Guzmania monostachia é uma bromélia tanque epífita C3-CAM facultativa, constituindo-se em um modelo muito interessante para estudar a sinalização que ocorre na transição da fotossíntese C3 para CAM. Baseado em resultados obtidos pelo Laboratório de Fisiologia Vegetal do IBUSP, constatou-se que a mudança em questão se dá de forma diferente ao longo do comprimento das folhas dessa espécie, sendo muito mais pronunciada na região apical do que na basal. Outra pesquisa, desenvolvida anteriormente no mesmo laboratório, sugere fortemente que na indução ao CAM, em plantas jovens de abacaxizeiro C3, o óxido nítrico (NO) e o ácido abscísico (ABA) atuam como mediadores dessa resposta. Levando em conta esses fatos, o presente trabalho visou caracterizar a participação do NO e do ABA como sinalizadores do CAM em uma bromélia que é reconhecidamente C3-CAM facultativa na natureza. Além disso, suas folhas apresentam diferentes níveis de expressão do CAM ao longo do comprimento, podendo, assim, constituir-se em um ótimo modelo para estudos de sinalização. Também se buscou, nesta pesquisa,saber se seria possível reduzir o modelo de estudo para folhas destacadas, não necessitando empregar a planta inteira nos experimentais. Após a comparação da fotossíntese entre folhas pertencentes a plantas inteiras e folhas destacadas, concluiu-se que é viável trabalhar com as folhas isoladas.Essas foram induzidas ao CAM por déficit hídrico, proporcionado por uma solução de polietilenoglicol (PEG) na concentração de 30%. O acúmulo noturno de acidez e a atividade das enzimas fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPC) e malato desidrogenase (MDH) em três porções foliares (porção basal, mediana e apical) foram usadas para caracterizar o grau de expressão do CAM. O conteúdo d\'água (expresso em porcentagem)foi usado como um indicativo da perda d\'água pelo tecido foliar.A participação do NO no processo de indução ao CAM foi avaliado por meio de dosagens por quimioluminescência, espectrofluorimetria e localização in situ por microscopia de fluorescência. Também foi usado um doador desse radical livre, o nitroprissiato de sódio (SNP). O ABA foi quantificado pela técnica de cromatografia a gás acoplada a espectrômetro de massas (GC-MS). As folhas mudaram seu metabolismo fotossintético de C3 para CAM no sexto dia de incubação com PEG (segundo o acúmulo noturno de ácidos e a atividade da enzima PEPC), mas a primeira queda detectável no teor d\'água ocorreu logo nas 12 primeiras horas, aumentando até 24ª hora. Nos dias seguintes (até o 7º), o menor teor de água foi encontrado na região basal da folha, enquanto que o CAM se expressou com maior intensidade na porção apical, sugerindo a existência de uma sinalização da redução hídrica entre a parte basal e a apical da folha. De fato, foram detectados maiores quantidades de ABA, em resposta ao déficit hídrico imposto pelo PEG, ao longo de todo o comprimento foliar, com maior quantidade na região apical. Teores significativamente maiores de NO foram detectados por espectrofluorimetria nos últimos três dias de experimento, apenas na região apical. A citolocalização do NO corroborou a quantificação por espectrofluorimetria, mostrando um aumento a partir do sexto dia nos ápices foliares. Conclui-se, portanto, que tanto o NO quanto o ABA parecem participar da sinalização do CAM. Possivelmente, o ABA desempenha um papel decisivo quanto à sinalização da diminuição do teor d\'água, devido ao seu aumento em todo o comprimento da folha,enquanto que o NO parece atuar como um mensageiro secundário, importante à indução do CAM na porção apical foliar. / Guzmania monostachia is a C3-CAM facultative epiphyte tank bromeliad and a very promising model to study the C3 to CAM transition. Results obtained on the Laboratory of Plant Physiology on IBUSP showed that this transition occurs differently along the leaf blade o this species, as it is much stronger on the apical portion of the leaf, when compared to the basal one. Another research, from the same group, strongly suggests that on the induction of CAM in young pineapple plants is mediated by abscisic acid (ABA) and nitric oxide (NO). Based on both of these results, this work intends to characterize the role of NO and ABA in CAM signaling, using as a model of study a species which is generally accepted to be a facultative CAM on natural conditions. Besides that, G. Monostachia shows different degrees of CAM along the leaf blade, which makes an interesting model of it for signaling studies. It was also attempted to use detached leaves as a valid model of study for this species. Since no remarkable differences were detected between an experiment performed with whole plants or detached leaves alone, it was chosen to carry over the work using only detached leaves. The induction of CAM was performed by drought, using a 30% polyethyleneglycol (PEG) solution. The nocturnal acid accumulation and the activity of phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) and malate dehydrogenase (MDH) enzymes were measured in three portions of the leaf (basal, middle and apical). The water amount was indicative of the water loss on foliar tissues. NO participation was assessed through chemioluminescence, spectrofluorimetry and in situ localization by fluorescence microscopy. A NO donor was also used. ABA was quantified by gas chromatography associated with mass spectrometry (GC-MS). The leaves changed the photosynthetic metabolism from C3 to CAM on the sixth day after the beginning of PEG exposure (as stated by the nocturnal acid accumulation and PEPC activity), but the decrease in water amount values started soon, after 12 hours of exposure, and stabilizing after 24 hours. The major loss of water percentage was detected on the basal portion, persisting until the seventh day, while on the apical portion, after two days the control and PEG-treated leaves remained similar. Since the C3-CAM change occurred in the apical portion, it is possible to suggest a signal transport from the base to the apex of the leaf in response to water loss. Indeed, the ABA levels remained higher with the water loss along the whole leaf, but with greater intensity on the apical portion. Higher NO levels were also detected on PEG-treated leaves, but only on the apical portion. The in situ localization of NO corroborates the spectrofluorimetry, showing an increase on the sixth day after PEG exposure on the leaf apex. In conclusion, both NO and ABA seem to participate on the signaling of CAM. Possibly, ABA plays a decisive role on indicating drought, because it increases on the whole leaf subjected to PEG, while NO is, maybe, a secondary signal, specific to processes that occur only on the apical portion, such as the CAM induction.

Foram conduzidos três experimentos com os objetivos de avaliar a influência da glutamina e nucleotídeos nas dietas de frangos de corte, considerando o desempenho, desenvolvimento e atividade enzimática da mucosa intestinal. No 1º experimento, foi determinado os melhores níveis de suplementação das fontes de glutamina, isolado (L-Gln) ou associado com ácido glutâmico (Aminogut®), e de acordo com resultados obtidos para as características de desempenho e atividades enzimáticas (mucosa intestinal e pâncreas), observou-se melhor desempenho para aves suplementadas com 1,5% de L-Gln e 3,0% de Aminogut®. No 2º experimento, foi determinado o melhor período (1 a 7, 1 a 14 ou 1 a 21 dias de idade) de suplementação dos níveis ótimos das fontes de glutamina observados no experimento 1. Segundo dados de desempenho, atividades enzimáticas e morfometria do intestino delgado (duodeno, jejuno e íleo), determinou-se que as fontes de glutamina podem ser suplementadas durante os primeiros sete dias de vida das aves, proporcionando aumento nas atividades das enzimas digestivas e pancreáticas nos frangos. No 3º experimento, foram avaliados os efeitos de três fontes de ação trófica (L-Gln, Aminogut® e nucleotídeos) associadas à vacinação contra a coccidiose, sobre o desenvolvimento do intestino delgado e algumas respostas imunológicas das aves. Pode ser observado efeito negativo da vacinação sobre o desempenho e morfometria da mucosa intestinal, entretanto, ao final do período experimental, as fontes de glutamina mostraram-se eficiente em recuperar perdas epiteliais da mucosa intestinal das aves desafiadas contra a coccidiose. Portanto, a suplementação destas fontes de ação trófica pode ser uma estratégia para o bom desenvolvimento dos frangos quando submetidos à estresse vacinal, considerando ainda a viabilidade econômica pelo segmento produtivo. / Three experiments were carried out to evaluate the influence of glutamine and nucleotides in diets of broiler chickens, on performance, development and enzymatic activity of the intestinal mucosa. In the first experiment, was estimated the best levels of glutamine sources supplementation, isolated (L-Gln) or associated with glutamic acid (Aminogut®). According to results for performance characteristics and enzymatics activities (intestinal mucosa and pancreas), was observed best performance for birds supplemented with 1.5% of L-Gln and 3.0% of Aminogut®. In the second experiment, was determined the best supplementation period (1 to 7; 1 to 14 or 1 to 21 days of age) of levels of glutamine sources observed in the first experiment. The results of performance, enzymatics activities and small intestine morphometry (duodenum, jejunum and ileum), suggested that glutamine sources evaluated can be supplemented during the first seven days of age, providing an increase in the enzymatics digestives and pancreatic activities at the broiler chickens. In the third experiment, were evaluated the effects of three sources with action trophic (L-Gln, Aminogut® and nucleotides) associated with vaccination against coccidiosis on development of small intestine and immune responses of the broilers. It was observed negative effect of vaccination on performance and morphometry of intestinal mucosa, however, at the end of experimental period, the glutamine sources showed efficiency to recovery epithelial losses of intestinal mucosa of birds, which were challenged against coccidiosis. Therefore, the supplementation of the trophic sources can be a strategy for optimum development of broilers when submitted to vaccination stress, considering the economic viability by the productive segment.

Orientador: José Clayston Melo Pereira / Banca: Vania Martins Nogueira / Banca: José Carlos Toledo Júnior / Resumo: O câncer é, atualmente, uma das principais causas de morte no mundo. Além disto, tem-se observado crescente resistência celular à forma de tratamento utilizando radioterapia com uso de drogas. O sistema enzimático glutationa S transferases (GSTs), um dos responsáveis por essa resistência, catalisa a conjugação da glutationa com a cisplatina, que é um dos fármacos mais aplicados na terapia do câncer, restringindo sua ação. Neste contexto, foi proposto a utilização de dinitrosilos de ferro (DNIC - dinitrosyl iron complex) [(Fe(NO)2Ligante] como alternativa para diminuição da resistência celular à agentes antineoplásicos. DNICs são geralmente formados em células expostas a óxido nítrico (NO) e ligam-se às enzimas da família GST inibindo seu efeito contra drogas anticâncer. Assim, propôs-se desenvolver complexos do tipo [Fe(NO)2X] (X = tiossemicarbazona), em que X seria um ligante com potencial atividade antineoplásica. Estes ligantes seriam facilmente substituídos por grupos da cadeia lateral de aminoácidos da GSTs, proporcionando um possível sinergismo de inibição da enzima e liberação de agentes antineoplásicos. As tiossemicarbazonas foram sintetizadas a partir de cinamaldeído e tiossemicarbazidas correspondentes em meio etanólico e caracterizados por espectroscopia de absorção na região do infravermelho (IV), UV-Vis, ressonância magnética nuclear (RMN) de ¹H e ¹³C, espectrometria de massas e análise elementar, assim como seus produtos de ciclização testados. Os complexos fora... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Cancer is currently one of the leading causes of death in the world. In addition, increased cellular resistance to the form of treatment using radiation therapy with drug use has been observed. The enzymatic system glutathione S transferases (GSTs), one of the responsible for this resistance, catalyzes the conjugation of glutathione with cisplatin, which is one of the drugs most applied in cancer therapy, restricting its action. In this context, has been proposed the use of iron dinitrosyls (DNIC - dinitrosyl iron complex) [(Fe (NO ) 2 Ligand ] as an alternative to decrease the cellular resistance to antineopl astic agents. DNICs are generally formed in cells exposed to nitric oxide (NO) and bind to the enzymes of the GST f amily inhibiting their effect against anticancer drugs. Thus, it was proposed t o develop complexes of type [Fe(NO) 2 X] (X = thiosemicarbazone), where X would be a ligand with potential antineoplastic activity. These linkers would be readily substituted by GSTs amino acid side chain groups, providing a possible synergism of enzyme inhibition and release of antineoplastic agents. Thiosemicarbazones were synthesized from cinnamaldehyde and corresponding thiosemicarbazides in ethanolic medium and characterized by absorption spectroscopy in the infrared (IR), UV - Vis region, ¹H and ¹ ³C nuclear magnetic resonance (NMR), mass sp ectrometry and elemental analysis, as well as their tested cyclization products. The complexes were obtained from the pr eviously p... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

by Lo Ming Yip. / "July 1998." / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 1998. / Includes bibliographical references (p. 208-247). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Mode of access: World Wide Web. / Abstract in Chinese.

A atividade dos receptores ativados por proliferadores de peroxissoma (PPAR) e receptor X hepático (LXR) são regulados por ácidos graxos. Entretanto, o papel do LNO2, um produto endógeno da nitração do ácido linoléico por espécies reativas derivadas de óxido nítrico (•NO), na via de sinalização que regula a ativação destes receptores ainda não está elucidada. Assim, considerando a propriedade do LNO2 como doador de •NO, nós investigamos a participação da via de sinalização p21Ras/Raf/ERK na ativação de PPAR e LXR por LNO2. Os resultados obtidos demonstraram que LNO2, na concentração de 0.01µM, foi um potente ativador de PPAR quando comparado ao ligante natural ácido linoléico, o qual apresentou ativação equivalente do PPAR na concentração de 10µM. O LNO2, contudo não teve efeito na ativação de LXR. LNO2 foi um potente ativador de p21Ras quando comparado ao ácido linoléico. A ativação de Ras ocorreu após 5 minutos de incubação com LNO2 em células parentais. Entretanto, em células transfectadas com p21RasC118S, o LNO2 não foi capaz de ativar Ras. A ativação de Ras e PPAR foi dependente da liberação de •NO a partir de LNO2, o que foi evidenciado na presença de C-PTIO, um seqüestrador de •NO. LNO2 ativou ERK, mas não demonstrou efeito relevante na ativação de p38 MAP kinase. A utilização de um inibidor específico de MEK, PD09895, inibiu a ativação de ERK induzida por LNO2, sugerindo que existe uma conexão entre ERK e a ativação de PPAR. Nós concluímos que a ativação do receptor nuclear PPAR por LNO2 é dependente de •NO e da via de sinalização p21Ras/Raf/ERK, a qual é capaz de ativar os subtipos α, &$946; e γ do PPAR, modulando, desse modo, a expressão de genes responsivos a este fator de transcrição. / Fatty acids bind to and regulate the activity of peroxissome proliferator-activated (PPAR) and liver X receptors (LXR). However, the role of LNO2, an endogenous product of the nitration of linoleic acid by nitric oxide (•NO)-derived reactive species, on signalling pathways regulating these nuclear receptors is poorly understood. Thus, considering the properties of LNO2 as •NO donor, we investigated the role of p21RasMAP kinases signaling pathway in the activation of PPARs and LXR by LNO2. LNO2 at physiologically relevant concentrations (0.01 µM) activates PPAR. By contrast, linoleic acid, a natural ligand for PPAR, only activated the receptor at much higher concentrations (10µM). However, it did not affect LXR activation. LNO2 is a more potent activator of p21 Ras than linoleic acid at the same conditions. Ras activation occurred within the first 5 minutes after LNO2 addition to parental cells. However, in p21RasC118s transfected cells, were unable to detect activation of Ras. Ras and PPAR activation depends on •NO released from LNO2 as evidenced by the inhibitory effect of C-PTIO, a •NO scavenger. LNO2 activated ERK but displayed no effects relevant on p38 MAP kinase. In addition, the use of specific inhibitors to MEK, PD09895, blocked PPAR activation and ERK phosphorylation by LNO2, suggesting a connection between ERK and the activation of PPAR. We conclude that LNO2 induced THP-1 cells activating Ras by S-nitrosation and recruiting the MAP kinase ERK, a downstream element of this signalling cascade and activated PPAR (α, β and γ).

O núcleo supraóptico (SON), uma das várias áreas hipotalâmicas envolvidas no equilíbrio hidroeletrolítico corporal, é de suma importância na complexa rede de sistemas fisiológicos que atuam na manutenção da homeostase. Este núcleo é constituído por um grupamento de neurônios magnocelulares (MNCs) responsáveis pela síntese e liberação de vasopressina e ocitocina, neuropeptídios cujos principais efeitos se fazem sobre a excreção de água e sal pelos rins. Alterações da osmolalidade plasmática implicam em mudanças funcionais intrínsecas (propriedades de membrana) e extrínsecas (sinápticas) na excitabilidade desses neurônios, com consequências para a liberação desses neuropeptídios. Além da osmolalidade, outros fatores são capazes de modular a excitabilidade dos MNCs, dentre elas o óxido nítrico (NO). Vários estudos têm mostrado que o NO desempenha um papel neuromodulador importante nesses neurônios, resultando na inibição da excitabilidade dos MNCs durante condições isotônicas e hipertônicas. Além disso, estas respostas são independentes das conexões sinápticas e envolvem a modulação de canais para cátions ativados por hiperpolarização e nucleotídeo cíclico (HCN). Entretanto, ainda é desconhecido à origem deste mensageiro neural, o envolvimento de outros tipos celulares nesta resposta, os mecanismos de sinalização utilizados pelo NO na modulação dos canais HCN, se esta modulação também ocorre em situações de aumentos de osmolaridade plasmática, e se há diferenças na modulação nitrérgica entre os fenótipos celulares. Assim, dada a importância deste núcleo para a manutenção do meio interno, elucidar os mecanismos pelo qual o NO modula os neurônios magnocelulares do SON torna-se essencial para o entendimento do controle da sua excitabilidade elétrica. Desta forma, considerando que: 1) os neurônios magnocelulares expressam a enzima para a síntese do NO em condições isotônicas e hipertônicas; 2) que os efeitos do NO parecem envolver, principalmente, a guanilato ciclase solúvel com consequente produção de cGMP; e 3) que os canais HCN são modulados por este segundo mensageiro, nós hipotetizamos que os MNCs são capazes de produzir NO independente de outros tipos celulares e do fenótipo celular, e que a modulação nitrérgica dos canais HCN envolve a produção de cGMP. Frente a isso, este projeto teve como objetivo: 1) investigar o envolvimento das células gliais na modulação nitrérgica observada nos MNCs; 2) desvendar a origem do NO; 3) estudar as vias de sinalização da modulação nitrérgica sobre os canais HCN 4) avaliar se os efeitos do NO nos canais HCN também ocorre durante estímulo hiperosmótico agudo, e 5) se há diferença na modulação do NO em relação ao fenótipo celular. Para tanto, utilizamos a eletrofisiologia celular, essencialmente a técnica de patch clamp em fatias do SON e neurônios isolados. Experimentos de fluorescência foram realizados para a detecção da atividade intracelular do NO com o intuito de elucidar a origem deste mensageiro neural. Além disso, técnicas de biologia celular e molecular também foram utilizadas para caracterizar o fenótipo da célula que se está registrando, uma vez que 3 tipos já foram descritos neste núcleo e podem responder de maneira diferente ao mesmo estímulo. Até o presente nossos resultados mostraram que: 1) A modulação nitrérgica nos MNCs não envolve células gliais, 2) O NO é produzido pelos neurônios magnocelulares durante estímulo hipertônico, e este processo é dependente das alterações da osmolalidade, mas não da atividade elétrica dos neurônios frente ao estímulo; 3) Esta modulação ocorre por um mecanismo dependente de S-nitrosilação e independentemente da formação de cGMP; 4) a modulação nitrérgica nos canais HCN não difere entre os diferentes tipos de fenótipos encontrados e também ocorre durante aumentos da osmolaridade plasmática. Frente a estes resultados podemos concluir que a excitabilidade dos neurônios magnocelulares do SON é essencialmente determinada por um efeito do NO sobre os canais HNC por um mecanismo dependente de S-nitrosilação. Desta forma, o NO apresenta-se como mais uma molécula nesse complexo mecanismo de manutenção do equilíbrio hidroeletrolítico do organismo. / The hypothalamic supraoptic nucleus (SON) plays an importante role in the complex systems network that operates to maintain the hydroelectrolytic balance of the body. The nucleus is formed by a cluster of neurons (magnocellular neurosecretory cells - MNCs) responsible for the synthesis and secretion of vasopressin and oxytocin, whose main effects are on the excretion of water and salt by the kidneys. Changes in plasma osmolality lead to intrinsic (membrane properties) and extrinsic (synaptic inputs) functional changes in these neurons, with consequences for neuropeptides release. Furthermore, besides osmolality, studies have shown that the electrical excitability of MNCs can be modulated by several factors, including nitric oxide (NO). Previous studies of our group, demonstrated that NO inhibits the excitability of MNCs during isotonic and hypertonic conditions and that this responses are independent of synaptic connections and involve the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels (HCN). However, some points remained unclear, such as: What is the origin of NO? Are there other cell types involved in this response? What signaling pathway does NO use to modulate HCN channels? Does NO modulate HCN channels during changes in the plasma osmolality? Are there differences in the nitrergic modulation according to cellular phenotypes? Considering that: 1) MNCs express the enzyme for nitric oxide synthesis, in isotonic and hypertonic conditions; 2) the NO effects involve, mainly, activation of guanylate cyclase with consequent increase in the cGMP production, and that 3) HCN channels are modulated by this second messenger, we hypothesize that MNCs are able to produce NO independently of other cells and cellular phenotypes, and that nitrergic modulation of HCN channels involves the guanylate cyclase activation. To answer those questions and to test our hypothesis, we used cellular electrophysiology, essentially Whole cell patch clamp using slices of the SON and isolated neurons. Fluorescence experiments were also used to detect the intracellular activity of NO in order to clarify the origin of this neuronal messenger. In addition, cellular and molecular biology approaches were also used to characterize the phenotype of recorded cells, since 3 distinct cellular types have been described in this nucleus. Our results demonstrate that: 1) NO is produced by MNCs during hypertonic stimulation, and this process is dependent on changes in osmolality, but not on the electrical activity of MNCs in response to the stimulus; 2) NO modulates the electric excitability of the neurons by acting on HCN channels and it does not differ among cellular phenotypes; and 3) the effect of NO occurs by a mechanism dependent of S-nitrosylation and independently of cGMP production. Considering these results we may conclude that electrical excitability of magnocellular neurons of the supraoptic nucleus is essentially determined by an effect of NO on Ih currents by a mechanism dependent of S-nitrosylation. Acting on HCN channels, NO is another player in the complex set of mechanisms controlling the hydroelectrolytic balance.

O núcleo supraóptico (SON), uma das várias áreas hipotalâmicas envolvidas no equilíbrio hidroeletrolítico corporal, é de suma importância na complexa rede de sistemas fisiológicos que atuam na manutenção da homeostase. Este núcleo é constituído por um grupamento de neurônios magnocelulares (MNCs) responsáveis pela síntese e liberação de vasopressina e ocitocina, neuropeptídios cujos principais efeitos se fazem sobre a excreção de água e sal pelos rins. Alterações da osmolalidade plasmática implicam em mudanças funcionais intrínsecas (propriedades de membrana) e extrínsecas (sinápticas) na excitabilidade desses neurônios, com consequências para a liberação desses neuropeptídios. Além da osmolalidade, outros fatores são capazes de modular a excitabilidade dos MNCs, dentre elas o óxido nítrico (NO). Vários estudos têm mostrado que o NO desempenha um papel neuromodulador importante nesses neurônios, resultando na inibição da excitabilidade dos MNCs durante condições isotônicas e hipertônicas. Além disso, estas respostas são independentes das conexões sinápticas e envolvem a modulação de canais para cátions ativados por hiperpolarização e nucleotídeo cíclico (HCN). Entretanto, ainda é desconhecido à origem deste mensageiro neural, o envolvimento de outros tipos celulares nesta resposta, os mecanismos de sinalização utilizados pelo NO na modulação dos canais HCN, se esta modulação também ocorre em situações de aumentos de osmolaridade plasmática, e se há diferenças na modulação nitrérgica entre os fenótipos celulares. Assim, dada a importância deste núcleo para a manutenção do meio interno, elucidar os mecanismos pelo qual o NO modula os neurônios magnocelulares do SON torna-se essencial para o entendimento do controle da sua excitabilidade elétrica. Desta forma, considerando que: 1) os neurônios magnocelulares expressam a enzima para a síntese do NO em condições isotônicas e hipertônicas; 2) que os efeitos do NO parecem envolver, principalmente, a guanilato ciclase solúvel com consequente produção de cGMP; e 3) que os canais HCN são modulados por este segundo mensageiro, nós hipotetizamos que os MNCs são capazes de produzir NO independente de outros tipos celulares e do fenótipo celular, e que a modulação nitrérgica dos canais HCN envolve a produção de cGMP. Frente a isso, este projeto teve como objetivo: 1) investigar o envolvimento das células gliais na modulação nitrérgica observada nos MNCs; 2) desvendar a origem do NO; 3) estudar as vias de sinalização da modulação nitrérgica sobre os canais HCN 4) avaliar se os efeitos do NO nos canais HCN também ocorre durante estímulo hiperosmótico agudo, e 5) se há diferença na modulação do NO em relação ao fenótipo celular. Para tanto, utilizamos a eletrofisiologia celular, essencialmente a técnica de patch clamp em fatias do SON e neurônios isolados. Experimentos de fluorescência foram realizados para a detecção da atividade intracelular do NO com o intuito de elucidar a origem deste mensageiro neural. Além disso, técnicas de biologia celular e molecular também foram utilizadas para caracterizar o fenótipo da célula que se está registrando, uma vez que 3 tipos já foram descritos neste núcleo e podem responder de maneira diferente ao mesmo estímulo. Até o presente nossos resultados mostraram que: 1) A modulação nitrérgica nos MNCs não envolve células gliais, 2) O NO é produzido pelos neurônios magnocelulares durante estímulo hipertônico, e este processo é dependente das alterações da osmolalidade, mas não da atividade elétrica dos neurônios frente ao estímulo; 3) Esta modulação ocorre por um mecanismo dependente de S-nitrosilação e independentemente da formação de cGMP; 4) a modulação nitrérgica nos canais HCN não difere entre os diferentes tipos de fenótipos encontrados e também ocorre durante aumentos da osmolaridade plasmática. Frente a estes resultados podemos concluir que a excitabilidade dos neurônios magnocelulares do SON é essencialmente determinada por um efeito do NO sobre os canais HNC por um mecanismo dependente de S-nitrosilação. Desta forma, o NO apresenta-se como mais uma molécula nesse complexo mecanismo de manutenção do equilíbrio hidroeletrolítico do organismo. / The hypothalamic supraoptic nucleus (SON) plays an importante role in the complex systems network that operates to maintain the hydroelectrolytic balance of the body. The nucleus is formed by a cluster of neurons (magnocellular neurosecretory cells - MNCs) responsible for the synthesis and secretion of vasopressin and oxytocin, whose main effects are on the excretion of water and salt by the kidneys. Changes in plasma osmolality lead to intrinsic (membrane properties) and extrinsic (synaptic inputs) functional changes in these neurons, with consequences for neuropeptides release. Furthermore, besides osmolality, studies have shown that the electrical excitability of MNCs can be modulated by several factors, including nitric oxide (NO). Previous studies of our group, demonstrated that NO inhibits the excitability of MNCs during isotonic and hypertonic conditions and that this responses are independent of synaptic connections and involve the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels (HCN). However, some points remained unclear, such as: What is the origin of NO? Are there other cell types involved in this response? What signaling pathway does NO use to modulate HCN channels? Does NO modulate HCN channels during changes in the plasma osmolality? Are there differences in the nitrergic modulation according to cellular phenotypes? Considering that: 1) MNCs express the enzyme for nitric oxide synthesis, in isotonic and hypertonic conditions; 2) the NO effects involve, mainly, activation of guanylate cyclase with consequent increase in the cGMP production, and that 3) HCN channels are modulated by this second messenger, we hypothesize that MNCs are able to produce NO independently of other cells and cellular phenotypes, and that nitrergic modulation of HCN channels involves the guanylate cyclase activation. To answer those questions and to test our hypothesis, we used cellular electrophysiology, essentially Whole cell patch clamp using slices of the SON and isolated neurons. Fluorescence experiments were also used to detect the intracellular activity of NO in order to clarify the origin of this neuronal messenger. In addition, cellular and molecular biology approaches were also used to characterize the phenotype of recorded cells, since 3 distinct cellular types have been described in this nucleus. Our results demonstrate that: 1) NO is produced by MNCs during hypertonic stimulation, and this process is dependent on changes in osmolality, but not on the electrical activity of MNCs in response to the stimulus; 2) NO modulates the electric excitability of the neurons by acting on HCN channels and it does not differ among cellular phenotypes; and 3) the effect of NO occurs by a mechanism dependent of S-nitrosylation and independently of cGMP production. Considering these results we may conclude that electrical excitability of magnocellular neurons of the supraoptic nucleus is essentially determined by an effect of NO on Ih currents by a mechanism dependent of S-nitrosylation. Acting on HCN channels, NO is another player in the complex set of mechanisms controlling the hydroelectrolytic balance.

O desestiolamento vegetal envolve a conversão de etioplastos em cloroplastos maduros e plenamente funcionais, sendo desencadeado pela luz através de um processo multifacetado que se baseia em redes de sinalização endógenas diversificadas e altamente coordenadas. Acredita-se que hormônios vegetais ou outras moléculas sinalizadoras, tais como o radical livre óxido nítrico (NO), desempenham papel importante na regulação desse conjunto de respostas fotomorfogênicas. No presente estudo, buscamos investigar, de forma integrada, a influência do NO, do etileno e das auxinas na indução do acúmulo de pigmentos fotossintéticos e desenvolvimentos dos cloroplastos desencadeados pela luz em plântulas de tomateiro (Solanum lycopersicum). Por meio da determinação do padrão temporal de acúmulo de pigmentos fotossintéticos, diferenciação de etioplastos em cloroplastos, flutuações nos teores endógenos de NO e na atividade e estado de ativação da nitrato redutase (NR) em plântulas do tipo selvagem (cultivar Micro-Tom, MT) e de mutantes fotomorfogênicos (áurea and high pigment 1) mantidas sob escuro contínuo ou expostas às luzes monocromáticas vermelha e azul, pudemos constatar uma clara correlação positiva entre a produção de NO via NR e a indução do acúmulo de pigmentos e desenvolvimento dos cloroplastos em resposta à luz. Dando suporte à importância da NR como fonte biossintética de NO nas plântulas de tomateiro em processo de desestiolamento, constatou-se que as diferentes estratégias empregadas com o intuito de inibir a indução da atividade dessa enzima em resposta à luz resultaram em reduções consideráveis na produção endógena de NO. De modo interessante, tratamentos com NO estimularam o acúmulo de pigmentos e a diferenciação plastidial nas células cotiledonares do mutante áurea sob luz vermelha, indicando, portanto, que essa molécula sinalizadora seria capaz de complementar a deficiência partial na percepção da luz vermelha característica desse mutante deficiente em fitocromos. Em paralelo, um antagonismo mútuo entre o NO e o etileno foi evidenciado por meio de uma série de constatações. (i) O acúmulo de pigmentos e diferenciação de cloroplastos induzidos nas plântulas de tomateiro em resposta às luzes vermelha e azul coincidiram temporalmente com um aumento e diminuição nas emissões de NO e etileno, respectivamente. (ii) Enquanto o NO se mostrou estimulatório ao acúmulo de pigmentos, tratamentos com etileno gasoso ou com o seu precursor (o ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico, ACC) drasticamente inibiram o acúmulo de pigmentos em resposta às luzes vermelha ou azul. (iii) Plântulas em processo de desestiolamento tratadas com etileno ou ACC apresentaram níveis reduzidos de NO, ao passo que plântulas do mutante com baixa sensibilidade ao etileno Never ripe (Nr) exibiram teores de NO endógeno significativamente aumentados. (iv) Plântulas de Nr em processo de desestiolamento apresentaram incrementos consideráveis tanto na atividade total quanto no estado de ativação da NR, uma enzima produtora de NO. (v) NO exógeno reduziu drasticamente a emissão de etileno em plântulas do mutante áurea mantidas sob luz vermelha. Em contrapartida, diversas evidências revelaram um sinergismo mútuo entre auxinas e NO durante o processo de destiolamento em plântulas de tomateiro. (i) O acúmulo de NO em resposta à luz coincidiu com um aumento na ativação do promotor sintético responsivo à auxinas DR5 em plantas de MT expostas às luzes vermelha ou azul. (ii) A suplementação com NO gasoso reestabeleceu a reduzida ativação do promotor DR5 observada em plântulas de áurea sob luz vermelha. (iii) Os teores endógenos de NO foram drasticamente aumentados e diminuídos em plântulas do mutante com baixa sensibilidade à auxinas (diageotropica) e no mutante hipersensível à auxinas (entire), respectivamente. Em conjunto, os dados obtidos parecem indicar que durante a indução do acúmulo de pigmentos fotossintéticos e diferenciação de cloroplastos em plântulas estioladas de tomateiro as interações NO-etileno e NO-auxinas seriam controladas via mecanismos regulatórios de retroalimentação positiva e negativa, respectivamente; e, assim, tais relações hormonais desempenhariam papel importante na coordenação da transição dessas plântulas do estado estiolado para o desenvolvimento fotomorfogênico / The transition from etiolated to green seedlings involves the conversion of etioplasts into mature, functional chloroplasts via a multifaceted light-driven process comprising multiple and tightly coordinated endogenous signaling networks. Plant hormones and other signaling molecules, such as the free radical nitric oxide (NO), are believed to play important roles in controlling the acquisition of these photomorphogenic traits. In the present study, we investigated, in an integrated way, the influence of NO, ethylene and auxins on the light-evoked greening and chloroplast development in tomato (Solanum lycopersicum) seedlings. By determining the time course of photosynthetic pigments accumulation, etioplast-to-chloroplast differentiation, fluctuations in endogenous NO content and in nitrate reductase (NR) total activity and activation state in wild type (Micro-Tom cultivar, MT) and in photomorphogenic mutants (aurea and high pigment 1) seedlings maintained under continuous darkness or exposed to monochromatic red (RL) or blue light (BL), we evidenced a clearly positive correlation between the NO production via NR and the light-induced cotyledon greening and chloroplast maturation. Supporting a role for NR as an important biosynthetic source of NO in de- etiolating tomato seedlings, different strategies employed to inhibit the light-evoked increment in the activity of this enzyme successfully reduced the endogenous NO production. Interestingly, exogenous NO stimulated greening and chloroplast differentiation in cotyledon cells of áurea seedlings maintained under RL, thereby indicating that this signaling molecule might complement the partial deficiency in RL perception characteristic of this phytochrome-deficient mutant. In parallel, a mutual antagonism between NO and ethylene was evidenced by a number of findings. (i) RL- or BL-induced greening and chloroplast differentiation in tomato seedlings temporally coincided with increases and decreases in NO and ethylene emission, respectively. (ii) Whereas NO stimulated cotyledon greening, treatments with gaseous ethylene or its precursor (1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid, ACC) severally impaired either RL- or BL-induced greening in MT. (iii) Ethylene- or ACC-treated de-etiolating seedlings presented significantly lower NO levels whereas the ethylene-insensitive Never ripe (Nr) mutant exhibited increased endogenous NO content. (iv) De-etiolating Nr seedlings exhibited increased total activity and activation state of the NO-generating enzyme NR. (v) Exogenous NO drastically reduced ethylene emission in au seedlings maintained under RL. On the other hand, a series of evidence indicated a mutual synergism between auxins and NO in de-etiolating tomato seedlings. (i) The light-induced NO accumulation coincided with an increased activation of the synthetic auxin-responsive promoter DR5 in both RL- and BL-exposed MT seedlings. (ii) Exogenous NO completely rescued the reduced activation of the DR5 promoter observed in au seedlings under RL. (iii) Endogenous NO was drastically decreased and increased in de-etiolating seedlings of auxin-insensitive (diageotropica) and auxin-hypersensitive (entire) tomato mutants, respectively. Taken together, these data reveal that negative and positive feedback regulatory loops orchestrate ethylene-NO and auxin-NO interactions during the light-triggered cotyledon greening and chloroplast differentiation in de-etiolating tomato seedlings, reinforcing the importance of these signaling molecules during the coordination of seedling transition from the etiolated state to photomorphogenic growth

O óxido nítrico (NO) é um versátil agente biológico, atuando em diversas partes do organismo, tais como cérebro, artérias, sistema imunológico, fígado e pulmões. Alterações nos níveis basais de NO são relacionadas a causas de diversas doenças como hipertenção, câncer, doença de Raymond´s e agregação plaquetária. Visando suprir tal deficiência, mostrou-se de grande valia a obtenção de fármacos capazes de liberar quantidades significativas de NO e de maneira controlada. Uma das possibilidades é o uso de compostos de coordenação, com centro metálico rutênio coordenado ao ligante nitrosil, os quais possuem como característica liberação de NO por estímulo externo. Neste trabalho foram estudados as propriedades químicas, fotoquímicas, farmacológicas e tumoricidas do complexo trans-[RuC(MAC)NO]2+, onde MAC é 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano (cyclam) ou 1,4,8,12-tetraazaciclopentadecano ([15]aneN4), na presença do fotossensibilizador [Ru(NH3)5pz]2+. Os estudos fotoquímicos mostraram que o fotossensibilizador utilizado, [Ru(NH3)5pz]2+, possui tempo de vida no estado excitado de 113 ps, e apresenta processos de transferências eletrônicas e de energia fotoinduzida com o oxigênio molecular, gerando espécies reativas de oxigênio (EROS) como oxigênio singlete e ânion superóxido. Na presença do complexo macrocíclico trans-[RuC(MAC)NO]2+ a irradiação luminosa de [Ru(NH3)5pz]2+ na região do visível proporciona trasferência eletrônica fotoinduzida entre o fotosenssibilizador e o complexo nitrosilo com concomitante formação de NO. O rendimento quântico de NO (NO) é dependente do meio e é de cerca de 10-4 Einstein.mol.cm-1 em meio aquoso sob argônio e 10-2 Einstein.mol.cm-1 em meio oxigenado. Os estudos farmacológicos mostraram que a mistura proposta, em tampão fosfato pH 7,4, promoveu 75% de dilatação em musculatura de aorta pré-contraída com KC enquanto que, quando incorporados em sistemas carreadores de fármacos como emulsão óleo-em-água, HEG gel e membrana sol-gel, promoveram 40%, 35% e 35% de dilatação, respectivamente. A via vasodilatadora foi detectada como sendo pela ativação da GMPc (guanosina monofosfato cíclica), através da quantificação da concentração de cálcio citosólico. Os estudos das atividades anti-tumorais com os complexos doadores de NO foram realizados com linhagens celulares do tipo B16F10, Melan A, HL-60 WMs e Jurkat. Estes experimentos mostraram redução da viabilidade celular dos melanomas entre 50% e 75%, não apresentou ação em células normais (MelanA), mostrando-se seletivos ás células neoplasicas; e 95% de redução da viabilidade celular das células leucêmica (HL-60). Os resultados obtidos e descritos neste trabalho permitem vislumbrar que o uso de espécies doadoras de NO e oxigênio singlete possam ser utilizados no futuro em terapia clínica. / Nitric oxide (NO) is a multipurpose biological agent that shows important role in brain, arteries, immunological system, liver and lungs. The NO basal level alterations have correlation with several diseases as hypertension, cancer, Raymonds disease and platelet aggregation. Aiming supply this deficient NO level, it was necessary propose new compounds that can release NO at controlled manner. One of the possibilities is utilize nitrosyl ruthenium complexes that have ability to release NO under external stimulus. In this work we have studied, the chemical, photochemical, pharmacological and anti-tumoral properties of the trans-[RuC(MAC)NO]2+ complex, were MAC is 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane (cyclam) or 1,4,8,12-tetraazacyclopentadecane ([15]aneN4), in the presence of the sensitizer [Ru(NH3)5pz]2+. The photochemical studies of [Ru(NH3)5pz]2+ complex showed excited state lifetime of 113 ps and presented photoinduced electron and energy transfer with oxygen resulting in reactive oxygen species (ROS) generation as singlet oxygen and superoxide anion. In the presence of trans-[RuC(MAC)NO]2+ complex, the visible light irradiation of [Ru(NH3)5pz]2+ causes photoinduced electron transfer between the photosensitizer and the nitrosyl ruthenium complex resulting NO generation. The quantum yield (NO) is milieu dependent and showed 10-4 Einstein.mol.cm-1 in inert atmosphere and 10-2 Einstein.mol.cm-1 in aerated aqueous solution. The pharmacological studies showed that the proposed mixture in phosphate buffer, under visible irradiation, induce 75% of relaxation in aorta pre-contracted with KC while this system incorporated into drug delivery system as water-in-oil emulsion, HEG gel and sol-gel membrane, the nitric oxide generated induced 40%, 35% and 35% of relaxation, respectively. The quantification of cytosolic calcium concentration, using confocal image, showed that vasodilatation pathway observed was via cGMP (cyclic guanosine monophosphate) activation. The anti-tumoral studies using NO donors were carried out for B16F10, Melan A, HL-60, WMs and Jurkat cells. Those experiments showed decrease from 50% to 75% of cell viability of tumor cells and no toxicity in melanoma cells and 95% of reduction of leukemic cells (HL-60). The obtained results described in this work permit to glimpse that the use of NO donor species and singlet oxygen maybe is a useful tool in the future in clinical therapy.

Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), mais de um bilhão de pessoas estão infectadas com uma ou mais doenças tropicais endêmicas encontradas especialmente entre as populações pobres da África, Ásia e América Latina. Nos últimos 25 anos, apenas 1% de todos os medicamentos desenvolvidos no mundo foram destinados ao tratamento de doenças tropicais, como a doença de Chagas. A doença de Chagas é causada por um protozoário intracelular, o Trypanosoma cruzi, e atualmente apenas dois compostos tem sido empregados para tratamento etiológico da doença de Chagas: nifurtimox e benznidazol. Entretanto, ambos os compostos apresentam considerável toxicidade sistêmica. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho foi desenvolver complexos híbridos de rutênio, com potencial atividade tripanocida, que possam atuar com maior eficácia em sítios biológicos específicos do Trypanosoma cruzi e com reduzida toxicidade sistêmica. Para tal efeito, moléculas com conhecida atividade microbicida como derivados aminoglicosídeos, óxido nítrico e benznidazol foram coordenados a complexos de rutênio originando as espécies Ru(desoxiestreptamina), Ru(neamina), cis-[Ru(bpy)2(Bz)(NO)](PF6)3 e cis-[Ru(NO2)(bpy)2(Bz)]PF6. Os complexos foram caracterizados por espectroscopia de absorção no UV-vis e FTIR, espectrometria de massa, análise elementar, voltametria cíclica e voltametria de pulso diferencial. Nossos estudos sugerem que os complexos Ru(desoxiestreptamina), Ru(neamina), cis-[Ru(bpy)2(Bz)(NO)](PF6)3 e cis-[Ru(NO2)(bpy)2(Bz)]PF6 apresentam propriedades químicas que suportam o sucesso da coordenação dos ligantes ao íon metálico rutênio(II) ou (III). Dentre todos os compostos estudados, cis-[Ru(NO2)(bpy)2(Bz)]PF6, apresentou maior potência tripanocida desprovida de citotoxicidade, a julgar pelos estudos in vitro. IC50 foi ao redor de 0,24 ?mol.L-1, o que é 47 vezes menor do que a droga comumente usada em tratamento de Doença de Chagas. Isto determinou avaliação in vivo, no que foi observado aumento da sobrevida dos animais infectados com tripomastigotas, para 60 dias. Os estudos desenvolvidos com complexos de rutênio no presente trabalho reafirmam o sucesso na obtenção de tais complexos inicialmente propostos, implementando importantes informações e perspectivas no que diz respeito a complexos nitrosilos de rutênio e seus potenciais terapêuticos na doença de Chagas. / Ru(bpy)2(Bz)(NO)](PF6)3 and cis-[Ru(NO2)(bpy)2(Bz)]PF6 complexes. The compounds were characterized by UV-vis absorption spectroscopy, FTIR, mass spectrometry, elemental analysis, and cyclic voltammetry and differential pulse voltammogram. The chemical characterization presented in this work gave evidencie that support the coordination of biological ligand in ruthenium ion such as in Ru(desoxiestreptamina), Ru(neamina), cis-[Ru(bpy)2(Bz)(NO)](PF6)3 and cis-[Ru(NO2)(bpy)2(Bz)]PF6 complexes. Subsequently, in vitro and in vivo studies have been conducted evaluating the cytotoxicity and trypanocidal activity of the ligands and ruthenium complexes. In vitro analysis suggested us that ruthenium complexes are greatly effective against T. cruzi. Among all complexes synthesized cis-[Ru(NO2)(bpy)2(Bz)]PF6 showed higher in vitro trypanocidal activity, which has determined the in vivo assays with this compound. IC50 was around 0,24 ?mol.L-1, which is 47 times less than usual drugs used in Chagas diseases treatment. This was performed using animals infected with T. cruzi in trypomastigote form, animal survivals until 60 days. The studies developed for ruthenium complexes reaffirm the success in obtaining of the complexes originally proposed, implementing important information and perspectives regarding the nitrosyl ruthenium complex and its therapeutic potential in Chagas disease.