Orientador: Tatiane Maria Rodrigues / Resumo: A morfologia, histoquímica e ultraestrutura dos tricomas glandulares têm sido estudadas em muitas espécies vegetais. Entretanto, alguns aspectos têm sido pouco abordados, como o envolvimento do citoesqueleto na morfologia e funcionamento glandular. Estudo recente demonstrou a relação entre a predominância de filamentos de actina e microtúbulos em células secretoras e a composição da secreção em tricomas glandulares. Além disso, pesquisas têm comprovado o envolvimento dos elementos do citoesqueleto na origem e manutenção dos tricomas tectores em plantas, sem informações para os tricomas glandulares. Sabe-se que o funcionamento do citoesqueleto está relacionado com a disponibilidade do cálcio, sendo que baixas concentrações desse íon podem prejudicar processos modulados por microtúbulos e actina. Apesar da presença de tricomas glandulares representar um caráter constitutivo em diversas espécies vegetais, fatores exógenos podem influenciar o desenvolvimento e o funcionamento glandular. Estudos têm mostrado que o ataque de herbívoros induz a formação de tricomas glandulares, levando a produção de substâncias com potencial repelente ou inseticida. Os objetivos desse trabalho foram investigar o papel do citoesqueleto na morfogênese e funcionamento de tricomas glandulares e no transporte lipídico em células secretoras de óleo, além de investigar a influência da herbivoria no desenvolvimento e funcionamento de tricomas glandulares. Foram estudadas duas espécies de Lamiaceae (Hyptis v... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The morphology, histochemistry and ultrastructure of glandular trichomes have been studied in many plant species. However, some aspects have been poorly approached, such as the involvement of the cytoskeleton on the gland morphology and functioning. Recent study demonstrated a relation between the predominance of actin filaments and microtubules in secretory cells and the secretion composition in glandular trichomes. In addition, researches have proven the involvement of the cytoskeletal elements in the origin and maintenance of non-glandular trichomes in plants, with no information for glandular trichomes. It is known that the cytoskeleton functioning is related with calcium availability and that low concentration of this ion can harm process modulated by actin filaments and microtubules. Despite the presence of glandular trichomes is a constitutive character in several plant species, exogenous factors can influence their development and functioning. Studies have showed that herbivore attacks induce the glandular trichomes formation, leading to the production of substances with repellent and insecticide potential. This work aimed to investigate the role of cytoskeleton in the glandular trichome morphogenesis and functioning, and in the lipid transport in oil secretory cells, in addition to investigate the influence of herbivory in the glandular trichomes formation and functioning. We studied two Lamiaceae species (Hyptis villosa and Ocimum gratissimum) and the model species ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-27T13:57:34Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2630530 bytes, checksum: 112de5671b9d3e521f0446f6d6d7237e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-27T13:57:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2630530 bytes, checksum: 112de5671b9d3e521f0446f6d6d7237e (MD5) Previous issue date: 2004-03-31 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Alguns aspectos da interação entre o gene de resistência Sw-5 e os tospovírus, foram analisados neste trabalho. A capacidade de Sw-5 conferir resistência em Nicotiana benthamiana foi avaliada em plantas transformadas com uma construção na qual a ORF e a região 3' do gene estavam sob controle do promotor 35S. As plantas transformadas foram resistentes à infecção por tospovírus. A comparação do espectro da resistência destas plantas com o observado para outras solanáceas , indica que as vias de sinalização e as respostas de defesa ativadas por Sw-5 estão conservadas nesta família, e que o polimorfismo genético nos componentes das vias de transdução de sinais pode resultar em diferentes níveis de resistência. A fim de identificar o gene de avirulência dos tospovírus, os genes N, NSm e NSs , foram expressos isoladamente ou em combinações, por meio do vetor viral PVX, em plantas com Sw-5. A expressão destes genes não foi capaz de desencadear a resposta de hipersensibilidade e tampouco interferiu na infecção da planta por PVX. Portanto, outro componente dos tospovírus deve ser responsável pelo desencadeamento da reação de resistência. Independentemente da presença do gene Sw-5, a expressão do gene NSs por meio do PVX , agravou os sintomas provocados por este vírus em algumas solanáceas, o que pode ter relação com a capacidade desta proteína de suprimir silenciamento gênico. Em plantas com Sw-5, a co-expressão da região 5' deste gene por meio do vetor PVX , favoreceu a infecção sistêmica por tospovírus. Uma vez que o efeito foi observado tanto para expressão senso quanto anti-senso, a redução dos níveis de mRNA de Sw-5 provocada por silenciamento gênico , poderia ser a causa desta interferência na resistência, embora a análise de Northern blot não tenha demonstrado tal redução. Uma seqüência homóloga a Sw-5 contendo uma ORF sem deleções ou interrupções prematuras foi clonada a partir do acesso LA371-20 de Lycopersicon peruvianum. Análises moleculares demonstraram que esta seqüência é originada do loco Sw-5 ou de região próxima a este e que segrega com a resistência a tospovírus. A capacidade deste e de outros três homólogos oriundos de distintos acessos de tomateiro de conferir resistência a tospovírus, foi avaliada em plantas transgênicas de tomateiro e tabaco. As plantas transformadas foram suscetíveis ao vírus. A não-funcionalidade destes homólogos pode ser devido à estrutura das construções utilizadas na transformação. Alternativamente, outros homólogos presentes nestes acessos de tomateiro podem ser os responsáveis pela resistência. / In this work some aspects of the tospovirus - Sw-5 interaction was analyzed. The capacity of the Sw-5 to confer resistance in Nicotiana benthamiana was evaluated in transgenic plants transformed with Sw-5 ORF containing its own 3 ́ UTR region under 35S promoter control. Transgenic plants were resistant to tospovirus infection. Comparisons of the resistance spectrum with other members of the Solanaceae suggest that the signal transduction pathways and resistance responses triggered by Sw-5 are conservated in solanaceae and that the genetic polymorphism in the signal transduction components may result in different resistance levels. The N, NSm and NSs genes isolated or in combination were expressed by PVX vector in plants harboring Sw-5 in order to detect the tospovirus avirulence gene. These genes were not able to trigger the hypersensitive response and to affect PVX infection in Sw-5 plants, which suggest that another tospovirus component is the elicitor of the resistance response. Independently of the Sw-5 gene, PVX clones harboring NSs gene induced more severe symptoms in some solanaceae plants. Gene silencing may be the cause of this symptoms. In transgenic plants harboring Sw-5 gene, the co-expression of the 5 ́ region of this gene by PVX favored tospovirus infection. As this effect was observed both for 5 ́ sense and anti- sense constructions it is possible that it has been caused by reduction on mRNA levels by gene silencing, although Northern blot analysis did not agree with this hypothesis. An Sw-5 homolog was cloned from LA371-20 accession. This homolog is localized in or near of Sw-5 locus and segregated with tospovirus resistance. The capacity of this and other three homologs originated from others accessions to confer tospovirus resistance was evaluated in tobacco and tomato transgenic plants. All the transformants were susceptible to the virus. Other homologs presents in the different accessions evaluated may be responsible for the resistance, although problems in the structure of the constructions can not be discarded. / Tese importada do Alexandria

L'endosymbiose racinaire entre les plantes et les champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA) permet aux plantes d'avoir un meilleur accès aux nutriments du sol. Pour cette raison, cette endosymbiose joue un rôle majeur dans les écosystèmes et pour l'agriculture durable. Les étapes clés de la colonisation des racines par les CMA sont: 1) la pénétration des CMA dans le système racinaire à travers les cellules de l'épiderme et du cortex externe, et 2) la formation dans les cellules du cortex interne d'une structure ramifiée appelée arbuscule, qui permet des échanges entre les cellules végétales et les hyphes fongiques. L'établissement de cette symbiose implique une communication entre les deux partenaires. Les plantes produisent des hormones, les strigolactones qui induisent chez les CMA la production de signaux symbiotiques : des lipo-chitooligosaccharides (Myc-LCO) et des chitooligosaccharides courts (Myc-COs). Les Myc-LCO et les Myc-CO induisent des réponses moléculaires et physiologiques chez les plantes qui sont capables de former des mycorhizes à arbuscules. Cependant, leur rôle exact dans l'établissement des mycorhizes à arbuscules n'est pas connu. La difficulté à cultiver et transformer le partenaire fongique de cette symbiose rend la recherche compliquée du côté fongique. Du côté des plantes, on sait que des membres de la famille des récepteurs kinases à domaines lysin (LysM-RLK) perçoivent des LCO et des CO produits par divers microorganismes et sont donc de bons candidats pour percevoir des Myc-LCO et des Myc-CO. La plupart des recherches sur les mycorhizes à arbuscules sont réalisées chez des légumineuses, espèces chez lesquelles plusieurs duplications de gènes codant les LysM-RLK ont eu lieu. J'ai donc utilisé lors de mon doctorat des Solanaceae (Solanum lycopersicum, Petunia hybrida et Nicotiana benthamiana) pour étudier le rôle de deux récepteurs putatifs de Myc- LCO, codés par les gènes LYK10 et LYK4. Ces deux gènes, physiquement proches l'un de l'autre dans les génomes de la plupart des dicotylédones, proviennent probablement d'une ancienne duplication en tandem. En utilisant une approche biochimique, nous avons montré que SlLYK10 de S. lycopersicum est capable de lier des LCO avec une haute affinité. De plus, j'ai montré que le promoteur de SlLYK10 est exprimé dans l'épiderme et le cortex externe avant la colonisation par les CMA, puis dans des cellules contenant des arbuscules au cours de la colonisation par les CMA. Enfin, des approches de génétique inverse chez la tomate et le pétunia ont permis de démontrer que LYK10 contrôle la pénétration des CMA dans les racines et la formation des arbuscules. Ces résultats suggèrent que LYK10 perçoit les LCO et active chez les plantes la machinerie nécessaire à la pénétration de CMA dans les cellules végétales et à la formation des arbuscules. / The root endosymbiosis between plants and arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) allows the plants to have a better access to soil nutrients. For this reason this endosymbiosis plays a major role in ecosystems and in sustainable agriculture. The key steps for AMF colonization are: 1) the AMF penetration in the root system through crossing epidermal/outer cortical cells, and 2) the formation of a branched inner cortex structure called arbuscules that permits exchanges between plant cells and fungal hyphae. The establishment of this symbiosis involves communication between the two partners of the symbiosis. Plants produce strigolactones, hormones that induce in AMF the production of symbiotic signals : lipo-chitooligosaccharides (Myc-LCOs) and short chitooligosaccharides (Myc-COs). Both Myc-LCOs and Myc-COs induce plant molecular and physiological responses known to be associated with the formation of arbuscular mycorrhiza (AM). However, theit exact role in AM establishment is unknown. The difficulty to grow and transform the fungal partner of this symbiosis makes the research complicated on the fungal side. On the plant side, members of the lysin motif receptor-like kinase (LysM-RLK) family are known to perceive LCOs and COs produced by various microorganisms and are thus good candidates to perceive Myc-LCOs and Myc-COs. Most of the laboratory researches on AM conducted worldwide are performed on legumes where the LysM-RLK family has encountered several gene duplications. During my PhD I used Solanaceae species (Solanum lycopersicum, Petunia hybrida and Nicotiana benthamiana) to study the role of two candidate Myc-LCO receptors encoded by the genes LYK10 and LYK4. These two genes are physically close to each other in genomes of most of the dicotyledons and likely originate from of an ancient tandem duplication. By using a biochemical approach, we showed that S. lycopersicum SlLYK10 is able to bind LCOs with high affinity. Moreover, I showed that SlLYK10 promoter is expressed in epidermis/outer cortex before AMF colonization and also in arbuscule-containing cells during colonization. Finally, reverse genetic approaches in tomato and petunia allowed demonstrating that LYK10 controls AMF penetration into the roots and arbuscule formation. Taken together, these results suggest that LYK10 perceive LCOs and induce/activate the plant machinery required for AMF penetration into plant cells. Altogether this strongly suggests that LCOs play a role in AMF perception by plant during AM establishment. By using the same approaches, we found that N. benthamiana NbLYK4, as its orthologs in legumes and other dicotyledons, also binds LCOs with high affinity and is involved in AM establishment and plant defence. NbLYK4-silenced plants showed reduced responses to defence elicitors and increased colonization by pathogens and AMF. This led to the hypothesis that LYK4 perceives LCOs and locally inhibits plant defence during AMF colonization. This strongly suggests that Myc-LCOs are able to regulate plant defence. In conclusion, at least two proteins are involved non-redundantly in LCO perception in Solanaceae, LYK10 and LYK4 and regulates complementary plant machineries required for AMF colonization.

Genetic information must be protected, maintained and copied from cell to daughter cells, from generation to generation. In plants, most of the cells contain complete genetic information, and many of these cells can regenerate to a whole new plant. Such a feature leads to the need for precise control of which genes will be active and which not because in growth and differentiation, only the activity of specific genes for the individual cells, tissues, organs are required. One of the mechanisms controlling the gene activity is RNA interference (RNAi), which down- regulates or blocks the expression of specific genes at the transcriptional or post-transcriptional level. The crucial part of the RNAi is guiding the RNAi machinery to the target. It is mediated via sequence complementarity of the target with a small RNA (sRNA), which is diced from a double- stranded RNA (dsRNA) precursor. The molecular mechanism of dsRNA and sRNA formation and also the target origin predestinates the subsequent silencing pathway. In transcriptional gene silencing (TGS), the gene expression is regulated through chromatin epigenetic modifications. One of the epigenetic marks is cytosine methylation, which is established mainly by RNA-directed DNA-methylation (RdDM) pathway. Although the protein machinery was relatively...

Interés del estudio: Los viroides son patógenos exclusivos de plantas que infectan un gran número de especies de interés agronómico. Sin capacidad descrita para codificar proteínas, todas las fases de su ciclo vital son estrictamente dependientes de su interacción con factores del huésped. Históricamente se ha asumido que la patogénesis es consecuencia de la competencia huésped-patógeno por factores celulares implicados en el ciclo vital del viroide. En los últimos años se ha propuesto que la respuesta de silenciamiento de RNA (RNAi) del huésped frente a estos patógenos es la responsable de la respuesta patogénica de los viroides. En el presente trabajo se ha tratado de estudiar en profundidad la relación entre el mecanismo de silenciamiento de RNA y la patogénesis viroidal (en concreto del viroide del enanismo del lúpulo, HSVd). Objetivos: 1- Estudiar el proceso de patogénesis inducido por HSVd y la maquinaria de RNAi 2- Caracterizar mediante secuenciación masiva los sRNAs derivados de HSVd (vd-sRNAs). 4- Analizar la distribución diferencial de vd-sRNAs en distintos tejidos (hoja y floema). 5- Determinar las alteraciones inducidas por la infección en las vías endógenas de RNAi. Elementos de la metodología a destacar: - Uso de un sistema transgénico para estudiar el fenómeno de la patogénesis. - Uso de técnicas de secuenciación masiva para la caracterización de sRNAs. - Análisis bioinformático de los datos generados por la secuenciación masiva. Resultados logrados: - Primera publicación en la literatura de la relación de un componente de las rutas de RNAi en la patogénesis viroidal ocasionada por HSVd. - Publicación de una de las primeras secuenciaciones masivas de sRNAs derivados del HSVd. - Primera caracterización de las poblaciones de sRNAs endógenos de C.sativus, incluyendo la primera caracterización de microRNAs en esta especie. - Identificación y detección de nuevos microRNAs en C.sativus. / Martínez Arias, GE. (2011). Relación entre el silenciamiento de RNA y la patogénesis inducida por un viroide con replicación nuclear [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/11302

[EN] During viral infections, the outcome of the infective process is a net balance between the compatible and defence interactions. When a virus infects the eukaryotic cell, it must deal with different host defence mechanisms among which RNA silencing is part of the initial plant innate defence response. RNA silencing in plants has the role of restraining viral proliferation in the infected cell and therefore regulates the equilibrium between viral load and plant cell integrity that is key for the plant-virus compatibility. The virus itself is inductor, target and suppressor of the RNA silencing in plants. Viral silencing suppressor proteins (VSR) counteract host antiviral silencing and modify the host gene expression programme to generate a permissive environment for compatible infections. In this PhD thesis we have studied the interface between viral and plant RNA silencing in the context of a compatible infection. Using Tobacco rattle virus (TRV) as a model viral system and Nicotiana benthamiana and Arabidopsis thaliana as host model systems, we have dissected the role of endogenous small RNAs to promote gene silencing responses to viral sequences. Our results point to possible functional interactions between miRNAs and complementary sequences in viral genomes even though the role of those interactions as a viral proliferation controls mechanisms is not part of this thesis. We have found that TRV 16K silencing suppressor protein effects play a central role to dictate the way the TRV and plant RNA silencing interact. The 16K protein avoids, partially, the assembly of silencing effectors complexes and thus compromises the impact of antiviral vsiRNAs-mediated and endogenous small RNAs-mediated RNA silencing. The suppressor effect of TRV does not have a significant impact on the miRNAs content, relative composition and activity although we cannot discard an effect on the metabolisms of some particular miRNA species. / [ES] En las infecciones por virus, el desenlace del proceso infectivo debe entenderse como el resultado neto de las interacciones compatibles y de defensa entre el virus y la planta hospedadora. Cuando un virus entra en una célula eucariota debe lidiar con la activación de diferentes mecanismos de defensa del huésped. El silenciamiento génico mediado por RNA constituye una primera línea de defensa innata de la planta, siendo los propios virus inductores, dianas y supresores de este sistema de defensa. Las plantas a través del silenciamiento génico son capaces de limitar la proliferación viral en las células infectadas permitiendo un delicado equilibrio entre la multiplicación del virus y la integridad celular. Sobre este equilibrio se fundamenta la relación de compatibilidad en la interacción planta-virus. En este escenario, los virus utilizan sus proteínas supresoras de silenciamiento (VSR) para modular los efectos antivirales del silenciamiento y reprogramar la expresión génica del huésped proporcionando un entorno favorable para el desarrollo de la infección compatible Con este trabajo hemos abordado el modo en que los virus interaccionan con el silenciamiento génico en el contexto de una infección compatible. Empleando el virus del cascabeleo del tabaco (TRV) como sistema viral y Nicotiana. benthamiana y Arabidopsis thaliana como modelos de huésped, hemos indagado en el potencial de los pequeños RNAs (sRNAs) endógenos para guiar procesos de silenciamiento sobre secuencias virales. Nuestros resultados suLa manera en que TRV interacciona con la ruta de silenciamiento está condicionada gieren la posibilidad de interacciones funcionales entre microRNAs (miRNAs) y secuencias complementarias en el genoma del virus, si bien su relevancia como mecanismo de control de la proliferación viral no se ha estudiado en este trabajo. por el efecto supresor de la proteína 16K. Esta proteína impide, al menos parcialmente, el ensamblaje de los complejos efectores de silenciamiento y puede por tanto comprometer el efecto del silenciamiento antiviral dependiente de sRNAs tanto virales (vsiRNAs) como endógenos. El efecto supresor de TRV no parece perturbar globalmente el contenido, composición relativa y actividad de los miRNAs, si bien no es descartable que induzca alteraciones en el metabolismo de especies concretas. / [CA] En les infeccions per virus, el desenllaç del procés infectiu ha d'entendre's com el resultat net de les interaccions compatibles i de defensa entre el virus i la planta hoste. Quan un virus entra a una cèl·lula eucariota ha de lluitar amb l'activació de diferents mecanisme de defensa de l'hoste. El silenciament gènic per RNA constitueix una primera línia de defensa innata de la planta, i els propis virus son inductors, dianes i supressors d'aquest sistema de defensa. Les plantes a través d'aquest silenciament, són capaces de limitar la proliferació viral a les cèl·lules infectades, permetent un delicat equilibri entre la multiplicació del virus i la integritat cel·lular. En aquest equilibri es fonamenta la relació de compatibilitat existent a la interacció planta-virus. En aquest escenari, els virus utilitzen les seues proteïnes supressores de silenciament (VSR) per tal de modular els efectes antivirals del silenciament i reprogramar l'expressió gènica de l'hoste, proporcionant un entorn favorable per al desenvolupament de la infecció compatible. Amb aquest treball hem abordat la manera en la que els virus interaccionen amb el silenciament gènic en el context d'una infecció compatible. Emprant el virus del cascavelleig del tabac (TRV) com a sistema viral i Nicotiana. benthamiana i Arabidopsis thaliana com a hostes models, hem indagat en el potencial dels RNAs endògens curts de doble cadena (sRNAs) per guiar processos de silenciament sobre seqüències virals. Els nostres resultats suggereixen la possibilitat de interaccions funcionals entre microRNAs (miRNAs) i seqüències complementàries al genoma del virus, tot i que la seua rellevància com a mecanisme de control de la proliferació viral no ha estat tractat en aquest treball. La manera en la que TRV interacciona amb les rutes de silenciament es troba condicionada per l'efecte supressor de la proteïna 16K. Aquesta proteïna impedeix, al menys parcialment, l'acoblament dels complexos efectors del silenciament i pot llavors comprometre l'efecte del silenciament antiviral depenent de sRNAs, tant virals (vsiRNAs) com endògens. L'efecte supressor de TRV no sembla pertorbar globalment el contingut, composició relativa i activitat dels miRNAs, tot i que no es pot descartar que induïsca alteracions en el metabolisme d'espècies concretes. / Martínez Priego, L. (2016). Actividad antiviral de pequeños RNAs endógenos y supresión de silenciamiento génico por la proteína 16K del virus del cascabeleo del tabaco (TRV) [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/61464

[ES] El éxito de la fertilización en las Angiospermas depende del adecuado y coordinado desarrollo de los diferentes tejidos del gineceo: ovario, estilo y estigma. Los mecanismos moleculares asociados a la correcta formación y desarrollo del gineceo han sido bien estudiados en la especie modelo Arabidopsis thaliana. Diversos genes pertenecientes a múltiples familias de factores de transcripción han sido sugeridos como reguladores indispensables en la correcta formación del estilo y el estigma de las Angiospermas. Entre ellas se encuentran la familia basic Helix Loop Helix, bHLH. Los genes HECATE (HEC) pertenecen al linaje de genes HEC1/2/3/IND. Análisis filogenéticos han revelado que las Angiospermas poseen, al menos, tres copias de genes HEC (HEC1/2/3), mientras que el gen INDEHISCENT (IND) es un parálogo especifico de HEC3 en Brassicaceae; las demás Angiospermas poseen homólogos preduplicación más similares a HEC3 que a IND. Funcionalmente, en Arabidopsis, los genes HEC1/2/3 son redundantes en la correcta formación de gineceo, mientras que IND tiene funciones en la diferenciación de la zona de dehiscencia del fruto. Así, nos propusimos conocer las funciones de los genes HEC, previas a la diversificación de Brassicaceae. Particularmente estudiamos los ortólogos de los genes HEC1/2/3 en Nicotiana benthamiana. En nuestro estudio, los genes NibeHEC1/2 solo se expresan en meristemos vegetativos y hojas, mientras que NibeHEC3 se expresa predominantemente durante el desarrollo de la flor y aumenta su expresión progresivamente hasta la antesis en el tracto de transmisión del estilo, el estigma y las zonas de dehiscencia de anteras y frutos, de un modo similar al que lo hacen conjuntamente los genes HEC1/2/3/IND en Arabidopsis. La caracterización funcional por VIGS y CRISPR-Cas9 nos confirmó que NibeHEC3 está implicado en la elongación de la región estilar y la diferenciación de las papilas estigmáticas. Además, NibeHEC3 es importante en el desarrollo de las anteras y los frutos de Nicotiana benthamiana. En conjunto, los datos reportados más nuestra caracterización funcional sugieren que los genes HEC3, previos al evento de duplicación del linaje HEC3/IND, conservan las funciones ancestrales en el desarrollo de la región más distal del gineceo y la diferenciación de la zona de dehiscencia de frutos, mientras que en Brassicacaceae, luego de la duplicación del linaje HEC3/IND, estas dos funciones parecen haberse subfuncionalizado durante la diversificación de la familia Brassicaceae entre los genes HEC1/2/3 e IND respectivamente. Además, describimos una novedosa función para los genes HEC3 asociada al desarrollo de las anteras en Nicotiana benthamiana, una función con la cual no se había asociado a los genes HEC con anterioridad. Así, el dilucidar detalles adicionales acerca de las funciones de los genes HEC y sugerir como estos interactúan para la formación del gineceo en eudicotiledóneas fuera de Brassicaceae ayudará a proporcionar información sobre diversos aspectos en la evolución y desarrollo del gineceo y del fruto en Angiospermas. / [CA] L'èxit de la fertilització en les Angiospermes depén de l'adequat i coordinat desenvolupament dels diferents teixits del gineceu: ovari, estil i estigma. Els mecanismes moleculars associats a la correcta formació i desenvolupament del gineceu han sigut ben estudiats en l'espècie model Arabidopsis thaliana. Diversos gens pertanyents a múltiples famílies de factors de transcripció han sigut suggerits com a reguladors indispensables en la correcta formació de l'estil i l'estigma de les Angiospermes. Entre elles es troben la família basic Helix Loop Helix, bHLH. Els gens HECATE (HEC) pertanyen al llinatge de gens HEC1/2/3/IND. Anàlisis filogenètiques han revelat que les Angiospermes posseeixen, almenys, tres còpies de gens HEC (HEC1/2/3), mentre que el gen INDEHISCENT (IND) és un paràleg específic d'HEC3 en Brassicaceae; les altres Angiospermes posseeixen homòlegs preduplicació més similar a HEC3 que a IND. Funcionalment, en Arabidopsis, els gens HEC1/2/3 són redundants en la correcta formació de gineceu, mentre que IND té funcions en la diferenciació de la zona de dehiscència del fruit. Així, ens vam proposar conéixer les funcions dels gens HEC, previs a la diversificació de Brassicaceae. Particularment estudiem els ortòlegs dels gens HEC1/2/3 en Nicotiana benthamiana. En el nostre estudi, els gens NibeHEC1/2 només s'expressen en meristemes vegetatius i fulles; mentre que NibeHEC3 s'expressen predominantment durant el desenvolupament de la flor i augmenten la seua expressió progressivament fins a l'antesi; aquests es mantenen expressats en el tracte de transmissió de l'estil, l'estigma i les zones de dehiscència d'anteres i fruits. Igual que ho fan conjuntament els gens HEC1/2/3/IND en Arabidopsis. La caracterització funcional per VIGS i CRISPR-Cas9 ens va confirmar que NibeHEC3 està implicat en l'elongació de la regió estilar i la diferenciació de les papil·les estigmàtiques. A més, NibeHEC3 és important en la diferenciació de les anteres y la zona de dehiscència de fruits de Nicotiana. Així mateix, les variacions detectades entre les seqüències dels ortòlegs del clade HEC3/IND podria explicar els canvis funcionals i els patrons d'expressió diferencials entre les espècies d'angiospermes. En conjunt, les dades reportades més la nostra caracterització funcional suggereixen que els gens HEC3, previs a la duplicació del llinatge HEC3/IND, conserven les funcions ancestrals en el desenvolupament de la regió més distal del gineceu i la diferenciació de la zona de dehiscència de fruits, mentre que en Brassicacaceae, després de la duplicació del llinatge HEC3/IND, aquestes dues funcions semblen haver-se subfuncionalitzat durant la diversificació de la família Brassicaceae entre els gens HEC1/2/3 i IND respectivament. A més, descrivim una nova funció per als gens HEC3 associada a la diferenciació de les anteres en Nicotiana benthamiana, una funció amb la qual no s'havia associat als gens HEC amb anterioritat. Així, el dilucidar detalls addicionals sobre les funcions dels gens els HEC i suggerir com aquests interactuen per a la formació del gineceu en eudicotiledònies fora de Brassicaceae ajudarà a proporcionar informació sobre diversos aspectes en l'evolució i desenvolupament del gineceu i del fruit en Angiospermes. / [EN] Successful fertilization in Angiosperms depends on the proper and coordinated development of the different tissues of the gynoecium: ovary, style and stigma. The molecular mechanisms associated with the correct formation and development of the gynoecium have been well studied in the model species Arabidopsis thaliana. Several genes belonging to multiple families of transcription factors have been suggested as indispensable regulators in the correct formation of the style and stigma in Angiosperms. Among them are the basic Helix Loop Helix family, bHLH. The HECATE (HEC) genes belong to the HEC1/2/3/IND gene lineage. Phylogenetic analyses have revealed that Angiosperms possess at least three copies of HEC genes: HEC1/2/3, whereas the INDEHISCENT (IND) gene is a specific HEC3 paralog in Brassicaceae; the other Angiosperms possess pre-duplication homologs more like to HEC3 than to IND. Functionally, in Arabidopsis, HEC1/2/3 genes are redundant in proper gynoecium formation while IND has functions in the differentiation of the fruit dehiscence zone. Thus, we set out to understand the functions of HEC genes prior to diversification of Brassicaceae In particular, we studied the orthologs of the HEC1/2/3 genes in Nicotiana benthamiana. In our study, NibeHEC1/2 genes are only expressed in vegetative meristems and leaves; while NibeHEC3 genes are predominantly expressed during flower development and increase their expression progressively until anthesis; they remain expressed in the style transmission tract, stigma and dehiscence zones of anthers and fruits. The same is true for the HEC1/2/3/IND genes in Arabidopsis. Functional characterization by VIGS and CRISPR-Cas9 confirmed that NibeHEC3 is involved in the elongation of the stylar region and differentiation of stigmatic papillae. In addition, NibeHEC3 is important in anther development and the differentiation of the dehiscence zone of Nicotiana benthamiana fruits. Taken together, the reported data plus our functional characterization suggest that HEC3 genes, prior to the HEC3/IND lineage duplication event, retain ancestral functions in the development of the most distal region of the gynoecium and the differentiation of the fruit dehiscence zone, whereas in Brassicaceae, after the duplication of the HEC3/IND lineage, these two functions appear to have been sub-functionalized during the diversification of the Brassicaceae family between the HEC1/2/3 and IND genes, respectively. In addition, we describe a novel function for the HEC3 genes associated with anther development in Nicotiana benthamiana, a function not previously reported for the HEC genes. Thus, elucidating additional details about the functions of the HEC genes and suggesting how they interact for gynoecium formation in eudicots outside Brassicaceae will help to provide insights into various aspects of gynoecium and fruit evolution and development in Angiosperms. / Agradezco a la beca Santiago Grisolia (GRISOLIA/2017/170), al Ministerio de Ciencias e Innovación BIO2015-64531-R, RTI2018-099239-B-I00 y el ExpoSeed H2020-MSCA- RISE-2015-691109 por facilitar la realización de esta investigación. / Ortiz Ramírez, CI. (2023). Evolución y caracterización funcional de los genes HEC3 en el desarrollo de flores y fruto de Nicotiana benthamiana [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/193298

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Barley is one of the most important crop species in Turkey and powdery mildew is one of the most common pathogen decreasing yield in barley. For this problem, agricultural biologists apply breeding technologies in order to select and propagate resistant barley cultivars. However, this is not a permanent solution since pathogens evolve rapidly to overcome plant resistance mechanisms. On the other hand, molecular plant pathologists are trying to understand basic mechanisms underlying plant-pathogen interactions by using molecular tools in order to develop long term solutions for preventing yield loss. In this thesis, miR159 mediated regulation of barley GAMyb transcription factor is studied. According to microRNA microarray results regarding to infection with powdery mildew pathogen Blumeria graminis f.spp hordei (Bgh) at different time points, miR159 expression level showed significant differences. Bioinformatics analysis revealed that miRNA159 targets GAMyb gene in barley. In order to investigate this relationsh&amp / #8223 / p, both miRNA and miRNA target were cloned into GFP containing expression vectors through Gateway cloning and resulting vectors were transformed into Nicotiana benthamiana through Agrobacterium mediated gene transfer. Observations based on GFP expression showed that miRNA159 targets and decreases the expression of GAMyb in vivo. v To conclude, this study can be evaluated as a distinctive study for two aspects / (i) it is the first study assessing a &ldquo / putative&rdquo / barley miRNA function biologically and (ii) developed a practical and effective functional assay for miRNA studies in plants.

A movement protein Potato virus X (PVX) chimera virus (PVX.GFP(CH3)) bearing the grapevine virus Grapevine rupestris stem pitting-associated virus (GRSPaV) triple gene block proteins (TGB) (denoted P1, P2 and P3) instead of the PVX TGB was delivered into N. benthamiana and other related species by agro-inoculation. This movement protein PVX chimera virus was found to be unable to support the local and systemic movement of PVX in cis. Local and systemic movement of this PVX chimera virus was restored in trans by the dianthovirus Red clover necrotic mosaic virus (RCNMV) movement protein and by a PVX TGB rescue virus that replaced the GRSPaV TGB with the PVX TGB (PVX.GFP(Rescue)). However, a PVX TGB hybrid chimera virus (PVX.GFP(HY2)) containing PVX P1 and the GRSPaV TGB had limited cell-to-cell, but not systemic, movement.