectados por N. caninum do que cães de propriedades de produção leiteira, e o risco de cães serem soropositivos em propriedades onde os proprietários não tem o hábito de recolher carcaças de animais mortos do campo foi maior (Odds Ratio = 6,11 IC 95% = 1,00- 37,17). Os dados sugerem que Neospora caninum está presente na região sul do Rio Grande do Sul, infectando cães urbanos domiciliados e rurais (leite e corte). A probabilidade de cães da área rural da região serem soropositivos para N. caninum é maior neste ambiente, provavelmente pelo fácil acesso destes animais a material infectado e ao grande contato cão/bovino, característico da bovinocultura da região. A principal forma de infecção por N. caninum entre os cães analisados é a horizontal (pós-natal), uma vez que a soroprevalência aumenta conforme aumenta a faixa etária.

Neospora caninum é um protozoário Apicomplexa, parasita intracelular obrigatório que possui o cão e outros canídeos como hospedeiros definitivos e os bovinos como principais hospedeiros intermediários. Causa nos primeiros encefalopatia e nos últimos abortos com perda da fertilidade, gerando prejuízos significativos na pecuária mundial. Como Toxoplasma gondii e Plasmodium, N. caninum possui um sistema específico de secreção que permite a invasão ativa do parasita na célula hospedeira, formação do vacúolo parasitóforo e replicação. Devido ao seu ciclo intracelular, várias estratégias foram desenvolvidas para caracterizar o processo de invasão no filo, como deleção ou controle da expressão de genes envolvidos. Entre os genes com papel importante no processo invasivo, NcMic2-like1 possui destaque já que o soro contra essa proteína recombinante inibiu 60% da invasão de N. caninum in-vitro. Essa proteína micronêmica possui domínios adesivos (uma integrina e seis trombospondinas) que atuam na ligação entre os receptores da célula hospedeira e o motor de actina e miosina do parasita, possibilitando a invasão ativa. O objetivo central do trabalho foi o desenvolvimento de ferramentas genéticas para a deleção e hiperexpressão de NcMic2-like1 e outras proteínas em N. caninum para a compreensão profunda desse mecanismo, além da caracterização, localização e expressão de NcMic2-like1. Para isso dois modelos baseados na resistência a drogas e integração ao genoma do parasita foram construídos. Um se baseia na resistência contra cloranfenicol (pelo gene Cloranfenicol Acetil Transferase - CAT) e o outro contra pirimetamina (pela mutação da Diidrofolato Redutase-Timidilato Sintase - DHFRM2M3). As sequências que conferem resistência foram ligadas ao promotor e região 3\' UTR de três genes de N. caninum, NcSAG1 (ou SAG1-like); NcDHFR ou NcHXGPRT conferindo resistência às drogas após transfecção. A esses vetores de resistência foram ligadas duas sequências do controle de expressão por tetraciclina, o sistema TetR/tetO. Adaptando o sistema de T. gondii para N. caninum, TetR foi expresso sob controle do promotor RPS13 ou Tubulina de N. caninum e tetO controlou a expressão de Lac-Z (?-galactosidase), ii uma enzima repórter. TetR e tetO foram transfectados de modo estável utilizando os vetores CAT e DHFRM2M3. O sistema foi responsivo à adição de tetraciclina, além de indicar um meio provavelmente independente de TetR quando apenas tetO foi avaliado em N. caninum. Foi possível expressar Lac-Z em N. caninum, possibilitando o desenvolvimento e padronização de ensaios de invasão, crescimento e detecção do taquizoíta. Também foi realizada a detecção de YFP (proteína amarelo fluorescente) nos taquizoítas transfectados com YFP fundida em TetR. Essas ferramentas de inserção e deleção de genes possibilitaram a construção de vetores para a hiper expressão ou deleção de NcMic2-like1. Para hiper expressão o vetor foi obtido pela substituição de Lac-Z pelo gene NcMic2-like1. Para deleção de NcMic2-like1 o vetor foi desenvolvido pela ligação do seu promotor e região 3\' UTR ä CAT ou NcDHFRM2M3, que promove a substituição do gene alvo pelos de resistência por recombinação homóloga. Adicionalmente foram desenvolvidas formas para a expressão e purificação de proteínas em N. caninum. Também foi obtida a solubilização de NcMIC2-like1 recombinante pelo sistema pET28 após a adição de uma cauda solúvel amplificada do genoma de N. caninum. O desenvolvimento de métodos de manipulação genética é um fato inédito para N. caninum e possibilitará estudos moleculares mais profundos sobre os mecanismos de invasão e replicação, onde NcMic2-like1 aparece como primeira candidata para esses ensaios. / The Apicomplexa protozoan Neospora caninum is an obligate and intracellular parasite that has the dog and other canides as definitive host and especially cattle as intermediate hosts. It causes respectively encephalopathy. abortions and loss of fertility causing deep economic impact at the world livestock. As Plasmodium and Toxoplasma gondii, N. caninum has a specific system of active secretion, which allows the invasion of the parasite into the host cell, the establishment of parasitophorous vacuole and replication. Due to the intracellular cycle of parasite, several strategies have been developed to characterize the invasion process of the phylum, such as deletion or control of expression of related genes. Among the genes with an important role in the invasive process, NcMic2-like1 stands out, once the serum against the recombinant form inhibited the in vitro invasion of N. caninum up to 69%. This microneme protein has adhesive domains (one integrin and six thrombospondins) acting between the host cell receptors and the actin/myosin motor of the parasite, allowing the active invasion. The main aim of this work was the development of genetic tools for deletion and overexpression of NcMic2-like1 and other proteins in N. caninum for a deep understanding of this mechanism, in addition to the characterization, localization and expression of NcMic2-like1. Therefore two models based on the drug resistance and integration into the genome of the parasite were constructed. One was based on the resistance against chloramphenicol (chloramphenicol acetyl transferase gene by - CAT) and the other against pyrimethamine (by mutation of dihydrofolate reductase-thymidylate synthase - DHFRM2M3). The sequences that confer these two drug resistance patterns have been ligated to the promoter and the 3\' UTR region of three genes from N. caninum, NcSAG1 (or SAG1-like); NcDHFR or NcHXGPRT, conferring resistance to the drugs after transfection. These vectors were ligated to two sequences that confer resistance controlled by tetracycline, the TetR / tetO system. The T. gondii system was adapted for N. caninum. TetR was expressed under the control of N. caninum tubulin promoter and tetO controlled the expression of Lac-Z (?-galactosidase), a reporter enzyme. TetR and tetO were stably inserted in N. caninum after transfection iv with the vectors based on CAT and DHFRM2M3.The system was responsive following tetracycline presence, in addition to a TetR independent mechanism in N. caninum . Moreover, it was possible to express Lac-Z in N. caninum enabling the development and standardization of invasion, growth and detection tachyzoite assays. It was also possible to detect through fluorescence microscopy the YFP (yellow fluorescent protein) in tachyzoites transfected with YFP fused to TetR.. The tools for gene insertion and deletion allowed the construction of vectors for hiperexpression or deletion of NcMic2-like1. For hiperexpression the vector was obtained by the replacement of the Lac-Z by the NcMic2-like1 gene. For the NcMic2-like1 deletion the vector was achieved after the ligation of its promoter and 3 \'UTR region to CAT or NcDHFRM2M3. This approach leads to the replacement of the target gene by the resistance gene through homologous recombination. Furthermore approaches for expression and purification of proteins in N. caninum were developed. Also, a soluble recombinant NcMIC2-like1 form was obtained with pET28 system added with a soluble tail amplified from a genome region of N. caninum. The development of genetic manipulation methods is an unprecedented event for N. caninum and will enable deeper molecular studies over mechanisms of invasion and replication, where NcMic2-like1 is the first candidate for these assays.

O objetivo deste estudo foi infectar experimentalmente cães com oocistos esporulados de N. caninum, via oral e avaliar a ocorrência ou não da infecção. Os oocistos utilizados como inóculo foram obtidos através de bioensaio em cães, usando cérebro de búfalos soropositivos para anticorpos anti-N. caninum. Os oocistos obtidos foram confirmados ser de N. caninum por métodos moleculares e por bioensaio em gerbilos. Oocistos esporulados, com no máximo 90 dias, foram utilizados na infecção de quatro cães, com oito semanas de vida e negativos para anticorpos anti-N. caninum e Toxoplasma gondii. Os cães 1 e 4 receberam um inóculo com 10.000 oocistos esporulados cada um; o cão 2 um inóculo com 5.000 oocistos esporulados e o cão 3 recebeu 1.000 oocistos esporulados de N. caninum. O total de fezes foi coletado e examinado diariamente durante um período de 30 dias. Nenhum oocisto foi encontrado nas fezes desses animais. Durante seis meses os cães foram acompanhados para observar uma possível soroconversão e quando esta ocorria os animais eram eliminados do experimento. / The objective of this study was to evaluate the acquisition of infection in dogs experimentally infected with sporulated oocysts. The oocysts used as inoculum were obtained by bioassay in dogs using brain of buffaloes positive for anti-N. caninum antibodies. The oocysts were confirmed to be N. caninum by molecular methods and by bioassay in gerbils. Sporulated oocysts with a maximum of 90 days were used in the infection of four dogs. The dogs were eight weeks old and were negative for anti-N. caninum and Toxoplasma gondii antibodies. Dogs 1 and 4 received an inoculum of 10,000 sporulated oocysts each, dog 2 an inoculum with 5,000 sporulated oocysts and dog 3 received 1,000 sporulated oocysts of N. caninum. The total feces eliminated by the dogs were collected and examined daily for a period of 30 days. No oocysts were found in the feces of these animals. For six months the dogs were monitored to observe a possible seroconversion and when this occurred the animals were eliminated from the experiment.

Trabalho realizado no Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar / Tese de mestrado integrado. Bioengenharia (Biotecnologia Molecular). Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2012