Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A nutrição inadequada é um dos principais fatores não-genéticos que afetam o desenvolvimento do encéfalo. O hipocampo é uma estrutura bastante sensível a alterações no aporte nutricional durante o desenvolvimento. No hipocampo a óxido nítrico sintase (ONS) é uma enzima altamente expressa e o óxido nítrico (ON) já foi apontado como tendo papel fundamental na potenciação de longa duração (LTP) e depressão de longa duração (LTD), responsáveis pelo processo de memória e aprendizado. Neste trabalho estudamos o efeito da malnutrição no comportamento associado à memória e aprendizado e na distribuição da ONS, através da técnica da nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato diaforase (NADPH-d). O presente trabalho foi aprovado pelo COMITÊ DE ÉTICA (CEA/055/2009). Foram utilizados ratos Wistar machos, divididos em dois grupos: grupo controle (GC) e grupo malnutrido (GM). A malnutrição se deu através da administração, para a mãe, de uma ração com 0% de proteína durante os 10 primeiros dias de lactação, iniciando-se no dia do nascimento dos filhotes. O GC recebeu ração comercial (22% de proteína). Os encéfalos foram processados histologicamente nas idades de P10, P20, P30, P45 e P90 (n=5 para cada idade e grupo estudado), sendo então realizada a histoquímica da NADPH-d para avaliar a distribuição da ONS. A avaliação dos comportamentos associados à ansiedade foi realizada através do labirinto em cruz elevado (LCE), o comportamento associados à busca por novos estímulos foi medida através do campo vazado (CV) e a memória/aprendizado foi avaliada através do labirinto aquático radial de 8 braços (LAROB) em animais P40 (n=10 para cada grupo) e P90 (n=11 para cada grupo). No GM em P10 observamos maior densidade de células NADPHd+ no giro denteado. Em P20, a marcação para NADPH-d no GM foi menor e esse padrão foi mantido em P30 e P45. No GM em P90 não observamos efeitos da dieta. Em P10, no GM observamos menor número de corpos marcados no stratum pyramidale (SPy). Em P20 o SPy encontrava-se intensamente marcado em ambos os grupos. Em P30 GM observamos maior número de células marcadas no SPy. Entretanto em P45, ambos os grupos apresentaram poucos corpos marcados. Em P90, o GM apresentou mais células marcadas no SPy. Não foram observadas diferenças significativas nas variáveis analisadas para o LCE. O GM em P90 explora maior número de orifícios, tanto na periferia (F=8,1; gl=1; P=0,014) quanto no número total (F=7,5; gl=1; P=0,017). Não foram observadas diferenças significativas para as variáveis analisadas no CV em P40. No teste de memória/aprendizagem foram observadas diferenças significativas entre o GM e o GC na latência de escape no 1 dia de testes em P90 (F=5,2; gl=1; P=0,033), com o GM apresentando melhor desempenho quando comparado ao GC. Esses valores podem ser explicados pela redução da latência para encontrar a plataforma de escape no GM. Não foram observadas diferenças significativas no LAROB em P40. Nossos resultados demonstram que a malnutrição protéica restrita aos 10 primeiros dias da lactação altera a distribuição da NADPH-d no hipocampo. A malnutrição afetou o comportamento dos animais em P40. Por outro lado, em P90 os primeiro dia de teste, sugerindo que o efeito observado está mais associado à novidade do ambiente de teste. / Undernutrition is one of the main epigenetic factors that affect brain development. The hippocampus is a very vulnerable structure that is selectively affected by alterations of food intake during the developmental period. Nitric oxide synthase is an enzyme highly expressed in this structure and nitric oxide has been postulated to have a role in hippocampal LTP and LTD. Here, we evaluated, in rats, the effects of protein malnutrition during the first 10 days of lactation on the distribution of NADPH-diaphorase and on the following behaviors: anxiety, novelty seeking and memory/learning. This study was approved by our University Ethics Committee (CEA/055/2009). Wistar male rats were divided into two groups: control group (CG) and malnourished group (MG). Dams were fed ad libitum with a normoprotein diet (22% protein) during gestation. During the first 10 days of lactation, MG dams received a protein free (0% protein) diet while CG dams received a normoprotein (22%protein) diet. After P10, all dams were fed with a normoprotein diet. On each age studied, P10 until P90 (n=5 for each group), the animals brains were processed histologically and then NADPH-d histochemistry was carried out. Behavioral tests were performed with one male from each litter. Anxiety-like effects were measured in the elevated plus maze (EPM) during 5 min. The time spent in and entries into the open arms were the measured variables. The hole board (HB) was used to assess novelty-seeking (number of nose pokes) for 5 min. Memory and learning were assessed in the 8-arm radial water maze (8-ARWM). The time needed to find a small platform (4 trials/day for 5 consecutive days) submerged in cloudy water was the measured variable. P10 MG animals showed more stained NADPH-d+ cells on the dentate gyrus. At P20, we observed fewer stained cells in MG and this pattern was also observed at P30 and P45. At P90 the staining pattern in the dentate gyrus was similar for both groups. P10 MG animals showed less stained cell bodies in the stratum pyramidale. At P20, the stratum pyramidale in both groups showed intense staining. P30 MG animals showed more stained NADPH-d cells, but, at P45, we observed few stained cells in both groups. Though P90 MG animals presented more stained cells in stratum pyramidale. No differences between groups were observed regarding the anxiety measures. Regarding novelty-seeking, P90 MG animals presented a significantly (ANOVA: P=0.014 and 0,017) higher number of nose pokes that CG ones. No differences were found between groups at P40. As for memory/learning, P90 MG animals had a significantly (P=0.032) reduced latency to find the platform than CG ones in the 8-ARWM. No differences were found between groups at P40. Our results demonstrate that protein malnutrition restricted to the first 10 days of lactation altered the distribution of NADPH-d on hippocampus. The malnourished animals did not display behavioral alterations at P40. Conversely, P90 malnourished animals displayed higher levels of novelty-seeking behavior and a better memory/learning performance, mainly in the first testing day, suggesting that the effect is highly dependent on the novelty of the testing situation.

Orientador: Joni Augusto Cirelli / Banca: Carlos Rossa Júnior / Banca: Sérgio Luís Scombatti de Souza / Resumo: O movimento ortodôntico ocorre por meio da remodelação dos tecidos periodontais em resposta à aplicação de uma força mecânica, sendo que vários mediadores químicos são sintetizados e liberados para seu início e manutenção. Dentre esses mediadores, o óxido nítrico (NO) atua como modulador da atividade de osteoclastos e osteoblastos na remodelação óssea. Interleucina-1_ (IL-1-_), interleucina-6 (IL-6) e fator de necrose tumoral-_ (TNF-_) estimulam a reabsorção óssea e encontram-se aumentados no movimento ortodôntico. Estes mesmos mediadores também encontram-se aumentados e participam da destruição tecidual na doença periodontal. O objetivo deste estudo é avaliar in vivo a expressão de IL-1b, IL-6, TNF-_, NO sintase constitutiva endotelial (ecNOS), e NO sintase indutível (iNOS) nos tecidos periodontais de dentes sob movimentação ortodôntica em condições de saúde e doença periodontal, correlacionando-as às alterações histomorfométricas nesses tecidos. Para isso, 88 ratos foram divididos nos grupos: 1-controle (CONTR), 2- doença periodontal experimental induzida por ligaduras (DP), 3- movimento ortodôntico (MO), 4- doença periodontal experimental induzida por ligaduras, seguido de movimento ortodôntico (MODP). Biópsias dos tecidos gengivais ao redor 13 dos primeiros molares foram removidas para análise da expressão protéica e de mRNA, respectivamente, por Western blot e RT-PCR em tempo real. Cortes histológicos foram obtidos para avaliação histomorfométrica da perda óssea alveolar. Análise estatística foi realizada através do one-way ANOVA e a comparação entre os grupos foi feita com o teste de Tukey (nível de significância de 5%). Resultado: Máxima expressão gênica de todas as proteínas avaliadas foi observada no grupo MODP, nos períodos de 3h (eNos) ou de 1 dia (citocinas e iNOS) (p<0.05)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Orthodontic tooth movement (OTM) occurs in response to mechanical forces through periodontal tissues remodeling. Several chemical mediators are synthesized and released for the beginning and maintenance of tissue remodeling. Among these mediators, nitric oxide (NO) acts as modulator of osteoclasts and osteoblasts activities in bone turnover. Interleukin-1_ (IL-1_), interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-_ (TNF-_) stimulate bone resorption and are increased in orthodontic movement. These same signaling molecules are also increased and play an important role on tissue destruction in periodontal disease. Objectives: The aim of this study was to assess in vivo the expression of IL-1ß, IL-6, TNF-_, NO synthase constitutive endothelial (ecNOS), and inducible NO synthase (iNOS) in dental tissues during orthodontic tooth movement in rats suffering from ligature-induced periodontal disease or in periodontally health animals. Cytokines expressions were correlated to histomorphometric changes on alveolar bone and other periodontal tissues. Methods: Eighty-eight rats were divided into four groups: 1- negative control (sham operated), 2 - ligature-induced periodontal disease (PD), 3 - orthodontic movement (OM), 4 - ligature-induced periodontal disease, followed by orthodontic movement (OMPD). Biopsies of gingival tissue around the first molars were removed for protein and mRNA expression analysis, respectively by, Western blot and Real Time RT-PCR. Histologic tissue sections were obtained for histomorphometric evaluation of alveolar bone loss. Statistical analysis was performed by one-way ANOVA and Tukey's posthoc tests for all parameters (5% significance level). Results: Maximum mRNA expression of all evaluated proteins was observed in the OMPD group, on 3h (eNos) or day 1 (citokines and iNos) periods (p<0.05). Also on day 1, all proteins were expressed in high levels for all groups... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Over 26 million Americans suffer from pulmonary disease, resulting in more than 150,000 deaths annually. Lung transplantation remains the only definitive treatment for many patients, but has meager survival rates and only approximately 1,700 of the 2,200 patients added to the lung transplant wait list each year are transplanted. Extracorporeal gas exchangers have been used as an alternative to mechanical ventilation in acute respiratory failure and as a bridge to transplantation in chronic respiratory failure. Current gas exchangers are limited by their high resistance and low biocompatibility that lead to patient complications and device clot formation. Therefore, there exists a dire need for improved devices that can act as destination therapy. To accomplish the goal of destination therapy, this dissertation discusses three studies that were performed to pave the way. First, I examined clot formation and failure patterns of two common clinical devices (Maquet’s CardioHelp (CH) and Quadrox (Qx)) to further our understanding of their limitations with respect to long-term support. Overall, it was demonstrated that the Qx devices fail earlier and more frequently than CH devices and result in a significantly greater reduction in platelet count, and that a four-inlet approach is beneficial. Next, I determined the optimal sweep gas nitric oxide (NO) concentration that minimizes platelet binding and activation while ensuring that blood methemoglobin (metHb) concentrations increase less than 5%. Miniature artificial lungs were attached to rabbits in a pumped veno-venous configuration and run for 4 h with NO added to the sweep gases in concentrations of 0, 100, 250, and 500 ppm (n=8 ea.). 100 ppm significantly reduced the amount of platelet consumption (p < 0.05), reduced platelet activation as measured by soluble p-selectin (p < 0.05), and had negligible increases in metHb and will thus be used in future experiments. Last, I tested the Pulmonary Assist Device (PAD) which was designed for long term use as a bridge to transplantation and destination therapy. Benchtop experiments were performed that confirmed that it meets our design and performance goals. From here, we are equipped to commence with 30-day PAD testing in sheep.

Síntese, aspectos estruturais, propriedades fotoquímicas, fotofísicas e fotoindução para avaliação citotóxica in vitro de derivados de [Ru (Pc)] (PC = ftalocianina) são descritos neste trabalho. O desenvolvimento ftalocianinas utilizando anéis macrocíclicos, substituídos e não substituídos simetricamente, coordenados com o centro metálico de rutênio permitiu a obtenção de diferentes compostos. Coordenação de ligantes derivados de óxido nítrico (NO) na posição axial do rutênio (II) permitiu obter [Ru(NO)(Pc)(NO2)], um complexo liberador de NO quando submetido ao processo de redução. Os complexos foram caracterizados por FTIR, UV-Vis, 1H RMN e espectrometria de massas. As propriedades fotoquímicas de complexos como ftalocianinas de rutênio (II) têm sido investigadas por fotólise a laser em diferentes comprimentos de onda. Na irradiação de luz em 660 nm em solução aquosa aerada, observamos o fotoprocesso com a produção de oxigênio singleto. Pode-se observar a relação do rendimento quântico de oxigênio singleto e dos fotossensibilizadores utilizados para sua produção. O oxigênio singleto para [Ru (Pc-R)] segue a ordem [Ru(Pc)]> [Ru (Pc-DCBz)]> [Ru(Pc-DMX)] com DCBz = ácido 4-(3,4-dicianofenoxi) benzóico e DMX = 4,5-bis (2,5-dimetilfenoxi) ftalonitrilo. Estudos fotobiológicos são destacados com particular enfoque na irradiação de luz em 660 nm com interesse para aplicações de terapia fotodinâmica (TFD). Neste contexto, temos também a avaliação citotóxica em linhagens de células B16F10 do efeito sinérgico entre NO e oxigênio singleto quando comparado ao complexo [Ru(Pc)], um composto que é apenas produtor de oxigênio singleto. O NO parece potencializar a ação de oxigênio singleto uma vez que em ensaios de viabilidade celular, o complexo [Ru(NO)(Pc)(NO2)] é pelo menos 40% mais ativo que [Ru(Pc)], considerando 8,93 J / cm2 como uma potência. Considerando apenas a produção de oxigênio singleto encontramos a espécie [Ru(Pc-DCBz)] mais citotóxica nas linhagens B16F10 e MCF-7, sob irradiação em 660nm. Com base em todos os estudos, concluímos que citotoxicidade é dependente tanto da localização subcelular quanto do rendimento quântico de oxigênio singleto. A citotoxicidade pode ser reforçada pela produção de NO, seguido por irradiação de luz na janela terapêutica. / Synthesis, structural aspects, photochemistry, photophysical and in vitro photoinduced cytotoxic properties of [Ru(Pc)] (pc = phthalocyanine) derivatives are described in this work. Use of an unsubstituted or symmetrically substituted phthalocyanine ring coordinated to the central ruthenium allowed to obtain different compounds. Coordination of nitric oxide (NO) derivative ligands on axial position of ruthenium(II) ion permitted to obtain [Ru(NO)(Pc)(NO2)] a NO deliver agent under reduction process. The complexes were characterized by FTIR, UV-Vis, 1H NMR and mass spectrometry. The photochemical properties of (phthalocyanine)ruthenium(II) like complexes have been investigated by laser photolysis at different wavelengths. At 660 nm light irradiation in aerated aqueous solution we observed photoprocesses with singlet oxygen production. We have addressed the relationship of the singlet oxygen quantum yield and the photosensitizers used in its generation. The singlet oxygen for [Ru(Pc-R)] follows the order [Ru(Pc)] > [Ru(Pc-DCBz)] > [Ru(Pc-DMX)] with DCBz = 4-(3,4-dicianofenoxy)benzoic acid and DMX = 4,5-bis (2,5-dimethylfenoxy)ftalonitrile. Photobiological studies are highlighted with particular focus on light irradiation on 660 nm with interest for photodynamic therapy (PDT) applications. In this way we also have compared the synergism effect of NO and singlet oxygen production with [Ru(Pc)] as a compound producer of singlet oxygen only by means of cytotoxicity in B16F10 cell line. The NO seems to leverage the singlet oxygen action once [Ru(NO)(NO2)(Pc)] cell viability is at least 40 % more active than [Ru(Pc)] considering 8.93 J/cm2 as a potency. Considering only singlet oxygen production we found [Ru(Pc-DCBz)] more cytotoxic specie in B16F10 and MCF7 cell lines, under irradiation in 660 nm. Based on all studies, we have concluded that citotoxycity is dependent on subcellular localization as well singlet oxygen quantum yield. The cytotoxicity could be enhanced by NO production followed by light irradiation on the therapeutic window.

Os complexos trans-[Ru(NO)(NH3)4(L)](X)3 (1), [Ru(NO)(Hedta)] (2) e seus precursores sintéticos trans-[Ru(H2O)(NH3)4(L)](X)2 (3), trans-[Ru(SO4)(NH3)4(L)](X) (4) , onde L = isn, nic, imN, 4-pic, py, P(OEt) e X = PF6 - e BF4 -, foram testados como captadores dos radicais livres DPPHo, OHo e O2 -o em meio aquoso. O potencial de oxidação do centro metálico nos complexos (1) foram estimados utilizando eletrodo de diamante dopado com boro como eletrodo de trabalho, estando situados em meio aquoso acima de 2,0 V vs. ECS (CH+ = 1,0 x 10-3, &micro; = 0,1 mol L-1). Os complexos (1) e (2) mostraram-se incapazes de reagir com o radical DPPHo, exceto o complexo trans-[Ru(NO)(NH3)4(P(OEt)3)]3+, que reagiu apenas em grande excesso (50 vezes) em relação ao radical DPPHo. Os complexos (3) reagiram quando em excesso ou em proporção estequiométrica. O mecanismo pelo qual esta reação ocorre é predominantemente o de transferência de elétrons. O radical OHo foi captado pelos complexos (1), sendo provavelmente o mecanismo predominante o de transferência de elétrons pela oxidação do centro metálico [Ru(NO)]3+ a [Ru(NO)]4+, compatível com o potencial de oxidação do radical OHo (acima de 2,8 V vs. ECS) reportado na literatura para este radical. As constantes de velocidade específica para estas reações foram estimadas como estando no intervalo de 108 a 1010 M-1 s-1. Não foi observada reação entre o radical OHo e os complexos (4). Os complexos (1) e (2) captam o radical O2 -o pela redução do ligante NO+ com constantes de velocidade específicas no intervalo de 2,0 ± 1,0 x 104 a 4,2 ± 1,0 x 105 M-1 s-1, em medidas efetuadas via cinética de competição com citocromo c. Após a redução, a liberação de NO foi acompanhada via eletrodo seletivo a NO e espectrofotometricamente pela reação do NO com o citocromo c. Nas condições experimentais utilizadas, não se observou a formação do íon peroxinitrito (ONOO-). Os complexos (3) e (4) não reagiram com o radical O2 -o. / The complexes trans-[Ru(NO)(NH3)4(L)](X)3 (1), [Ru(NO)(Hedta)] (2) and their synthetic precursors trans-[Ru(H2O)(NH3)4(L)](X)2 (3), trans-[Ru(SO4)(NH3)4(L)](X) (4) , where L = isn, nic, imN, 4-pic, py, P(OEt) e X = PF6 - and BF4 -, were tested as scavengers for the radicals DPPHo, OHo e O2 -o in aqueous media. The redox potential for the metal center in the complexes (1) were obtained a using boron doped diamond electrode as working electrode. The redox potentials values for ruthenium nitrosyl complexes were higher than 2,0 V vs. SCE. The complexes (1) and (2) were unable to reduce the radical DPPHo, excepted the complex ion trans-[Ru(NO)(NH3)4(P(OEt)3)]3+. The complexes (3) react with DPPHo in stoichometric proportion. Electron transfer from the oxidation of the ruthenium(II) center seems to be the reaction pathway. The OHo radical reacts with ruthenium nitrosyls, predominantly oxidizing the metal center, yielding the fragment [Ru(NO)]4+. This reaction is exothermic since the redox potential of the OHo is around 2.8 V vs. SCE. From competition kinetics the rate constant for this reaction were estimated in the range of 108 a 1010 M-1 s-1. Since the reaction between OHo radical and the complexes (4) was not observed, the hydrogen atom transfer mechanism for the scavenger of OHo by the nitrosyl complexes ca be ruled out. The complexes (1) and (2) scavenge the radical O2 -o by the reduction of the coordinated nitrosyl with specific rate constants ranging from 2,0 ± 1,0 x 104 to 4,2 ± 1,0 x 105 M-1 s-1 as probed by competitive kinetics using cytochrome c. After reduction, nitric oxide dissociation were probed ampherometricaly using a selective NO electrode or spectrophotometrically using cytochrome c as probe. Reduction of the complexes (3) by superoxide ion was not observed and may suggest the coordinated nitrosonium as the reaction site for reduction.

Oxisteróis (por exemplo, 7hidroxicolesterol) são gerados por modificações oxidativas que ocorrem na molécula de colesterol. Podem ser encontrados em elevados níveis plasmáticos em pacientes com aterosclerose e como componentes da placa aterosclerótica. Considerando que o colesterol é o principal componente da cavéola (domínios específicos da membrana plasmática que ancoram diversas proteínas de sinalização) formulamos a hipótese que os oxisteróis podem ser incorporados a estes domínios, interferindo com as vias de sinalização aí localizadas. Células endoteliais de veia umbilical humana (HUVECs) em cultura foram expostas a 7hidroxicolesterol (10g/mL) por diferentes tempos. Analisamos a incorporação desse oxisterol à cavéola utilizando espectrometria de massa e a atividade das proteínas de sinalização presentes neste domínio: óxido nítrico sintase endotelial (eNOS), CD40/CD40L, receptor do fator de crescimento de fibroblastos (rFGF), utilizando PCR quantitativo e imunoblots. Inicialmente mostramos que o 7hidroxycholesterol, em concentrações fisiológicas, foi incorporado às cavéolas mais acentuadamente que em outros domínios de membrana. Esse fenômeno impediu o desligamento entre eNOS e caveolina, prejudicando a função dessa enzima. Também mostramos que o receptor CD40 apresentou uma maior incorporação à cavéola e o rFGF manteve uma ativação mais longa quando células foram expostas ao 7hidroxicolesterol. Esses efeitos gerados pelo oxisterol não estavam relacionados à sua ação sobre mediadores inflamatórios ou receptores nucleares, desde que nenhuma diferença foi observada no perfil de citocinas ou na expressão de genes dependentes da ativação de LXR. Assim, concluímos que a incorporação de 7hidroxycholesterol nos domínios de cavéola pode interferir com vias de sinalização sabidamente envolvidas na aterogênese ou na ruptura da placa / Oxysterols (for example, 7hidroxycholesterol) are generated by oxidative modifications to cholesterol molecules. They have been described in high levels in patients with atherosclerosis and as components of the atherosclerotic plaque. Since cholesterol is the main component of caveolae (plasma membrane domains that anchor several signaling proteins), we hypothesized that oxysterol could be incorporated to these domains, interfering with the signaling networks that use this pathway. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) in culture were exposed to 7hidroxycholesterol (10g/mL) for different times. We analyzed incorporation of this oxysterol to caveolae using mass spectroscopy and the activity of signaling pathways present in these domains: endothelial nitric oxide synthase (eNOS), CD40/CD40L, fibroblast growth factor receptor (FGFr), using quantitative PCR and immunoblots. Initially we showed that 7hidroxycholesterol, in physiological concentrations, was incorporated to caveolae more prominently than to other plasma membrane domains. This phenomenon caused a difficulty in eNOS release from caveolin, impairing its function. We also showed that the receptor CD40 presented a stronger incorporation to caveolae and FGFr maintained a longer activation when cells were exposed to 7hidroxycholesterol. These oxysterol effects were not related to its action in inflammatory mediators or nuclear receptors, since no difference could be observed in cytokine profiles or in the expression of genes dependent on LXR activation. Therefore we conclude that 7hidroxycholesterol incorporation in caveolae domains may interfere with signaling pathways known to be involved in atherogenesis or in plaque rupture

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / IntroduÃÃo: A Mucosite Intestinal (MI) e a diarrÃia severas sÃo efeitos colaterais freqÃentes (15-25%) e limitantes da quimioterapia do cÃncer de cÃlon com Irinotecano (CPT-11). Atà o presente momento, pouco se conhece sobre a fisiopatologia da MI. Objetivo: Estudar os mecanismos e mediadores envolvidos na mucosite intestinal induzida por CPT-11, verificando a participaÃÃo da protease caspase-1, das citocinas interleucina-1 (IL-1), interleucina-18 (IL-18) e interleucina-33 (IL-33), do Ãxido nÃtrico, de mediadores 5-lipoxigenase e do PAF, assim como a seqÃÃncia de interaÃÃo entre esses mediadores sob aspectos da resposta inflamatÃria e morfofuncionais. MÃtodos: Camundongos Swiss, C57BL/6 (BL), BALB/c (BC) ou knockout para Caspase-1 (Casp-/-), IL-18 (IL-18-/-), Ãxido nÃtrico sintase induzida (iNOS-/-), 5-Lipoxigenase (5-LOX-/-), receptor para PAF (PAFr-/-) machos, 22 g, foram divididos em grupos (n=4-5) e tratados por 4 dias com salina (5 mL/kg, i.p) ou CPT-11 (60 mg/kg, i.p) ou foram prÃ-tratados com IL-18bp (proteÃna ligante de IL18, 200 Âg/animal/4 dias, i.p.), aminoguanidina (AG, 50 mg/kg, s.c, 2x/dia/4 dias), IL-33 (1 Âg/animal/4 dias, i.v, 1h antes do CPT-11) ou loperamida ([4x3 mg/kg e 4x30 mg/kg]/animal, s.c.) em associaÃÃo com CPT-11. No 5 dia, avaliou-se a diarrÃia por escores, o leucograma e, apÃs sacrifÃcio, coletou-se o duodeno para dosagem da atividade de mieloperoxidase (MPO, neutrÃfilos/mg tecido) e de Ãxido nÃtrico sintase induzida (iNOS pM citrulina/h/mg proteÃna), morfometria (razÃo vilo/cripta) e contratilidade in vitro à Acetilcolina (%contraÃÃo em relaÃÃo ao KCl60 mM). Para anÃlise estatÃstica utilizou-se ANOVA/Newman-Keuls ou Kruskal Wallis/Dunn. P<0,05 foi aceito. Resultados: Camundongos BL apresentaram um padrÃo de mucosite intestinal similar ao observado no camundongo Swiss sob aspectos morfofuncionais. O CPT-11 induziu leucopenia em todos os animais independentemente do tratamento aplicado. Adicionalmente, o CPT-11 induziu em animais BL e BC, nÃo tratados, aumento de MPO intestinal, reduÃÃo da relaÃÃo vilo/cripta, amento da contratilidade in vitro e dos eventos de diarrÃia comparados com animais injetados somente com salina (p<0,05). A despeito da administraÃÃo de CPT-11, animais Caspase-1-/-, IL-18-/- ou BC tratados com IL-18bp apresentaram atividade de MPO e de iNOS reduzidas, bem como aumento na relaÃÃo vilo/cripta, menor contratilidade duodenal in vitro e eventos de diarrÃia atenuados em comparaÃÃo aos respectivos controles tratados com salina (p>0,05). Dados idÃnticos tambÃm foram observados em camundongos injetados com IL-33 e que receberam CPT-11. A reduÃÃo na atividade de iNOS naqueles animais motivou o estudo do efeito do CPT-11 em animais iNOS-/- ou tratados com aminoguanidina. Observaram-se menores nÃveis de citocinas IL-1beta e KC, bem como uma atividade de MPO reduzida no duodeno desses animais. AlÃm disso, verificou-se preservaÃÃo da relaÃÃo vilo/cripta e da espessura da camada muscular, menor contratilidade duodenal in vitro e eventos de diarrÃia atenuados similar ao observado nos respectivos controles que receberam apenas salina (p>0,05). PorÃm, a administraÃÃo de CPT-11 a animais PAFr-/- foi capaz de induzir alteraÃÃes morfofuncionais e o aumento da atividade de MPO intestinal. Em camundongos 5-LOX /- ou tratados com loperamida (controle positivo), ambos os grupos injetados com CPT-11, observaram-se aumento da atividade de MPO e alteraÃÃes morfomÃtricas. Contudo, sobre aspectos funcionais de contratilidade in vitro, visualizou-se proteÃÃo. ConclusÃes: Esses resultados sugerem que a via caspase-1-IL-18 Ãxido nÃtrico contribui para o desenvolvimento da resposta inflamatÃria e alteraÃÃes morfofuncionais na mucosite intestinal induzida por CPT-11. A IL-33 parece ser um fator protetor compensatÃrio nessa cascata inflamatÃria. A 5-LOX e o PAFr parecem ter papel secundÃrio na patogÃnese da mucosite intestinal por CPT-11. / Introduction: Severe Intestinal Mucositis (IM) and diarrhea are frequent and dose-limiting side-effects of colon cancer chemotherapy with irinotecan (CPT-11). At present, much of IM pathophysiology remains unknown. Aims: To study the mechanisms and inflammatory mediators involved in CPT-11-induced intestinal mucositis, verifying the role of the protease caspase-1, cytokines interleukin-1 (IL-1), interleukin-18 (IL-18) and interleukin-33 (IL-33), nitric oxide, 5-lipoxygenase and PAF as well as the sequence of activation of these mediators in the inflammatory response and morphofunctional contexts. Methods: Swiss, C57BL/6 (BL), BALB/c (BC) male mice or caspases-1(Casp-1-/-), IL-18 (IL-18-/-), inducible nitric oxide synthase (iNOS-/-), 5-Lipoxygenase (5-LOX-/-), PAF receptor (PAFr-/-) knockout mice, 22g, were divided into groups (n=4-5) and treated for 4 days with saline (5 mL/kg, i.p.) or CPT-11 (60 mg/kg, i.p.) or were given IL-18bp (IL-18 binding protein, 200 Âg/animal/4 days, i.p.), aminoguanidine (AG, 50 mg/kg, s.c, 2x/day/4 days), IL-33 (1 Âg/animal/4 days, i.v, 1h previously CPT-11) or loperamide ([4x3 mg/kg and 4x30 mg/kg]/animal, s.c.) co-administered with CPT-11. On day 5, diarrhea and leukocyte counts were assessed, and following sacrifice duodenal portions of the animal were collected to assess myeloperoxidase (MPO, neutrophils/mg tissue) and nitric oxide synthase (iNOS pM citruline /h/mg protein) activity, morphometric analysis, and in vitro contractility (%contraction in relation to KCl 60 mM). ANOVA/Newman Keuls or Kruskal Wallis/Dunn were used as statistical tests. P<0.05 was accepted. Results: IM was morphofunctionally similar in both BL and Swiss. CPT-11 induced leukopenia in all animal lineages despite the treatment given. Additionally, CPT-11 induced MPO, increased in vitro contractility and diarrheic events, and villi/crypt ratio reduction in BL and BC mice in comparison with saline treated mice (p<0.05). Despite the injection of CPT-11, Casp-1-/-, IL-18-/- or IL-18bp treated BC mice presented reduced MPO and iNOS activities and also increased villi/crypt ratio, reduced duodenal in vitro contractility and mild diarrhea similar to saline-treated mice (P>0.05), similar to the patterns seen in IL-33 treated mice. The reduced iNOS activity found in the earlier mice led us to investigate the CPT-11 effect on iNOS /- and aminoguanidine-treated mice. Lower IL-1beta and KC cytokine levels, as well as reduced MPO activity were found. Also, preserved villi/crypt ratio and muscle layer thickness, normal duodenal contractility and diarrheic events were seen similarly to saline-treated mice (p>0.05). However, CPT-11-treated PAFr-/- presented morphofunctional alterations and increased intestinal MPO activity. 5-LOX-/- or loperamide treated mice (positive control), both injected with CPT-11, exhibited increased MPO activity and morphometric alterations, but no exacerbation on in vitro contractility was observable. Conclusion: Taken together, these results suggest the role of caspase-1/Interleukin-18/nitric oxide cascade on pathogenesis of CPT-11-induced morphofunctional alteration and inflammatory response (IM). IL-33 seems to be a compensatory protective factor on this inflammatory cascade. 5-LOX and PAFr show a likely secondary role on IM pathophysiology.

INTRODUÇÃO: A Pitiríase liquenoide (PL) é doença cutânea de etiologia desconhecida. Foi recentemente classificada no grupo das discrasias linfóides de células T. Excetuando-se os estudos sobre as características fenotípicas e moleculares dos linfócitos T na PL, trabalhos relativos aos demais componentes da resposta tecidual cutânea nesta doença são escassos. MÉTODOS: Biopsias de 34 pacientes com diagnóstico clínico e histopatológico de PL foram classificadas de acordo com características histopatológicas nos grupos de pitiríase liquenóide aguda (PLA) (n = 15) e crônica (PLC) (n = 19), e submetidas a técnica imunoistoquímica para demonstração de células de Langerhans, dendrócitos dérmicos fator XIIIIa+, expressão da forma induzida da óxido nítrico sintase (iNOS), fator de necrose tumoral alfa (TNFalfa), interferon gama (IFNy) e interleucinas (IL) 12 e 10. Fez-se a comparação dos resultados obtidos entre os grupos de PLA e PLC. A expressão de iNOS foi também comparada com grupo controle de pele normal (n = 10). RESULTADOS: A população de células de Langerhans epidérmicas foi menor no grupo de PLA. O número de dendrócitos dérmicos fator XIIIa+ não diferiu entre os grupos. Foi observada expressão epidérmica e dérmica de iNOS em ambos os grupos de PL. Três espécimes do grupo controle de pele normal apresentaram fraca expressão de iNOS epidérmica e dérmica. O grupo de lesões de PLA mostrou maior expressão dérmica de TNFalfa e IFNy. A depleção de células de Langerhans epidérmicas foi acompanhada de maior expressão epidérmica de TNFalfa e IL-10. Houve correlação entre a expressão de iNOS e a população de dendrócitos dérmicos fator XIIIa+. CONCLUSÕES: Na PLA a população de células de Langerhans é menor que na PLC e se correlacionou com maior expressão epidérmica de TNFalfa e IL-10. Não houve diferenças na população de dendrócitos dérmicos fator XIIIa+ nos dois grupos de lesão. Demonstrou-se, pela primeira vez, expressão epidérmica e dérmica de iNOS nas lesões de PL. A expressão de iNOS dérmica correlacionou-se com a população dendrocítica Fator XIIIa+. Houve correlação entre a expressão de TNFalfa e de IFNy com as alterações inflamatórias da PLA. Houve correlação negativa entre a expressão dérmica de IL-12 e IL-10 nas lesões da PL. No espectro da resposta tecidual da PL participam as células dendríticas da pele, em ambiente de padrão imunológico Th1 predominante, com conseqüente indução da expressão de iNOS nos sítios de lesão. / BACKGROUND: Pityriasis lichenoides (PL) is a cutaneous disease of unknown etiology which has been regarded as an immunologically mediated reaction. Recently, it was reclassified in the group of Cutaneous Lymphoid T cell Dyscrasia. There are few reports addressing mainly T cell subsets in PL tissue reaction. METHODS: Skin biopsies taken from 34 patients with confirmed diagnosis of PL where classified as pityriasis lichenoides et varioloformis acuta (PLEVA) (n = 15) and pityriasis lichenoides chronica (PLC) (n = 19) according to histopathological features. The skin biopsies where subjected to immunohistochemical technique to demonstrate Langerhans cells, Factor XIIIa+ dermal dendrocytes, inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression, tumor necrosis factor alfa (TNFalfa), interferon gama (IFNy) and interleukins (IL) 12 and 10. The ensuing results were compared among the two PL groups. The iNOS results in PL group were also compared to a normal skin control group (n = 10). RESULTS: In PLEVA lesions, there was a decrease in Langerhans cells population when compared to PLC lesions. The factor XIIIa+ dermal dendrocytes number did not differ among PL groups. There was a strong epidermal and dermal iNOS expression in both PL groups. A faint iNOS expression was observed in three specimens of the control group. A higher TNFalfa and INFy expression was observed in PLEVA lesions. The Langerhans cells decrease observed in those lesions was accompanied by higher TNFalfa and IL-10 expression. There was a significant correlation between factor XIIIa+ dermal dendrocytes population and dermal iNOS expression. CONCLUSIONS: PLEVA lesions displayed a decrease in Langerhans cells number, accompanied by higher TNFalfa and IL-10 expression. There was no difference in the amount of factor XIIIa+ dermal dendrocytes in PLEVA and PLC lesions. The study demonstrated, for the first time, the iNOS expression in PL lesions. The factor XIIIa+ dermal dendrocytes population correlated to dermal iNOS expression. TNFalfa and INFy expression correlated to inflammatory alterations observed in PLEVA lesions. There was a negative correlation between IL-12 and IL-10 expression in PL lesions. Dendritic cells participate in the PL spectrum of tissue reaction which is characterized by predominant TH1 cytokines milieu that favors iNOS expression.

O óxido nítrico (NO) é um radical livre gasoso que participa de uma série de processos biológicos fisiológicos sendo produzido por enzimas denominadas óxido nítrico sintases (NOS). Diversos estudos vem demonstrando sua participação na resposta inflamatória crônica, na qual as células inflamatórias, com destaque para os macrófagos, são estimuladas a sintetizarem NOS, que por esse motivo são denominadas induzíveis (iNOS) e passam a produzir o óxido nítrico que vai atuar na modulação do processo. A fim de comprovar sua participação filogenética na resposta granulomatosa, utilizou-se como modelo experimental a inoculação de onco-BCG na musculatura de tilápias-do-Nilo (Oreochromys niloticus) e de girinos de rã touro-gigante (Rana catesbeiana), na região plantar de tartarugas ?red ear? (Trachemys scripta elegans) e no coxim plantar de hamsters sírios (Mesocricetus auratus). Fragmentos da lesão foram colhidos aos 14, 28 e 42 dias pós-inoculação, fixados em Carnoy por quatro horas, sendo em seguida transferidos para álcool 70o GL. Procedeu-se a confecção de preparados histopatológicos segundo métodos de rotina que foram corados pelo método da hematoxilina e eosina. Imunoistoquímica foi realizada para a verificação da produção de óxido nítrico indiretamente através da marcação da iNOS com anticorpos anti-iNOS humana biotinilados produzidos em coelhos. Observou-se em todos os animais desenvolvimento de granulomas que mostraram tendência a maior organização aos 42 dias; as características celulares foram semelhantes, com algumas variações específicas. Constatou-se marcação imunoistoquímica em macrófagos presentes nas lesões produzidas pela inoculação de BCG em todos os grupos experimentais, exceto nos girinos aos 14 dias, cuja marcação foi irrelevante. Os resultados permitiram concluir que o óxido nítrico participa da resposta inflamatória granulomatosa, bem como a utilização de imunoistoquímica mostrou-se método eficiente para evidenciar sua produção em estudos filogenéticos. Pesquisas futuras deverão qualificar e quantificar mediadores químicos envolvidos na regulação da participação do óxido nítrico para melhor compreender sua fisiopatologia na modulação do granuloma inflamatório. / Nitric oxide (NO) is a gaseous free radical that takes part in a series of biological physiological processes. It is produced by enzymes called nitric oxide synthetases (NOS). Several studies have demonstrated its role in chronic inflammatory response, in which inflammatory cells, mainly macrophages, are stimulated to synthesize NOS, being called then inducible nitric oxide synthetases (iNOS). Nitric oxide is then produced and acts in the modulation of the process. In order to corroborate its phylogenetic role in granulomatous response, the inoculation of onco-BCG experimental model was used in the muscle of Nile tilapias (Oreochromys niloticus) and bullfrog tadpoles (Rana catesbeiana), in the plantar region of red eared sliders (Trachemys scripta elegans) and in the plantar pad of hamsters (Mesocricetus auratus). Fragments of the lesions were collected at 14, 28 and 42 days after inoculation, fixed in Carnoy for four hours, and then transferred to alcohol 70o GL. After that, histopathological slides were prepared following routine methods, and stained by hematoxylin-eosin. Immunohistochemical tests were performed in order to assess the production of nitric oxide indirectly by means of marking iNOS with biotinylated human anti-iNOS antibodies produced by rabbits. It was observed in all animals that the development of granulomas showed greater tendency of organization at 42 days; cell characteristics were similar, with some specific variations. Immunohistochemical marking was observed in macrophages present in lesions produced by BCG inoculation in all experimental groups, except in tadpoles at 14 days, which showed irrelevant marking. Results enabled the conclusion that nitric oxide takes part in granulomatous inflammatory response. Besides, the use of immunohistochemistry showed to be an efficient method for evidencing the production of nitric oxide in phylogenetic studies. Future research studies should qualify and quantify chemical mediators involved in the regulation nitric oxide role in order to better understand its physiopathology in the modulation of inflammatory granuloma.

Ao final da gestação de ratas se observa hiporeatividade a agentes constritores que tem sido atribuída à produção alterada de óxido nítrico (NO) e prostanóides. Nesse estudo foi observada a participação dos derivados da sintase de NO (NOS) e ciclooxigenase (COX) nas alterações de reatividade vascular à fenilefrina (FE) durante a gestação, bem como a interferência da tensão passiva inicial na importância relativa dessas enzimas. Foi avaliada a resposta vasoconstritora à fenilefrina em anéis de aorta de ratas não grávidas (NG, fase estro do ciclo estral) e grávidas (G, 19o e 20o dias de gestação) com o endotélio íntegro ou lesado, e após inibição da COX ou da NOS. Fixando a concentração de FE (10-7 M) e variando a tensão passiva inicial (0,25, 0,50, 0,75, 1 ou 2g) a que o anel foi submetido, foi observado aumento da magnitude da resposta vasoconstritora dependente do aumento do estiramento do tecido em G e NG, sendo anéis de aorta de G menos reativos à FE do que NG nas diferentes tensões. A retirada do endotélio, a inibição da NOS por L-NNA ou da COX por diclofenaco de sódio (DF) reverteram parcialmente essa hiporeatividade. A adição de concentrações cumulativas de FE em anéis de aorta de G e NG submetidos às tensões passivas de 0,5 e 1 g demonstrou, novamente, hiporeatividade associada à gestação. A retirada do endotélio foi capaz de igualar a resposta constritora à FE de G e NG. A inibição da via NOS/guanilato ciclase com L-NNA e ODQ aumentou a reatividade de G e NG não alterando as diferenças de ambos; no entando, utilizando 0,5 g de tensão passiva, a adição de L-NNA igualou a resposta constritora à FE de G e NG. A adição de DF diminuiu a reatividade de NG igualando os grupos nas tensões de 0,5 e 1,0 g. O relaxamento induzido por acetilcolina em vasos pré-contraídos com FE não foi alterado pela gestação. Os resultados sugerem que a hiporeatividade à fenilefrina em anéis de aorta de ratas ao término da gestação está relacionada a uma alteração da ação de fatores derivados do endotélio, da NOS e da COX, sendo que as condições iniciais determinam a importância relativa desses agentes. / Late pregnancy is associated with diminished reactivity to vasoconstrictor agents that may be mediated by altered production/release of nitric oxide (NO) and prostaglandins. In the present study the role of NO synthase (NOS) and cyclooxygenase (COX) derived products in the altered vascular reactivity to phenylephrine (PE) was investigated in the isolated aorta of late-pregnant rats at different basal conditions. The vasoconstrictor response to PE was recorded in aorta rings of non-pergnant (NP, estrous) and late pregnant rats (P, 19- to 20 day) in the presence and absence of the endothelium, and with COX or NOS inhibition. The contractile response to PE (10-7 M) augmented with increasing resting tension from 0.25 to 2.0 g in both P and NP aorta; however, the responses in aortic rings from P were smaller at all passive tension employed. Endothelium removal or NOS inhibition with L-NNA or COX inhibition with sodium diclofenac (DF) attenuated but did not abolished the hyporesponsivity of P aorta. Concentration-response curves induced by PE were also attenuated in aortic rings of P compared with those of NP at both 0.5 and 1.0 g of resting tensions. Endothelium removal potentiated the constrictor response induced by PE in both P and NP aortas and abolished the difference between the groups. The NOS/guanilato cyclase pathway inhibition enhanced the PE-induced responses in P and NP but aortas of P maintained at 1.0 g of passive tension still respond less to PE; at 0.5 g of resting tension, however, L-NNA abolished the differences between P and NP. DF blunted PE-induced contraction only in NP aorta at both resting tensions and abolished the difference between P and NP aorta responses to PE. The relaxant responses of aortic rings to acetylcholine were not influenced by pregnancy. These results suggest that the refractoriness to PE-induced contraction observed in aortic rings of late-pregnant rats is related to altered production of NOS and COX endothelial factors. In addition, the basal conditions determine the relative contribution of these factors to the observed refractoriness to vasoconstrictor agent.