O óxido nítrico (NO) é um mensageiro biológico que tem vital importância em muitos processos fisiológicos, tais como o controle cardiovascular, a sinalização neural e a defesa contra microorganismos e tumores. Sua natureza radicalar lhe confere grande reatividade e versatilidade e torna um desafio o entendimento de sua bioquímica. A molécula de NO reage rapidamente com alguns metais de transição e forma compostos estáveis denominados complexos nitrosilos, os quais podem ser utilizados como fonte geradora de óxido nítrico. Neste caso, faz-se necessário o entendimento do comportamento físico-químico desses compostos. No presente trabalho foram sintetizados os complexos: [RuII(terpy)(L)NO]n+ onde o ligante terpy = 2,2:6,2- terpiridina e L = cloreto (Cl-), 2,2-bipiridina (bpy), benzoquinonadiímina (bdqi-COOH) e benzoquinonadiamina (bdcat-COOH). Os estudos fotoquímicos e farmacológicos desses novos compostos do tipo [RuII(terpy)(L)NO]n+ foram feitos em meio aquoso. Os compostos nitrosilos de rutênio sintetizados mostraram fotolabilização do óxido nítrico (NO) sob irradiação em 355 nm com rendimento quântico de 0,14 0,02, 0,47 0,03 e 0,46 0,02 mol eistein-1 para L = bpy, bdqi-COOH e bdcat-COOH, respectivamente, e 0,0065 0,001 mol eistein-1 para irradiação em 532 nm a partir do complexo [Ru(bdqi-COOH)(terpy)NO]3+. O caminho fotoquímico para irradiação em 355 foi descrito envolvendo diferentes etapas de reação. No entanto, apenas um caminho reacional foi mais bem atribuído para a irradiação em 532 nm, envolvendo o mecanismo de transferência eletrônica fotoinduzida. O efeito de vasodilatador ocasionado pelo NO a partir da irradiação do complexo [Ru(bdqi-COOH)(terpy)NO]3+ na região do visível foi comparado ao nitroprussiato de sódio (NSP). Os resultados foram bastante semelhantes entre ambas as espécies. Similares estudos farmacológicos foram feitos para o complexo [Ru(NO2)(bpy)(terpy)]+ em meio fisiológico e sob irradiação em 355 nm. O mecanismo fotoquímico descrito para tal composto se baseia na formação de dois fotoprodutos, onde (I) há fotoaquação do fragmento RuII-NO2 produzindo as espécies RuII-H2O e NO2- e uma segunda etapa (II) devido à dissociação homolítica do NO a partir do nitrito coordenado, formando as espécie RuII-OH2 e NO. Baseado no mecanismo fotoquímico, o nitro complexo de rutênio foi incorporado a uma microemulsão água óleo (W/O) e utilizada em estudos de vasodilatação muscular. O tempo observado para o máximo de relaxamento muscular promovido pelo complexo [Ru(NO2)((bpy)terpy)]+ foi de 50 minutos. Todos os complexos nitrosilos de rutênio descritos neste trabalho foram avaliados como doadores de NO encapsulados em matrizes sólidas. Os complexos [RuII(terpy)(L)NO]n+ foram encapsulados em matrizes do tipo sol-gel e silicone e submetidos a irradiação na região do ultravioleta (355 nm) e visível (532 nm). Todos as matrizes mostraram se tratar de material amorfo. A microscopia eletrônica de varredura mostrou partículas com formas irregulares, com tamanho de 1000 m para ambas as matrizes e distribuição homogênea. A fotólise das matrizes encapsuladas com complexos nitrosilos de rutênio foram imersas em solução tampão pH = 7,40 e a 37,0 0C. A cinética de liberação de NO a partir desses sistemas mostrou ser do tipo primeira ordem . / Nitric oxide (NO) is a biological messenger. It has been implicated in many physiological processes, including cardiovascular control, neuronal signaling, and defence against microorganism and tumors. Its radicalar nature gives it great reactivity and versatility, and makes the knowledge of its biochemistry a challeng. The NO molecule reacts fast with some transition metal resulting stable compounds named nitrosyl complexes that can be used as nitric oxide producers. For such use, it is necessary a good understanding of the physical-chemical behavior of these complexes. In the present work, the following complexes were synthesized: [RuII(terpy)(L)NO]n+ where terpy = 2,2:6,2 - terpyridine and L = chloride (Cl- ), 2,2 -bipiridine (bpy), benzoquinonediimine (bdqi-COOH) e benzoquinonediamine (bdcat-COOH). The compounds were isolated and characterized by elementary analysis, by spectroscopy (UV-visible, infrared, and fluorescence), HPLC, electrochemical techniques (cyclic and differential pulse voltammetry) and spectroeletrochemistry. Infrared spectroscopy has show band at 1850 cm-1 1960 cm-1 region attributed, to nNO stretching. The oxidation state for benzoquinone ligands were also characterized by this technique and shows band at 1700 cm-1 and 1280 cm-1, for L = bdqi-COOH and bdcat-COOH species, respectively. UV-visible spectra have displayed bands in the ultraviolet region originated by p®p* transition of the unsatured ligands and bands in 350 - 380 nm region characterized as MLTC due dp(RuII)®p*(NO+) transition. The [Ru(bdqi-COOH)(terpy)NO]3+ spectrum has also shown the MLTC band in 510 nm due the dp(RuII)®p*(bdqi-COOH) transition. Electrochemical experiments have revealed two processes in the nitrosyl ligand: NO+/NO0 e NO0/NO-. The different nitrosyl redox potential depends on the inductive effects of ligand L. The complexes were irradiated in a Nd:YAG laser flash photolysis apparatus at ultraviolet (355 nm) and visible (532 nm) irradiation. During the irradiation the NO liberation was measured in situ by amperometry, and the solution spectral change was verified by UV-visible spectroscopy. The amperometric detection was done by a NO sensor electrode (NOmeter), which data were the base to calculate the quantum yields of NO liberation (fNO). For all complexes, fNO were determined in 355 nm light irradiation. The photochemical pathway at 355 nm light irradiation was described as a differents photochemical mechanism. The photochemical mechanism for NO releasing by [Ru(bdqi-COOH)(terpy)NO]3+ complex under 532 nm light irradiation involves an intramolecular photoinduced electron transfer. Biological studies showed that [Ru(bdqi-COOH)(terpy)NO]3+ complex can be considered a promising drug. Their vasodilatation action is similar to sodium nitroprusside (SNP) and cytotoxic action diminishi 74 % for celular viability for metastatic cell.

Os complexos trans-[Ru(NO)(NH3)4(L)](X)3 (1), [Ru(NO)(Hedta)] (2) e seus precursores sintéticos trans-[Ru(H2O)(NH3)4(L)](X)2 (3), trans-[Ru(SO4)(NH3)4(L)](X) (4) , onde L = isn, nic, imN, 4-pic, py, P(OEt) e X = PF6 - e BF4 -, foram testados como captadores dos radicais livres DPPHo, OHo e O2 -o em meio aquoso. O potencial de oxidação do centro metálico nos complexos (1) foram estimados utilizando eletrodo de diamante dopado com boro como eletrodo de trabalho, estando situados em meio aquoso acima de 2,0 V vs. ECS (CH+ = 1,0 x 10-3, µ = 0,1 mol L-1). Os complexos (1) e (2) mostraram-se incapazes de reagir com o radical DPPHo, exceto o complexo trans-[Ru(NO)(NH3)4(P(OEt)3)]3+, que reagiu apenas em grande excesso (50 vezes) em relação ao radical DPPHo. Os complexos (3) reagiram quando em excesso ou em proporção estequiométrica. O mecanismo pelo qual esta reação ocorre é predominantemente o de transferência de elétrons. O radical OHo foi captado pelos complexos (1), sendo provavelmente o mecanismo predominante o de transferência de elétrons pela oxidação do centro metálico [Ru(NO)]3+ a [Ru(NO)]4+, compatível com o potencial de oxidação do radical OHo (acima de 2,8 V vs. ECS) reportado na literatura para este radical. As constantes de velocidade específica para estas reações foram estimadas como estando no intervalo de 108 a 1010 M-1 s-1. Não foi observada reação entre o radical OHo e os complexos (4). Os complexos (1) e (2) captam o radical O2 -o pela redução do ligante NO+ com constantes de velocidade específicas no intervalo de 2,0 ± 1,0 x 104 a 4,2 ± 1,0 x 105 M-1 s-1, em medidas efetuadas via cinética de competição com citocromo c. Após a redução, a liberação de NO foi acompanhada via eletrodo seletivo a NO e espectrofotometricamente pela reação do NO com o citocromo c. Nas condições experimentais utilizadas, não se observou a formação do íon peroxinitrito (ONOO-). Os complexos (3) e (4) não reagiram com o radical O2 -o. / The complexes trans-[Ru(NO)(NH3)4(L)](X)3 (1), [Ru(NO)(Hedta)] (2) and their synthetic precursors trans-[Ru(H2O)(NH3)4(L)](X)2 (3), trans-[Ru(SO4)(NH3)4(L)](X) (4) , where L = isn, nic, imN, 4-pic, py, P(OEt) e X = PF6 - and BF4 -, were tested as scavengers for the radicals DPPHo, OHo e O2 -o in aqueous media. The redox potential for the metal center in the complexes (1) were obtained a using boron doped diamond electrode as working electrode. The redox potentials values for ruthenium nitrosyl complexes were higher than 2,0 V vs. SCE. The complexes (1) and (2) were unable to reduce the radical DPPHo, excepted the complex ion trans-[Ru(NO)(NH3)4(P(OEt)3)]3+. The complexes (3) react with DPPHo in stoichometric proportion. Electron transfer from the oxidation of the ruthenium(II) center seems to be the reaction pathway. The OHo radical reacts with ruthenium nitrosyls, predominantly oxidizing the metal center, yielding the fragment [Ru(NO)]4+. This reaction is exothermic since the redox potential of the OHo is around 2.8 V vs. SCE. From competition kinetics the rate constant for this reaction were estimated in the range of 108 a 1010 M-1 s-1. Since the reaction between OHo radical and the complexes (4) was not observed, the hydrogen atom transfer mechanism for the scavenger of OHo by the nitrosyl complexes ca be ruled out. The complexes (1) and (2) scavenge the radical O2 -o by the reduction of the coordinated nitrosyl with specific rate constants ranging from 2,0 ± 1,0 x 104 to 4,2 ± 1,0 x 105 M-1 s-1 as probed by competitive kinetics using cytochrome c. After reduction, nitric oxide dissociation were probed ampherometricaly using a selective NO electrode or spectrophotometrically using cytochrome c as probe. Reduction of the complexes (3) by superoxide ion was not observed and may suggest the coordinated nitrosonium as the reaction site for reduction.

Sepse é definida como uma resposta inflamatória sistêmica frente a um estímulo infeccioso. Na fase inicial da doença ocorre aumento da secreção de vasopressina (AVP) e na fase tardia observamos uma redução, apesar dos elevados níveis de mediadores inflamatórios e agravamento da hipotensão que são estímulos para a secreção do hormônio. O óxido nítrico (NO), produzido pela enzima óxido nítrico sintase (NOS), parece modular a secreção de AVP dependendo do contexto fisiopatológico. Durante sepse experimental nosso grupo demonstrou que as concentrações plasmáticas de nitrato, que servem como índice da produção de NO, se elevam progressivamente durante a evolução da doença, mas não há evidências de que isto ocorra também a nível central. Nosso objetivo foi avaliar temporalmente a concentração de nitrato no líquido cefalorraquidiano (LCR) e a atividade enzimática das NOS no hipotálamo de ratos submetidos à sepse por ligadura e perfuração cecal (CLP). Os procedimentos, aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais do Campus de Ribeirão Preto (CEUA-USP, protocolo nº 10.1.294.53.7), foram realizados com ratos Wistar pesando 250 ± 30 gramas, os quais foram divididos em dois grupos: CLP e operação fictícia (OF). Após 0, 2, 6 e 24 horas das cirurgias, foi feita a coleta do LCR para a determinação da concentração de nitrato pelo método de quimiluminescência NO/ozônio. Imediatamente após os animais foram decapitados para coleta de sangue utilizado para determinação de hematócrito, sódio sérico, proteína, interleucina (IL)-1?, nitrato e AVP plasmáticos. Também foram removidas as neurohipófises para análise do conteúdo de AVP e o hipotálamo para análise da atividade da NOS pelo método da Citrulina. Nos animais sépticos, as concentrações plasmáticas de AVP seguiram o padrão esperado, com aumento em 2h e 6h, retornando a níveis basais em 24h. Os estoques neurohipofisários de AVP reduziram em 2h e 6h retornando a níveis basais em 24h. O sódio sérico e as proteínas plasmáticas diminuíram 2h, 6h e 24h após CLP, e os hematócritos aumentaram nos mesmos períodos. As concentrações plasmáticas de IL-1? e nitrato aumentaram 6h e mantiveram-se elevadas 24h após CLP. Entretanto, no LCR o nitrato aumentou em 6h, mas retornou a níveis basais em 24h. A atividade hipotalâmica das NOS totais e constitutivas eram de 50 a 100 vezes maiores que as das NOS induzidas e aumentaram 6h e 24h após a CLP. Os resultados deste estudo mostram que as atividades das NOS observadas no hipotálamo ex vivo dos ratos sépticos indicam a presença de formas viáveis das enzimas, sendo a isoforma constitutiva a mais relevante para a produção de NO nesta região cerebral. Além disso, as alterações temporais das concentrações de nitrato no LCR diferem da de nitrato plasmático, revelando um perfil diferenciado da produção de NO central em relação à periférica, e que este pode estar relacionado à secreção bifásica de AVP na sepse / Sepsis is defined as a systemic inflammatory response to an infectious stimulus. In the initial phase of the disease the secretion of vasopressin (AVP) is increased and late is observed a reduction, although high levels of inflammatory mediators and worsening of the hypotension, which are stimuli for the hormone secretion. Nitric oxide (NO) produced by the enzyme nitric oxide synthase (NOS), appears to modulate the secretion of AVP depending on the pathophysiological context. During experimental sepsis our group demonstrated that the plasma nitrate concentrations, which serve as an index of NO production, increase gradually during the course of the disease. However, there is no evidence that this also occurs at the central level. Our aim was to evaluate the temporal nitrate concentration in the cerebrospinal fluid (CSF) and the enzymatic activity of NOS in the hypothalamus of rats submitted to sepsis by cecal ligation and puncture (CLP). The procedures, approved by the Ethics Committee on Animal Use of the Campus of Ribeirão Preto (CEUA - USP, Protocol nº10.1.294.53.7) were performed with Wistar rats weighing 250 ± 30 grams, which were divided into two groups: CLP and Sham operation. After 0, 2, 6 and 24 hours of surgery, CSF was collected for determining the nitrate concentration by the chemiluminescence NO/ozone method. Immediately after, the animals were decapitated, blood was collected and used for hematocrit, serum sodium, protein, interleukin (IL)-1?, nitrate and plasma AVP determination. The neurohypophysis was removed for AVP content determinations and hypothalamus for NOS activity analysis by the method of citrulline. In septic animals, plasma concentrations of AVP showed the expected pattern, an increase at 2h and 6h and returning to basal levels at 24h. The AVP neurohypophyseal stocks decreased at 2h and 6h returning to basal levels at 24h. The sodium serum and plasma proteins decreased 2h, 6h and 24h after CLP, and the hematocrit increased at the same periods. The plasma concentration of IL-1? and nitrate increased 6h and remained elevated 24h after CLP. However, in the cerebrospinal, nitrate increased at 6h but returned to basal level in 24h. The total and constitutive NOS activities were fifty to one hundred times higher than inducible NOS and were increased 6h and 24h after CLP. These results suggest that the activity of NOS observed in the hypothalamus ex vivo of rats septic indicates the presence of viable forms of enzymes, and that the constitutive isoform is the most relevant for the NO production in this brain region. Moreover the temporal alterations of the nitrate concentrations in the CSF differ from the plasma nitrate, showing a different profile of the central and peripheral NO production, which may be related to biphasic AVP secretion in the sepsis.

Desde os anos 50 o mercúrio tem chamado a atenção de muitos pesquisadores. No Brasil, a preocupação inicial se restringia à exposição humana pelo seu uso na mineração do ouro. Entretanto, nos últimos anos a atenção de muitos pesquisadores se voltou para outras fontes de exposição, incluindo fontes naturais. Na região Amazônica, os solos são naturalmente ricos em mercúrio. Devido a constante degradação da floresta, o solo se torna mais exposto à ação das chuvas que facilitam a passagem do mercúrio aos rios. Na água o mercúrio sofre um processo de metilação, se transformando em metilmercúrio (MeHg) que se acumula principalmente nos peixes da região. As populações ribeirinhas, que têm sua alimentação baseada no consumo de peixes, são as principais vítimas da exposição a este metal. Muito tem se estudado a respeito dos efeitos tóxicos do metilmercúrio, reconhecido como a forma do mercúrio mais perigosa à saúde humana, devido à alta solubilidade para atravessar barreiras biológicas, capacidade de bioacumulação e elevada meia-vida de eliminação dos tecidos. Dentre os efeitos tóxicos mais documentados do MeHg, encontram-se aqueles relacionados ao sistema nervoso. Entretanto, o sistema cardiovascular tem tomado destaque como um outro alvo a toxicidade do metal. Apesar do número considerável de estudos nesta área, ainda não há um consenso quanto aos mecanismos cardiotóxicos do mercúrio e muitos resultados em estudos clínicos são muito conflitantes. Alguns estudos em ratos sugerem uma relação entre a diminuição de disponibilidade do óxido nítrico (NO), com aumento na exposição ao metilmercúrio. O NO é um componente de extrema importância na fisiologia cardiovascular, porque mantêm o tônus vascular e inibe a agregação plaquetária. Por outro lado, uma dieta rica em peixes e castanhas, comum na região Amazônica, fornece ao organismo quantidades consideráveis de selênio (Se), um nutriente conhecido por propriedades antioxidantes bem como antagonista de efeitos tóxicos de alguns metais, principalmente o mercúrio. Isso sugere que os efeitos danosos do MeHg podem ser minimizados pela presença de selênio na dieta. Neste sentido, o presente estudo avaliou em uma população ribeirinha (n=265), do Rio Tapajós, no Estado do Pará a relação entre as concentrações de mercúrio e selênio em sangue, plasma e cabelo e os níveis de óxido nítrico no plasma. / Since the 1950s, the mercury has attracted attention of many researchers. In Brazil, the initial concern was restricted to human exposure of its use in gold mining. However in the latest years, many researchers have concerned to others exposure sources, including natural sources. In Amazon region, the soils are naturally rich in mercury. Soils become more exposed to rain actions, which provide the passage of mercury to the rivers due to forest degradation. In the water, mercury suffers a methylation process changing to methyl mercury (MeHg), which stores up mainly in the fish of that area. The riverside population, who has a diet based on fish, is the main victims of the exhibition to this metal. The toxic effects of methyl mercury have been studied and this metal is recognized as the most dangerous type of mercury to human health due to the high solubility to cross biological barriers, the capacity of bioaccumulation and the high half-life of elimination from tissues. Among the most studied toxic effects of MeHg, there are those related to the nervous system. However the cardiovascular system has been a highlight as another metal toxicity target. In spite of the large number of studies, there is not an agreement about the cardio toxic mechanisms of mercury and many results in clinical studies are very controversial. Some studies in mice suggest a relationship between the reduction of nitric oxide (NO) and the increase of methyl mercury exposure. Nitric oxide is a very important component in cardiovascular physiology because it maintains the vascular tone and inhibits the platelets aggregation. On the other hand, a diet based on fish and nuts, which are common in Amazon region, provides a large quantity of selenium (Se) to the organism. This nutrient is known by its antioxidant qualities and it is also known as an antagonist of some metal, especially mercury, toxic effects. These facts suggest that the harmful effects of MeHg may be reduced due to the presence of selenium in diet. Therefore, the present study has estimated the relationship among mercury and selenium concentrations in blood, plasma and hair and the nitric oxide levels in plasma, in a riverside population (n=265) of Tapajós River in Pará

A exposição ao estresse induz um aumento dos níveis de óxido nítrico (NO) e glutamato em estruturas do cérebro de ratos, as quais estão relacionadas com o transtorno de depressão maior (DM) em humanos. Ademais, o estresse está diretamente relacionado com o aumento da metilação do DNA, uma alteração epigenética repressiva, no hipocampo de animais. Estudos anteriores demonstraram o efeito tipo antidepressivo dos inibidores da enzima óxido nítrico sintase (NOS) em animais submetidos ao estresse. Porém não se sabe se há uma relação entre o aumento do NO e glutamato induzido pelo estresse e alteração na metilação do DNA em genes relacionado com a patofisiologia da DM. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos dos inibidores da NOS nas alterações comportamentais e nos mecanismos intracelulares relacionado com a metilação do DNA no cérebro de ratos submetidos ao teste do desamparo aprendido (learned helplessness - LH) e em cultura celular do hipocampo desafiadas com NMDA e dexametasona. Métodos: Estudo 1: Cultura primária de células do hipocampo ou cultura imortalizada HiB5 foram desafiadas/estressadas com NMDA (30µM,1h), L-arginina (500µM,1h) e/ou dexametasona (1µM, 1h ou 24h) e pré-tratadas com inibidor seletivo da nNOS (NPA, 100nM, 30min antes do desafio) ou com inibidor da DNMT (5-Aza, 10 µM, 30 min antes do desafio). A expressão dos genes para as enzimas DNMTs, BDNF, NT4, TrkB e nNOS foram avaliadas por RT-qPCR, a expressão proteica das enzimas DNMT3b e nNOS foram avaliadas por western blotting. Estudo 2: Ratos foram submetidos à choques inescapáveis (0,4 mA; 40 choques) na sessão de pré-teste do LH, após sete dias os animais foram submetidos a sessão de teste (choques escapáveis de 0,4 mA). Os animais foram tratados com inibidores da NOS 7-nitroindazole (7-NI;60mg/kg,i.p), aminoguanidina (AMG; 30mg/kg,i.p) ou veículo por 7 dias e submetidos a sessão de teste 1h, após a última injeção. A metilação global foi analisada por imunoensaio (ELISA) e a expressão dos genes DNMT3b, BDNF, nNOS e iNOS foram avaliadas por RT-qPCR, nas estruturas: cortex, hipocampo ventral e hipocampo dorsal. Resultados: Estudo 1: O pré- tratamento com NPA, atenuou o aumento da expressão do mRNA para a enzima DNMT3b, em cultura primária do hipocampo desafiada com NMDA, dexametasona e Larginina, e também em cultura HiB5 desafiada com dexametasona. Porém, o NPA não inibiu a diminuição da expressão do BDNF (exon 1, exon 4 e exon 9), em cultura primária de células do hipocampo desafiadas com NMDA. O pré tratamento com 5-Aza, não inibiu as alterações induzidas pelo NMDA em cultura primária de hipocampo. Estudo 2: Ratos submetidos ao estresse dos choques inescapáveis na sessão de pré-teste apresentaram aumento no número de falhas em escapar dos choques na sessão de teste (desamparo aprendido), um efeito que foi atenuado pelo tratamento com AMG ou 7-NI. Interessantemente, o efeito comportamental do estresse foi acompanhado por aumento nos níveis da metilação global do DNA e DNMT3b no hipocampo ventral (vHPC), que foi atenuado pelos pré-tratamentos com AMG e 7-NI, porém não houve diferença estatisticamente significante no córtex e no hipocampo dorsal dos ratos. Conclusão: Os dados apresentados demonstraram que tanto o estresse (in vivo) quanto o desafio com glicocorticóides, NMDA e L-arginina (in vitro) são capazes de modular a expressão daenzima DNMT3b e a metilação de DNA no hipocampo. O tratamento com inibidores da NOS reduzem os efeitos do estresse in vivo (comportamental e molecular) e in vitro. Em conjunto, os dados sugerem que a liberação de glutamato e NO durante o estresse pode modular a expressão da enzima DNMT3b, levando ao aumento da metilação do DNA em genes relacionados com a resposta de adaptação ao estresse. Essa é a primeira evidência de que o NO pode modular metilação do DNA induzida por estresse. / Stress exposure increases glutamate and nitric oxide (NO) levels, as well as DNA methylation in the hippocampus. However, it is not yet known if there is a causal relationship between these events. Moreover, both nitric oxide synthase (NOS) inhibitors and DNA methylation inhibitors counteract the behavioral effects of stress. Therefore, our aim was to investigate the effects of NOS inhibitors on stress-induced changes on behaviour, DNA methylation and genes expression in the hippocampus of rats submitted to learned helplessness - LH. Moreover, the effects of direct administration of dexamethasone (glucocorticoid), NMDA and L-arginine was investigated in hippocampal cell cultures. Methods: Study 1: Primary hippocampal cell culture was challenged with NMDA (30µM,1h), L-arginine (500µM,1h) or dexamethasone (1µM,24h) and pretreated with nNOS inhibitor (NPA, 100nM, 30min before the challenge) or with DNMT inhibitor (5-Aza, 10 µM, 30 min before the challenge). DNMTs, BDNF, NT4, TrkB and nNOS gene expression was assessed by RT-qPCR. DNMT3b and nNOS levels were assessed by western blotting. Study 2: Rats were submitted to inescapable footshocks and treated with the NOS inhibitors 7-nitroindazole (7-NI; 60 mg/kg, i.p) or aminoguanidine (AMG; 30 mg/kg, i.p], or vehicle for 7 days and tested 1h after the last injection with escapable footshocks. The number of escape failures during the test, global DNA methylation (ELISA) and DNMT3b, BDNF, nNOS and iNOS mRNA expression (RT-qPCR) was evaluated. Results: NPA pretreatment attenuated DNMT3b mRNA expression in hippocampus primary cell culture challenged with NMDA, dexamethasone or L-arginine. Similarly effects were observed in HiB5 cell challenged with dexamethasone. However, NPA pretreatment did not inhibit the decrease of BDNF (exon 1, exon 4 and exon 9) induced by NMDA. Moreover, pretreatment with 5-Aza did not inhibit the decreased of BDNF induced by NMDA in primary cell culture. Study 2: Stress exposure increased the number of escape failures in the test, which was attenuated by treatment with AMG or 7-NI, an antidepressant-like effect. Interestingly, the increased DNA methylation DNMT3b mRNA expression in the ventral hippocampus (vHPC) of stressed rats were also attenuated by treatment with both AMG and 7-NI. Conclusions: NOS inhibitors attenuated stress-induced depressive-like behavior, DNA methylation and DNMT3b mRNA expression in the vHPC. In vitro, selective nNOS inhibition also blocks corticosterone-, NMDA- and L-arginine-induced DNMT3b mRNA expression in hippocampal cell culture. Altogether, our results suggest that glutamate release, leading to NO production during stress may mediate intracellular mechanisms that regulate DNMT3b expression and DNA methylation. This is the first evidence indicating that NO modulates DNA methylation induced by stress.

A melatonina, um derivado da serotonina, é o principal produto da glândula pineal. Pode ser produzida também por diversas células e tecidos extrapineais, como retina, trato gastrointestinal, células do sistema imunológico, entre outros. Nos mamíferos exerce diferentes papéis, sendo que, classicamente, é conhecida por atuar como mediadora química da fase escura. A liberação rítmica desse hormônio para a corrente sanguínea e para o líquido cefalorraquidiano marca o ciclo claro-escuro e as estações do ano para os órgãos internos. Além disso, a melatonina atua como moduladora do sistema imunológico e da inflamação, agente citoprotetora e antioxidante. Os mecanismos de ação também são diversos e variam desde receptores de membrana às interações intracelulares. No presente trabalho mostramos que a melatonina inibe a produção de NO ativado por ACh ou BK em cultura de células granulares de cerebelo. Esses agonistas ativam as NOS constitutivas, que são dependentes do aumento de Ca2+ intracelular. A melatonina também bloqueia o aumento de Ca2+ intracelular induzido por ACh, sugerindo que, o efeito dessa indolamina sobre a produção de NO ativado por ACh é, provavelmente, um efeito sobre o aumento de Ca2+ intracelular. Lipopolissacarídeo da parede de bactéria gram-negativa ativa a transcrição da isoforma induzida NOS. A melatonina inibe a expressão dessa enzima e a produção de NO induzidas pela endotoxina bacteriana. Nossos resultados indicam que esses efeitos são dependentes da inibição da via do fator de transcrição NFKB. Em resumo, o presente trabalho mostra que a melatonina inibe a atividade da NOS constitutiva e a expressão da NOS induzida. Esses efeitos são dependentes de mecanismos específicos e devem estar relacionados às diferentes funções celulares. / Melatonin, a serotonin derivative, is the main product of the pineal gland. Can also be produced by various extra¬pineal sites as retina, gastrointestinal tract, immune cells, among others. In mammals it has different roles, and, classically, is known to act as a chemistry mediator of the darkness. The rhythmic release of this hormone into the blood and cerebrospinal fluid marks the light¬dark cycle and the seasons to the internal organs. Moreover, melatonin acts as a modulator of the immune system and inflammation, a cytoprotective agent and reduces free radicals formation. The mechanisms of action are also diverse and vary from membrane receptors to intracellular interactions. Here we show that melatonin inhibits the production of NO activated by ACh or BK in cultured cerebellar granule cells. These agonists activate constitutive NOS, which are dependent on increased intracellular Ca2+. Melatonin also blocks acetylcholine-induced Ca2+ intracellular increase, suggesting that, this indolamine effects on NO production activated by ACh is, probably, an effect on the increase of intracellular Ca2+. Lipopolysaccharide of gram¬negative bacteria wall activates the transcription of inducible NOS isoform. Melatonin inhibits the enzyme expression and NO production in granule cerebellar cells activated with the bacterial endotoxin. Our data shows that these effects are dependent on inhibition of nuclear factor kappa B pathway. In summary, the present work shows that melatonin inhibits constitutive NOS activity and inducible NOS expression. These effects are dependent on specific mechanisms and should be related to different cellular functions.

Os comportamentos agonísticos sociais dispostos por animais dominantes e subordinados podem ser notados no paradigma residente intruso. No hipotálamo há o núcleo pré-mamilar ventral (PMv) ligado a um sistema sexualmente dimórfico e relacionado a reprodução e comportamentos agonísticos. A cópula é fundamental para a modulação do comportamento de dominância e aumenta os níveis de CART (Cocaine and Amphetamine Regulated Transcript) no PMv. Animais knockout de Sintase do Óxido Nítrico (NOS) apresentam agressão acentuada. Através da hibridização in situ estudamos a expressão de CART e de NOS nos animais com experiência sexual prévia ao encontro agonístico e sem experiência sexual (naive). No grupo que copulou foi visto aumento na expressão de CART e comportamento diferente do grupo naive visto que buscam a dominância e não apresentam posturas de submissão. Este aumento não foi observado nos níveis de NOS. Sugere-se que a experiência sexual esteja relacionada ao aumento de CART no PMv e possivelmente perda do comportamento subordinado e aumento da busca da dominância. / Aggressive behavior occurs when the interests of one or more individuals conflict. Territory is one of these interests, and the resident intruder paradigm is widely used to observe the expression of social agonistic behaviors. The dominance behavior has been studied under several views and it was shown that it can be raised by the presence of the female, its olfactory clues and by the sexual behavior. In the hypothalamus there is the premammillary ventralis nucleus (PMv) connected to a sexual dimorphic system and related to reproduction and agonistic behaviors. This nucleus was suggested as being involved in the modulation of aggressive behavior, and PMvs neuropeptides can have a direct relation with the expression of those agonistic behaviors. Males exposed to females olfactory clues show an increase in the expression of CART (C Cocaine and Amphetamine Regulated Transcript) in the PMv. Nitric oxide synthase (NOS) knockout animals show increased aggression. In the present investigation, using in situ hybridization we studied the expression of the mRNA of CART and NOS on intruders exposed to the resident-intruder paradigm. Two experimental groups were examined: one with sexual experience before the agonistic encounter and other naïve. It was observed increased expression of CART in the PMv in the sexual-experienced intruder. More, these animals behaved differently from naive intruders, and did not display submissive postures and start searching for dominance. Sexual experienced intruders presented increased expression of CART, but not NOS, mRNA. Thus, suggesting that the sexual experience is related to an increase in CART expression in the PMv and possibly with the lost of submissive behavior and increased search for dominance status.

A literatura aborda vastamente a relação entre as inflamações e infecções bucais e a ocorrência de doenças cardiovasculares, entre elas a aterosclerose. Sabemos que o uso de próteses dentárias totais removíveis pode causar inflamação bucal, porém a relação entre inflamações/infecções relacionadas ao uso de próteses e a ocorrência de doenças cardiovasculares ainda não foi suficientemente descrita. O objetivo do presente estudo foi investigar a correlação entre indicadores clínicos e bioquímicos de aterosclerose e os índices de nitrato salivar de usuários de próteses dentárias totais removíveis. Trata-se de um estudo de abordagem quantitativa, correlacional, descritivo, de corte transversal, realizado em uma Unidade de Saúde Preventiva em um município do interior paulista, no período de julho de 2014 a março de 2015. A amostra foi constituída por 44 indivíduos edêntulos totais e usuários de próteses dentárias totais removíveis. Foram avaliadas as variáveis sociodemográficas (sexo, idade, cor da pele, situação familiar conjugal, escolaridade, profissão/ocupação); as características clínicas (medida indireta da Pressão Arterial e Índice Tornozelo Braquial); as variáveis bioquímicas (Colesterol Total e glicemia capilar) e os níveis de óxido nítrico (NO) salivar, obtidos pela dosagem de nitrato realizada por técnica de quimioluminescência. As análises descritivas, com cálculo de frequências absolutas e porcentagens e descrição das médias, desvio padrão e medianas, foram realizadas por meio do pacote estatístico Statistical Package for Social Science - SPSS, versão 16.0. Para análise de correlação linear entre as variáveis foi utilizado o coeficiente de correlação de Spearman. Os resultados foram expressos como valores máximos e mínimos, medianas, médias ± erros padrões das médias (EPM), e as diferenças consideradas estatisticamente significativas para p<0,05. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto-USP. A análise do perfil sociodemográfico indicou que a amostra foi composta essencialmente por mulheres, com idade média de 62,9±7,9 anos, cor da pele branca, que conviviam com companheiros e filhos, apresentaram baixos índices de escolaridade e exerciam atividades no próprio lar. A maioria dos participantes (54,4%) informou ter diagnóstico prévio de Hipertensão Arterial Sistêmica e 38,7% apresentaram níveis alterados de pressão arterial no momento da medida. Mais da metade da amostra foi classificada com tolerância diminuída à glicose (56,8%); 22,7% apresentaram níveis elevados de CT e 22,7% apresentaram índices de ITB>1,3, valor indicativo de calcificação arterial. Os participantes apresentaram elevados índices de nitrato salivar, com média de 462,2µM/ml. Não observamos correlação entre as variáveis descritas e os níveis de nitrato salivar. Nossos resultados indicam que a população estudada apresenta fatores de risco para doenças cardiovasculares e aterosclerose. A ausência de correlação entre as variáveis clínicas e bioquímicas e os níveis de NO salivar indicam que, no presente estudo, o NO não se mostrou um bom marcador de alterações sistêmicas. Podemos considerar que os elevados índices de NO salivar indicam possibilidade de inflamações/infecções focais entre usuários de próteses dentárias, contudo são necessários estudos adicionais para averiguar se estas alterações bucais podem levar ao aumento do risco cardiovascular / The literature widely covers the relations between the inflammations and mouth infections and the occurrence of cardiovascular disease, including atherosclerosis. It is known that the use of dental prosthesis, removable or not can cause mouth inflammations, but the linking between the infection related to the use of prostheses and cardiovascular diseases has not been described enough. The purpose of this study was to investigate the correlation of clinical and biochemical indicators of atherosclerosis and salivary nitrates rates of complete denture wearers. It is a quantitative, descriptive and correlational study of a cross section carried out in a Preventive Health Office in a small city in the state of Sao Paulo, from July 2014 to March 2015. In the sample there were 44 edentulous users of removable dental prosthesis. The evaluation included socio-demographic variations (sex, age, skin color, marital status, education degree, profession); clinical characteristics (indirect measure of blood pressure and ankle brachial index) ; biochemical variations (total cholesterol and capillary glycemia) and the levels of salivary nitric oxide (ON), obtained by the nitrate dosing carried out through chemiluminescence technique. The descriptive analysis with calculation of absolute frequencies, percentage and description of standard deviation averages were accomplished through Statistical Package for Social Science_ SPSS, version 16.0. The coefficient of Spearman correlation has been used to analyze the linear correlation among the variations. The results were expressed as maximum and minimum values and difference significant to p 0,05. The Project was approved by the Comite de Etica em Pesquisa da Escola de Enfermagem de Ribeirao Preto - USP. The sócio-demographic analysis has indicated that the sample was compound mostly by women aged from 62,9 about 7,9, White skin,, living with husband and children, who had low education degree and were housewives. Most of the sample (54,4%) iwere previously diagnosed with Systemic Arterial Hypertension and 38,7% showed altered levels of blood pressure at the moment of de measurement. More than 50% of the sample was classified with glucose tolerance diminished (56,8%); 22,7% presented enhanced levels of CT and 22,7% presented index of ITB 1,3, indicative of arterial calcification. The subjects presented high levels of salivary nitrate, average 462,2uM/ml. Correlation between the described variations and the levels of salivary nitrate has not been observed. Our results indicate that the subjects show risk factors to develop atherosclerosis and cardiovascular diseases. The absence of correlation among the clinical and biochemical variations, and the levels of salivary ON indicate that, in this study, the ON has not been a good indicator of systemic alterations. It can be considered that enhanced levels of salivary ON indicate a possibility of focal inflammations among wearers of dental prostheses, although further studies are necessary to check if these oral alterations can increase the cardiovascular risk

Neste trabalho, duas estratégias para obtenção de um complexo de rutênio com os tetraazamacrociclos insaturados 2,3,9,10-tetrametil-1,4,8,11-tetraazaciclotetradeca-1,3,8,10-tetraeno (TIM) ou 5,7,712,14,14-hexamethil-1,4,8,11-tetraazaciclotetradeca-4,11-dieno (1,7-CT) foram estudados. [RuCl2(TIM)] e [RuCl2(1,7-CT)] seriam precursores para obtenção de nitrosilo complexos capazes de liberar óxido nítrico fotoquimicamente pela irradiação com luz em comprimentos de onda na região do visível, como na Terapia Fotodinâmica. Essas duas estratégias são a reação utilizando o rutênio como template e a metalação do ligante previamente sintetizado. A estratégia de metalação foi empregada com o ligante 1,7-CT e utilizando o complexo cis-[RuCl2(dmso)] como precursor para obter o cis-[Ru(1,7-CT)Cl2]Cl. Este método foi aplicado com sucesso para sintetizar complexos de rutênio ligantes tetraazamacrocíclicos como cyclam, cyclen, imcyclen. O ligante 1,7-CT foi sintetizado com sucesso. O espectro de infravermelho mostrou bandas em 3130 cm-1, 2910 cm-1, 1663 cm-1, e 1547 cm-1, em acordo com o relatado na literatura, e o espectro de RMN-1H mostrou singletes em 1.45 ppm, 2.04 ppm, 2.77 ppm, e tripletes em 2.92 ppm e 3.39 ppm, como esperado. Tentativas de síntese do complexo de rutênio correspondente não foram bem sucedidas, conforme se depreende pelos espectros de RMN-1H e de infravermelho. A estratégia que aplica o efeito template para a obtenção do complexo foi a que deu os melhores resultados, embora o complexo não tenha sido isolado do meio reacional. Os resultados das análises espectroscópicas obtidos do extrato seco da reação mostram que o complexo [RuCl2(TIM)] foi obtido. Os espectros de absorção no UV-visível foram feitos durante a reação e mostraram que os precursores estavam reagindo, pois novas bandas apareciam em detrimento do desaparecimento das originais, ao longo da reação. Há alguns indícios de que possa ter havido decomposição, pois o espectro de RMN-1H mostrou um pequeno singleto em 2.25 ppm que pode indicar a presença de 2,3-butanodiona como resultado da decomposição. O espectro de RMN-1H também mostrou um quintupleto em 2.09 ppm e um tripleto em 3.13 ppm, conforme esperado para o macrociclo. Os espectros de infravermelho mostraram a presença de bandas em 1690 cm-1, 1429 a 1374 cm-1, 1200 cm-1 e 942 cm-1, consistentes com a presença do TIM no complexo, além da banda em 448 cm-1, consistente com a presença de ligações Ru-N. A comparação entre os espectros de infravermelho do complexo de rutênio com os complexos análogos de níquel e ferro apoia essas atribuições. / ABSTRACT In this work, two strategies to obtain a complex of ruthenium with the unsaturated tetraazamacrocycles 2,3,9,10-tetramethyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradeca-1,3,8,10-tetraene (TIM) or 5,7,712,14,14-hexamethyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradeca-4,11-diene (1,7-CT) were studied. [RuCl2(TIM)] and [RuCl2(1,7-CT)] would be precursors to obtain nitrosyl complexes able to deliver nitric oxide photochemically by irradiation with visible light as in photodynamic therapy. These two strategies are the reaction using ruthenium as template and the metallation of the ligand previously synthesized. The metallation strategy was used with the ligand 1,7-CT and the precursos cis-[RuCl2(dmso)4] to obtain cis-[Ru(1,7-CT)Cl2]Cl. This method is successfuly applied to synthesize ruthenium complexes with tetraazamacrocyclic ligands as cyclam, cyclen, imcyclen. The 1,7-CT was successfully synthesized. The infrared spectrum of 1,7-CT showed bands about 3130 cm-1, 2910 cm-1, 1663 cm-1, and 1547 cm-1, in agreement with the data found in the literature, and the 1H-NMR spectrum showed singlets at 1.45 ppm, 2.04 ppm, 2.77 ppm, and triplets at 2.92 ppm and 3.39 ppm, as expected. Attempts to synthesize the corresponding ruthenium complex were unsuccessful as long as 1H NMR and infrared spectroscopy are concerned. The strategy applying the template effect to obtain the complex was the one that gave the more positive results, although the complex was not isolated from the reaction media. Spectral analysis from the dry extract of the reaction drove us to believe that the complex [RuCl2(TIM)] was obtained. The UV-visible absorption spectra taken during the reaction showed that the precursors were properly reacting because new bands were taking place of the originals bands of the precursors during the reaction course. There are some indications that some decomposition may have taken place, as the 1H NMR spectrum showed a small singlet at 2.25 ppm that could indicate the presence of 2,3-butanedione as a result of this decomposition. The 1H NMR spectrum also showed a quintuplet at 2.09 ppm and a triplet at 3.13 ppm, as expected for the macrocycle. The infrared spectrum showed the presence of bands about 1690 cm-1, 1429 to 1374 cm-1, 1200 cm-1 and 942 cm-1, consistent with the presence of TIM in the complex, and the presence of bands about 448 cm-1, consistent with the presence of Ru-N bonds. Comparison of the ruthenium complex infrared spectrum to those of the nickel and iron analogous complexes supports this assumption.

O presente estudo avaliou, em aorta de ratos, o efeito de uma sessão de exercício físico aeróbio na resposta vasoconstritora dependente e independente de receptores adrenérgicos, assim como a participação dos sistemas de síntese e remoção de óxido nítrico (NO) nestas respostas. Para isso, um grupo de ratos foi submetido a uma sessão de exercício físico em esteira rolante (grupo EX, n=14), enquanto o outro grupo permaneceu em repouso (grupo CTR, n=14), sendo que imediatamente após este período os ratos de ambos os grupos foram sacrificados e foi feita a retirada da aorta torácica para realização de medidas funcionais e bioquímicas in vitro. Resultados: pudemos observar que o grupo EX apresentou menor resposta vasoconstritora máxima à noradrenalina e ao cloreto de potássio quando comparados ao grupo CTR. Esta diferença na reatividade vascular deixou de ser observada nos anéis aórticos com o endotélio removido ou pré-incubados com um inibidor da síntese de NO. Além disso, o grupo EX apresentou maior biodisponibilidade de NO, maiores níveis vasculares de ânions superóxido, e maiores atividades das enzimas NAD(P)H oxidase e superóxido dismutase comparado ao grupo CTR. Esses resultados demonstram que uma única sessão de exercício físico aeróbio é capaz de atenuar a resposta vasoconstritora dependente e independente de receptores adrenérgicos em aorta de ratos, principalmente por aumentar a biodisponibilidade vascular de óxido nítrico, apesar de aumentar os níveis vasculares de ânions superóxido / The present study investigated, in rat aortas, the effect of one bout of aerobic exercise on the adrenergic receptor-dependent and -independent vasoconstrictor response, and the role of nitric oxide (NO) synthesis and scavenging systems on this vasomotor response. One group of rats was submitted to a single bout of exercise on a treadmill (EX group, n=14) and the other one was placed in the treadmill without running (CTR group, n=14). Immediately after this period, both groups were euthanized and the thoracic aorta was removed for functional and biochemical analysis. Results: one bout of exercise attenuated the maximal contractile response to both noradrenaline and potassium chloride compared to CTR group. These differences on vascular reactivity were not observed in aortic rings when the endothelium was removed or aortic rings pre-incubated with a nitric oxide synthesis inhibitor. Additionally, EX group increased NO bioavailability, increased vascular superoxide levels, and increased NAD(P)H oxidase and superoxide dismutase activity compared to CTR group. These results demonstrate that one bout of aerobic exercise is able to attenuate adrenergic receptor-dependent and -independent vasoconstrictor response in rat aorta, mainly by increasing vascular NO bioavailability, despite the enhanced vascular superoxide levels