A Doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa relacionada à idade, que se caracterizada pela perda progressiva da memória, pela incapacidade de realizar atividades do cotidiano e alterações de personalidade. Esta doença é caracterizada histopatologicamente pela presença de placas senis e dos emaranhados neurofibrilares e também pela perda sináptica e morte neuronal. Além disso, já está bem estabelecido que a neuroinflamação é uma característica proeminente do cérebro de pacientes com doença de Alzheimer, no qual respostas inflamatórias desempenham um papel significativo na progressão da doença. Infelizmente, os fármacos utilizados no tratamento desta doença são limitados a inibidores da acetilcolinesterase que não têm impacto na patogênese da doença. As estatinas, que pertencem à classe de drogas redutoras de colesterol, têm sido propostas como novos agentes úteis na terapia da doença de Alzheimer devido às suas propriedades neuroprotetoras e anti-inflamatórias. Neste estudo, avaliamos o efeito neuroprotetor da atorvastatina, um inibidor da HMG-CoA redutase contra a toxicidade induzida pelo peptídeo Aβ25-35 em culturas organotípicas de hipocampo de ratos. As culturas foram tratadas com 2,5 uM ou 5μM de atorvastatina e então expostas a 25μM do peptídeo Aβ25-35 durante 48h. Também foi investigado o envolvimento da via de sinalização PI3K, as respostas oxidativas, a ativação astroglial, e os níveis de sinaptofisina (marcador pré-sináptico) e de citocinas. O tratamento com atorvastatina impediu a lesão celular induzida pela exposição ao Aβ25-35, reduziu as respostas inflamatórias e oxidativa e aumentou o imunoconteúdo de sinaptofisina. Além disso, a atorvastatina preveniu significativamente a ativação da GSK-3β, a ativação astroglial e o aumento nos níveis de TNF-α e IL-6. Tomados em conjunto, estas observações sugerem que a atorvastatina pode proporcionar uma eficaz ação neuroprotetora contra a neurotoxicidade induzida pelo Aβ através da ativação da via de sinalização PI3K/AKT e atenuação das respostas oxidativas e neuroinflamatórias, podendo ser uma potencial terapia a ser usada na DA. / Alzheimer’s disease is an age-related neurodegenerative disorder characterized by progressive memory loss, inability to perform the activities of daily living and personality changes. AD is characterized histopathologically by the presence of senile plaques, neurofibrillary tangles, synapse loss and neuronal death. Moreover, it is now recognized that neuroinflammation is a proeminent feature of Alzheimer’s disease brain, with inflammatory responses playing a significant role in modulating disease progression. Unfortunately, drugs effective for this disease are limited to acetylcholinesterase inhibitors that do not impact disease pathogenesis. Statins, which belong to the class of cholesterol-reducing drugs, were proposed as novel agents useful in AD therapy due the neuroprotective and anti-inflammatory properties that they have. In this study, we evaluated the neuroprotective effect of atorvastatin, a HMG-CoA reductase inhibitor, against Aβ25-35 peptide induced toxicity in organotypic hippocampal slice cultures. The cultures were treated with 2.5μM or 5μM of atorvastatin and then exposed to 25μM of Aβ25-35 for 48h. We also investigated the involvement of PI3K signaling pathway, oxidative responses, astroglial activation, and synaptophysin (pre-synaptic marker) and cytokines levels on the atorvastatin protection against β-amyloid-induced toxicity. Atorvastatin treatment prevented the cell damage induced by the exposure to peptide Aβ25-35, reduced inflammatory and oxidative responses and increased the immunocontent of synaptophysin. In addition, atorvastatin significantly prevented the activation of GSK-3β, the astroglial activation and the β-amyloid-induced increase in TNF- and IL-6 levels. Taken together, these observations suggest that atorvastatin may provide an effective neuroprotective action against neurotoxicity induced by Aβ through the activation of the PI3K/AKT signaling pathway and attenuation of oxidative responses and neuroinflammation, and could be a potencial drug used on Alzheimer disease.

O aumento da longevidade da população mundial tem como consequência uma maior prevalência de doenças neurodegenerativas. A Doença de Alzheimer (DA) é a desordem neurodegenerativa mais prevalente e a principal causa de demência após os 60 anos. A DA caracteriza-se por um crescente declínio na função mental e memória do paciente. Esses sintomas são acompanhados pela presença de alterações estruturais no tecido cerebral: os emaranhados neurofibrilares constituídos pela proteína tau hiperfosforilada e as placas senis constituídas pelo peptídeo beta-amiloide (A ). O peptídeo A tem sido considerado o principal responsável pelos processos de disfunção sináptica, morte neuronal e consequente declínio cognitivo dos pacientes com DA. O cenário atual ao qual se enquadram nossos conhecimentos sobre a etiologia, fisiopatologia e terapêutica da DA ainda não permitem um entendimento completo e satisfatório sobre essa doença e seu tratamento. A curcumina, um polifenol de origem vegetal, tem atraído considerável interesse devido aos seus potenciais benefícios à saúde humana. Alguns estudos têm demonstrado que a curcumina possui propriedades antioxidantes, antiinflamatórias e anti-amiloidogênicas em modelos animais de DA. Entretanto, as bases moleculares para a sua neuroproteção ainda não estão totalmente esclarecidas. Neste trabalho, avaliamos diversos mecanismos que são modulados pela curcumina em modelos in vivo e in vitro de toxicidade induzida pelo peptídeo A 1-42. Inicialmente, demonstramos que o co-tratamento com curcumina reduziu a morte celular induzida pela exposição ao peptídeo A por 48 h em culturas organotípicas de hipocampo de ratos. Em paralelo, a curcumina preveniu a redução da proteína sinaptofisina, a geração de espécies reativas, a ativação astrocitária e microglial, bem como, a alteração na secreção de importantes mediadores inflamatórios. Além disso, o mecanismo envolvido com sua neuroproteção pode estar associado com a regulação da fosforilação da proteína -catenina e da modulação da via de sinalização PI3K, através da regulação dos substratos Akt e GSK-3 , visto que o uso do inibidor LY294002 bloqueou o efeito neuroprotetor da curcumina. Diante da intensa ativação astrocitária observada no primeiro capítulo, investigamos o efeito da curcumina na reatividade astrocitária em cultura primária de astrócitos expostos ao peptídeo A . Neste trabalho observamos que os mecanismos de proteção da curcumina envolvem a prevenção da ativação da proteína JNK e a regulação do perfil de sumoilação de astrócitos, visto que a superexpressão de SUMO-1 diminui a reatividade astrocitária induzida pelo peptídeo A . Além do efeito neuroprotetor contra a morte celular, a curcumina demonstrou ter efeitos benéficos na transmissão sináptica, evitando a diminuição da excitabilidade neuronal em fatias organotípicas de hipocampo de ratos expostas por 24 h ao peptídeo A e este efeito parece estar associado com a modulação das proteínas CaMKII e sinapsina I. Para a avaliação do efeito neuroprotetor da curcumina no modelo in vivo de toxicidade ao peptídeo A 1-42, devido a sua baixa biodisponibilidade, comparamos a eficiência de nanocápsulas de curcumina e curcumina livre na prevenção dos danos cognitivos induzidos pela injeção icv do peptídeo A . De modo interessante, observamos um significativo aumento do desempenho in vivo da curcumina nanoencapsulada, a qual apresentou efeitos similares ou melhores com uma dose 20 vezes menor do que a dose efetiva de curcumina livre. Os mecanismos de neuroproteção da curcumina neste modelo parecem envolver o fator neurotrófico BDNF e a via de sinalização PI3K/Akt. Juntos, nossos resultados não somente confirmam o potencial da curcumina no tratamento dos processos neurodegenerativos como também oferecem uma via efetiva para melhorar o efeito neuroprotetor da curcumina através da nanobiotecnologia. / The increased longevity of the population has resulted in a higher prevalence of neurodegenerative diseases. Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder and the leading cause of dementia in persons over 60 years. The AD is characterized clinically by progressive impairments in cognition and memory. These clinical features are accompanied by the presence of structural changes in brain tissue: neurofibrillary tangles formed by hyperphosphorylated tau protein and amyloid plaques formed by amyloid beta-peptide (A ). A has been considered the main processes responsible for synaptic dysfunction, neuronal death and subsequent cognitive decline in patients with AD. The current scenario of our knowledge of the etiology, pathophysiology and therapy of AD does not allow a full and satisfactory understanding of this disease and its treatment. Curcumin, a naturally occurring polyphenol, has attracted considerable interest for its beneficial potentials for human health. Over the past decade, studies have been shown that curcumin is associated with antioxidant, anti-inflammatory and anti-amyloidogenic properties in models of AD; however, the molecular basis for its neuroprotection is not yet fully understood. In this study, we evaluated several mechanisms that are modulated by curcumin in in vitro and in vivo models of A 1-42-induced toxicity. Initially, we demonstrated that co-treatment with curcumin reduced the cell death induced by exposure to peptide A for 48 h in organotypic hippocampal slice cultures. In parallel, curcumin prevented the reduction of synaptophysin protein, generation of reactive species, astrocytic and microglial activation and the changes in the release of important inflammatory mediators. Furthermore, the mechanism involved in this neuroprotection may be associated with regulation of phosphorylation of -catenin protein and modulation of PI3K signaling pathway, by regulating the substrates Akt and GSK-3 , since the use of inhibitor LY294002 blocked the neuroprotective effect of curcumin. Given the intense astrocytic activation observed in the first study, we investigated the effect of curcumin on astrocytic reactivity in primary culture of astrocytes exposed to A 1-42. In this study we observed that the protective mechanisms of curcumin involve the prevention of JNK activation and regulation of SUMOylation profile of astrocytes, whereas overexpression of SUMO-1 reduces astrocyte reactivity induced by A . Besides the neuroprotective effect against cell death, curcumin shown to have beneficial effects in synaptic transmission, avoiding the reduction of neuronal excitability in organotypic hippocampal slices exposed for 24 h to A 1-42 and this effect could be associated with CaMKII and synapsin I modulation by curcumin. For evaluating the neuroprotective effect of curcumin in an in vivo model of A -induced toxicity, due to its poor bioavailability, we compared the efficiency of curcumin-loaded lipid-core nanocapsules and free curcumin in preventing cognitive impairments induced by icv injection of A 1- 42. Interestingly, we observed a significant increase in the in vivo performance of nanoencapsulated curcumin, which presented similar or better neuroprotective results in a dose 20-fold lower compared to the effective dose of free curcumin. The neuroprotective mechanisms of curcumin in this model appear to involve the neurotrophic factor BDNF and PI3K/Akt signaling pathway. Taken together, our results not only confirm the potential of curcumin in treating neurodegenerative processes but also offer an effective way to improve the neuroprotective efficiency of curcumin through nanobiotechnology.

A Doença de Alzheimer é uma desordem que acomete milhões de indivíduos por todo o mundo, e a sua incidência tem aumentado muito nas últimas décadas. A doença é caracterizada por diversas alterações no sistema nervoso central, e dentre elas ocorrem alterações importantes no metabolismo da glicose, com redução da utilização desse composto, levando a um importante déficit energético. A Doença de Alzheimer está intimamente relacionada com o Diabetes Mellitus, pois além de ocorrerem alterações semelhantes nas duas desordens, pacientes com diabetes têm risco aumentado de desenvolver Alzheimer. Além da correlação com Diabetes Mellitus, existem evidências de que a hipercolesterolemia também está associada ao maior risco de desenvolver Doença de Alzheimer, o que nos levou a investigar o potencial neuroprotetor das estatinas. Esse trabalho tem como objetivo avaliar alterações comportamentais e bioquímicas em dois modelos de desordens do metabolismo da glicose, bem como avaliar o possível papel neuroprotetor das estatinas, aminoguanidina e n-acetil-cisteína. / Alzheimer’s disease is a disorder that affects millions of individuals around the world, and its incidence has increased in recent decades. Alzheimer’s disease is characterized by several alterations in the central nervous system, and changes in glucose metabolism is among the most important, reducing the uptake of this compound, leading to a significant energy deficit. Alzheimer’s disease is closely related to Diabetes Mellitus, and similar metabolic changes occur in both disorders. Besides, diabetic patients present increased risk for Alzheimer’s disease. In addition, another risk factor to Alzheimer’s is high levels of plasma cholesterol, which lead some research groups to evaluate the potential neuroprotective effect of statins. The aim of this study is to asses behavioral and biochemical changes in two models of glucose metabolism disorders, and evaluate the possible neuroprotective role of statins, aminoguanidine and N-acetyl-cysteine

O Status epilepticus induzido por LiCl-pilocarpina causa uma massiva neurodegeneração em diversas regiões cerebrais, e a maioria dos fármacos antiepilépticos clássicos não são suficientemente eficazes para proteger os neurônios da morte. Antagonistas do receptor N-metil-D-aspartato apresentam ação anticonvulsiva e são atualmente capazes de proporcionar neuroprotecção contra a morte neuronal induzida pelo SE. No entanto, estes compostos demonstraram inúmeros efeitos colaterais. Apesar disso, a memantina, um antagonista NMDA de baixa afinidade, é clinicamente bem tolerada e não induz tantos efeitos indesejados. Portanto, o objetivo do presente estudo foi investigar o efeito neuroprotetor da memantina contra a degeneração neuronal induzida pelo status epilepticus induzido por LiCl-pilocarpina nos períodos iniciais da vida. Filhotes de ratos Wistar receberam memantina (20 mg / kg ip) em diferentes regimes de tratamento. A neurodegeneração foi quantificada por fluoro jade C. Em CA1 a neurodegeneração diminuiu significativamente quando os animais receberam memantina nos regimes de pós-tratamento realizados às 0 e 0,25 horas. Além disso, o pós-tratamento foi capaz de proteger contra a neurodegeneração em uma região da amígdala. O pré-tratamento com memantina mostrou uma redução da morte celular no tálamo. Nossos resultados demonstram o efeito neuroprotetor da memantina na morte neuronal induzida pelo SE no início da vida. Este efeito é dependente do tempo de tratamento e da região cerebral. / Status epilepticus induced by LiCl-pilocarpine is accompanied by neurodegeneration and the classical antiepileptic drugs are not effective in protect neurons from death. Typical N-methyl-D-aspartate receptor antagonists exhibit anticonvulsant action and are currently able to provide neuroprotection against SE-induced neuronal death. However, these compounds have demonstrated undesirable side effects. Despite this, memantine, a low-affinity NMDA antagonist, is clinically well tolerate and does not induce side effects. Therefore, the aim of the present study was to investigate the neuroprotective effect of the memantine against neuronal degeneration induced by early life LiCl-Pilocarpine-induced status epilepticus. Wistar pup rats received memantine (20 mg/kg i.p.) at different treatment regimens before and after SE induction. Neurodegeneration was quantified by fluoro jade C staining. In CA1 subfield neurodegeneration was significantly decreased when animals received memantine at 0h and 0.25h post-treatment regimens. Additionally, post-treatment was able to protect against neurodegeneration in amygdala region. Memantine pre-treatment showed a reduction of cell death in thalamus. Our results demonstrated the neuroprotective effect of memantine on neuronal loss induced by SE early in life. This effect was time- and region-dependent.

A doença de Alzheimer (DA) é uma devastadora desordem neurológica que afeta mais de 37 milhões de pessoas ao redor do mundo, caracterizada pelo progressivo dano cognitivo e pela perda da memória. Estas alterações clínicas são acompanhadas por alterações histológicas cerebrais características da doença, as quais incluem atrofia cerebral, perda de neurônios e disfunção sináptica secundárias à deposição extracelular do peptídeo beta-amilóide (Aβ) e à deposição intracelular de emaranhados neurofibrilares constituídos da proteína tau. Fármacos disponíveis para a terapia da DA apresentam efeito limitado e tratamentos utilizando um único medicamento ou a combinação de terapias que possam efetivamente parar ou modificar o curso da doença ainda não se encontram disponíveis. O resveratrol, um polifenol de origem vegetal, tem atraído considerável interesse devido aos seus potenciais benefícios à saúde humana. Diversos estudos têm demonstrado que o resveratrol possui propriedades anti-amiloidogênicas; entretanto, os efeitos biológicos in vivo do resveratrol são fortemente limitados devido a sua baixa biodisponibilidade, a qual representa uma barreira no desenvolvimento de aplicações terapêuticas do resveratrol. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi desenvolver uma nova formulação capaz de superar a baixa solubilidade, a limitada estabilidade, a elevada metabolização e a baixa biodisponibilidade do resveratrol e avaliar o seu efeito frente à toxicidade induzida pelo Aβ em modelos in vitro e in vivo. Inicialmente, o isômero trans do resveratrol foi incorporado em nanocápsulas poliméricas de núcleo lipídico (RSV-LNC) e a distribuição destas nanocápsulas nos tecidos cerebral, hepático e renal foi avaliada após a administração intraperitoneal (i.p.) ou por gavagem em ratos saudáveis. As nanocápsulas apresentaram elevada capacidade de encapsulamento do resveratrol e animais tratados com RSV-LNC exibiram maior concentração do resveratrol no cérebro, no fígado e no rim quando comparados aos animais tratados com resveratrol livre (RSV) após administrações diárias pelas vias i.p. ou gavagem. Na sequência, nós comparamos o efeito do tratamento com RSV e RSV-LNC frente à toxicidade induzida pelo Aβ através da exposição de culturas organotípicas de hipocampo ao Aβ1-42 por 48 h. Tanto o tratamento prévio quanto o simultâneo das culturas com RSV ou RSV-LNC reduziram significativamente a morte celular induzida pelo Aβ, com o RSV-LNC apresentando efeito mais pronunciado. O pré-tratamento com ambos, RSV ou RSV-LNC, preveniu a produção de espécies reativas de oxigênio; entretanto, o tratamento simultâneo com RSV não protegeu as culturas do dano oxidativo. Ambos os tratamentos, prévio e simultâneo, com RSV-LNC bloquearam a neuroinflamação desencadeada pelo Aβ de maneira sustentada. Além disso, apenas os tratamentos com RSV-LNC foram capazes de aumentar a liberação da IL-10 mesmo na presença do Aβ e prevenir/reduzir a ativação glial e a fosforilação da JNK. Finalmente, nós avaliamos o efeito do resveratrol frente à toxicidade induzida pelo Aβ através da injeção intracerebroventricular do Aβ1-42 em ratos. Nós observamos que os animais que foram injetados com o Aβ1-42 exibiram um significativo défcit na memória, o qual foi acompanhado pela significativa redução nos níveis da sinaptofisina no hipocampo. É importante ressaltar que através do uso das nanocápsulas o resveratrol foi capaz de reduzir estes efeitos deletérios do Aβ1-42 enquanto o tratamento com RSV não foi capaz de proteger da toxicidade induzida pelo Aβ, o que pode ser explicado pelo robusto aumento na biodisponibilidade cerebral do resveratrol atingida pelo uso das nanocápsulas. Adicionalmente, a ativação astrocitária e microglial, bem como fosforilação da JNK desencadeada pelo Aβ foram reduzidas somente após o tratamento com RSV-LNC, enquanto ambos os tratamentos com RSV e RSV-LNC foram capazes de reestabelecer os distúrbios na sinalização mediada pela GSK-3β e a desestabilização da β-catenina desencadeadas pelo Aβ. Juntos, nossos resultados não somente confirmam o potencial do resveratrol no tratamento dos processos neurodegenerativos como também oferecem uma via efetiva para melhorar o efeito neuroprotetor do resveratrol através de um sistema nanocarreador. Estes resultados fornecem suporte para futuros estudos objetivando o entendimento dos mecanismos envolvidos no efeito neuroprotetor do resveratrol. Além disso, a combinação do resveratrol com o sistema de entrega mediado por nanocápsulas poliméricas de núcleo lipídico abrem novas possibilidades para o tratamento da doença de Alzheimer. / Alzheimer's disease (AD) is a devastating neurological disorder that affects more than 37 million people worldwide, characterized clinically by progressive impairments in cognition and memory. These clinical features are accompanied by characteristic histological changes in the brain, which include brain atrophy, loss of neurons and loss of synaptic function secondary to extracellular deposition of amyloid-beta peptide (Aβ) and intracellular deposition of neurofibrillary tangle composed of the microtubule-associated protein tau. Available drugs for AD therapy have small effect sizes and we still not have a single treatment or combination therapy that can effectively stop or reverse the relentless progression of AD. Resveratrol, a naturally occurring polyphenol, has attracted considerable interest for its beneficial potentials for human health. Several studies have been shown that resveratrol is associated with anti-amyloidogenic properties; however, the in vivo biological effects of resveratrol appear strongly limited by its low bioavailability, which is a barrier to the development of therapeutic applications. In this context, the present study was designed to develop a novel resveratrol formulation to overcome its poor solubility, limited stability, high metabolization and weak bioavailability, and to evaluate the effects of resveratrol against in vitro and in vivo Aβ-induced toxicity. Initially, trans-resveratrol was loaded into lipid-core nanocapsules (RSV-LNC) and the nanocapsule distribution in brain, liver and kidney tissues was evaluated by intraperitoneal (i.p.) and gavage routes in healthy rats. Lipid-core nanocapsules showed high entrapment of resveratrol and animals treated with RSV-LNC displayed a higher resveratrol concentration in the brain, the liver and the kidney than those treated with free resveratrol (RSV) after daily i.p. or gavage administration. Next, we compared the effects of RSV and RSV-LNC treatment against Aβ-induced toxicity by expositing organotypic hippocampal cultures to Aβ1-42 by 48 h. Pre- and co-treatment of cultures with both, RSV and RSV-LNC, significantly attenuated Aβ-induced cell death, with RSV-LNC showing somewhat higher potency. Reactive oxygen species formation was prevented by pretreatment with both RSV or RSV-LNC; however, co-treatment with RSV failed to protect cultures from oxidative damage. Pre- and co-treatment with RSV-LNC was able to block the neuroinflammation triggered by Aβ in a sustained pattern. Furthermore, only RSV-LNC treatments were able to increase IL-10 release even in the presence of Aβ, and prevent/decrease glial activation and JNK phosphorylation. Finally, we evaluated the effects of resveratrol against Aβ-induced toxicity by using an intracerebroventricular injection of Aβ1-42 model in rats. We found that Aβ1-42-injected animals showed a significant impairment on learning-memory ability, which was paralleled by a significant decrease in hippocampal synaptophysin levels. Noteworthy, by using lipid-core nanocapsules, resveratrol was able to rescue these deleterious effects of Aβ1-42 while treatment with RSV failed to protect against Aβ-induced toxicity, which can be explained by robust increase of brain bioavailability of resveratrol achieved by lipid-core nanocapsules. Additionally, activated astrocytes and microglial cells, as well as JNK phosphorylation triggered by Aβ was reduced only after RSV-LNC treatment, while both RSV and RSV-LNC treatments were able to restore the disturbance in GSK-3β signaling and destabilization of β-catenin triggered by Aβ. Taken together, our results not only confirm the potential of resveratrol in treating neurodegenerative processes but also offer an effective way to improve the neuroprotective efficiency of resveratrol by nanocarrier delivery system. These findings provide further support for future studies aiming at precisely understanding of mechanisms involved in the neuroprotective effects of resveratrol. Furthermore, the combination of resveratrol and lipidcore nanocapsules-based delivery system may open new avenues for the treatment of Alzheimer’s disease.

O glutamato, principal neurotransmissor excitatório no sistema nervoso central (SNC), está envolvido em várias funções cerebrais e da retina, como aprendizado/memória, desenvolvimento e envelhecimento cerebral e função visual. No entanto, o aumento da concentração do glutamato na fenda sináptica pode levar a neurotoxicidade. A excitotoxicidade glutamatérgica está relacionada a várias desordens cerebrais, tanto agudas quanto crônicas. Manter o nível de glutamato em concentrações fisiológicas relevantes ao adequado funcionamento do SNC se faz necessário. Para tanto, existem transportadores específicos para o glutamato, responsáveis por controlar os níveis de glutamato na fenda sináptica. Os ácidos graxos essenciais ω3 vêm ganhando especial atenção de pesquisadores por seus efeitos sobre o SNC, tanto responsáveis pelo adequado desenvolvimento e funcionamento cerebral e da retina, quanto por sua ação neuroprotetora frente a patologias relacionadas com a excitotoxicidade glutamatérgica. Na presente tese, nós demonstramos que os ácidos graxos ω3 são importantes para a homeostasia do sistema glutamatérgico tanto no hipocampo quanto na retina de ratos. Uma dieta deficiente em ácidos graxosω3, mantida durante todo o período de desenvolvimento do SNC até a vida adulta, foi capaz de atrasar o desenvolvimento normal das sinapses glutamatérgicas, onde houve uma redução de proteínas sinápticas (NMDA, AMPA e α-CaMKII) no período pós-natal, promovendo alterações comportamentais na vida adulta de ratos, como comportamentos de hiperatividade e ansiedade. Os animais deficientes em ω3 também apresentaram déficits na memória aversiva de longa duração, que foi relacionado com uma baixa interação do receptor NMDA com a proteína cinase Fyn, bem como a redução dos níveis de DHAω3 e BDNF no hipocampo dos ratos. Os ácidos graxos ω3 preveniram as alterações sobre parâmetros do sistema glutamatérgico (queda na captação de glutamato, aumento de transportadores de glutamato GLAST e GLT-1) provocadas por um único evento convulsivo neonatal. Além disso, os animais deficientes em ácidos graxos ω3 apresentaram aumento no conteúdo de GFAP (proteína astrocitária) e redução no conteúdo de NeuN (proteína neuronal) independente do evento convulsivo. Os ácidos graxosω3 também preveniram o déficit de memória de curta duração na vida adulta dos ratos causado pela convulsão 5 neonatal. Na retina de ratos, a deficiência dos ácidos graxos ω3 causou alterações na captação de glutamato e no conteúdo do transportador GLT-1. Após um insulto isquêmico na retina, os animais deficientes em ácidos graxos ω3 apresentaram alterações em parâmetros do sistema glutamatérgico (queda na captação de glutamato, aumento de GLT-1 e EAAC1). Já nos animais que receberam ácidos graxos ω3, o conteúdo de GLT-1 foi maior tanto basal quanto isquêmico, e somente o EAAC1 foi modulado. Nossos resultados mostram a importância dos ácidos graxos ω3 em manter a homeostasia glutamatérgica, contribuindo para o adequado desenvolvimento, funcionamento e proteção do SNC e da retina. / The main excitatory neurotransmitter in central nervous system (CNS), glutamate, is involved in many functions in brain and retina, such as learning / memory, brain and retina development and aging, and visual process. However, increased glutamate concentrations in synaptic cleft could lead to neurotoxicity. Glutamate excitotoxicity was related to many neurological acute and chronic disorders. Keeping glutamate at relevant physiological concentrations to adequate CNS function is necessary. The high affinity glutamate transporters are responsible to maintain glutamate below neurotoxic levels, preventing excitotoxicity. The essential omega-3 fatty acids (ω3) have received attention from scientific community because of its effects on brain development and neuroprotection against pathologies related to glutamatergic excitotoxicity. In the present thesis, we demonstrated that dietary ω3 fatty acids are important for glutamatergic system homeostasis in the hippocampus and retina of rats. A ω3 deficient diet, maintain since gestation until adulthood, was capable to delay the normal glutamatergic synapse development, with a reduction in synaptic proteins (NMDA, AMPA and αCaMKII) in the postnatal period, promoting behavioral alterations in adulthood in rats (hyperactivity and anxiety-like behavior). The deficient animals also presented aversive long-term memory deficit, which was related to reduction in the interaction of NMDA receptor with Fyn kinase protein, as well as in DHA and BDNF hippocampal content in rats. Dietary ω3 fatty acids prevented alterations on glutamatergic system functionality (decrease in glutamate uptake activity, increase in glutamate transporters GLAST and GLT-1 contents) caused by one single neonatal seizures episode. Dietary ω3 fatty acids also prevented aversive short-term memory deficit in adulthood caused by neonatal seizures. In the retina, ω3 deficiency caused decrease in glutamate uptake and reduction in GLT-1 content in basal conditions. After ischemic insult in the retina, ω3 deficient rats presented alteration on parameters of glutamatergic system evaluated (decrease in glutamate uptake activity, increase in GLT-1 and EAAC1 transporters). In ω3 adequate rats, GLT-1 content was higher in basal and ischemic conditions, and only EAAC1 was increase after ischemia. Taking together, our data show the importance of dietary ω3 fatty acids to maintain glutamatergic system homeostasis, contributing to adequate development, function and protection of CNS and retina.

Estudos com resveratrol (RSV) tiveram um crescimento exponencial nos últimos anos, especialmente focando seu efeito benéfico na saúde humana. Recentemente, foram publicados trabalhos mostrando um forte efeito neuroprotetor, não somente reduzindo lesões cerebrais, mas também promovendo a recuperação funcional após a isquemia cerebral. Entretanto, as bases moleculares para a neuroproteção ainda são desconhecidas. Neste trabalho, avaliamos diversos mecanismos que são modulados pelo resveratrol em modelos experimentais de isquemia cerebral. Inicialmente, demonstramos que o tratamento com RSV, administrado durante 7 dias antes da indução da lesão isquêmica, diminuiu a morte neuronal em hipocampo e córtex cerebral de ratos submetidos a isquemia cerebral global. Em paralelo, reduziu a geração de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. Este efeito foi associado com o aumento de antioxidantes endógenos, além da prevenção do aumento da peroxidação lipídica e da diminuição da atividade da Na+K+-ATPase induzidos pela isquemia cerebral global. Tendo em vista que o insulto isquêmico aumentou rapidamente os níveis de espécies reativas de oxigênio, investigamos o efeito do resveratrol sobre o perfil lipídico, e demonstramos que ele foi capaz de prevenir a diminuição de gangliosídeos, fosfolipídios e colesterol observada em hipocampo e córtex de ratos isquêmicos. A análise de vias de sinalização possivelmente envolvidas, mostrou que o efeito neuroprotetor do resveratrol envolve a modulação da via de sobrevivência PI3- K/Akt através da ativação de seus substratos GSK-3β e CREB. Adicionalmente, vias que controlam a neuroinflamação foram moduladas por resveratrol, o qual diminuiu a ativação glial, reduziu a fosforilação da JNK, diminuiu a translocação nuclear de NF- κB, reduzindo sua ativação e seus possíveis substratos iNOS e COX-2. A seguir avaliamos o efeito do resveratrol em promover a angiogênese em células endoteliais cerebrais e demonstramos que ele foi capaz de promover a proliferação, migração e indução da formação de tubo vascular in vitro. Além da função da célula, o RSV mostrou mudar o aspecto morfológico de células endoteliais do cérebro associadas com o rearranjo do citoesqueleto e relocalização de β-catenina e VE-caderina. A avaliação de vias de sinalização associadas com a angiogênese promovida pelo resveratrol, mostrou o envolvimento das vias PI3-K/Akt e MAPK/ERK, que regularam eNOS modulando os níveis de VEGF e metaloproteinases. Considerando que angiogênese e neurogênese são processos acoplados, investigamos o efeito do RSV no aumento de fatores tróficos e na plasticidade neuronal. Demonstramos que o RSV promoveu a recuperação funcional e está intimamente relacionada com o aumento da angiogênese e neurogênese após a isquemia cerebral focal. Em conjunto, nossos resultados abrem a perspectiva para o desenvolvimento de uma nova estratégia terapêutica para o tratamento da isquemia cerebral. / Recent studies with resveratrol (RSV) have been growing exponentially throughout the years, especially focusing on its beneficial effect on human health. Recently published studies, showing strong neuroprotective effects of RSV, not only reduce brain damage, but also promotes functional recovery after stroke. However, the molecular basis for neuroprotection is still unknown. In this study, we evaluated various mechanisms that are modulated by RSV in experimental models of cerebral ischemia. Initially, we demonstrated that by administering RSV, for 7 days prior to global cerebral ischemia, decreased neuronal cell death in the cerebral cortex and hippocampus of rats as well as reducing the generation of oxygen and nitrogen reactive species. The observed neuroprotection was associated with increased endogenous antioxidants, a decrease of Na+ K+ ATPase, and the prevention of lipid peroxidation. With an ischemic insult, levels of ROS rapidly increase which may lead to a decrease in lipids. However, we investigated the effects of RSV on lipid profiles and it showed that it was able to prevent a decrease in the amount of gangliosides, phospholipids, and cholesterol observed in the hippocampus and cortex of ischemic rats. There are several possible signaling pathways of RSV. Analysis of these pathways reveals that the neuroprotective effects of RSV involve the modulation of PI3-K/Akt survival pathway by activating its substrates GSK-3β and CREB. Furthermore, RSV modulates pathways involved in neuroinflammation, decreasing glial activation, phosphorylation of JNK, nuclear translocation and activation of NF- κB and its possible substrates of iNOS and COX-2. Additionally, we also investigated the effects of RSV on angiogenesis in brain endothelial cells. Results showed that RSV was able to promote proliferation, migration and vascular tube formation in vitro. Signaling pathways associated with angiogenesis by RSV, involves PI3-K/Akt and MAPK/ERK pathways which both regulate eNOS in the modulation of VEGF and metalloproteinase levels. Furthermore, RSV showed that the morphological change of brain endothelial cells was associated with cytoskeletal rearrangement and relocation of β-catenin and VE-cadherin. Considering that angiogenesis and neurogenesis are coupled processes, we investigated the effects of RSV on the increase of trophic factors and neuronal plasticity. We demonstrate that RSV increased functional recovery as well as intimately related to the increase of angiogenesis and neurogenesis after focal cerebral ischemia. Therefore, our results open the perspective for the development of a new therapeutics for the treatment of stroke.

A acidemia metilmalônica é um erro inato do metabolismo caracterizado pelo acúmulo tecidual de ácido metilmalônico (MMA), dano oxidativo e alterações neurológicas, como degeneração estriatal e convulsões. Considerando que o óxido nítrico é um mensageiro químico trans-sináptico que está envolvido em diversos eventos fisiopatologógicos e seu papel na toxicidade induzida pelo MMA é pouco conhecido, nós decidimos investigar a participação deste radical livre nas alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pela administração intraestriatal de MMA. No primeiro trabalho, foi evidenciado que a administração intraestriatal de um inibidor não-seletivo da enzima óxido nítrico sintase, metil éster de Nϖ-nitro-L-arginina (LNAME: 10-4 - 100 nmol/0,5 μl), exerceu efeito bifásico nas convulsões e na carbonilação proteíca induzidas pela injeção de MMA (4,5 μmol/1,5 μl; 30 minutos após a injeção de L-NAME) no estriado de ratos. Estes resultados sugeriram um envolvimento do óxido nítrico nas convulsões e no dano oxidativo induzido pelo MMA. Em um segundo momento, confirmamos o envolvimento do óxido nítrico nas convulsões induzidas por MMA, uma vez que a injeção intraestriatal de MMA causou um aumento na concentração de nitrito e nitrato (NO2 e NO3) estriatal. Além disso, os episódios convulsivos induzidos por MMA apresentaram uma correlação significativa com a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase no estriado injetado, mas não com os níveis de carbonilação protéica, um marcador de dano oxidativo protéico. Neste estudo também foi avaliado o efeito da administração intraestriatal do azul de metileno (AM; 0,015 a 1,5 nmol/ 0,5 μl), que possui atividade antioxidante e é um inibidor da guanilato ciclase, nas convulsões e dano oxidativo induzidos pelo MMA. O AM (1,5 nmol/0,5 μl) diminuiu a formação de NO2 e NO3 estriatal e preveniu as convulsões, a carbonilação protéica e a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidos pelo MMA. Esses dados sugerem que a atividade da Na+,K+-ATPase pode ser de grande importância para a gênese das convulsões induzidas pelo MMA e que o AM exerce efeito neuroprotetor contra as alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pelo MMA. Além disso, se essas alterações ocorerem nos pacientes com acidemia metilmalônica, é possível propor que o AM poderia ser considerado como uma terapia adjuvante para o tratamento desta acidemia. O efeito da administração do 7-nitroindazol (7-NI; 3-60 mg/kg, i.p.), um inibidor da enzima NOSn, nas convulsões, carbonilação protéica, produção de NO2 e NO3 e na atividade da Na+,K+-ATPase após trinta minutos da administração intraestriatal de MMA (6 μmol/ 2 μl) também foi avaliado. O tratamento com 7-NI (60 mg/kg, i.p.) potencializou as convulsões, aumentou a carbonilação protéica e reduziu a produção de NO2 e NO3 induzidos pelo MMA, entretanto, este tratamento não alterou a atividade da Na+,K+-ATPase. A adminstração intraestriatal de L-arginina (50 nmol/ 0.5 μl), mas não de D-arginina (5 and 50 nmol/ 0.5 μl), aumentou a produção de NO2 e NO3 e preveniu as convulsões, a carbonilação protéica e a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidos pelo MMA. Esses resultados sugerem que o óxido nítrico neuronal pode exercer um efeito protetor sobre as convulsões bem como nas alterações neuroquímicas evidenciadas neste modelo de acidemia orgânica. Concluindo, estes resultados ampliam o papel dos radicais livres nas alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pela administração intra-estriatal de MMA.

A Doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa relacionada à idade, que se caracterizada pela perda progressiva da memória, pela incapacidade de realizar atividades do cotidiano e alterações de personalidade. Esta doença é caracterizada histopatologicamente pela presença de placas senis e dos emaranhados neurofibrilares e também pela perda sináptica e morte neuronal. Além disso, já está bem estabelecido que a neuroinflamação é uma característica proeminente do cérebro de pacientes com doença de Alzheimer, no qual respostas inflamatórias desempenham um papel significativo na progressão da doença. Infelizmente, os fármacos utilizados no tratamento desta doença são limitados a inibidores da acetilcolinesterase que não têm impacto na patogênese da doença. As estatinas, que pertencem à classe de drogas redutoras de colesterol, têm sido propostas como novos agentes úteis na terapia da doença de Alzheimer devido às suas propriedades neuroprotetoras e anti-inflamatórias. Neste estudo, avaliamos o efeito neuroprotetor da atorvastatina, um inibidor da HMG-CoA redutase contra a toxicidade induzida pelo peptídeo Aβ25-35 em culturas organotípicas de hipocampo de ratos. As culturas foram tratadas com 2,5 uM ou 5μM de atorvastatina e então expostas a 25μM do peptídeo Aβ25-35 durante 48h. Também foi investigado o envolvimento da via de sinalização PI3K, as respostas oxidativas, a ativação astroglial, e os níveis de sinaptofisina (marcador pré-sináptico) e de citocinas. O tratamento com atorvastatina impediu a lesão celular induzida pela exposição ao Aβ25-35, reduziu as respostas inflamatórias e oxidativa e aumentou o imunoconteúdo de sinaptofisina. Além disso, a atorvastatina preveniu significativamente a ativação da GSK-3β, a ativação astroglial e o aumento nos níveis de TNF-α e IL-6. Tomados em conjunto, estas observações sugerem que a atorvastatina pode proporcionar uma eficaz ação neuroprotetora contra a neurotoxicidade induzida pelo Aβ através da ativação da via de sinalização PI3K/AKT e atenuação das respostas oxidativas e neuroinflamatórias, podendo ser uma potencial terapia a ser usada na DA. / Alzheimer’s disease is an age-related neurodegenerative disorder characterized by progressive memory loss, inability to perform the activities of daily living and personality changes. AD is characterized histopathologically by the presence of senile plaques, neurofibrillary tangles, synapse loss and neuronal death. Moreover, it is now recognized that neuroinflammation is a proeminent feature of Alzheimer’s disease brain, with inflammatory responses playing a significant role in modulating disease progression. Unfortunately, drugs effective for this disease are limited to acetylcholinesterase inhibitors that do not impact disease pathogenesis. Statins, which belong to the class of cholesterol-reducing drugs, were proposed as novel agents useful in AD therapy due the neuroprotective and anti-inflammatory properties that they have. In this study, we evaluated the neuroprotective effect of atorvastatin, a HMG-CoA reductase inhibitor, against Aβ25-35 peptide induced toxicity in organotypic hippocampal slice cultures. The cultures were treated with 2.5μM or 5μM of atorvastatin and then exposed to 25μM of Aβ25-35 for 48h. We also investigated the involvement of PI3K signaling pathway, oxidative responses, astroglial activation, and synaptophysin (pre-synaptic marker) and cytokines levels on the atorvastatin protection against β-amyloid-induced toxicity. Atorvastatin treatment prevented the cell damage induced by the exposure to peptide Aβ25-35, reduced inflammatory and oxidative responses and increased the immunocontent of synaptophysin. In addition, atorvastatin significantly prevented the activation of GSK-3β, the astroglial activation and the β-amyloid-induced increase in TNF- and IL-6 levels. Taken together, these observations suggest that atorvastatin may provide an effective neuroprotective action against neurotoxicity induced by Aβ through the activation of the PI3K/AKT signaling pathway and attenuation of oxidative responses and neuroinflammation, and could be a potencial drug used on Alzheimer disease.

O Status epilepticus induzido por LiCl-pilocarpina causa uma massiva neurodegeneração em diversas regiões cerebrais, e a maioria dos fármacos antiepilépticos clássicos não são suficientemente eficazes para proteger os neurônios da morte. Antagonistas do receptor N-metil-D-aspartato apresentam ação anticonvulsiva e são atualmente capazes de proporcionar neuroprotecção contra a morte neuronal induzida pelo SE. No entanto, estes compostos demonstraram inúmeros efeitos colaterais. Apesar disso, a memantina, um antagonista NMDA de baixa afinidade, é clinicamente bem tolerada e não induz tantos efeitos indesejados. Portanto, o objetivo do presente estudo foi investigar o efeito neuroprotetor da memantina contra a degeneração neuronal induzida pelo status epilepticus induzido por LiCl-pilocarpina nos períodos iniciais da vida. Filhotes de ratos Wistar receberam memantina (20 mg / kg ip) em diferentes regimes de tratamento. A neurodegeneração foi quantificada por fluoro jade C. Em CA1 a neurodegeneração diminuiu significativamente quando os animais receberam memantina nos regimes de pós-tratamento realizados às 0 e 0,25 horas. Além disso, o pós-tratamento foi capaz de proteger contra a neurodegeneração em uma região da amígdala. O pré-tratamento com memantina mostrou uma redução da morte celular no tálamo. Nossos resultados demonstram o efeito neuroprotetor da memantina na morte neuronal induzida pelo SE no início da vida. Este efeito é dependente do tempo de tratamento e da região cerebral. / Status epilepticus induced by LiCl-pilocarpine is accompanied by neurodegeneration and the classical antiepileptic drugs are not effective in protect neurons from death. Typical N-methyl-D-aspartate receptor antagonists exhibit anticonvulsant action and are currently able to provide neuroprotection against SE-induced neuronal death. However, these compounds have demonstrated undesirable side effects. Despite this, memantine, a low-affinity NMDA antagonist, is clinically well tolerate and does not induce side effects. Therefore, the aim of the present study was to investigate the neuroprotective effect of the memantine against neuronal degeneration induced by early life LiCl-Pilocarpine-induced status epilepticus. Wistar pup rats received memantine (20 mg/kg i.p.) at different treatment regimens before and after SE induction. Neurodegeneration was quantified by fluoro jade C staining. In CA1 subfield neurodegeneration was significantly decreased when animals received memantine at 0h and 0.25h post-treatment regimens. Additionally, post-treatment was able to protect against neurodegeneration in amygdala region. Memantine pre-treatment showed a reduction of cell death in thalamus. Our results demonstrated the neuroprotective effect of memantine on neuronal loss induced by SE early in life. This effect was time- and region-dependent.