O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito da inibição das cadeias inflamatórias reguladas pela ação do interferon-gama (IFN-γ) e da enzima óxido nítrico sintase indutível (iNOS) no dano radioinduzido após exposição a dose letal (8 Gy) ou moderada a severa (4 Gy) nos tecidos hematopoiéticos (baço e medula) de modelos experimentais irradiados nestas doses. Grupos de camundongos isogênicos C57Bl/6j foram expostos à radiação correspondente a 4 ou 8 Gy em exposições de corpo inteiro em fonte panorâmica de 60Co. Da mesma forma, foram irradiados camundongos cuja expressão de IFN-γ ou iNOS é ausente ou indetectável. Outros grupos receberam via oral por toda a duração do experimento um inibidor atividade de iNOS, aminoguanidina, ou via intraperitoneal uma quimiocina primordial promotora da hematopoiese, CXCL12, até o quarto dia após a exposição. Outra divisão experimental recebeu os dois agentes concomitantemente. Os animais foram sacrificados nos dias 2º, 4º e 8º após a irradiação, e fragmentos dos baços e fêmures foram preservados para histologia. Os esplenócitos e células não aderentes da medula óssea femoral foram removidos e divididos, fornecendo alíquotas para posterior RT-PCR e suspensões celulares apropriadas para ensaios de citometria de fluxo específicos para a detecção da freqüência de populações CD34+. Nestes mesmos dias de experimento, alíquotas de sangue caudal foram coletadas para contagem de hemácias e plaquetas periféricas. Os resultados mostraram que a ausência da produção de interferon-gama no local irradiado aumenta a sobrevivência e a quantidade de células progenitoras hematopoiéticas e que a ausência de iNOS ou seu bloqueio funcional diminuem a extensão do dano radioinduzido nos tecidos hematopoiéticos. Além disso, foi possível observar que a suplementação com CXCL12 sintética aumenta a freqüência do fenótipo CD34+ P.chave: radiação ionizante; medula óssea; óxido nítrico; aminoguanidina nos baços dos modelos testados, e que seu efeito parece antagonizar com a inibição da produção de NO pela aminoguanidina. / This study aimed to evaluate the effect of inhibition of the inflammatory chains governed by the action of interferon-gamma (IFN-γ) and the enzyme inducible nitric oxide synthase (iNOS) in damage after radiation exposure to lethal dose (8 Gy) or moderate /severe dose (4 Gy) in hematopoietic tissues (spleen and bone marrow) of experimental models irradiated at these doses. Groups of isogenic C57Bl/6j mice were exposed to radiation (4 or 8 Gy) in whole-body exposures in a 60Co panoramic source. Similarly, were irradiated mice whose iNOS or IFN-γ expression was absent or undetectable. Other groups received orally in all days of experiments an inhibitor of iNOS activity, aminoguanidine, or CXCL12, a primordial chemokine known as an hematopoeisis promoter intraperitonially by days 0 to 4th after radiation events Another groups received the two agents concomitantly. The animals were sacrificed on days 2nd, 4th and 8th after irradiation, and fragments of the spleens and femurs were preserved for histology. Splenocytes and non-adherent cells from femoral bone marrow were removed and divided, providing aliquots for subsequent RT-PCR and cell suspensions suitable for flow cytometry experiments specific to the detection of the frequency of CD34+ cell populations. In same days of experiment, tail blood samples were collected for counting of peripheral red blood cells and platelets. The results showed that the absence of the production of interferon-gamma at the irradiated sites increases the survival and the amount of hematopoietic progenitor cells and that the absence of iNOS or its functional blockade reduces the extent of radioinduced damage in tested hematopoietic tissues. Furthermore, it was possible to observe that supplementing with synthetic CXCL12 increases the frequency of CD34+ Keywords: ionizing radiation, bone marrow, nitric oxide, aminoguanidine phenotype in the spleens of tested models, and that its effect seems to antagonize the inhibition of the production of NO by aminoguanidine.

Made available in DSpace on 2017-07-21T14:13:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vanessa Kovalski Silverio.pdf: 1423306 bytes, checksum: 68729da0a75b158004d6a33911081b96 (MD5) Previous issue date: 2015-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Septic shock, which is triggered by microbial products, is mainly characterized by an inadequate tissue perfusion caused by a decreased in blood pressure, vascular damage, hyporeactivity to vasoconstrictors and disseminated intravascular coagulation, which can lead to multiple organ dysfunction and death. Nitric oxide (NO) is an important player in the pathogenesis of sepsis and septic shock, having both protective and deleterious effects. Trials of nonselective NOS inhibitors have shown increased mean arterial pressure, but also increased pulmonary artery pressure and reduced cardiac output. Thus, despite the intense research, there was no clinical progress so far. Perhaps this is due to lack of compression of NO signaling pathways. There is a knowledge gap on the role of the NO-guanylate cyclase- guanosine 3 ', 5'-cyclic monophosphate (cGMP) pathway during the early stages of sepsis. Most work has studied the role of cGMP by inhibiting the enzyme responsible for its production (guanylate cyclase), however, in this work we chose to try the increased cGMP levels by inhibiting an enzyme responsible for their degradation, phosphodiesterase 5 (PDE5). In the early stages of shock occurs an intense release of vasoconstrictors agents, which can lead to ischemia damage. In this scenario, cGMP could play a key role counterbalancing these agents and preventing tissue damage. Sildenafil, a type-5 cGMP phosphodiesterase inhibitor, increase GMP at smooth muscle cells and promotes vasodilation .Thus, the purpose of this study was to investigate the effect of treatment with sildenafil in the early stages of sepsis. Male Wistar rats were divided into 2 groups of 16 animals each and submitted to either Cecal Ligation and Puncture (CLP) or the sham procedure. Eight hours after the procedure, the CLP and sham groups were randomly assigned to receive sildenafil (10 mg/kg orally) or vehicle. Twenty-four hours after the CLP or sham procedure, the mean arterial blood pressure, systolic and diastolic blood pressure and vascular reactivity to phenylephrine were evaluated. Additionally, blood samples were collected for measurement of nitric oxide (nitrate and nitrite), urea, creatinine, AST, ALT, lactate and CK.; hematological analyzes were also performed. Statistical significance was analyzed by two-way ANOVA followed by post hoc Bonferroni. The results shows that the CLP was able to reproduce the main characteristics of humans sepsis like as, systemic inflamation, hypotension, reduced response to vasoconstrictors, hypoxia and tissue damage. Interestingly, treatment with sildenafil improved and the organ hypoperfusion at early stages of sepsis reducing organ injury. Thus, phosphodiesterase inhibition may be a useful therapeutic strategy if administered at the proper window of opportunity. / O choque séptico, que é desencadeado por produtos microbianos, é caracterizado principalmente por uma perfusão tecidual inadequada causada pela diminuição da pressão arterial, lesão vascular, hiporreatividade a vasoconstritores e coagulação intravascular disseminada, o que pode levar à disfunção de múltiplos órgãos e morte. O óxido nítrico (NO) tem um importante papel na patogênese da sepse e choque séptico, tendo efeitos tanto protetores como deletérios. Ensaios clínicos com inibidores não seletivos da NOS (óxido nítrico sintase) motraram melhora nos níveis da pressão arterial média, porém houve também um aumento da pressão da artéria pulmonar e redução do débito cardíaco. Assim, apesar da investigação intensa, não houve progressos clínicos até agora. Talvez isso se deve à falta de compreensão do NO e suas vias de sinalização. Há por exemplo uma lacuna sobre o papel da enzima guanilato ciclase solúvel e do segundo mensageiro guanosina 3',5'- monofosfato cíclico (cGMP) durante os momentos iniciais da sepse. A maioria dos trabalhos tem estudado o papel do cGMP através da inibição da enzima responsável pela sua produção (guanilato ciclase), porém, neste trabalho optamos por tentar o aumento dos níveis de cGMP através da inibição de uma enzima responsável pela sua degradação, a fosfodiesterase 5 (PDE5). Nos primeiros estágios de choque ocorre uma intensa liberação de agentes vasoconstritores, o que pode levar a danos por isquemia. Neste cenário, o cGMP pode desempenhar um papel chave para contrabalançar esses agentes e impedir danos nos tecidos. O sildenafil, um inibidor de fosfodiesterase do tipo 5, aumenta cGMP em células do músculo liso promovendo vasodilatação. Assim, o propósito do presente estudo foi investigar o efeito do tratamento com sildenafil nas fases iniciais da sepse. Ratos Wistar machos foram divididos em 2 grupos de 16 animais cada e submetidos ao procedimento CLP (Cecal Ligation and Puncture) ou à falsa cirurgia (sham). Oito horas após o procedimento, os grupos CLP e sham foram aleatoriamente divididos para receber sildenafil (10 mg / kg por via oral) ou veículo. Vinte e quatro horas após o procedimento CLP ou sham, a pressão arterial média, sistólica e diastólica e reatividade vascular à fenilefrina foram avaliadas. Além disso, amostras de sangue foram coletadas para a dosagem de óxido nítrico (nitrato e nitrito), uréia, creatinina, AST, ALT, lactato e CK; análises hematológicas também foram realizadas. A significância estatística foi analisada por ANOVA de duas vias seguida de post hoc Bonferroni. Os resultados mostram que o modelo CLP foi capaz de reproduzir as principais características da sepse como inflamação sistêmica, hipotensão, redução da resposta ao vasoconstritores, hipóxia e dano tecidual. Interessantemente, o tratamento com sildenafil melhorou a hipoperfusão em estágios iniciais de sepse reduzindo a lesão de órgãos. Sendo assim, inibidores das fosfodiasterases, como o sildenafil, podem ser ferramentas terapêuticas úteis para o tratamento da sepse, desde que administrados na correta janela de oportunidade.

Introdução: Há crescentes evidências que sinalizam o papel do estresse crônico como desencadeante e mesmo perpetuador de crises asmáticas, bem como a importância do parênquima pulmonar na piora funcional da asma. Objetivos: Deste modo, consideramos relevante avaliar em cobaias com inflamação alérgica crônica pulmonar como o estresse físico repetido, induzido pela natação forçada, modula a responsividade do parênquima pulmonar, ainfiltração eosinofílica, ativação da via de estresse oxidativo e o remodelamento, bem como o papel da ativação de enzima óxido nítrico sintase induzida nestas respostas. Métodos: Os animais receberam inalações duas vezes por semana durante quatro semanas com doses crescentes de ovoalbumina ou solução fisiológica Após 24 horas da quarta inalação os animais foram separadas em dois grupos onde metade destes animais foi submetido ao protocolo de natação forçada por dez dias com intervalo de dois dias, para a indução do estresse, enquanto a outra metade dos animais permaneceu sem a indução de estresse. Para avaliar a participação da ativação de iNOS nesta resposta as cobaias foram novamente divididas em grupos, onde parte foi tratada com 1400-W (inibidor específico de iNOS, 2mg/kg ip/dia/4 dias) ou veículo no mesmo período, iniciando 30 minutos antes da sétima inalação. Para avaliação das repercussões comportamentais da indução de estresse os animais foram submetidos ao teste de campo aberto, sendo obtidos os seguintes parâmetros: distância percorrida, velocidade média total, tempo de movimentação total. Foi também coletada uma amostra de sangue no dia da realização da mecânica pulmonar para a dosagem do cortisol. Após 72h da sétima inalação, os animais foram anestesiados, exsanguinados e fatias de tecido pulmonar periférico foram retiradas e suspensas em banho orgânico de Krebs, e a resistência (Rt) e elastância (Et) do tecido pulmonar periférico foram avaliadas em condição basal e após desafio com ovoalbumina (1%). Foi também obtida a medida de histerisividade. Após a realização da mecânica oscilatória, as mesmas fatias de tecido pulmonar periférico foram submetidas à avaliação histopatológica. Resultados: Nos animais submetidos a natação forçada foi observado um aumento no peso da adrenal, no cortisol sérico, na distância percorrida e no tempo de movimentação em campo aberto o que demonstrou que a natação forçada foi eficaz como indutor de estresse. Os animais expostos às inalações com ovalbumina apresentaram valores maiores de porcentagem de aumento da resistência e da elastância tecidual após desafio com ovoalbumina (p<0.05). Os animais expostos às inalações com ovalbumina e submetidos a estresse induzido por natação forçada apresentaram um aumento da resistência e elastância teciduais (p<0,05), enquanto que o tratamento com 1400W reverteu esse aumento tanto nos animais sensibilizados quantos nos sensibilizados submetidos a estresse. Houve aumento do número de eosinófilos (P<0.05), de células iNOS positivas (P<0,05), da deposição de fibras colágenas (P<0,05), no conteúdo de actina (P<0,05) e de 8-epi-PGF2a (P<0,05) no septo alveolar. Nos animais sensibilizados e submetidos ao estresse houve aumento todos os parâmetros morfológicos descritos anteriormente (P<0,05) exceto pelo depósito de fibras colágenas. A administração de 1400W reduziu todos estes parâmetros funcionais e morfológicos (P<0,05) com exceção do conteúdo de actina no septo alveolar, da infiltração eosinofílica e dos níveis de cortisol sérico. Conclusões: Neste modelo experimental, o bloqueio específico da iNOS atenuou a constrição, a inflamação eosinofílica, a expressão de iNOS, o remodelamento no parênquima pulmonar tanto nos animais apenas sensibilizados quanto nos animais sensibilizados e submetidos ao estresse. Estas alterações podem estar relacionadas aos efeitos da ativação da óxido nítrico sintase induzida na modulação da via do estresse oxidativo, sinalizada pelos efeitos na produção de isoprostano 8. O presente estudo sugere que a inibição específica da iNOS pode amplificar as estratégias terapêuticas utilizadas na abordagem de doenças inflamatórias crônicas pulmonares / Introduction: There is growing evidence to indicate the role of chronic stress even perpetuating as triggering asthma attacks and the importance of functional lung parenchyma in worsening of asthmatic responses. Objective: We considered relevant to evaluate in guinea pigs with chronic allergic pulmonary inflammation if repeated physical stress, induced by forced swimming, modulates the responsiveness of the distal lung parenchyma, eosinophilic infiltration, oxidative stress pathway activation and extracellular matrix remodeling as well as the role of the activation of induced nitric oxide synthase in these responses. Methods: The animals received inhalations twice a week for four weeks with increasing doses of ovalbumin or normal saline. After 24 hours of the fourth inhalation, the animals were separated into two groups where half of these animals were subjected to the protocol of forced swimming for ten days with an interval two days, while the other half of the animals remained without stress induction. In order to evaluate the involvement of iNOS activation in this response, guinea pigs were again divided in two groups, one part of them were treated with 1400W (specific inhibitor of iNOS, 2mg/kg ip/day/4 days) or vehicle in the same period, starting 30 minutes before the seventh inhalation. To evaluate the behavioral impact of stress induction, the animals were subjected to open field test, and we obtained the following parameters: distance traveled, average speed, total time of handling. It was also collected a blood sample on the day of pulmonary mechanics to measure cortisol. After 72h of the seventh inhalation, animals were anesthetized, and exsanguinated and slices of peripheral lung tissue were removed, suspended in a Krebs bath, and resistance (Rt) and elastance (Et) of peripheral lung tissue were evaluated either at baseline condition and after oavalbumin challenge (1%). It was also measured the histerisivity. After the end of the mechanical oscillatory evaluation, the same slices of peripheral lung tissue were submited to histopathological analysis. Results: We observed that animals submitted to forced swimming had an increase in adrenal weight, in the serum cortisol, in the distance and time of movement in the open field, showing that forced swimming was effective as stressor. The animals exposed to inhalations with ovalbumin and submited to stress induced by forced swimming had an increase in pulmonary tissue resistance and elastance (p <0.05), had an increased in the number of eosinophils (P <0.05), iNOS positive cells (P <0.05), actin (P <0.05) and 8-epi-PGF2a content (P <0.05) in alveolar septum compared to ovalbumin exposed animals (OVA group). Treatment with 1400W reversed this response in sensitized animals submitted or not to stress induction (P <0.05) There was no difference in the collagen deposition. Administration of 1400W for sensitized and stressed animals reduced all these functional and morphological parameters (P <0.05) except for the actin content of the alveolar septum, eosinophilic infiltration and cortisol levels. Conclusions: In this experimental model, the specific iNOS inhibition attenuated the constriction, the eosinophilic inflammation, the iNOS expression, the lung parenchyma remodeling in animals sensitized and submitted or not to stress induction. These changes may be related to the effects of inducible nitric oxide activation in the modulation of oxidative stress pathway. This study suggests that specific inhibition may amplify the therapeutic strategies to chronic inflammatory lung diseases

A fisiopatologia do choque séptico caracteriza-se por uma produção excessiva de mediadores inflamatórios, dentre eles o óxido nítrico (NO), conduzindo a uma hipotensão prolongada associada a um aumento inicial de vasopressina (AVP) e uma diminuição na fase tardia. A ketamina é um anestésico com propriedades cardioestimulatórias e anti-inflamatórias. O presente trabalho testou a hipótese de que a ketamina, através de suas propriedades anti-inflamatórias no choque séptico, teria uma ação inibitória sobre a síntese do óxido nítrico, favorecendo a liberação de AVP e preservando a função cardiovascular. O choque endotoxêmico foi induzido através de uma injeção i.v. de 1,5 mg/kg de lipopolissacarídeo (LPS) em ratos Wistar adultos machos. Após a injeção de LPS, um grupo de animais foi tratado com ketamina (10 mg/kg) e o grupo controle recebeu salina. A administração de LPS produziu uma queda significativa da pressão arterial média (PAM) (p<0,01) associada a um aumento da freqüência cardíaca (FC) (p<0,01). Essas alterações foram acompanhadas por uma elevação significativa nas concentrações plasmáticas de AVP após duas horas (p<0,01), seguida de queda nas próximas horas, e por uma elevação nas concentrações de NO plasmático (p<0,01). Quando o LPS foi combinado à administração i.v. de ketamina, observou-se uma atenuação da hipotensão (p<0,01) e uma potencialização na liberação de AVP (p<0,01) pelo LPS. No entanto, a produção de NO após a adminstração da ketamina não mostrou diferença em relação ao LPS, indicando não ser esta a via utilizada pela ketamina. Para verificar o papel da ativação simpática na preservação da função cardiovascular pela ketamina no choque endotoxêmico, utilizou-se um inibidor simpático central, a moxonidina (MOXO). O pré-tratamento i.v. com MOXO (50 µg /Kg) atenuou significativamente o aumento da FC produzido pela ketamina (p < 0,05) apenas na segunda e quarta horas, porém com ação não significativa sobre a PAM. Estes dados sugerem um efeito cardioestimulatório da ketamina no choque séptico principalmente por uma potencialização na liberação da AVP e esta parece não se dar pela via do NO / The pathophysiology of septic shock is characterized by excessive production of inflammatory mediators, including nitric oxide (NO), leading to a prolonged hypotension associated with an initial increase of vasopressin (AVP) and a late phase decrease. Ketamine is an anesthetic with cardiostimulatory and anti- inflammatory properties. The present study tested the hypothesis that ketamine, through its anti-inflammatory properties in septic shock, have an inhibitory effect on the synthesis of nitric oxide, promoting the release of AVP and preserving cardiovascular function. Endotoxemic shock was induced by an iv injection of 1.5 mg / kg lipopolysaccharide (LPS) in adult male Wistar rats. After LPS injection, a group of animals was treated with ketamine (10 mg / kg) and the control group received saline. The LPS administration produced a significant decrease in mean arterial pressure (MAP) (p <0.01) associated with an increase in heart rate (HR) (p <0,01). These changes were accompanied by significant increases in plasma AVP after two hours (p <0.01), followed by fall in the coming hours, and plasma NO increasing (p <0.01). When LPS was combined with iv ketamine administration, there was an attenuation of hypotension (p <0.01) and an enhancement in the release of AVP (p <0.01) by LPS. However, the production of NO after ketamine adminstration showed no difference compared to LPS, indicating this is not the route used by ketamine. To verify the role of sympathetic activation in ketamine\'s preservation of cardiovascular function in endotoxemic shock, used a central sympathetic inhibitor, moxonidine (moxo). Pretreatment with moxo iv (50 µg / kg) significantly attenuated the increase in HR produced by ketamine (p <0.05) only in the second and fourth hour, but with no significant action on the MAP. These data suggest that the cardiostimulatory effect of ketamine in septic shock primarily occurs by potentiation of AVP release, and this does not seem to give the NO pathway

Introdução: Em pacientes deprimidos, a mortalidade cardíaca devido à doença cardíaca coronária (CHD) é duas vezes maior do que em pacientes coronarianos nãodeprimidos, possivelmente devido à presença de disfunção endotelial. Pode haver uma associação entre a utilização de drogas antipsicóticas e doenças cardiovasculares, que são associadas à disfunção endotelial vasotônica. Os estudos relacionados aos efeitos das drogas antipsicóticas sobre a função endotelial vascular são praticamente inexistentes. Objetivo: Esse estudo foi delineado para avaliar os mecanismos envolvidos na reatividade vascular dependente do endotélio sob ação da droga antipsicótica atípica clozapina. Materiais e método: As curvas concentraçãoresposta em anéis pré-contraídos com PE (1 ?M), foram registradas na presença e na ausência de inibidores dos inibidores L-NAME e indometacina, os quais foram incubados, isolados e/ou em associação, por 30 minutos. Para estudar a participação dos canais para K+ foram realizados experimentos com os bloqueadores Tetraetilamonio e Cloreto de potássio (Kcl). Para finalizar o protocolo foram realizados experimentos com bloqueadores da guanilato ciclase (ODQ e azul de metileno) e os inibidores dos canais de K+ (apamina, paxilina e glibenclamida). Resultados: A clozapina causou relaxamento dependente do endotélio envolvendo as três vias de relaxamento (GMPc/NO, AMPc/PGI2 e hiperpolarização). Essa observação foi embasada na ineficiência dos bloqueadores, L-NAME, Indometacina e Tetraetilamônio (TEA), respectivamente. O relaxamento dependente do endotélio foi atenuado pela associação L-NAME/Indometacina e abolido em vasos contraídos por cloreto de potássio e incubados com glibenclamida. Conclusão: Estes resultados sugerem que há participação sinérgica, provavelmente através de um mecanismo de cross-talk, dos sistemas cAMP, cGMP e hiperpolarização. Portanto, mais estudos sobre possíveis funções endoteliais relacionadas aos efeitos colaterais dos antipsicóticos cardiovasculares seriam uma direção de pesquisa adequada. / Objective: In depressed patients, cardiac mortality due to coronary heart disease (CHD) is twice as high as in non-depressed coronary patients, possibly due to the presence of endothelial dysfunction. There may be an association between the use of antipsychotic drugs and cardiovascular diseases, which are associated with vasotonic endothelial dysfunction. Studies related to the effects of antipsychotic drugs on vascular endothelial function are practically non-existent. Aims: This study was designed to evaluate the mechanisms involved in endothelium-dependent vascular reactivity under the action of the atypical antipsychotic drug clozapine. Method: As concentration-response curves in pre-contracted rings with PE (1 ?M), they were recorded in the presence and absence of inhibitors of the L-NAME and indomethacin inhibitors, which were incubated, isolated and / or in association, for 30 minutes. To study the participation of the K + channels, experiments were performed with the tetraethylammonium and potassium chloride (Kcl) blockers. In order to obtain the protocol they were performed with guanylase cyclase blockers (ODQ and methylene blue) and K + channel inhibitors (apamina, paxilin and glibenclamide). Results: Clozapine caused endothelium-dependent relaxation as the three relaxation pathways (cGMP / NO, cAMP / PGI2 and hyperpolarization). This observation was based on the inefficiency of the blockers, L-NAME, Indomethacin and Tetraethylammonium (TEA), respectively. Endothelium-dependent relaxation was attenuated by the association LNAME / Indomethacin and abolished in vessels contracted by potassium chloride and incubated with glibenclamide. Conclusion: These results suggest that there is synergistic participation, probably through a cross-talk mechanism, of the cAMP, cGMP and hyperpolarization systems. Therefore, more studies of possible endothelium function related to cardiovascular antipsychotics side effects would be a proper research direction.

A redução da biodisponibilidade óxido nítrico (&#8226;NO) tem sido responsável por complicações vasculares em algumas doenças, incluindo Diabetes Mellitus tipo 2 (DMII). A disfunção endotelial (DE) pode ser ocasionada pela baixa biodisponibilidade do &#8226;NO e estudos indicam que a hiperglicemia pode estar contribuindo para esse evento. Outro fato importante é que grande parte dos indivíduos que apresentam Intolerância à Glicose (IG) evolui para DMII. Portanto, o objetivo desse trabalho foi avaliar de que forma o estado hiperglicêmico poderia interferir sobre os metabólitos do &#8226;NO (S-nitrosotióis, nitrato + nitrito e nitrotirosina), inibidores endógenos da &#8226;NO sintase (ADMA e SDMA), homocisteína e a DE através da medida da atividade da n-acetil-&#946;-glicosaminidase (NAG). Neste estudo participaram 140 voluntários: 12 controles (C), 32 IG e 96 DMII. A concentração de glicose foi superior nos grupos IG (109&#177;10mg/dL) e DMII (165&#177;66mg/dL) em relação ao grupo C (88&#177;11mg/dL) (p<0.05). Somente o grupo DMII (8,5&#177;1,9%; 4,57&#177;2,78mg/dL) apresentou níveis elevados de hemoglobina glicada e frutosamina em relação ao grupo C (6,0&#177;0,9%; 2,31&#177;0,27mg/dL). Entretanto, os metabólitos do &#8226;NO (nitrato+nitrito, S-nitrosotióis e nitrotirosina) apresentaram concentrações elevadas nos grupos IG (35,1&#177;12,9&#181;M; 137&#177;45nM; 352&#177;104nM) e DMII (39,2&#177;18,0&#181;M; 143&#177;73nM 472&#177;231nM) em relação ao grupo C (26,6&#177;6,2&#181;M; 78&#177;46nM; 260&#177;74nM). A função endotelial também esteve alterada nos grupos IG (28,0&#177;7,3U/L) e DMII (29,4&#177;8,7U/L) em relação ao grupo C (21,7&#177;3,9U/L), como indicado pela atividade da NAG. O mesmo comportamento foi observado com os inibidores endógenos de &#8226;NO (ADMA e SDMA). A concentração de homocisteína plasmática não apresentou diferença significativa entre os grupos. Os dados demonstraram que os indivíduos IG apresentaram alterações bioquímicas, relacionadas ao estresse oxidativo e à disfunção endotelial, semelhantes aos pacientes com DMII, as quais poderiam contribuir para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares. / The nitric oxide (NO) has been responsible for vascular complications in some diseases, including Diabetes Mellitus type 2 (DMII). Endothelial dysfunction (ED) may be caused by NO low bioavailability and studies indicate that the hyperglycemia may be contributing to this event. Other important fact is that a large number of individuals who present Glucose Intolerance (GI) develop DMII. Therefore, the objective of this study was to evaluate the way the hyperglycemic state could interfere upon the NO metabolites (S-nitrosotiois, nitrate + nitrite and nitrotirosine), endogen inhibitors of NO synthase (ADMA, and SDMA) and the DE using n-acetyl-&#946;-glicosaminidase (NAG) activity measure. In this study, 140 volunteers participated: 12 as controls (C), 32 GI and 96 DMII. Glucose concentration was superior in GI group (109&#177;10 mg/dL) and DMII group (165&#177;66mg/dL) in relation to group C (88&#177;11mg/dL) (p<0.05). Only DMII group (8,5&#177;1.9%; 4,57&#177;2,78mg/dL) showed high leveIs of glicade hemoglobin and frutosamine in relation to group C (6,0&#177;0,9%; 2,31&#177;0,27mg/dL). However, NO metabolites (nitrate + nitrite, S-nitrosotiois and nitrotirosine) showed high concentrations in groups GI (35,1&#177;12,9&#181;M; 137&#177;45nM; 352&#177;104nM) and DMII (39,2&#177;18,O&#181;M; 143&#177;73nM; 472&#177;231nM) in relation to group C (26,6&#177;6,2&#181;M; 78&#177;46nM; 260&#177;74nM). The endothelial function was aIso altered in groups GI (28,0&#177;7,3U/L) and DMII (29,4&#177;8,7U/L) in relation to group C (21,7&#177;3,9U/L), as indicated by NAG activity. The same behavior was observed with endogen inhibitors of NO (ADMA and SDMA). Plasmatic homocystein concentration has not shown significant difference between the groups. Data has shown that the individuaIs IG presented biochemistry alterations, related to the oxidative stress and the endothelial dysfunction, similar to the patients with DMII, which could contribute to the development of cardiovascular diseases.

Guzmania monostachia é uma bromélia-tanque epífita que apresenta uma alta plasticidade fotossintética, sendo capaz de regular positivamente o metabolismo ácido das crassuláceas (CAM) em resposta ao déficit hídrico. Também foi visto para essa espécie que o incremento do CAM se dá de forma diferente ao longo do comprimento da folha, sendo mais intenso na região apical do que na basal. Trabalhos anteriores indicaram que o óxido nítrico (NO) parece estar envolvido na regulação do CAM, mas nada se sabe dos mecanismos pelos quais isso ocorre. Uma vez que parecem não existir receptores específicos de NO, acredita-se que ele seja capaz de se ligar diretamente às proteínas, através de um processo conhecido como nitrosilação. O presente trabalho visou determinar se o NO estaria atuando na regulação do CAM em G. monostachia através da nitrosilação de proteínas relacionadas a esse metabolismo. Para tanto, foram feitos três desenhos experimentais. No primeiro, folhas destacadas de G. monostachia foram mantidas por 7 dias em água (controle) ou em uma solução contendo 30% de PEG (déficit hídrico). Durante esse período, foram monitorados parâmetros indicativos de estresse (porcentagem de água, potencial hídrico, além dos teores de clorofilas, carotenoides e proteínas), CAM (atividade da fosfoenolpiruvato carboxilase - PEPC - e acúmulo noturno de malato e citrato) e emissão de NO. Todas as análises foram feitas nas porções basal e apical das folhas. Ao final dos 7 dias de escassez hídrica, também foram feitas dosagens de nitrosotióis totais e a visualização em gel de proteínas nitrosiladas na porção apical. O segundo experimento visou verificar a modulação da atividade de enzimas pela nitrosilação. Para tanto, extratos proteicos de folhas de G. monostachia foram incubados com glutationa reduzida (GSH) ou S-nitrosoglutationa (GSNO) para, em seguida,verificar diferenças nas atividades das enzimas PEPC, malato desidrogenase (MDH), ascorbato peroxidase (APX), catalase (CAT) e isocitrato desidrogenase dependente de NADP+ (NADP-ICDH). No terceiro experimento foi feita a aplicação do sequestrador de NO 2-(4-carboxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxil-3-óxido (cPTIO) ou de NO gasoso em folhas destacadas mantidas em PEG ou água, respectivamente. Os resultados mostraram que o aumento do CAM se dá seis dias após o início do tratamento de déficit hídrico, concomitantemente com o aumento na produção de NO. Esses dois fenômenos ocorreram somente na porção apical da folha. A quantidade de proteínas nitrosiladas, no entanto, diminuiu em resposta ao déficit hídrico nesta porção, indicando que o aumento na emissão de NO pode ser oriundo de uma desnitrosilação de proteínas. De fato, a atividade de três (PEPC, APX e NADP-ICDH) das cinco enzimas analisadas mostraram uma diminuição em resposta ao tratamento com GSNO. Dessa forma, o NO parece não se ligar diretamente às enzimas do CAM para regular sua atividade. Mesmo assim, a aplicação de NO gasoso causou um aumento em todos os parâmetros relacionados ao CAM após 5 dias, sugerindo algum tipo de controle transcricional sobre genes relacionados a esse tipo de fotossíntese / Guzmania monstachia is an epiphytic tank-bromeliad capable of up-regulating CAM under water deficit. Moreover, the increase in CAM is stronger in the apical portion of the leaf, when compared to the base. Nitric oxide (NO) is a signaling molecule involved in the regulation of CAM, but the mechanisms underlying this phenomenon are still largely unknown. NO is capable of interacting with proteins through a process known as nitrosylation. Here, we investigated whether NO could regulate CAM by protein nitrosylation. In order to do so, we performed three experiments. In the first one, detached leaves were maintained for 7 days in water or in a solution containing 30% of poliethylene glycol 6000 (PEG). During this period, the water percentage, water potential, contents of chlorophylls and carotenoids, phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) activity, nocturnal malate and citrate accumulation, and NO emission were monitored daily in the basal and apical portions of the leaf. At the seventh day of the water shortage, quantification of total nitrosothiols and in-gel visualization of nitrosylated proteins were also performed in the apical portion. The second experiment consisted in incubating proteic extracts of G. monostachia with reducedglutathione (GSH) or S-nitrosoglutathione (GSNO) to assess the impact of nitrosylation in enzymatic activity. The enzymes selected to this step were PEPC, malate dehydrogenase (MDH), ascorbate peroxydase (APX), catalase (CAT) and NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase (NADP-ICDH). The third experiment consisted in the application of the NO scavenger 2-(4-carboxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxil-3-óxido (cPTIO) or gaseous NO to leaves maintained in water or in PEG 30%, respectively. The results show that there was an increase of both CAM and NO in the leaf apex at the sixth day of water deficit. The level of nitrosylated proteins, however, decreased in this portion, indicating that the emission of NO may be the result of a de-nitrosylation process. In fact, the activity of three (PEPC, APX and NADP-ICDH) out of five enzymes analyzed decreased with nitrosylation. Therefore, NO does not regulate directly the activity of CAM enzymes. Nevertheless, exogenous NO increased all of the assayed CAM parameters after 5 days, indicating transcriptional control of CAM-related genes

Em trabalhos anteriores nós apresentamos um sensor sólido de óxido nítrico (NO) preparado pelo método sol-gel utilizando como aprisionadores complexos de Fe 2+ -DETC. Neste trabalho, reportamos o efeito de alguns surfactantes (CTAB-catiônico, SDS-aniônico, Triton X100-neutro e o plurônico F127) sobre o sensor. A ressonância paramagnética eletrônica (RPE) foi usada para quantificar o número de moléculas de NO-Fe 2+ -DETC. A presença dos surfactantes aumenta a resistência mecânica dos sensores sólidos, sendo mais pronunciada nos sensores contendo CTAB e Triton. Sem os surfactantes não há sinal do complexo NO-Fe 2+ - DETC. O tempo de secagem foi otimizado para 30 min. O sinal mais intenso foi obtido com os sensores contendo os surfactantes a 12 mM. Os surfactantes de um modo geral aumentam a quantidade de NO aprisionado. A difusão do NO foi estimada através do tempo de aprisionamento do NO sendo maior na presença do F127 e SDS. A saturação do sinal de NO nos sensores acontece em 10 min. Uma maior mobilidade dos complexos NO-Fe 2+ -DETC foi encontrada nos sensores contendo SDS e F127 e foi estimada pela forma de linha. Para os sensores no estado sólido o limite de detecção foi de 2 µM utilizando o F127 como aditivo, para o SDS, CTAB e Triton o limite foi de 6 µM, 8 µM e 10 µM respectivamente. Na solução coloidal a menor quantidade detectada foi de 0,1µM também com o F127. A sensibilidade dos sensores aumenta em pelo menos 5 vezes nos sensores sólidos preparados com o F127 em detrimento aos demais e pode ser melhorada utilizando surfactantes mistos. / In previous work we present a solid sensor for nitric oxide (NO) prepared by sol-gel method using the trapped complex of Fe 2+ -DETC. In this work, we report the effect of some surfactants (CTAB, cationic, anionic, SDS, Triton-X100 and neutral pluronic F127) on the sensor. The electron paramagnetic resonance (EPR) was used to quantify the number of molecules of NO-Fe 2+ -DETC. The use of surfactant increases the mechanical strength of solid sensors, being more pronounced in sensors containing CTAB and Triton. Without the surfactant no EPR signal of the complex NO-Fe 2+ -DETC was observed. The drying time was optimized to 30 min. The strongest EPR signal was obtained with the sensors containing the surfactant to 12 mM. The surfactants in general increase the amount of NO trapped. The diffusion of NO was estimated by the time of trapping of the NO that it was higher in the presence of F127 and SDS. The signal saturation of the NO sensors occurs in 10 min. A higher mobility of the complex NO-Fe 2+ -DETC was found in sensors containing SDS and F127 and was estimated by lineshapes. For the solid state sensors the detection limit was 2 µM using the F127 as additive and for the SDS, CTAB and Triton the limit was 6 µM, 8 µM and 10 µM respectively. In the colloidal solution the least amount detected was 0.1 µM also with the F127. The sensitivity of the sensors increases at least 5 times in the solid sensors prepared with the F127 in detriment to the other and can be improved by using mixed surfactants.

O óxido nítrico (NO) é um mensageiro químico gerado pela atividade da enzima óxido nítrico sintase (NOS) a qual foi detectada em vários órgãos incluído o sistema reprodutor. O sistema NOS/NO parece desempenhar papel importante na maturação oocitária entre outras funções. No entanto, apesar das evidências, há poucos estudos sobre o papel desse sistema em oócitos da espécie bovina. Sabe-se que o NO atua pela via da guanilato ciclase (GC) estimulando a produção do nucleotídeo GMPc, que por sua vez é capaz de influenciar os níveis de outro nucleotídeo, o AMPc, que é um importante elemento da via de sinalização das gonadotrofinas nos oócitos e no controle da maturação oocitária. O objetivo do presente estudo foi de investigar o envolvimento da via do GMPc na ação do sistema NOS/NO na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos e seu efeito sobre a via do AMPc. Com a maior concentração estudada do doador de NO (10-7M de SNAP), apenas 36% dos oócitos conseguiram alcançar o estágio de RVG (P< 0,05), após 9 horas de maturação. Esse atraso também foi observado com diferentes concentrações do estimulador de GC (5, 10 ou 50&mu;M de Proptoporfirina IX) e pelo análogo de GMPc (1, 2 e 4mM de 8-Br-GMPc ), que apresentaram uma taxa média de RVG de 50% para os tratamentos e 70% para os grupos controles sem as drogas (P<0,05). No início da maturação (0h), os níveis de GMPc foram de 5,29 pmol/oócito sofrendo uma queda logo na primeira hora de cultivo para 2,97 pmol nos oócitos do grupo controle e 1,54 pmol nos cultivados com associação de 10-7M de SNAP (doador de NO) e 100&mu;M de OQD (inibidor de GC (P<0,05). No grupo de oócitos cultivados apenas com SNAP, os níveis de GMPc se mantiveram em 4,51 pmol/oócito, semelhante ao grupo imaturo (0h de cultivo, P>0,05). O doador de NO manteve estável o nível de GMPc somente na primeira hora de maturação. Após 3 e 6 h de MIV, os níveis de GMPc permaneceram baixos e similares (0,07 a 2,46 pmol/oócito, P>0,05) nos grupos controle (sem drogas), tratado com doador de NO (10-7M de SNAP) associado ou não ao inibidor de guanilato ciclase (100&mu;M de OQD). Também foi observada uma queda nos níveis de AMPc em relação ao grupo imaturo (32,42 fmol de AMPc/oócito) para os demais grupos (P<0,05), que apresentaram aproximadamente, 12,0 a 16,0 fmol de AMPc/oócito durante a primeira hora, 3,3 a 8,0 fmol/oócito durante a terceira hora e 7,4 a 18,3 durante a sexta hora de maturação (P>0,05). O NO afetou os níveis de GMPc no início da maturação, mas não os níveis de AMPc. O NO e o GMPc podem atuar no controle da expressão gênica de uma série de proteínas envolvidas no controles dos níveis de AMPc e GMPc ou suas funções. Esse controle pode ser efeito direto do NO (PKG2, PDE3A, PDE4D e PDE8A), do GMPc (ADCY6) ou do NO via GMPc (PKA1) e varia com o compartimento considerado (oócito ou células do cumulus). Esses resultados demonstraram a inter-relação das vias NO/GMPc/AMPc e toda a sua complexidade dependendo do tipo celular e da fase da maturação de oócitos bovinos. / The NOS/NO system seems to play an important role in oocyte maturation besides other functions. However, despite the evidence, there are few studies on the possible role of this system in bovine oocytes. It is known that NO acts via guanylate cyclase (GC) by stimulating the production of the nucleotide cGMP, which in turn can influence the levels of another nucleotide, cAMP, which is an important element of the signaling pathway of gonadotropins in oocytes and in the control of oocyte maturation. The aim of the present study was to investigate the involvement of the cGMP pathway in the action of the NOS/NO system on the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes and its effect on the cAMP pathway. The highest studied concentration of the NO donor (10-7M SNAP), only 36% of oocytes were able to undergo GVBD (P<0.05) after 9 hours of maturation. This delay was also observed with different concentrations of the GC stimulator (5, 10 or 50&mu;M Proptoporfirin IX) and the cGMP analogue (1, 2 and 4 mM 8-Br-cGMP), which had an average of 50% GVBD for treatment groups and 70% for control groups without drugs (P<0.05). At the beginning of maturation (0 h) cGMP levels were 5.29 pmol/oocyte and decreased within the first hour of culture to 2.97 pmol and 1.54 pmol in the control group and in oocytes cultured in 10-7M SNAP (NO donor) associated with 100&mu;M OQD (GC inhibitor; P<0.05). In the group of oocytes cultured only with SNAP, cGMP levels remained at 4.51 pmol/oocyte similar to the immature group (0 h culture, P> 0.05). The increase of NO maintained cGMP levels stable only during the first hours of maturation. After 3 and 6 h IVM, cGMP levels remained low and similar (0.01 to 2.5 pmol/ ocyte, P>0.05) in control (without drugs), treated with NO donor (SNAP 10-7M) with or without the guanylate cyclase inhibitor (100&mu;M OQD). A decrease in cAMP levels was also observed when compared with the immature group (32.42 fmol cAMP/oocyte) for the other groups (P <0.05), which showed 12.0 to 16.0 fmol cAMP/oocyte after the first hour, 3.3 to 8.0 fmol/oocyte after the third hour and 7.4 to 18.3 after the sixth hour of IVM (P>0.05). NO and cGMP may act to control gene expression in a series of proteins involved in control of the levels of cAMP and cGMP or their functions. The control may be a direct effect of NO (PKG2, PDE3, PDE4D and PDE8A), cGMP (ADCY6) or NO via cGMP (PKA1) and varies with the compartment considered (oocyte or cumulus cells). The results showed the interrelationship of the NO/cGMP/cAMP pathway and all its complexity depending on the cell type and the stage of maturation in bovine oocytes.

O pré e pós-condicionamento isquêmico são fenômenos cardioprotetores que limitam o dano tecidual no infarto agudo do miocárdio. Seus efeitos benéficos ocorrem através da ativação de complexas vias sinalizadoras intracelulares, que têm a inibição da formação do poro de transição de permeabilidade mitocondrial como efetor final comum. A presença de fatores de risco, como a hipercolesterolemia, pode interferir nos resultados finais quando se lança mão de tais medidas cardioprotetoras. Entretanto, há na literatura achados contraditórios que não mostram interferência do colesterol elevado sobre a cardioproteção do pré-condicionamento isquêmico. No pós-condicionamento isquêmico, mais recentemente descrito, as primeiras evidências também mostram resultados conflitantes, que carecem de mais estudos. A baixa disponibilidade do óxido nítrico presente na hipercolesterolemia está associada a níveis elevados de dimetilarginina assimétrica, um inibidor da óxido nítrico sintetase, e pode ser o responsável por abolir os benefícios de ambas as medidas cardioprotetoras aqui estudadas. Procuramos, neste trabalho, avaliar a influência da hipercolesterolemia sobre o pré e pós-condicionamento isquêmico, e correlacionar os níveis de colesterol total e dimetilarginina assimétrica com o tamanho do infarto do miocárdio experimental em ratos anestesiados. Nós encontramos um maior tamanho do infarto nos animais hipercolesterolêmicos apesar do uso destas medidas cardioprotetoras. / Ischemic pre and postconditioning are cardioprotective phenomena that limit heart tissue damage in acute myocardial infarction. Its beneficial effects occur through the activation of complex intracellular signaling pathways, which have the inhibition of the formation of the mitochondria permeability transition pore as common final effector. The presence of risk factors such as hypercholesterolemia may interfere with final results when it makes use of such cardioprotective measures. However, there are contradictory findings in the literature which show no interference of high cholesterol on cardioprotection of ischemic preconditioning. In ischemic postconditioning, more recently described, the initial evidences also shows conflicting results, which require further studies. The low availability of nitric oxide present in hypercholesterolemia is associated with high levels of asymmetric dimethylarginine, an inhibitor of nitric oxide synthase, and may be responsible for removing the benefits of both cardioprotective measures studied here. The objective of our study was to assess the effect of hypercholesterolemia on ischemic pre and postconditioning and correlate the levels of total cholesterol and asymmetric dimethylarginine with the size of experimental myocardial infarction in anesthetized rats. We found a larger myocardial infarction in the hypercholesterolemic animals despite the use of these cardioprotective measures.